Summary
Seçici etiketli floresan GnRH-I -II ve -III türevleri güvenilir izleme araçları ve bunların hücresel alımı miktarının vardır. Bu yazıda, görselleştirmek ölçmek ve çeşitli hücre hatlarında Bu GnRH konjugatların alım verimliliğini karşılaştırmak için deneyler getirmektedir.
Abstract
GnRH analogları etkili hedefleme parçaları ve seçici kötü huylu tümör hücrelerinin hangi yüksek ekspres GnRH reseptörleri içine antikanser ajanları teslim edebiliyoruz. Bununla birlikte, GnRH analogları 'hücre içine kabul edilmesine kantitatif analizi ve GnRH-bazlı ilaç verme sistemlerinde incelenmiştir hücre tipleri şu anda sınırlıdır. Daha önce kişiye, seçici olarak etiketli floresan GnRH I-II ve III türevleri, büyük bir tespit edilebilirliğini sağlar ve tekrarlanabilir ve sağlam deneyler için uygun kimyasal özellikleri vardır. Biz de bu etiketli GnRH analogları uygun up-to-date yöntemleri GnRH-tabanlı ilaç dağıtım sistemleri hakkında yeni bilgiler sunabilir bulundu. GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] - - GnRH-II ve [Lys 8 (FITC)] - GnRH Bu yazının [D-Lys 6 (FITC)] hücresel alımında ilgili bazı basit ve hızlı deneyler tanıttı EBC-1 (akciğer) üzerine -III, BxPc-3 (pankreas) ve Detroit-562- (yutak) malign tumor hücreleri. Bu GnRH-FITC eşlenikleri ile paralel olarak, GnRH-I reseptörlerinin hücre yüzeyi seviyesi de daha önce ve konfokal lazer tarama mikroskobu ile GnRH tedaviden sonra, bu hücre hatları üzerinde incelenmiştir. GnRH-FITC ile konjügatlarının hücreye kabul floresans ile aktive edilmiş hücre sıralama ile nicelendirildi. Bu deneylerde, GnRH analoglarının ve hücre türleri arasında önemli farklılıklar arasında küçük farklılıklar gözlendi. hücre çizgileri arasında önemli farklılıklar, hücre yüzeyi GnRH-I reseptörlerinin onların farklı düzeyde ilişkilidir. kişiye deneyler, görselleştirmek ölçmek ve çeşitli yapışık hücre kültürleri üzerinde zamana ve konsantrasyona bağlı bir şekilde GnRH FITC konjugat alımı verimi karşılaştırma pratik yöntemler içerir. Bu sonuçlar verilen hücre kültürü üzerinde GnRH konjugatları ilaç hedefleme verimini tahmin ve GnRH-tabanlı ilaç taşıyıcı sistemlerin incelenmesi daha fazla deneyler için iyi bir temel sunabilir.
Introduction
Peptid bazlı hedeflenmiş ilaç taşıyıcı sistemler son birkaç yıldır 1, 2 üzerinde kanser tedavisinde hızlı bir gelişen ve gelecek vaat eden bölgeyi haline gelmiştir. İnsan Gonadotropin salgılatıcı hormon reseptör tip I (GnRH-IR) öncelikle hipofiz bezi bulunur ama aynı zamanda kendini üreme 3 sorumlu diğer bazı dokularda mevcut mesafesindedir. GnRH-IR üreme sistemi 4, 5 ile ilgili ya da ilgisiz, kanserli dokuların bir dizi olarak ifade edilmektedir. Sağlıklı dokular ile karşılaştırıldığında birçok habis tümör hücreleri üzerindeki GnRH-IR yüksek ifadesi hedeflenmiş tedavinin 5, 6 için bir fırsat sağlar.
Birçok gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH) analogları hedefleme parçaları olarak kullanılabilir, son birkaç on yıl içinde geliştirilmiştirf "> 7, 8, 9. Bu peptidler habis tümör hücrelerine yüksek seçicilikle antikanser ajanları vermek için mümkün olan aşırı ifade GnRH-IR 6. tekabül eden konjuge olmayan daha yüksek seçicilik ve daha iyi bir verim ile birkaç GnRH bağlı anti-tümör ilaç serbest ilaç, 8, 9 7 bildirilmiştir.
GnRH peptidlerinin ve bunların reseptörleri ile ilgili önceki yayınların GnRH İR GnRH 10 analogları için farklı seçiciliğe sahip çeşitli konfigürasyonlar varsayabiliriz bildirmiştir. Son derece değişken GnRH İR karmaşık ve çeşitli sinyal yolları doğal ve yapay ligandlar 11 karşı farklı bir aktivite ile donatıldığı şaşırtıcı şekilde bulunmuştur sahiptir. Bu gerçekler GnRH-tabanlı sistemlerin incelenmesi zorlu olun. Öte yandan, y umut verici terapötik potansiyele sahiptir. Radyo işaretli GnRH peptit ile yaptığı deneyler, daha önce burada floresan etiketli GnRH analogları kullanıldı, 12, 13, 14, 15, fakat deneyler rapor edilmiştir de sınırlıdır. Radyoaktif etiket yüksek hassasiyet sağlarken, floresan etiketleme birçok avantaj, örneğin, daha kolay kullanım ve farklı fluorophores counterstain yeteneğine sahiptir. Başarılı bir şekilde ilaç iletimi için kullanılmıştır Üç yaygın GnRH analogları -GnRH-l, [D-Lys 6] -GnRH II ve GnRH-III fakat hedefleme parçaları olarak bu peptidlerin etkinliği [6, D-Lys] olan nadiren, 17 16 karşılaştırdık. Diğer taraftan, farklı kanser hücreleri ve GnRH analogları kullanılmış olan ayrı deneylerden elde edilen sonuçlar farklı.
