Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

במבחנה הדמיה וכימות של יעילות מיקוד והתרופות של אנלוגים של GnRH שכותרתו fluorescently

Published: March 21, 2017 doi: 10.3791/55529
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 3, 2
1MTA-SE Pathobiochemistry Research Group, Semmelweis University, 2Department of Medical Chemistry, Molecular Biology and Pathobiochemistry, Semmelweis University, 3MTA-ELTE Research Group of Peptide Chemistry, Eötvös Loránd University

Summary

GnRH-I ניאון שכותרתו סלקטיבי, -II ו -III נגזרים הם כלי אמין עבור מעקב וכימות ספיגת הסלולר שלהם. כתב יד זה מציג ניסויים כדי להמחיש, לכמת ולהשוות את היעילות הספיגה של conjugates GnRH אלה שורות תאים שונות.

Abstract

אנלוגים של GnRH הם moieties מיקוד יעיל ומסוגל לספק סוכני נגד סרטן באופן סלקטיבי לתוך תאים סרטניים ממאירים אשר מאוד קולטני GnRH מפורשת. עם זאת, ניתוח כמותי של ספיגת הסלולר 'אנלוגים של GnRH ואת סוגי התאים נחקרו מערכות אספקת סמי GnRH המבוסס מוגבלים בשלב זה. בעבר הציגו, ניאון שכותרתו סלקטיבי GnRH לי, -II ו -III נגזר לספק detectability הגדול, ויש להם תכונות כימיות מתאימות לניסוי לשחזור ויציב. גם מצאנו כי שיטות עַדכָּנִי המתאימות עם אנלוגים של GnRH שכותרתו אלה יכולים להציע מידע רומן על מערכות אספקת סמים מבוססים GnRH. כתב יד זה מציג כמה ניסויים פשוטים ומהירים לגבי ספיגת הסלולר של [D-ליס 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-ליס 6 (FITC)] - GnRH-II ו [ליס 8 (FITC)] - GnRH -III על EBC-1 (ריאות), את BxPC-3 (לבלב) ועל t ממאיר דטרויט-562- (הלוע)תאי umor. במקביל conjugates GnRH-FITC הללו, הרמה פני התא של קולטני GnRH-נבדקה גם על שורות תאים אלה לפני ואחרי טיפול GnRH ידי מיקרוסקופ סריקת ליזר confocal. ספיגת הסלולר של conjugates GnRH-FITC הייתה לכמת ידי מיון תא מופעל קרינה. בניסויים אלו הבדלים קלים בין אנלוגים של GnRH ואת ההבדלים עיקריים בין סוגי תאים נצפו. ההבדלים המשמעותיים בין שורות תאים מתואמים עם הרמה המובחנת של קולטני תא משטח GnRH-I. הניסויים הציגו לכלול שיטות מעשיות לדמיין, לכמת ולהשוות את היעילות הספיגה של conjugates GnRH-FITC בתוך הזמן- ואופן ריכוז-תלויים בתרביות תאים חסידות שונות. תוצאות אלו יכולות לחזות את יעילות מיקוד התרופה של conjugates GnRH על תרבית תאים הנתונה, ומציעות בסיס טוב עבור ניסויים נוספים בבדיקת מערכות אספקת סמים מבוסס GnRH.

Introduction

פפטיד מערכות מבוססות שיגור תרופות הפכו פיתוח מהיר תחום מבטיח בטיפול בסרטן על 1 בשנים האחרונות, 2. סוג קולטן גונדוטרופין אדם ההורמון משחרר לי (GnRH-IR) ממוקם בעיקר בבלוטת יותרת המוח אך הוא מופיע גם בכמה רקמות אחרות אשר אחראים עצמי רבייה 3. GnRH-IR מתבטא גם במספר רקמות סרטן, הקשורים או שאינם קשורים במערכת הרבייה 4, 5. הביטוי הגבוה של GnRH-IR בכמה תאים סרטניים ממאירים לעומת רקמות בריאות מספק הזדמנות עבור טיפול ממוקד 5, 6.

הורמון גונדוטרופין משחררים רב (GnRH) אנלוגים פותחו בעשורים האחרונים, אשר יכול לשמש מיקוד moietiesf "> 7, 8, 9. פפטידים אלה מסוגלים לספק סוכנים אנטי סרטניים עם סלקטיביות גבוהה לתוך תאים סרטניים ממאירים אשר על-Express 6 GnRH-IR. תרופות אנטי סרטניות מספר מצומדות GnRH עם סלקטיביות גבוהה ויעיל יותר מאשר מקביל unconjugated תרופה ללא תשלום דווחה 7, 8, 9.

פרסומים קודמים על פפטידים GnRH ואת הקולטנים שלהם דיווחו כי GnRH-IR ניתן להניח תצורות שונות אשר יש סלקטיביות שונה עבור GnRH אנלוגים 10. GnRH-IR משתנה מאוד יש מסלולי איתות מורכבים ומגוונים ניחן פעילות שונים נגד ליגנדים טבעיים ומלאכותיים שלהם 11. עובדות אלו הופכות חקירה של מערכות מבוססות GnRH מאתגרת. מצד שני, את y בעלי פוטנציאל טיפולי מבטיח. כמה ניסויים עם פפטידים radiolabeled GnRH דווחו בעבר 12, 13, 14, 15, אך ניסויים שבהם שכותרתו fluorescently אנלוגים של GnRH שימשו עדיין מוגבל. בעוד סימון הרדיואקטיבי מציע רגישות גבוהה, תיוג פלורסנט יש יתרונות נוספים, למשל טיפול הקל, ואת יכולת counterstain עם fluorophores השונה. שלושה אנלוגים של GnRH נפוצה אשר שימשו בהצלחה עבור משלוח הסמים הם [D-ליס 6] -GnRH-I, [D-ליס 6] -GnRH-II ו- GnRH-III, אך האפקטיביות של פפטידים אלה moieties מיקוד לעתים רחוקות לעומת 16, 17. מצד השני, תוצאות מניסויים נפרדים שבו תאים סרטניים שונים אנלוגים של GnRH שמשו מגוונת.

ntent "> בהתבסס על שיקולים אלה, התמקדנו הגידול מיקוד ופוטנציאל משלוח סמים של פפטידים GnRH אלה, מסונתז ובכך ואפיין את [D-ליס 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-ליס 6 (FITC ]) - GnRH-II ו [8 ליס (FITC)] - conjugates פפטיד GnRH-III 18 אנלוגים אלו מסומנים באופן סלקטיבי עם FITC על שרשרת הצד של ליס או D-ליס (פפטיד-FITC שלהם יחס 1: 1 בכל. המצומד). הרעיון היה כי תיוג פלורסנט סלקטיבי יכול להציע מידע רומן על פפטידים אלה, ומאפשר מעקב שלהם טוב וכימות אמין. יש הטיות אלה טיפול בטוח ויכולת גילוי אמין, אשר עושים את זה קל יותר להשוות יעילות מיקוד הגידול שלהם, ואת הקרנת סוגים רבים של תאים סרטניים ממאירים. אנו מקווים כי עד-כדי ניסויי תאריך עם conjugates פפטיד אלה יכולים לתרום להתפתחות של סרטן רומן מיקוד conjugates סמי GnRH, ולעזור לזהות זפת טיפולית חדשהמקבל גם כן.

כתב היד הנוכחי מדגים כמה ניסויים לשחזור מהיר גם עם conjugates GnRH-FITC. הביטוי שטח פני התא של GnRH-R הוא מצב מכריע לגבי ספיגת GnRH, ולכן אנחנו במקביל בודקים את הרמה פני התא של GnRH-IR על שורות תאים הנבדקות. אנו לנגד עיניו את conjugates GnRH-IR ו- GnRH-FITC ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (CLSM) לכמת את ספיגת הסלולר של conjugates GnRH-FITC באמצעות תא הקרינה מיון מופעל (FACS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תרביות תאים ריאגנטים

  1. שמירה על תרביות תאים במדיום המומלץ על ידי היצרן, בתוספת 10% (v / v) בסרום שור העובר ואנטיביוטיקה (בינוני מלא שנקרא). שמור את בקבוק culturing תא חממת אווירת humidified, 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. בצע את ההתפשטות confluency של תאים על ידי מיקרוסקופ ההפוך (באמצעות מטרת 10X לעומת שלב).
  2. כאשר התאים מגיעים confluency נאותה, להסיר את המדיום, ולשטוף את תרבות עם 2-3 מ"ל, סטרילי פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). הסר את PBS ולהוסיף 0.5 מ"ל, פתרון 0.25% טריפסין-EDTA סטרילית התרבות התא לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד תאים לנתק (כ -10 דקות).
  3. להשעות את התאים 3-4 בינוני מלא סטרילי מ"ל להפסיק טריפסין ולהעביר אותם לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי. צנטריפוגה התאים ב XG 150 עבור 4 דקות בטמפרטורת החדר (RT). בטל supernatant בזהירות להשעות את pellet 2-3 בינוני מלא סטרילי מ"ל.
  4. להוציא 100 μL של ההשעיה תא ומערבבים עם 100 μL 0.4% (V / m) trypan פתרון כחול, כדי להכתים את התאים המתים. טען 10 μL של תערובת זו לתוך hemocytometer ולקבוע את מספר תאי קיימא על ידי מיקרוסקופ ההפוך.
  5. לדלל את הכמות הנדרשת של השעית תא שהוכנה בשלב 1.3 עד 10 מיליליטר עם מדיום מלא סטרילי, המכילה 4 x 10 4 תאים / מיליליטר.
  6. הוסף 250 μL של השעית תא (מוכנות בשלב 1.5) לכל טוב (10 4 תאים / טוב) לשבע בארות של הכוס הראשונה השקופיות תחתונות 8-גם מיקרוסקופיות. השתמש שקופית זו בשיטה הספיגה GnRH.
  7. הוסף 250 μL של השעית תא (מוכנות בשלב 1.5) לכל טוב (10 4 תאים / טוב) לחמש בארות של השקופיות מיקרוסקופיות 8-גם השניות. שקופית זו תשמש בשיטת ביטוי GnRH-IR.
  8. הוסף 1 מ"ל של השעיה תא (מוכן בשלב 1.5) לכל טוב (4 x 10 4 תאים / טוב) לשבעה wells של צלחת 12-היטב. צלחת זה ישמש בשיטת כימות GnRH.
  9. בואו התאים לדבוק על שני השקופיות המיקרוסקופיות צלחת. דגירה אותם באינקובטור האווירה humidified, 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
  10. לאחר הדגירה לבדוק את התאים על ידי מיקרוסקופ ההפוך (באמצעות אובייקטיבי בניגוד שלב 10X). אם התאים בריאים מצורפים, המשך בביצוע השלבים הבאים.
  11. הכן 10 מ"מ GnRH-FITC פתרון המניות ב sulfoxide דימתיל (DMSO) מכל אחד משלושת conjugates 18. (השתמש ריכוזי דילול הבאות: 16.43 מיקרוגרם / μL [D-ליס 6 (FITC)] - GnRH-I, 16.97 מיקרוגרם / μL [D-ליס 6 (FITC)] - GnRH-II ו- 16.47 מיקרוגרם / μL [ליס 8 ( FITC)] - GnRH-III) שמור פתרונות מניות אלה במקום חשוך ב RT ולהשתמש אותם בתוך מספר שבועות.
  12. לדלל 1.7 μL כל אחד מהפתרונות המניה שלוש 10 מ"מ GnRH-FITC ב 1.7 בינוני מלא מ"ל. Shake הפתרונות הללו. (Thesדואר הם 10 מיקרומטר GnRH-FITC בטיפול התקשורת.) לדלל 150 μL כל אחד בינוני בטיפול שלוש 10 מיקרומטר GnRH-FITC ב 1.35 מ"ל בינוני מלא. Shake פתרונות אלה, כמו גם (אלה הם המדיום בטיפול 1 מיקרומטר GnRH-FITC).
    הערה: כל-FITC GnRH המכיל בינוני בטיפול צריך להיות מוגן מפני אור נגמר תוך כמה שעות.
  13. מחממים שש המדיום בטיפול GnRH-FITC (מוכן בשלב 1.12) ו -4 מ"ל בינוני מלא ל -37 מעלות צלזיוס.
  14. לדלל 3 μL של פתרון בדיקה ניאון 5 מ"מ (counterstain גרעיני המוזכרים רשימת חומרים) ב 3 מ"ל PBS עד 5 מיקרומטר. פתרון זה אמור להיות מוגן מפני אור, לשמור אותו ב RT ולהשתמש אותו תוך מספר שעות.