Bu düşünceler dayanarak ntent ">, bu GnRH peptidler hedef tümör ve ilaç dağıtım potansiyeli üzerinde duruldu ve bu suretle de sentezlenen ve [D-Lys 6 (FITC)] karakterize - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] - GnRH II ve [Lys 8 (FITC)] - GnRH III peptid birleşikleri 18 Bu analoglar seçmeli olarak Lys ya da D-Lys (peptid-FITC oranı yan zinciri 1 FITC ile etiketlenmiştir: her biri 1. konjuge). Fikir seçici floresan etiketleme bu peptitler hakkında yeni bilgiler sunmak ve onların iyi izleme ve güvenilir ölçümü sağlar ki oldu. bu konjügatlar daha kolay onların tümör hedefleme verimini karşılaştırmak yapmak güvenli kullanım ve güvenilir tespit edilebilirliğini var, ve malign tümör hücrelerinin çok sayıda türde tarama. Biz up-to bu peptid konjugatları ile tarih deneyleri GnRH-ilaç konjugatları hedefleyen yeni kanser gelişimine katkıda ve yeni tedavi tar tanımlamak için yardımcı olabilir umuyoruzde alır.Mevcut el yazması GnRH-FITC konjugatları ile bazı iyi tekrarlanabilir ve hızlı deneyler gösteriyor. GnRH-R'nin hücre yüzey ifadesi bu nedenle eş zamanlı olarak test edilen hücre hatları üzerinde GnRH-IR, hücre yüzeyi seviyesine araştırıldı GnRH alımı ile ilgili belirleyici bir durumdur. Bu konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile GnRH IR ve GnRH-FITC birleşikleri görsel ve floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) kullanılarak GnRH-FITC ile konjügatlarının hücreye kabul ölçülmüştür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hücre Kültürleri ve Reaktiflerin hazırlanması 1.
- % 10 (h / h) cenin sığır serumu ve antibiyotiklerin (denilen tam ortam) ile desteklenmiş üreticinin tavsiye edilen aracı madde içinde hücre kültürleri, koruyun. 37 ° C'de, nemlendirilmiş,% 5 CO2 atmosferi inkübatöründe hücre kültürü şişesi tutun. ters mikroskop ile hücrelerin çoğalmasını ve konfluent takip (10X faz kontrast objektifi kullanılarak).
- Hücreler yeterli konfluent ulaştığında, orta kaldırmak ve 2-3 mL, steril fosfat tamponlu tuz (PBS) ile kültür yıkayın. PBS çıkarın ve hücre kültürü 0.5 mL steril% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi eklenmekte ve hücreler (yaklaşık 10 dakika) ayrılana kadar 37 ° C'de inkübe edin.
- Tripsin durdurmak ve steril bir santrifüj tüpü içine aktarmak için 3-4 ml steril tam orta hücreleri Askıya. oda sıcaklığında 4 dakika boyunca (RT) 150 x g'de santrifüjleyin hücreleri. dikkatle Süpernatantı atın ve p askıya2-3 ml steril komple ortam içinde ellet.
- hücre süspansiyonu 100 mcL çıkarın ve ölü hücreleri leke, 100 mL% 0.4 (m / V) tripan mavisi çözüm ile karıştırın. Yük hemasitometre içine bu karışımın 10 uL ve ters mikroskopla yaşayan hücrelerin sayısını belirlemek.
- 4 x 10 4 hücre / ml ihtiva eden steril bir tam ortam ile 10 mL adım 1.3 hazırlanan hücre süspansiyonu gerekli miktarda, seyreltilir.
- Ilk cam alt 8-de mikroskopik slayt yedi kuyu içine çukur başına (adım 1.5 hazırlanmış) hücre süspansiyonu 250 mcL ekleyin (10 4 hücre / çukur). GnRH alım yönteminde bu slaytı kullanın.
- İkinci 8-de mikroskopik slayt beş kuyu içine çukur başına (adım 1.5 hazırlanmış) hücre süspansiyonu 250 mcL ekleyin (10 4 hücre / çukur). Bu slayt GnRH İR sentezleme yöntemi kullanılacaktır.
- Ekle 1 oyuk başına (1.5 adım hazırlandı) ml hücre süspansiyonu (4 x 10 4 hücre / çukur), yedi wel halinde12 oyuklu bir plakanın mi. Bu plaka, GnRH miktar yönteminde kullanılacaktır.
- Hücreler iki mikroskobik slaytlar ve plaka üzerinde bağlı olsun. 48 saat boyunca 37 ° C'de, nemlendirilmiş,% 5 CO2 atmosferi inkübatöründe inkübe.
- Kuluçkadan sonra (10X faz kontrast objektif kullanarak) inverted mikroskop hücreleri kontrol edin. hücreleri sağlıklı ve ekli ise, aşağıdaki adımlarla devam edin.