2. מיקרוסקופית סריקת לייזר Confocal (CLSM)

  1. שיטה ספיגה GnRH
    1. קח את השקופית המיקרוסקופית הראשונה מוכנה בשלב 1.6 ו פיפטה את המדיום המלא מפני כל אחד מהשבע היטב. הוסף 250 μL של Medi המלא שחומם מראשאממ לתוך הבאר הראשונה. השתמש באפשרות זו כביקורת שלילית. הוסף 250 μL של GnRH-FITC שחומם מראש בטיפול תקשורת (מ 1.13) לכל אחד משש הבארות הבאות (3 בארות עם 1 מיקרומטר ו -3 עם 10 מיקרומטר). דגירת השקופיות בתוך חממת אווירת humidified, 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות.
    2. פיפטה את המדיום מבאר כל ולשטוף את התאים עם 250 μL PBS. הוסף 250 μL של פתרון תיקון (10% נייטרלי שנאגרו פורמלין) לתוך זה היטב דגירה את השקופית ב RT, במשך 10 דקות.
    3. פיפטה את פתרון תיקון מכל טוב לשטוף את התאים עם 250 μL PBS. הוסף 250 μL של PBS המכיל 5 פתרון בדיקת ניאון מיקרומטר מוכן בשלב 1.14 לבאר כל דגירת השקופיות ב RT, במשך 10 דקות.
    4. פיפטה את פתרון בדיקת ניאון מכל טוב, לשטוף את התאים פעמים עם 250 μL PBS בזהירות. להוסיף 3-4 טיפות של הרכבה בינונית לתוך כל טוב, סוף סוף. שמור את השקופית בחושך ב RT, עד ההדמיה.
    5. שיטת ביטוי GnRH-IR
      1. קח את השקופית המיקרוסקופית 8-גם השני מוכן בשלב 1.7 ו פיפטה את המדיום המלא מפני כל אחד מחמש הבארות.
      2. הוסף 250 μL של בינוני מלא שחומם מראש לתוך הבאר הראשונה, להשתמש בשם זה כביקורת שלילית. הוסף 250 μL של בינוני מלא שחומם מראש לתוך הבאר השנייה מדי, להשתמש בזה כדי לבחון ביטוי GnRH-IR לפני טיפול GnRH.
      3. הוסף 250 μL כל אחד בתקשורת בטיפול השלוש שחוממו מראש 10 מיקרומטר GnRH-FITC לשלוש הבארות הבאות. להשתמש בבארות אלה כדי pretreat את התאים עם conjugates GnRH-FITC לפני בחינת ביטוי GnRH-IR. דגירת השקופיות בתוך חממת אווירת humidified, 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
      4. פיפטה את המדיום בטיפול מכל אחת משלוש הבארות אשר ישמש לבחון ביטוי GnRH-IR לאחר הטיפול GnRH ולשטוף בארות אלה עם 250 μL של בינוני מלא שחומם מראש. הוסף 250μL של שחומם מראש בינוני מלא לתוך כל אחת משלוש הבארות. דגירת השקופיות בתוך חממת אווירת humidified, 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
      5. פיפטה את המדיום מכל אחת חמש בארות לשטוף את התאים עם 250 μL PBS. הוסף 250 μL של תיקון פתרון זה לתוך זה היטב דגירה את השקופית ב RT, במשך 10 דקות.
      6. פיפטה את פתרון תיקון מכל טוב לשטוף את התאים עם 250 μL של PBS. הוסף 250 μL של PBS המכיל אלבומין 5% שור (BSA) פתרון חסימת לבאר כל דגירה שקופיות ב RT עבור 1 שעות.
      7. מדולל 10 μL של נוגדן ראשוני GnRH-IR ב 1 מ"ל PBS (1 ל -100 יחס). שמור את זה ב RT ולהשתמש אותו תוך מספר שעות.
      8. פיפטה את הפתרון החוסם BSA מבאר כל פרט הבקרה השלילית (גם ראשון). שוטפים את התאים עם 250 μL PBS (למעט הביקורת השלילית היטב). הוסף 250 μL של PBS המכיל נוגדן ראשוני GnRH-IR מוכן בשלב 2.2.7 לתוך EACגם שעות (למעט השליטה השלילית). דגירת השקופיות ב RT עבור 1 שעות, במקום חשוך.
      9. לדלל 2.5 μL של נוגדנים משני שכותרתו אלקסה -546 1.25 מ"ל PBS (1: 500 יחס).
        הערה: פתרון זה אמור להיות מוגן מפני אור, לשמור אותו ב RT ולהשתמש אותו תוך מספר שעות.
      10. פיפטה פתרונות מכל אחת חמש בארות לשטוף את התאים עם 250 μL PBS. הוסף 250 μL של PBS המכיל AF 546 נוגדנים משני שכותרתו מוכנה בשלב 2.2.9 לבאר כל אחד. דגירת השקופיות ב RT עבור 1 שעות בחושך.
      11. פיפטה את הפתרון מכל טוב לשטוף את התאים עם 250 μL PBS. הוסף 250 μL של PBS המכיל 5 פתרון בדיקת ניאון מיקרומטר מוכן בשלב 1.14 לבאר כל דגירת השקופיות עבור 10 דקות, ב RT.
      12. פיפטה את פתרון בדיקת ניאון מכל טוב לשטוף את התאים פעמים עם 250 μL PBS בזהירות. להוסיף 3-4 טיפות של תקשורת הרכבה לתוך כל טוב, לאחר מכן. שמור את השקופית כההב RT עד ההדמיה המיקרוסקופית.
    6. הַדמָיָה
      1. תמונה התאים על ידי מיקרוסקופ סורק לייזר confocal הפוכה (באמצעות טבילה אובייקטיבי שמן 63X)
        1. השתמש אורכי גל פליטת עירור / הבא. conjugates GnRH: 488/514 ננומטר, נוגדן שכותרתו Alexa 546: 488/546 ננומטר (שימוש רק עבור שיטת ביטוי GnRH-IR), בדיקה ניאון Draq5: 633/680 ננומטר.
        2. הגדר את הפרמטרים הדמיה באמצעות תאי בקרה שלילית. שימוש בפרמטרים האלה בתאים שטופלו תמונה (איור 3). Re-להתאים את פרמטרי הדמיה על כל שקופית מיקרוסקופית בתחילת הניתוח. תמונות כוונן ייצוא עם התוכנה המסופקת על ידי היצרן במידת הצורך.

    קרינה מופעלת 3. Cell מיון (FACS)

    1. שיטת כימות GnRH
      1. קח את הצלחת מוכנה בשלב 1.8 ו פיפטה את הבינוני המלא מבית EAch של שבע בארות. הוסף 1 מ"ל של מדיום מלאה שחומם מראש לתוך הבאר הראשונה. השתמש באפשרות זו כביקורת שלילית. הוסף 1 מיליליטר כל אחד מהשישה שחומם מראש בטיפול מדיה (3 בארות עם 1 מיקרומטר ו -3 בארות עם 10 מיקרומטר) לתוך שש הבארות הבאות. דגירה את הצלחת חממת אווירת humidified, 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות.
      2. פיפטה את המדיום מבאר כל. שוטפים את התאים פעמיים עם 2 מ"ל PBS בזהירות. הוספת 500 μL של פתרון טריפסין-EDTA לתוך כל בארות. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס עד תאי לנתק (כ -10 דקות).
      3. הוסף 1 מ"ל של מדיום מלאה לתוך כל טוב לעצור טריפסין. לנער את הצלחת. להשעות את התאים בעדינות עם טפטפת, ולהעביר את ההשעיה מבאר כל לתוך צינורות FACS. בצנטריפוגה צינורות ב XG 150 למשך 4 דקות, ב 4 ° C..
      4. יוצקים את supernatants בקפידה, עם מהלך אחד. הוספת 500 μL של PBS קר כקרח לתוך צינור אחד FACS בעדינות מחדש להשעות את התאים. שמור את הצינורות על קרח עד הסוףשל הניסוי.
    2. ניתוח וחישוב
      1. לנתח את התאים על ידי cytometry הזרימה. עבור עירור, השתמש לייזר באורך גל 488 ננומטר ארגון ו לגילוי להשתמש 530 ננומטר אורך גל. הגדר את זרימת cytometer פרמטרים על ידי הפעלת תאי בקרה שלילית. שימוש בפרמטרים אלה לנתח תאים שטופלו (איור 4 א). להעריך את הנתונים עם תוכנה של היצרן, לקבוע עוצמת פלורסנט חציון ערכי (MFI), ולחשב את הערכים MFI יחסית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תמונות מתקבלות על ידי מיקרוסקופ סריקת ליזר confocal (CLSM) להציע מידע מרהיב על הספיגה של conjugates GnRH-FITC על תרבית תאים הנתונה בתוך זמן ואופן ריכוז תלוי. במקביל conjugates GnRH-FITC אלה, הנוכחות של GnRH-IR על פני התא לאימות גם על ידי הניסוי CLSM. יתר על כן, באמצעות בדיקת ניאון מכתים DNA מרחיקה אדומה, אפשר counterstain הגרעינים של תאים מלבד GnRH ו GnRH-IR. עם זאת, בעוד תמונת confocal אינה ניתנת לכימות, "שיטת ספיגת GnRH" הפשוטה יכולה להעריך בקלות אם התאים שנבדקו מכילים כמות גבוהה יותר או נמוכה של conjugates GnRH-FITC. Conjugates GnRH-FITC מיושם, הריכוזים שלהם, ואת הזמן של הטיפול משתנים לפי שיטה זו, על פי צורך. כפי שניתן לראות בתרשים 1 תאים סרטניים שונים מכילים רמות שונות של GnRH-FITC באופן תלוי ריכוז. "שיטת ביטוי GnRH-IR" המתקדמת מתארת ​​את להדמיה של GnRH-IR פני תא על ידי immunocytochemistry, לפני ואחרי טיפול GnRH-FITC. בחלקו הראשון של שיטה זו (לפני הטיפול GnRH-FITC), אנו לחזות GnRH-IR ידי immunocytochemistry, ללא טיפול GnRH-FITC. בחלקו השני של שיטה זו (לאחר הטיפול GnRH-FITC), אנחנו מתייחסים תאים עבור H 1 עם 10 מיקרומטר GnRH-FITC. לאחר הטיפול, אנו דגירת התאים בינוניים מלא ל 1 h נוסף ולדמיין GnRH-IR ידי immunocytochemistry. כפי שניתן לראות בתרשים 2A, תאים סרטניים שונים מציגים רמות שונות של GnRH-IR על פני השטח שלהם לפני הטיפול GnRH-FITC. כפי שניתן לראות בתרשים 2B, לאחר הטיפול GnRH-FITC, את GnRH-IR לבטא בתאי לשמור (EBC-1) או עלייה (דטרויט-562) GnRH-IR ברמה על הקרומים שלהם. בשלב זה, יש לציין כי אישרנו בעבר כי BxPC-3 תאים גם להביע GnRH-IR, אבל לא להציג את זה על הממברנה שלהם 18. ניתן דמיינו GnRH-IR בתוך התאים BxPC-3 על ידי immunocytochemistry אם הם permeabilized הקרומים שלהם. תופעה זו מסבירה את היעילות הספיגה GnRH יחסית נמוכה של תאי BxPC-3. בהתבסס על הצהרה אלה אנו מתמקדים רק על-IR GnRH פני התא כאן. השוואת איור 1 איור 2 מאשרת כי רמת-IR GnRH פני התא בקורלציה עם כמות GnRH-FITC בתאים המתאימים. יתר על כן, איור 3 ג מבהיר כי GnRH-FITC מופנם לתאים בגלל הלוקליזציה של GnRH-FITC מופרדת האות של פני תא GnRH-I-Rafter 1 h טיפול GnRH-FITC. אנו מסיקים כי "שיטת ביטוי GnRH-IR" תומכת המידע המתקבל "שיטת ספיגת GnRH".