- Üç konjuge 18 her biri dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mM GnRH-FITC ile bir stok çözelti hazırlayın. GnRH-I, 16.97 mg / ml [D-Lys 6 (FITC)] - - GnRH II ve 16.47 mg / ml [Lys 8 (16.43 ug / ml [D-Lys 6 (FITC)]: (bu sulandırma konsantrasyonlarını kullanarak FITC)] - GnRH-III) oda sıcaklığında karanlık bir yerde bu stok çözümleri tutun ve birkaç hafta içinde onları kullanın.
- 1.7 uL 1.7 mL komple ortam içinde 10 mm GnRH-FITC ile her ana çözeltiden seyreltilir. Bu çözümleri çalkalayın. (THESe medyayı tedavi 10 uM GnRH-FITC vardır.) 1.35 ml tam orta 150 uL üç 10 uM GnRH-FITC tedavi ortamının her seyreltin. hem de bu çözümleri çalkalayın (bu 1 uM GnRH-FITC tedavi orta).
Not: tedavi ortamı içeren tüm GnRH FITC ışıktan korundu ve bir kaç saat içinde kullanılmalıdır gerekir. - 37 ° C'de altı GnRH-FITC ile muamele ortam (Aşama 1.12 hazırlandı) ve 4 ml komple ortam önceden ısıtın.
- 5 mM flüoresan prob çözeltisi 3 uL 5 uM 3 ml PBS (Malzeme Listesi bahsedilen nükleer karşı-) seyreltin. Bu çözelti oda sıcaklığında tutmak ve birkaç saat içinde onu kullanmak, ışıktan korunmalıdır.
2. Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM)
- GnRH uptake yöntemiyle
- Adım 1.6 hazırlanan ilk mikroskobik slayt atın ve iyi yedi her birinden tam orta dışarı pipetle. ısıtılmış tam medi 250 uL ekleyinİlk kuyuya um. Bir negatif kontrol olarak kullanın. (1 uM, 3 10 uM 3 kuyu) altı kuyu her birine (1.13) ortam tedavi önceden ısıtılmış GnRH-FITC 250 ul. 5 saat boyunca 37 ° C'de, nemlendirilmiş,% 5 CO2 atmosferi inkübatör slayt inkübe edin.
- Her kuyucuktan alınan ortam üzerinden pipet ve 250 uL PBS ile yıkama hücreleri. 10 dakika boyunca, her bir kuyunun içine sabitleme çözeltisi (% 10 nötr tamponlu formalin) 250 uL ekleyin ve oda sıcaklığında slayt inkübe edilir.
- Her kuyudan sabitleme çözüm pipet ve 250 uL PBS ile hücreleri yıkayın. 10 dakika boyunca, her bir kuyunun içine adım 1.14 hazırlanan 5 uM floresan prob çözeltisi ihtiva eden 250 ml PBS ilave edin ve oda sıcaklığında slayt inkübe edilir.
- her bir floresan prob çözüm pipet ve dikkatle 250 uL PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Sonunda, her bir kuyunun içine montaj orta 3-4 damla ekleyin. görüntüleme kadar oda sıcaklığında karanlıkta slayt tutun.
- GnRH-IR ifade yöntemi
- Adım 1.7 hazırlanan ikinci 8-iyi mikroskopik slayt atın ve beş kuyuların her birinden tam orta dışarı pipetle.
- İlk kuyuya ısıtılmış tam orta 250 mcL ekleyin, bu kadar olumsuz kumandayı kullanın. çok ikinci kuyuya ısıtılmış tam orta 250 mcL ekleyin ve GnRH tedavisinden önce GnRH-IR ifade incelemek için kullanabilirsiniz.
- Önümüzdeki üç kuyulara 250 uL üç ısıtılmış 10 uM GnRH-FITC tedavi medya her ekleyin. GnRH-IR ifade incelemeden önce GnRH-FITC konjugatları ile hücrelerin ön muamele edilmesi için bu kuyu kullanın. 1 saat boyunca 37 ° C'de, nemlendirilmiş,% 5 CO2 atmosferi inkübatör slayt inkübe edin.
- GnRH tedaviden sonra GnRH-IR ifade incelenmesi ve önceden ısıtılmış tam ortam 250 uL, bu kuyu yıkama için kullanılacak üç kuyu her birinden tedavi ortamı üzerinden Pipet. 250 ekleuL üç kuyu her birine tam orta önceden ısıtılmış. 1 saat boyunca 37 ° C'de, nemlendirilmiş,% 5 CO2 atmosferi inkübatör slayt inkübe edin.
- Beş kuyuların her birinden orta dışarı Pipet ve 250 uL PBS ile hücreleri yıkayın. 10 dakika boyunca, her bir Çözeltinin sabitleme 250 uL ekleyin ve oda sıcaklığında slayt inkübe edilir.
- Her kuyudan sabitleme çözüm pipet ve 250 ml PBS ile yıkama hücreleri. 1 saat boyunca, her kuyuya% 5 sığır serum albumin (BSA) Bloklama çözeltisi ihtiva eden 250 ml PBS ilave edin ve oda sıcaklığında slayt inkübe edilir.
- (: 100 oranı 1) 1 ml PBS içinde GnRH İR birincil antikor 10 uL seyreltilir. Oda sıcaklığında tutun ve birkaç saat içinde tüketin.
- Negatif kontrol (ilk sıra) hariç her kuyudan BSA engelleme çözümü Pipet. (Negatif kontrol oyuğu dışında) 250 uL PBS ile hücreleri yıkayın. 250 uL PBS EAC içine adım 2.2.7 hazırlanan GnRH İR primer antikor ihtiva eden ekleme(Negatif kontrol hariç) h kuyu. karanlık bir yerde, 1 saat boyunca oda sıcaklığında slayt inkübe edin.
- (: 500 oranı 1) 1.25 mL PBS Alexa 546 etiketli ikincil antikor 2.5 uL seyreltilir.
NOT: Bu çözelti, oda sıcaklığında tutmak ve birkaç saat içinde onu kullanmak, ışıktan korunmalıdır. - Beş kuyuların her birinden çözümler Pipet ve 250 uL PBS ile hücreleri yıkayın. her bir kuyunun içine adım 2.2.9 hazırlanan AF 546 etiketli ikincil antikor içeren 250 ml PBS ekleyin. Karanlıkta 1 saat boyunca oda sıcaklığında slayt inkübe edin.
- Her kuyudan çözüm pipet ve 250 uL PBS ile hücreleri yıkayın. her bir kuyunun içine adım 1.14 hazırlanan 5 uM floresan prob çözeltisi ihtiva eden 250 ml PBS ilave edin ve oda sıcaklığında, 10 dakika süre ile slayt inkübe edin.
- Her kuyudan floresan prob çözüm pipet ve dikkatle 250 uL PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Daha sonra, her bir kuyunun içine montaj medya 3-4 damla ekleyin. Karanlıkta slayt tutunOda sıcaklığında mikroskopik görüntüleme kadar.
- Görüntüleme
- Görüntü (63X immersiyon yağı hedefi kullanarak) ters konfokal lazer tarama mikroskobu ile hücrelerin
- Aşağıdaki uyarma / emisyon dalga boylarında kullanın. GnRH konjugatları: 488/514 nm, Alexa 546 etiketli antikor: 488/546 nm (sadece GnRH-IR ifade yöntemi için kullanılması), Draq5 floresan prob: 633/680 nm.
- Negatif kontrol hücreleri kullanılarak görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Görüntü tedavi hücrelere bu parametreleri (Şekil 3) kullanın. Yeniden ayarlamak analizin başında her mikroskobik slaytta görüntüleme parametreleri. Gerekirse üretici tarafından sağlanan yazılım ile ince ayar ve ihracat görüntüler.
- Görüntü (63X immersiyon yağı hedefi kullanarak) ters konfokal lazer tarama mikroskobu ile hücrelerin
3. floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS)
- GnRH miktar yöntemi
- Adım 1.8 hazırlanan plaka almak ve ea komple orta dışarı pipetleYedi kuyu Ch. İlk kuyuya ısıtılmış tam ortam 1 ml. Bir negatif kontrol olarak kullanın. Ekle 1 ml altı kuyu içine ortam (1 uM ve 10 uM 3 kuyu 3 kuyu) tedavi etmek ısıtılmış altı her. 5 saat boyunca 37 ° C'de, nemlendirilmiş,% 5 CO2 atmosferi inkübatör plaka inkübe edin.
- Her kuyudan orta dışarı pipetle. dikkatli bir şekilde 2 ml PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Her bir kuyu içine tripsin-EDTA çözeltisi 500 ul ekle. Hücreler (yaklaşık 10 dakika) ayrılana kadar 37 ° C'de inkübe plakası.
- Tripsin durdurmak için her bir kuyunun içine tam orta 1 ml. plaka çalkalayın. Bir pipet yardımıyla hafifçe hücreleri Askıya ve FACS tüpleri içine her bir kuyudan süspansiyonu transfer. 4 ° C'de 4 dakika boyunca 150 x g'de santrifüjleyin tüpler.
- tek hamle ile, dikkatlice süpernatantlar dökün. hücreler askıya tekrar yavaşça her FACS tüpü içinde buz soğukluğunda 500 ul PBS ekleyin. sonuna kadar buz üzerinde tüpler tutunDeney.
- Analiz ve hesaplama
- flow sitometri hücreleri analiz edin. eksitasyon için 488 nm argon lazer dalga boyu kullanımı ve saptama için 530 nm dalga boyu kullanın. Negatif kontrol hücreleri çalıştırarak parametreleri sitometresi akışını ayarlayın. Tedavi hücreleri (Şekil 4A) analiz etmek için bu parametreleri kullanın. Üreticinin yazılımı ile verilerin değerlendirilmesi medyan floresan yoğunluğu (MFI) değerlerinin belirlenmesi ve göreli MFI değerlerini hesaplamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile elde edilen görüntüler, zaman ve konsantrasyona bağlı bir şekilde verilen hücre kültürü üzerinde GnRH FITC konjugat alımından hakkında muhteşem bilgiler sunmaktadır. Bu GnRH-FITC eşlenikleri ile paralel olarak, hücre yüzeyi üzerinde GnRH-IR varlığı da CLSM deneyi ile kanıtlanabilir. Bundan başka, bir uzak-kırmızı bir DNA boyama flüoresan probun kullanarak, GnRH ve GnRH-IR yanında hücre çekirdekleri counterstain mümkündür. konfokal görüntü ölçülebilir değildir Ancak, basit bir "GnRH alım yöntemi" kolayca test hücreler GnRH-FITC konjugatları yüksek veya düşük miktarda içerip tahmin edebilirsiniz. Gerektiğinde uygulanan GnRH FITC