חשוב להשתמש קבוצה טובי-הסתגלותטינג במהלך ההדמיה. כמו באיור 3A על אורך גל הפליטה של FITC (514 ננומטר) ואת הנוגדנים משני שכותרתו fluorophore (546 ננומטר), תאי בקרה השליליים המטופל יש גם autofluorescence קלה. קרינה בלתי רצויה זו יכולה לספק תוצאות חיוביות כוזבות. ובכך, בתחילת ההדמיה חשוב להתאים את עוצמת הקרינה על תאי השליטה כפי שמוצגת באיור 3 ב. צפוי כי אחד יהיה להתבונן איתות ברורה של הגרעינים על אורך גל הפליטה של ​​גרעיני הכתם (680 ננומטר), עם אות הניאון על שני אורכי גל האחרים הוא רק גלוי או קרוב לאפס. כל דגימות תאים האחרות צריכות להיות צלמו עם פרמטרים טובי-הסתגלות וקבועים אלה. בדרך זו, האות שנצפה 514 ננומטר נגזר האות של FITC-GnRH בלבד, ב 546 ננומטר מן האות של GnRH-IR במיוחד ב -680 ננומטר מן האות של גרעינים כפי שמוצג באיור 3C. תמונות יכולות להיות fine-מכוון לאחר ההדמיה באמצעות תוכנה במידת צורך.

Cytometry זרימה ניסויים להציע מידע לכימות על כמות conjugates GnRH-FITC אשר נלקחו על ידי התאים. Conjugates GnRH-FITC מיושם, הריכוזים שלהם ואת הזמן של הטיפול גם משתנה לפי שיטה זו, על פי צורך. התאים טופלו משמשים בקרה שלילית כמו להתאמת זרימת cytometry פרמטרים ולקבוע עוצמת פלורסנט החציוני שלהם (MFI) בתחילת הניתוח. כפי שמודגם על איור 4A MFI נקבע עבור כל דגימה באמצעות אותם הפרמטרים. הערכים MFI ביחס מחושבים מן הערכים MFI באמצעות נוסחת חישוב באיור 4 ב. בעזרת נוסחא זו, ערך MFI היחסי של תאי שליטה היא תמיד אפס. הערכים ביחס MFI מחושב לכמת את עוצמת ניאון של conjugates GnRH-FITC, ואלה עומדות ביחס ישר על שלהםריכוזי verage בתאים. כמו באיור 5, עם נתונים אלה, ניתן להדגים ולהשוות איך ביעילות תאים סרטניים אלה לקחת את conjugates GnRH-FITC. לפיכך, התוצאות שהושגו על ידי זרימת cytometry להשלים ולתמוך תמונות שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ confocal.

איור 1
איור 1: תמונות Confocal של מטופל ואת [ליס 8 (FITC)] - GnRH-III מטופלים תאים סרטניים. כתם כחול: גרעינים; כתם ירוק: [ליס 8 (FITC)] - GnRH-III. תמונות אלה מתקבלים באמצעות "שיטת ספיגת GnRH". (א) אותות הקרינה של תאים שלא טופלו מותאמים כמעט לאפס ב 514 ננומטר (ירוק) על כל שורת תא. חללית פלורסנט מרחיק אדום Draq5 משמשת להכתים את הגרעינים של תאים. (ב) לאחר החלת ההגדרות, סרטן הריאות EBC-1 ואת האדם דטרויט-562תאי הלוע סרטן להראות לזיהוי, אבל אות נמוכה ב 514 ננומטר (ירוק) לאחר 5 טיפול h עם 1 מיקרומטר [8 ליס (FITC)] - GnRH-III. (ג) לאחר טיפול 5 שעות עם 10 מיקרומטר [ליס 8 (FITC)] - GnRH-III, כל אחד שורות תאי השלוש אות נוכחית ניאון גבוה. תוצאות מניסוי זה מראות כי BxPC-3 תאים בסרטן הלבלב לקחו GnRH-FITC עם יעילות נמוכה בהרבה בהשוואה לקווי שני התאים האחרים ניתנים למיקוד בקלות על ידי הטיות GnRH. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: תמונות Confocal של שטח פני התא GnRH-IR לפני ואחרי [6 D-ליס (FITC)] - GnRH-I הטיפול. כתם כחול: גרעינים; כתם ירוק: [D-ליס 6 (FITC)] - GnRH-I; כתם אדום : GnRH-IR. תמונות אלה נוצרות באמצעות "שיטת ביטוי GnRH-IR". (א) לפני טיפול GnRH-FITC, תאי BxPC-3 אין GnRH-IR על הממברנה, אולם EBC-1 תאי תערוכה גבוהים, ותאי דטרויט-562 מסוימים להפגין רמה מתונה של-IR GnRH. (ב) לאחר טיפול GnRH-FITC, תאים BxPC-3 עדיין אינם מציגים GnRH-IR על הממברנה שלהם. EBC-1 תאים לשמור ביטוי GnRH-IR ו- GnRH-FITC שלהם מופיע בתוך מהם. תאי דטרויט-562 נראים מפגין רמה גבוהה יותר של GnRH-IR לאחר טיפול והם תופסים GnRH-FITC, כמו גם. ניסוי זה מגלה כי סוגים שונים של תאים סרטניים ממאירים מפגינים רמה שונה של-IR GnRH על פני השטח שלהם, ואת ספיגת GnRH-FITC נראה כקשור קשר הדוק הביטוי GnRH-IR פני התא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