eşlenik, konsantrasyonları ve muamele süresi, bu yöntemde değişkendir. Şekil 1'de gösterildiği gibi, farklı kanser hücreleri, konsantrasyona bağlı bir şekilde GnRH-FITC farklı seviyelerde ihtiva eder. gelişmiş "GnRH-IR ifade yöntemi" önce ve GnRH-FITC tedavisinden sonra, immünhistokimya ile hücre yüzeyi GnRH-IR görselleştirme açıklar. (GnRH-FITC tedavi öncesi) Bu yöntemin ilk bölümünde, GnRH-FITC ile muamelesi olmadan, bağışıklık kimyası GnRH-IR görselleştirmek. (GnRH-FITC tedaviden sonra) bu yöntem ikinci bölümünde, 10 uM GnRH-FITC ile 1 saat boyunca hücrelerin tedavisi. Tedavi sonra, 1 saat daha tam bir ortam içinde hücrelerin inkübe ve bağışıklık kimyası GnRH-IR görselleştirmek. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, farklı kanser hücreleri GnRH FITC tedavi öncesi yüzeylerinde GnRH-IR farklı düzeylerde gösterir. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, GnRH-FITC ile tedaviden sonra hücreler eksprese GnRH İR bunların membranlar üzerinde (EBC-1) veya artış (Detroit 562) GnRH-IR düzeyde tutmak. Bu noktada, daha önce doğruladı unutmayın BxPC-3 hücreleri, GnRH-IR ifade eden, ancak membran 18 üzerinde mevcut değildir. Zarları geçirgen halinde GnRH-IR, bağışıklık kimyası BxPc-3 hücre içinde görselleştirilebilir. Bu olgu, BxPc-3 hücrelerinin daha düşük GnRH alım verimi açıklamaktadır. Bu açıklamada dayanarak burada hücre yüzeyi GnRH-IR odaklıyız. Şekil 1 karşılaştırılması 2 hücre yüzeyi GnRH-IR seviyesi tekabül eden hücrelerde GnRH-FITC miktarı ile ilişkili olduğunu teyit Şekil. Ayrıca, Şekil 3C GnRH-FITC lokalizasyonu GnRH-FITC tedavisinin hücre yüzey GnRH-I-Mertek 1 saat sinyalinden ayrılır çünkü GnRH-FITC hücrelerine içselleştirilmiş olduğunu açıklar. Biz "GnRH-IR ifade yöntemi" "GnRH alım yöntemi" elde edilen bilgileri destekler sonucuna varıldı.
Iyi ayarlanmış set kullanmak önemlidirgörüntüleme sırasında ler. FITC (514 nm) ve fluorofor etiketli sekonder antikor (546 nm) emisyon dalga Şekil 3A'da gösterildiği gibi, muamele edilmemiş negatif kontrol hücreleri de hafif otofloresansı sahiptir. Bu istenmeyen floresan yanlış pozitif sonuçlar sağlayabilir. Böylece, görüntüleme başında, Şekil 3B'de gösterildiği gibi, kontrol hücreleri üzerinde floresans yoğunluğunu ayarlamak için önemlidir. Bu bir başka iki dalga boyunda floresan sinyali ile, nükleer boya (680 nm) emisyon dalga çekirdeklerin net bir sinyal gözlemlemek beklenmektedir sadece görünür ya da sıfıra yakındır. Tüm diğer hücre örnekleri bu iyi ayarlanmış ve sabit parametreler ile görüntülü olmalıdır. Şekil 3C'de gösterildiği gibi, bu şekilde, 514 nm 'de gözlemlenen sinyal GnRH-IR, özellikle ve çekirdeklerin sinyalinden 680 nm sinyali 546 nm' de sadece FITC GnRH sinyali elde edilir. Görüntüler fi olabilirGerekirse yazılımını kullanarak görüntüleme sonra ne ayarlanmış.
deneyler hücreleri tarafından alındı GnRH-FITC konjugatları miktarı hakkında ölçülebilir bilgi sunan Flow sitometri. Gerektiğinde uygulanan GnRH-FITC ile konjügatları, konsantrasyonları ve tedavi süresi, bu yöntemde, aynı zamanda değişkendir. muamele edilmemiş hücrelerin akış sitometrisi parametreleri ve analiz başındaki ortalama florasan yoğunluğu (MFI) belirlemek için ayarlama negatif kontrol olarak kullanılmaktadır. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, MFI aynı parametreler kullanılarak her numune için belirlenmiştir. Görece MFI değerleri Şekil 4B'de Hesaplama aşağıdaki formül kullanılarak MFI değerleri hesaplanır. Bu formülü kullanarak, kontrol hücrelerin göreceli MFI değeri her zaman sıfırdır. hesaplanan nispi MFI değerleri a doğru orantılıdır GnRH-FITC konjugatlarının, floresan yoğunluğunu ölçmekhücrelerde verage konsantrasyonları. Bu verilerle, Şekil 5'te gösterildiği gibi, bir göstermek ve bu kanser hücreleri GnRH-FITC konjugatları sürebilir ne kadar etkin karşılaştırabilirsiniz. Böylece, akış elde edilen sonuçlar sitometri tamamlayıcı ve konfokal mikroskobu ile elde edilen görüntüleri destekler.
Şekil 1: [Lys 8 (FITC)] tedavi edilmemiş ve Konfokal görüntüler - GnRH-III kanser hücrelerini tedavi. Mavi leke: çekirdekler; yeşil leke: [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III. Bu görüntüler "GnRH alım yöntemi" kullanılarak elde edilir. (A) muamele edilmemiş hücrelerin floresans sinyalleri her bir hücre hattı üzerinde 514 nm'de (yeşil) sıfıra yakın göre ayarlanmıştır. Draq5 uzak-kırmızı flüoresan prob hücre çekirdekleri leke için kullanılır. EBC-1 akciğer kanseri ve Detroit-562 insan ayarlarını uyguladıktan sonra (B)yutak kanseri hücreleri saptanabilir gösterir, ancak 1 mcM [Lys 8 (FITC)] ile 5 saat tedaviden sonra 514 nm (yeşil) düşük sinyal - GnRH-III. 10 uM 5 saat muameleden sonra (C): [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III, üç hücre çizgilerinin her biri bu yüksek flüoresan sinyal. Bu deneyden elde edilen sonuçlar, GnRH konjugeleri ile kolayca hedeflenebilir diğer iki hücre ile karşılaştırıldığında BxPc-3 pankreas kanser hücrelerinin daha düşük verimlilik ile GnRH-FITC aldı göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: öncesi ve sonrası [D-Lys 6 (FITC)] hücre yüzeyi GnRH-IR Konfokal görüntüler - GnRH-I tedavisi. Mavi leke: çekirdekler; yeşil leke: [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I; kırmızı leke : GnRH-IR. Bu görüntüler "GnRH-IR ifade yöntemi" oluşturulur. (A) GnRH-FITC ile tedaviden önce, BxPc-3 hücreleri, ancak membran üzerinde GnRH-IR yok EBC-1 hücreleri, yüksek sergiler, ve bazı Detroit 562 hücreleri, GnRH-IR orta düzeyde sergilerler. GnRH-FITC muameleden sonra (B) BxPc-3 hücreleri hala zar üzerinde GnRH-IR göstermezler. EBC-1 hücreler GnRH-IR ifade ve GnRH-FITC içlerinde görünür korumak. Detroit-562 hücreleri tedaviden sonra GnRH-IR yüksek düzeyde sergileyen gibi görünüyor ve onlar da, GnRH-FITC sürebilir. Bu deney, habis tümör hücrelerinin farklı yüzeylerinde GnRH-IR farklı seviyede sergilediği görülmektedir, ve GnRH-FITC alımı yakın hücre yüzeyi GnRH IR ekspresyonu ile ilişkili gibi görünmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: EBC-1 akciğer kanseri hücrelerinin Konfokal görüntüler. Mavi leke: çekirdekler; yeşil leke: [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III; kırmızı bir leke: GnRH-IR. Bu görüntüler "GnRH-IR ifade yöntemi" ile yapılır. Aşırı amplifiye cihaz ayarlarını kullanarak (a) (GnRH-FITC ve Alexa 546 olmadan) Tedavi edilmemiş negatif kontrol hücreleri 514 nm ve 546 nm 'de tespit edilebilir ve arzu edilmeyen floresan sahiptir. (B) işlem görmemiş negatif kontrol hücreleri üzerinde gösterge ayarlarının, yeşil (514nm) ve kırmızı (546 nm) sinyali sıfıra yakındır. (C) Düzeltilmiş parametreler tedavi GnRH-FITC ve GnRH-IR boyanan hücreler için açık ve güvenilir sinyallerine neden. GnRH-FITC ile muameleden sonra, GnRH-FITC (yeşil) lokalizasyonu hücre yüzeyi GnRH-IR (kırmızı) ayrılır.529fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: veri akış sitometri değerlendirilmesi. Tedavi görmüş ve görmemiş Detroit 562 hücreleri (A) Histogram. hücre örneklerinin MFI değerleri histogram belirlenir. x-ekseni hücreler floresan yoğunluğunu gösterir, ve y-ekseni, sayı gösterir. Siyah çizgi: GnRH-FITC tedavi öncesi MFI; Yeşil noktalı çizgi: MFI 1 uM [Lys 8 (FITC)] ile 5 saat tedavi sonrası - GnRH-III; GnRH-III - 10 mcM [Lys 8 (FITC)] ile 5 saat tedaviden sonra MFI: kırmızı kesikli çizgi. Göreceli MFI değerleri (B) Hesaplama formülü. göreceli MFI değerleri MFI değerleri hesaplanır. Bu hesaplama kullanılarak, muamele edilmemiş kontrol numunesinin görece MFI değeri her zaman sıfırdır. relat muamele edilmiş numunelerin ive MFI değerleri hücre içindeki GnRH FITC konjugat miktarını temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: GnRH-FITC konjugatlarının 1 uM 5 saat muameleden sonra kanser hücrelerinin Nispi MFI değerleri. Bağıl MFI değerleri karşılaştırılabilir ve verilen hücre tipleri GnRH analogları sürebilir ne kadar etkin tanımlar. GnRH-IR olmayan sergileyen BxPc-3 hücreleri, bu GnRH analoglarının yalnızca eser miktarda ihtiva eder. EBC-1 akciğer kanser hücrelerini ifade eden GnRH-IR orta içeren ve Detroit-562 yutak kanseri hücreleri GnRH analoglarının yüksek miktarda içerir. Sonuçlar = 3 N, ortalama ± SD olarak sunulmuştur."_blank"> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deneyler eleme yapışık seçici olarak etiketlenmiş GnRH analoglarını kullanım tarif in vitro hücre kültürleri. Konfokal mikroskopi ve sitometrisi yöntemleri takip için uygun bir süre ve konsantrasyon bağımlı bir tarzda, bu GnRH-FITC ile konjügatlarının hücreye kabul miktarının olan akar. Bu deneyler aşağıdaki kritik adımlar vardır: 1) steril, sağlıklı hücre kültürü korumak; 2) GnRH peptidler yüksek kalitede olmalıdır; 3) makul konsantrasyonları ve inkübasyon süreleri takip edilmelidir; 4) tedavi edilmesi ve yıkama adımları; 5) cihaz ayarlarını iyi ayarlanmış.