_content "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 3
איור 3: תמונות Confocal של תאים סרטניים ריאות EBC-1. כתם כחול: גרעינים; כתם ירוק: [ליס 8 (FITC)] - GnRH-III; כתם אדום: IR-GnRH. תמונות אלה מבוצעות על ידי "שיטת ביטוי GnRH-IR". (א) תאי שליטה שליליים מטופל (ללא GnRH-FITC ו אלקסה 546) יש קרינה לזיהוי ו רצויה ב 514 ננומטר ו 546 ננומטר בעת שימוש בהגדרות המכשיר על-מוגברות. (ב) שינוי הגדרות המכשיר על תאי בקרה שלילית מטופל, ירוק (514nm) ואדום (546 ננומטר) אות הוא קרוב לאפס. (C) פרמטרים מותאמים לגרום איתותים ברורים ואמינים עבור GnRH-FITC מטופלים GnRH-IR התאים מוכתם. לאחר טיפול GnRH-FITC, לוקליזציה של GnRH-FITC (ירוק) מופרדת-IR GnRH פני התא (אדום).529fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: הערכת תזרים cytometry נתונים. (א) היסטוגרמה של המטופל ותאי דטרויט-562 מטופלים. הערכים MFI של דגימות תאים נקבעים מעת ההיסטוגרמה. ציר ה- X מתאר את עוצמת הניאון של תאים, ואת ציר y מתאר את סעיפי האישום. הקו השחור: MFI לפני הטיפול GnRH-FITC; קו מקווקו בירוק: MFI לאחר הטיפול 5 שעות עם 1 מיקרומטר [ליס 8 (FITC)] - GnRH-III; אדום מקווקו קו: MFI לאחר הטיפול 5 שעות עם 10 מיקרומטר [8 ליס (FITC)] - GnRH-III. (ב) נוסחת חישוב ערכים MFI יחסית. הערכים MFI ביחס מחושבים מן הערכים MFI. באמצעות חישוב זה, ערך MFI היחסי של מדגם קבוצת הביקורת הוא תמיד אפס. relat ערכי ive MFI של דגימות מטופלים מייצגים את סכום conjugates GnRH-FITC אשר נמצא בתוך התאים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: הערכים MFI יחסית של תאים סרטניים לאחר טיפול 5 שעות עם 1 מיקרומטר של conjugates GnRH-FITC. ערכי MFI יחסית ניתנים להשוואה ולהגדיר כיצד סוגי התאים הנתונים ביעילות יכולים לקחת עד אנלוגים של GnRH. GnRH-IR שאינו מפגין תאים BxPC -3 להכיל רק עקבות של אנלוגים אלה GnRH. The-IR GnRH לבטא בתאי סרטן ריאות EBC-1 מכיל מתונה לבין תאים סרטניים הלוע דטרויט-562 מכילים כמות גבוהה של אנלוגים של GnRH. תוצאות מוצגות כממוצע ± SD, N = 3."_blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הניסויים שתוארו במסמך להשתמש אנלוגים של GnRH שכותרתו סלקטיבי עבור חסיד ההקרנה בתרביות תאים במבחנה. מיקרוסקופיה Confocal וזרימת cytometry שיטות יכולות לשמש למעקב לכימות ספיגת הסלולר של conjugates GnRH-FITC אלה בתוך זמן ואופן ריכוז תלוי. יש ניסויים אלה השלבים הקריטיים הבאים: 1) לשמור על תרבית תאים סטריליים, בריאה; 2) פפטידים GnRH חייבים להיות באיכות גבוהה; 3) ריכוזים סבירים פעמי דגירה חייבים להיות מלווה; 4) צעדים לטיפול כביסה; 5) טובי-הסתגלות גדרות מכשירות.

תאים נשמרים המדיום המומלץ על ידי היצרן בתוספת 10% (V / V) בסרום שור עובר ואנטיביוטיקה (בינונית מלא). תאים צריכים להיות כל הזמן והטיפול בה סביבה סטרילית עד הטיפול השלבים (עם conjugates GnRH-FITC). לפני הניסויים, לבדוק את התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. הם צריכים להיות בריאים, מצ"ב חייב להגיע בכמות הנדרשת.

חשוב להשתמש פפטידים GnRH עם איכות וטוהר גבוהה. אנחנו מסונתזים פפטידים אלה וטהרנו אותם מעל 98% 18. הפפטיד יכול להיות מאוחסן ב -25 ° C במקרר כאבקה lyophilized. 10 מ"מ GnRH-FITC פתרונות מניות ב DMSO צריך להישמר במקום חשוך בטמפרטורת החדר ומשמש בתוך כמה שבועות. חקרנו את היציבות של conjugates אלה ומצא כי הם סטאבילה ב DMSO ועוצמת הקרינה שלהם נשמרות לאחר 1 חודש אחסון נאות. הריכוז של conjugates GnRH-FITC ואת הזמן של הטיפולים משתנים בניסויים אלה, אשר מציעים יתרונות גדולים, אך עם מגבלות מסוימות (ראה להלן). הריכוזים שיושמו פעמי דגירה בפרוטוקול זה הם המלצות בלבד, אבל הם מספקים בסיס טוב עבור הניסויים הראשוניים.