Hücreler, üreticinin% 10 ile takviye tavsiye edilen aracı madde (V / V), fetal sığır serumu ve antibiyotiklerin (tam ortam) içinde muhafaza edilmiştir. Hücreler tutulur ve (GnRH-FITC konjugatları ile) işleme adımları kadar steril bir ortamda ele alınmalıdır. Deneylerden önce, bir ters mikroskop kullanılarak hücre kontrol edin. Bunlar sağlıklı olmalıdırEkli ve gerekli miktarlarda ulaşmalıdır.
Yüksek kalite ve saflıkta GnRH peptidlerin kullanımı için önemlidir. Biz, bu peptidleri sentezlenmiştir ve üzerinden% 98 ila 18, onları arıtıldı. peptid liyofilize bir toz halinde, bir buzdolabında -25 ° C 'de muhafaza edilebilir. DMSO içinde 10 mM GnRH-FITC ile stok çözeltileri, oda sıcaklığında karanlık bir yerde tutulur ve bir kaç hafta içinde yukarı kullanılmalıdır. Biz bu konjugatların istikrar araştırdık ve DMSO stabil ve onların floresan yoğunluğu uygun depolama 1 ay sonra korunur bulundu. GnRH-FITC konjugat konsantrasyonunun ve tedavi zaman büyük avantajlar sunmaktadır, bu deneylerde, değişken olmakla birlikte, bazı sınırlamalar (aşağıya bakınız). Bu protokol uygulanan konsantrasyonlar ve kuluçka süreleri sadece tavsiye niteliğindedir, ancak ilk deneyler için iyi bir zemin sağlamaktadır.
CLSM deneyleri sever gerektirirark yıkama adımları. Bu adımlar, dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. hücreleri üzerine doğrudan sıvı transferi yapmayın. Aksine, yan veya bu amaçla kuyuların köşesini kullanın. Bu yıkayarak ve yapıştırılır hücreleri kaybetme en aza indirebilirsiniz. floresan örnekleri (photobleaching etki) duyarsızlaştıracak gibi aynı zamanda, bütün deney sırasında direkt ışık önlemek için tavsiye edilir. Karanlık bir yerde tedavi örnekleri tutmak veya deney sırasında alüminyum folyo bir parça ile kaplı. önceki bulgulara dayanarak, uygulanan tedavi ortamı son DMSO konsantrasyonu (% 0.1 (hacim / hacim), 10 uM muamele ortam DMSO) ve sonuçları üzerinde bir etkiye sahip ve böylece DMSO içermeyen komple ortam olan önemsiz olduğunu fark negatif kontrol olarak, aynı zamanda uygundur.
CLSM ve FACS deneyler sırasında iyi ayarlanmış alet parametreleri kullanmak önemlidir. Bu parametreler hem analizleri önce, her hücre tipine yeniden kalibre edilmesi gerekir. CLSM deneyde, SiLazer yoğunluğu, dedektör kazanç ve ofset, iğne deliği boyutunu: konfokal görüntülerin gnal yoğunluğu aşağıdaki parametrelere bağlıdır. Bu parametreleri ayarlarken, kabul edilebilir bir görüntü oluşturmak ve photobleaching önlemek için en düşük lazer gücünü kullanın. Yakın sıfır (Şekil 3B) ile lekesiz negatif kontrol hücrelerin arka plan floresan ayarlamak için görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Bu düzeltilmiş parametrelerle görüntü tedavi edilen hücreler yalancı pozitif sonuç önlemek için. GnRH veya GnRH-IR hakkında gerekli bilgileri içeren nm 514 nm ve 546 tedavi hücrelerden salınan ek sinyaller. Bu adımlar CLSM deneylerinde deneyim gerektirir. FACS deneyinde, arsa ortasında ana yaşam hücre popülasyonunu ayarlamak için bir standart ileri dağılım tarafı scatter plot (doğrusal ölçek) ve set gerilimleri oluşturmak. canlı hücreler etrafında bir bölge çizin. Bir histogram oluşturma, set apsis bir (FL1-530 nm, logaritmik ölçek) kanal ve bir kapı olarak önceden tanımlanan bölgeyi belirlemek içinBu histogramda için. 10 1 (Şekil 4A) altında boyanmamış negatif kontrol hücre sinyali getirmek FL1 gerilimi ayarlar. Bu düzeltilmiş parametreler ile tedavi hücreleri analiz edin.
Bundan başka, zaman zaman hücre kültürlerinin Mycoplasma durumunu kontrol etmek çok önemlidir. Çeşitli deneyler, bu amaç için kullanılabilir. Mycoplasma pozitifliği durumunda, hücreler atmak ve yeni bir kültür ile çalışmaya başlamak. Mikoplazma önlemek için optimize edilir, kültür ortamı içinde bir antibiyotik karışımı kullanmak tavsiye edilir. GnRH-FITC konjugatların uygulanan konsantrasyon ve tedavi süresi, ancak flüoresan tespiti için çok zayıf sinyaller neden olabilir düşük konsantrasyonlarda ve kısa bir bekleme süresi uygulanarak, bu deneylerde değişkendir.
GnRH analogları ile paralel olarak GnRH-IR görüntüleme yaparken, daha yüksek GnRH-FITC konsantrasyonu önerilmektedir (10 uM en uygunudur). Daha yüksek konsantrasyonda nedeniKısa inkübasyon süresi (1 saat) ve GnRH-FITC konjugatlara kıyasla etiketli antikorun nispeten yüksek floresan sinyalidir. Öte yandan, iki floresan boya emisyonu (514 nm ve 546 nm) arasında küçük bir örtüşme yalnızca 546 nm'de meydana gelmektedir ve GnRH-FITC konjugatları sinyalinden türetilmiş olan, bulunmuştur. Şekil 3 'de gösterildiği gibi ancak Alexa 546 ve iyi ayarlanmış parametreleri göreli olarak daha yüksek flüoresan sinyal, bu etkiyi en aza indirmek. çakışmasını önlemek için başka bir olası çözüm, (CLSM teknik parametreler bu izin veriyorsa) FITC ile karşılaştırıldığında farklı dalgaboyu ve / veya daha iyi ayrı emisyon spektrumu vardır ikincil antikor etiketli uygulamak etmektir. Bu olasılık, GnRH-FITC eşlenikleri ile paralel bağlı flüoresan probları kullanarak sağlayan CLSM yöntemi, büyük bir avantaj sağlar. Örneğin, bu alternatif fluoresan problar gerektiği gibi diğer organellere counterstaining için kullanılabilir.
GnRH-FITC konjugatları uygulanan konsantrasyon aşağıdaki sınırlamalar vardır. GnRH-FITC konjugat maksimum konsantrasyon limiti çözünürlükleri 18 dayanır. Bu değerler, oda sıcaklığında PBS içinde aşağıdaki gibidir: GnRH-I: 90 uM; GnRH-II: 40 uM; GnRH-III: 200 uM. Diğer yandan, önceki deneylerde bu GnRH peptidlerinin alımı İnsana ait GnRH-I reseptörlerinin dışında reseptörlerin gerçekleşebilir düşünülmektedir; Bu alım 18 (10 uM üstü) daha yüksek konsantrasyonlarda daha belirgin olduğu görülmektedir. GnRH-FITC konjugatları alt saptama sınırı parametreleri çeşitli dayalı, ama ideal ayarları bu ÇİİS deneyler için yaklaşık 1 uM'dir edilir. Biz akış sitometri konfokal mikroskopi daha iyi hassasiyeti sunar bulundu. İdeal ayarlarında, GnRH-FITC konjugatları miktar limiti daha düşük 1 uM olabilir. algılama veya tayin sınırı olabilirBunlar, hücre tipine ve inkübasyon süresi bağımlı olduğu için, her deneyde farklı olacak. bu örnek başına hücrelerin binlerce algılar ve hücrelerin ortalama sinyal hesaplanır çünkü FACS tarafından elde edilen veriler, CLSM daha güvenilir olduğunu unutmayın. Bununla birlikte, protokol, FACS GnRH FITC konjugat hücresel lokalizasyonu ve GnRH-IR, hücre yüzeyi ekspresyonu ile ilgili bilgi vermez. Bu düşünceler dayanarak CLSM ve FACS deneyleri farklı avantajlara sahip, sonuçlandırmak ve birbirlerini tamamlarlar. Öte yandan, yüksek miktarda görüntü analizi ilginç ve FACS ve CLSM analizi için iyi bir alternatif olabilir.
Özetle, bu deneylerden elde edilen veriler, üç GnRH-FITC ile konjügatların her biri, hücre yüzeyi GnRH-IR ifade eden hücreler içine girebilir teyit etmektedir. Bu GnRH analogları aynı konsantrasyonlarda benzer hedefleme potansiyeline sahiptirler. Farklı kutu yüzeyinde Ancak, GnRH-IR düzeyicer hücreler oldukça değişkendir. Akışkan sitometri analizi verilerinden hesaplanan sonuçlar hücre kuşakları ya da GnRH analoglarının karşılaştırmasını sağlar. Aynı zamanda, konfokal mikroskobu ile elde edilen görüntüler, hücre yüzeyi GnRH İR ekspresyon seviyesini ortaya koymak ve bu konjugatlar hücrelere içselleştirilir teyit edebilir. Bu sonuçlara dayanarak, bir tanıtılan deneyler GnRH dayalı ilaç taşıyıcı sistemlerin araştırılması için pratik ve değişken yöntemler içerir ve daha fazla deneyler için iyi bir temel sağladığını teyit edebiliriz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0.1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
References
- Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11 (2016).
- Majumdar, S., Siahaan, T. J.
- Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K.
- Schally, A. V., et al.
- Limonta, P., et al. GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies. Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).
- Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances. J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).
- Manea, M., et al. In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice. Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).
- Argyros, O., et al. Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth. Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).
- Karampelas, T., et al. GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery. Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).
- Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -L. Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling. Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).
- Millar, R. P., et al. Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).
- Olberg, D. E., et al. Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression. Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).
- Zoghi, M., et al. Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging. Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).
- Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging. Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).
- Nederpelt, I., et al. Characterization of 12 GnRH peptide agonists - A kinetic perspective. Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).
- Szabo, I., et al. Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting. J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).
- Leurs, U., et al. GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate. Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).
- Murányi, J., et al. Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells. J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).