ניסויים CLSM דורשים לנתקשלבי כביסת al. פעולות אלה אמורות להתבצע בזהירות. אל תעביר את נוזלים ישירות על התאים. במקום זאת, להשתמש בצד או בפינה של בארות למטרה זו. זה יכול למזער שטיפה לסרוגין לאבד את התאים הדבקים. מומלץ גם להימנע מאור שמש ישיר במהלך הניסוי כולו, כפי שהוא יכול להוריד את רמת רגישות דגימות הניאון (אפקט photobleaching). שמור את דגימות מטופלים במקום חשוך או מכוסה בפיסת נייר אלומיניום במהלך הניסוי. בהתבסס על ממצאים קודמים, הבחנו כי ריכוז DMSO הסופי בתקשורת בטיפול להחיל זניח (0.1% (V / V) DMSO בתקשורת בטיפול 10 מיקרומטר) אין כל השפעה על תוצאות, ובכך בינוני מלא DMSO סביבה נקייה לגמרי מתאים גם כביקורת שלילית.

חשוב להשתמש בפרמטרים מכשיר טובי-הסתגלות במהלך הניסויים CLSM ו FACS. פרמטרים אלה צריך לכייל מחדש על כל סוג תא, לפני שתי הגישות. בניסוי CLSM, סיעוצמת gnal של תמונות confocal תלוי בפרמטרים הבאים: עוצמת הלייזר, רווח גלאי לקזז, וגודל חריר. כאשר התאמת הפרמטרים הללו, להשתמש בכוח לייזר הנמוך ביותר לייצר דימוי מקובל ולהימנע photobleaching. הגדר את פרמטרי ההדמיה להתאים את קרינת הרקע של תאי בקרה שלילי בלא כתם כמעט לאפס (איור 3 ב). תמונת תאים שטופלו עם פרמטרים המותאמים אלה, כדי למנוע תוצאות חיוביות כוזבות. אותות נוספים הנפלטים בתאים שטופלו ב 514 ננומטר ו 546 ננומטר להכיל את המידע הנדרש על GnRH או-IR GnRH. צעדים אלה דורשים ניסיון בניסויים CLSM. בניסוי FACS, ליצור פיזור עלילה סטנדרטית קדימה פיזור בצד (בקנה מידה ליניארי) ומתחים להגדיר כדי להתאים את אוכלוסיית תא החי הראשית באמצע העלילה. צייר באזור סביב תאים חיים. צור היסטוגרמה, להגדיר abscissa לתעל אחד (FL1-530 ננומטר, סולם לוגריתמים) ולהגדיר באזור שהוגדר בעבר כשערעבור היסטוגרמה זו. גדר מתח FL1 להביא את האות של תאי שליטה שליליים בלא כתם מתחת לגיל 10 1 (איור 4 א). לנתח תאים שטופלו פרמטרים מותאמים אלה.

יתר על כן, חשוב לבדוק את מצב mycoplasma של תרביות תאים מעת לעת. מבחנים שונים זמינים למטרה זו. במקרה של חיוביות mycoplasma, להשליך תאים ולהתחיל לעבוד עם תרבות חדשה. מומלץ להשתמש בתערובת אנטיביוטיה במדיום התרבות אשר מותאם במיוחד כדי למנוע mycoplasma. הריכוז היישומית של conjugates GnRH-FITC, ואת הזמן של טיפולים משתנים בניסויים אלה, אולם החלה בריכוזים נמוכים וזמני דגירה קצרים עלולים לגרום אותות חלשים מדי עבור גילוי קרינה.

כאשר הדמיה-IR GnRH במקביל אנלוגים של GnRH, ריכוז GnRH-FITC גבוה מומלץ (10 מיקרומטר הוא אופטימלי). סיבת הריכוז הגבוהזה זמן דגירה הקצר (1 שעה) ואת אות הקרינה הגבוהה יחסית של הנוגדן שכותרתו לעומת conjugates GnRH-FITC. מצד השני, חפיפת קטין בין שתי פליטות צבע פלואורסצנטי (514 ננומטר 546 ננומטר) נמצאת, אשר מתרחשת רק עם 546 ננומטר והוא נגזר מן האות של conjugates GnRH-FITC. עם זאת, את אות הניאון יחסית הגבוהה של אלקסה 546 והפרמטרים טובי-הסתגלות יכולה למזער את האפקט הזה, כפי שמודגם באיור 3. פתרון אפשרי נוסף כדי למנוע את החפיפה, הוא להחיל נוגדן הנקרא משני אשר יש גל עירור שונה ו / או ספקטרום פליטה נפרד טוב יותר לעומת FITC (אם הפרמטרים הטכניים CLSM לאפשר זאת). אפשרות זו מציעה יתרון גדול עבור שיטת CLSM, המאפשרת באמצעות בדיקות ניאון אופציונליות במקביל conjugates GnRH-FITC. לדוגמה, בדיקות ניאון חלופיות אלה יוכל לשמש עבור counterstaining אברונים אחרים לפי הצורך.

ריכוז היישומית של conjugates GnRH-FITC יש את המגבלות הבאות. מגבלת ריכוז מרבית של conjugates GnRH-FITC מבוססת על המסיסות שלהם 18. ערכים אלה הם באים ב PBS בטמפרטורת חדר: GnRH-I: 90 מיקרומטר; GnRH-II: 40 מיקרומטר; GnRH-III: 200 מיקרומטר. מצד השני, בניסויים קודמים אנחנו אמורים כי ספיגים של פפטידים GnRH אלה יכולים להתבצע על ידי קולטנים אחרים מאשר קולטני GnRH-I אדם; ספיגה זה חשוב ומשמעותי יותר בריכוזים גבוהים (מעל 10 מיקרומטר) 18. מגבלת זיהוי הנמוכה של conjugates GnRH-FITC מבוססת על מגוון פרמטרים, אבל במסגרות אידיאלית הוא כ 1 מיקרומטר לניסויי CLMS. מצאנו זרימת cytometry מציעה רגישה יותר טוב מיקרוסקופיה confocal. בהגדרות אידיאליות, מגבלת כימות של conjugates GnRH-FITC יכולה להיות נמוך מ -1 מיקרומטר. המגבלה של זיהוי או כימות יכוללהיות שונה בכל ניסוי, כי הם תלויים על זמן סוג דגירת תא. שים לב הנתונים המתקבלים על ידי FACS הוא יותר אמין יותר מאשר CLSM, מכיוון שהיא מאתרת אלפי תאים לדגימה ואת האות של תאים הממוצע מחושב. עם זאת, בפרוטוקול, FACS אינו מספק מידע על לוקליזציה הסלולר של conjugates GnRH-FITC והביטוי פני התא של GnRH-IR. בהתבסס על שיקולים אלה אנו מסיקים כי, את CLSM וניסויי FACS יש יתרונות ברורים, והם משלימים אחד את השני. מצד השני, ניתוח תמונה תכול גבוה יכול להיות מעניין אלטרנטיבה טובה עבור FACS וניתוח CLSM.

לסיכום, הנתונים שהתקבלו מניסויים אלה מאשרים כי כל אחד משלושת conjugates GnRH-FITC יכול להיכנס לתאים המבטאים פני התא-IR GnRH. יש אנלוגים של GnRH אלה אונות מיקוד דומות באותו הריכוזי. עם זאת, רמת GnRH-IR על פני השטח של פח שונהבתאי סרטן הוא משתנה מאוד. תוצאות מחושבות מנתוני ניתוח תזרים cytometry מאפשרות השוואה של שורות תאים או אנלוגים של GnRH. במקביל, התמונות המתקבלות על ידי מיקרוסקופ confocal יכול לחשוף את רמת הביטוי GnRH-IR פני התא ולאשר כי conjugates אלה הן הפנימו לתוך התאים. בהתבסס על תוצאות אלו, אפשר לאשר כי הניסויים הציגו לכלול שיטות מעשיות ומשתנות החקירה של מערכות שיגור תרופה המבוססת GnRH ומציעים בסיס טוב עבור ניסויים נוספים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EBC-1 JCRB Cell Bank JCRB0820 Human lung squamous cell carcinoma
BxPC-3 ATCC CRL-1687 Human pancreatic adenocarcinoma
Detroit-562 ATCC CCL-138 Human pharyngeal carcinoma
RPMI-1640 Medium with L-glutamine Lonza BE12-702F Culture medium for BxPC-3 cells
Eagle's Minimum Essential Medium Lonza BE12-611F Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0.1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells
Fetal Bovine Serum Euro Clone ECS0180L Complements the culture medium
MycoZap Plus-CL  Lonza VZA-2012 Complements the culture medium (antibiotics)
Standard Line Cell Culture Flasks VWR 10062-872 Provide consistent, sterile growth environment for cells
Trypsin-EDTA Mixture  Lonza BE17-161E Remove attached cells
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza BE17-516F Solvent
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418-100ML Solvent
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061 Used to counting cells
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I made by us - Purity ≥98% (HPLC)
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II made by us - Purity ≥98% (HPLC)
[Lys8(FITC)]-GnRH-III made by us - Purity ≥98% (HPLC)
glass bottom 8-well microscopic slide Ibidi 80826 Use in CLSM experiment
Corning Costar cell culture plate, 12 well Sigma-Aldrich CLS3513-50EA Use in FACS experiment
Fixing solution (10% neutral buffered formalin) Bio-Optica 01V60P Fix adherent cells
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-10G Prevent the nonspecific binding of the antibodies
GnRHR Antibody Proteintech 19950-1-AP Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors
Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate Thermo Fisher Scientific A11035 Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody
Fluorescent probe solution (Draq5) Thermo Fisher Scientific 62254 Counterstain nuclei
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML Use in CLSM experiment, preserving fluorescence
Inverted microscope Elektro-Optika Ltd.  Alpha XDS-2T Check the phenotype and confluency of cell cultures
Inverted confocal laser scanning microscope Zeiss LSM-710 Use in CLSM experiment
Flow cytometer BD Biosciences BD FACSCalibur Use in FACS experiment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11 (2016).
  2. Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
  3. Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K. GnRH in non-hypothalamic reproductive tissues. Anim Reprod Sci. 88 (1-2), 95-113 (2005).
  4. Schally, A. V., et al. Hypothalamic hormones and cancer. Front Neuroendocrinol. 22 (4), 248-291 (2001).
  5. Limonta, P., et al. GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies. Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).
  6. Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances. J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).
  7. Manea, M., et al. In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice. Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).
  8. Argyros, O., et al. Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth. Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).
  9. Karampelas, T., et al. GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery. Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).
  10. Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -L. Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling. Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).
  11. Millar, R. P., et al. Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).
  12. Olberg, D. E., et al. Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression. Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).
  13. Zoghi, M., et al. Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging. Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).
  14. Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging. Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).
  15. Nederpelt, I., et al. Characterization of 12 GnRH peptide agonists - A kinetic perspective. Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).
  16. Szabo, I., et al. Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting. J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).
  17. Leurs, U., et al. GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate. Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).
  18. Murányi, J., et al. Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells. J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).

Tags

Cancer Research גיליון 121 ממוקד טיפול סרטן תאים סרטניים המצומד מיקרוסקופיה confocal GnRH FITC FACS CLSM
<em>במבחנה</em> הדמיה וכימות של יעילות מיקוד והתרופות של אנלוגים של GnRH שכותרתו fluorescently
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murányi, J., Varga, A., Gurbi,… More

Murányi, J., Varga, A., Gurbi, B., Gyulavári, P., Mező, G., Vántus, T. In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues. J. Vis. Exp. (121), e55529, doi:10.3791/55529 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter