In vitro Imaging og Kvantificering af Drug Targeting Effektivitet af fluorescens-mærkede GnRH-analoger

Summary

Selektivt mærket fluorescerende GnRH-I, -II og-III derivater er pålidelige værktøjer til sporing og kvantificering deres cellulære optagelse. Dette håndskrift introducerer eksperimenter for at visualisere, kvantificere og sammenligne optagelsen effektiviteten af ​​disse GnRH konjugater i forskellige cellelinier.

Abstract

GnRH-analoger er effektive målretning dele og i stand til at levere anticancer midler selektivt til maligne tumorceller som meget udtrykkelige GnRH-receptorer. Dog er kvantitativ analyse af GnRH-analoger 'cellulære optagelse og de undersøgte celletyper i GnRH-baserede drug delivery systemer øjeblikket er begrænset. Tidligere indførte, selektivt mærket fluorescerende GnRH I, -II og-III-derivater giver stor detekterbarhed, og de har egnede kemiske egenskaber til reproducerbare og robuste eksperimenter. Vi fandt også, at de relevante up-to-date metoder med disse mærkede GnRH-analoger kunne tilbyde roman information om GnRH-baserede drug delivery-systemer. Dette håndskrift indfører nogle enkle og hurtige eksperimenter vedrørende cellulære optagelse af [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-II og [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH -III på EBC-1 (lunge), den BxPC-3 (bugspytkirtlen) og på Detroit-562- (pharynx) ondartet tumor celler. Parallelt med disse GnRH-FITC-konjugater blev cellen overfladeniveau GnRH-I-receptorer også undersøgt på disse cellelinier før og efter GnRH behandling ved konfokal laserscanningsmikroskopi. Den cellulære optagelse af GnRH-FITC-konjugater blev kvantificeret ved fluorescens-aktiveret cellesortering. I disse forsøg blev der observeret mindre forskelle mellem GnRH-analoger og store forskelle mellem celletyper. De signifikante forskelle blandt cellelinjer er korreleret med deres særskilte niveau af celleoverflade GnRH-I-receptorer. De indførte eksperimenter indeholder praktiske metoder til at visualisere, kvantificere og sammenligne optagelsen effektiviteten af ​​GnRH-FITC-konjugater på en tids- og koncentrationsafhængig måde af forskellige adhærente cellekulturer. Disse resultater kunne forudse det stof målrettet effektiviteten af ​​GnRH konjugater på given celle kultur, og tilbyder et godt grundlag for yderligere eksperimenter i undersøgelsen af ​​GnRH-baserede drug delivery-systemer.

Introduction

Peptidbaserede målrettet drug delivery-systemer er blevet en hurtig udviklende og lovende område i kræftbehandling i de seneste par år ^{1, 2.} Menneskelig gonadotropin hormon receptor type I (GnRH-IR) er primært placeret i hypofysen, men er også til stede i flere andre væv, som er ansvarlige for selv-reproduktion ^3. GnRH-IR udtrykkes også i en række kræftformer væv, beslægtet eller relateret til reproduktive system ^{4, 5.} Den høje ekspression af GnRH-IR på flere maligne tumorceller sammenlignet med raske væv giver en mulighed for målrettet terapi ^{5, 6.}

Mange gonadotropin-frigivende hormon (GnRH) analoger er blevet udviklet i de seneste årtier, som kunne anvendes som målsøgningsdelef "> ^{7, 8, 9.} Disse peptider er i stand til at levere anticancermidler med høj selektivitet til maligne tumorceller, som overudtrykker GnRH-IR ^6. Adskillige GnRH konjugerede anti-tumor lægemidler med højere selektivitet og bedre effektivitet end den tilsvarende ukonjugerede frit lægemiddel er rapporteret ^{7, 8, 9.}

Tidligere publikationer om GnRH peptider og deres receptorer rapporterede, at GnRH-IR kan antage forskellige konformationer, som har forskellig selektivitet for GnRH-analoger ^10. Den meget variabel GnRH-IR har komplekse og forskellige signalveje er udstyret med forskellige aktivitet mod deres naturlige og kunstige ligander ^11. Disse kendsgerninger gør undersøgelse af GnRH-baserede systemer udfordrende. På den anden side y besidder lovende terapeutisk potentiale. Adskillige forsøg med radiomærkede GnRH peptider blev tidligere rapporteret ^{12, 13, 14, 15,} men forsøg, hvor der blev anvendt fluorescensmærkede GnRH-analoger er stadig begrænset. Mens radioaktiv mærkning giver høj følsomhed, fluorescerende mærkning har flere andre fordele, for eksempel lettere håndtering, og evnen til at modfarvning med forskellige fluoroforer. Tre fælles GnRH-analoger, som har med succes været anvendt til medicinafgivelse er [D-Lys ^6] -GnRH-I, [D-Lys ^6] -GnRH-II og GnRH-III, men effektiviteten af disse peptider som målretningsgrupper er sjældent sammenlignet ^{16, 17.} På den anden side, følger af separate forsøg, hvor forskellige cancerceller og GnRH-analoger blev brugt er forskelligartet.

ntent "> Ud fra disse overvejelser, fokuserede vi på tumoren målretning og potentielle lægemiddel afgivelse af disse GnRH peptider og derved syntetiseret og karakteriseret [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys ⁶ (FITC )] - GnRH-II og [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH-III peptidkonjugater ¹⁸ Disse analoger er selektivt mærket med FITC på sidekæden af deres Lys eller D-Lys (peptid-FITC forholdet 1: 1 ved hver. konjugat). Tanken var, at den selektive fluorescerende mærkning kan tilbyde nye oplysninger om disse peptider, og giver deres gode sporing og pålidelig kvantificering. disse konjugater har sikker håndtering og pålidelig sporbarhed, der gør det lettere at sammenligne deres tumor effektivitet målrettet, og screening af mange typer af maligne tumorceller. Vi håber, at up-to date eksperimenter med disse peptid konjugater kunne bidrage til udviklingen af ​​nye kræft rettet mod GnRH-drug konjugater, og hjælpe med at identificere nye terapeutiske tjærebliver så godt.

Den foreliggende manuskript demonstrerer nogle godt reproducerbare og hurtige eksperimenter med GnRH-FITC-konjugater. Celleoverfladeekspression af GnRH-R er en afgørende betingelse om GnRH-optagelse, derfor har vi samtidigt undersøgte celleoverfladen niveau af GnRH-IR på de testede cellelinier. Vi visualiseret GnRH-IR- og GnRH-FITC-konjugater ved konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) og kvantificeret den cellulære optagelse af GnRH-FITC-konjugater under anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS).

Protocol

1. Fremstilling af cellekulturer og reagenser

1. Oprethold cellekulturerne i producentens anbefalede medium suppleret med 10% (vol / vol) føtalt bovint serum og antibiotika (kaldet komplet medium). Den celledyrkning kolben holde i en fugtig, 5% _{CO2-atmosfære} inkubator ved 37 ° C. Følg spredning og sammenflydning af celler ved omvendt mikroskop (ved hjælp 10X fasekontrast mål).
2. Når cellerne når en passende konfluens, fjernes mediet, og vask kulturen med 2-3 ml sterilt phosphatbufret saltvand (PBS). Fjern PBS og tilsæt 0,5 ml steril 0,25% trypsin-EDTA-opløsning til cellekulturen og inkuberes ved 37 ° C, indtil cellerne løsnes (ca. 10 min).
3. Suspendere cellerne i 3-4 ml sterilt komplet medium at stoppe trypsin og overføre dem til et sterilt centrifugerør. Centrifugeres cellerne ved 150 x g i 4 minutter ved stuetemperatur (RT). Supernatanten fjernes omhyggeligt og suspendere pellet i 2-3 ml sterilt komplet medium.
4. Tag 100 pi af cellesuspensionen og blandes med 100 pi 0,4% (m / V) trypan blå opløsning, at farve døde celler. Belastning 10 pi af denne blanding i et hæmocytometer og bestemme antallet af levedygtige celler ved omvendt mikroskop.
5. Fortynd den nødvendige mængde cellesuspension fremstillet i trin 1.3 til 10 ml med sterilt komplet medium, indeholdende 4 x 10 ⁴ celler / ml.
6. Tilsæt 250 pi cellesuspension (fremstillet i trin 1.5) per brønd (10 ⁴ celler / brønd) i syv brønde på den første glas bund 8 brønde mikroskoppræparatet. Brug denne glider i GnRH optagelse metode.
7. Tilsæt 250 pi cellesuspension (fremstillet i trin 1.5) per brønd (10 ⁴ celler / brønd) i fem brønde i den anden 8-brønds mikroskoppræparatet. Dette dias vil blive anvendt i GnRH-IR ekspressionsmetode.
8. Tilsæt 1 ml cellesuspension (fremstillet i trin 1.5) per brønd (4 x 10 ⁴ celler / brønd) i syv wells af en 12-brønds plade. Denne plade vil blive anvendt i GnRH kvantificering metode.
9. Lad cellerne klæber på de to mikroskopiske objektglas og pladen. Inkuber dem i en fugtig, 5% _{CO2-atmosfære} inkubator ved 37 ° C i 48 timer.
10. Efter inkubationen kontrolleres cellerne ved omvendt mikroskop (under anvendelse af 10X fasekontrast mål). Hvis cellerne er sunde og fastgjort, fortsætte med følgende trin.
11. Forbered 10 mM GnRH-FITC stamopløsning i dimethylsulfoxid (DMSO) fra hver af de tre konjugater ^18. (Brug disse fortyndingsforhold koncentrationer: 16.43 ug / uL [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I, 16,97 ng / nl [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-II og 16,47 ng / nl [Lys ⁸ ( FITC)] - GnRH-III) Opbevar disse stamopløsninger i et mørkt sted ved stuetemperatur, og bruge dem op inden for et par uger.
12. Fortynd 1,7 pi hver af de tre 10 mM GnRH-FITC stamopløsninger i 1,7 ml komplet medium. Ryst disse løsninger. (These er 10 uM GnRH-FITC behandling medier.) Fortynd 150 pi hver af de tre 10 uM GnRH-FITC behandlingsmedium i 1,35 ml komplet medium. Ryst disse løsninger samt (disse er de 1 uM GnRH-FITC behandlingsmedium).
    BEMÆRK: Alle GnRH-FITC indeholder behandling medium bør beskyttes mod lys og brugt op inden for et par timer.
13. Forvarm seks GnRH-FITC behandlingsmedium (fremstillet i trin 1.12) og 4 ml komplet medium til 37 ° C.
14. Fortynd 3 pi 5 mM fluorescerende probe løsning (nuklear kontrastfarve nævnt i liste Materials) i 3 ml PBS til 5 uM. Denne opløsning skal beskyttes mod lys, holde det ved stuetemperatur, og bruge den færdig inden for et par timer.

2. Konfokal Laser Scanning Microscopy (CLSM)

1. GnRH optagelsesmetode
   1. Tag den første mikroskoppræparatet fremstillet i trin 1.6 og pipette den fuldstændige medium fra hver af de syv brønd. Tilsættes 250 pi af forvarmet komplet medium i den første brønd. Brug dette som en negativ kontrol. Tilsæt 250 pi af forvarmet GnRH-FITC behandling medier (fra 1,13) til hvert af de næste seks brønde (3 brønde med 1 pM og 3 med 10 uM). Inkuber slæden i en fugtig, 5% _{CO2-atmosfære} inkubator ved 37 ° C i 5 timer.
   2. Pipette ud mediet fra hver brønd og vask af cellerne med 250 pi PBS. Tilsættes 250 pi af fikseringsopløsning (10% neutral pufret formalin) i hver brønd og inkuber objektglasset ved stuetemperatur, i 10 minutter.
   3. Pipette ud fikseringsopløsningen fra hver brønd og vask af cellerne med 250 pi PBS. Tilføj 250 pi PBS indeholdende 5 pM fluorescerende probe opløsning fremstillet i trin 1,14 i hver brønd og inkuber objektglasset ved stuetemperatur, i 10 minutter.
   4. Pipette den fluorescerende probe opløsningen fra hver brønd, og vask af cellerne to gange med 250 pi PBS omhyggeligt. Tilføj 3-4 dråber Mounting Medium til hver brønd endelig. Hold dias i mørke ved stuetemperatur, indtil billeddannelse.
   5. GnRH-IR ekspressionsmetode
      1. Tag den anden 8-brønds mikroskoppræparatet fremstillet i trin 1.7 og pipette den fuldstændige medium fra hver af de fem brønde.
      2. Tilsæt 250 pi forvarmet komplet medium i den første brønd, bruge dette som negativ kontrol. Tilsæt 250 pi forvarmet komplet medium ind i den anden brønd også, og bruge denne til at undersøge GnRH-IR-ekspression før GnRH-behandling.
      3. Tilføj 250 pi hver af de tre forvarmet 10 um GnRH-FITC behandling medier i de næste tre brønde. Brug disse brønde at forbehandle cellerne med GnRH-FITC-konjugater før undersøge GnRH-IR udtryk. Inkuber slæden i en fugtig, 5% _{CO2-atmosfære} inkubator ved 37 ° C i 1 time.
      4. Pipette ud behandlingsmediet fra hver af de tre brønde, som vil blive anvendt til at undersøge GnRH-IR ekspression efter GnRH behandling og vask disse brønde med 250 pi forvarmet komplet medium. Tilsæt 250pi forvarmet komplet medium til hver af de tre brønde. Inkuber slæden i en fugtig, 5% _{CO2-atmosfære} inkubator ved 37 ° C i 1 time.
      5. Pipette ud mediet fra hver af de fem brønde og vask af cellerne med 250 pi PBS. Tilføj 250 pi fikseringsopløsning til hver brønd og inkuber objektglasset ved stuetemperatur, i 10 minutter.
      6. Pipette ud fikseringsopløsningen fra hver brønd og vask af cellerne med 250 pi PBS. Tilsættes 250 pi PBS indeholdende 5% bovint serumalbumin (BSA) blokeringsopløsning i hver brønd og inkuberes objektglasset ved stuetemperatur, i 1 time.
      7. Fortynd 10 pi GnRH-IR primært antistof i 1 ml PBS (1: 100-forhold). Hold det ved stuetemperatur, og bruge den færdig inden for et par timer.
      8. Pipette ud BSA blokeringsopløsning fra hver brønd undtagen den negative kontrol (første brønd). Vask cellerne med 250 pi PBS (undtagen den negative kontrol brønd). Tilsæt 250 pi PBS indeholdende GnRH-IR primært antistof fremstillet i trin 2.2.7 i each brønd (undtagen den negative kontrol). Inkubér dias ved RT, i 1 time, på et mørkt sted.
      9. Fortynd 2,5 pi af Alexa 546 mærket sekundært antistof i 1,25 ml PBS (1: 500-forhold).
         BEMÆRK: Denne opløsning skal beskyttes mod lys, holde det ved stuetemperatur, og bruge den færdig inden for et par timer.
      10. Pipette ud løsninger fra hver af de fem brønde og vask af cellerne med 250 pi PBS. Tilsættes 250 pi PBS indeholdende AF 546 mærket sekundært antistof fremstillet i trin 2.2.9 i hver brønd. Inkubér dias ved RT, i 1 time i mørke.
      11. Pipette ud opløsningen fra hver brønd og vask af cellerne med 250 pi PBS. Tilføj 250 pi PBS indeholdende 5 pM fluorescerende probe opløsning fremstillet i trin 1,14 i hver brønd og inkuber glideren i 10 min, ved stuetemperatur.
      12. Pipette den fluorescerende probe opløsningen fra hver brønd og vask cellerne to gange med 250 pi PBS omhyggeligt. Tilføj 3-4 dråber montering medier i hver brønd, bagefter. Hold dias i mørkeved stuetemperatur, indtil mikroskopisk billeddannelse.
   6. Imaging
      1. Billede cellerne ved omvendt konfokal laser scanning mikroskop (ved hjælp 63X nedsænkning olie mål)
         1. Brug følgende excitation / emission bølgelængder. GnRH konjugater: 488/514 nm, Alexa 546 mærket antistof: 488/546 nm (brug kun for GnRH-IR udtryk metoden), DRAQ5 fluorescerende probe: 633/680 nm.
         2. Opsæt de billeddannende parametre ved hjælp af de negative kontrol celler. Brug disse parametre til billede behandlede celler (Figur 3). Re-justere imaging parametre på hver mikroskoppræparatet i begyndelsen af ​​analysen. Finjustere og eksport billeder med den software, der af fabrikanten, hvis nødvendigt.

   3. Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS)

   1. GnRH kvantificering metode
      1. Tag pladen forberedt i trin 1.8 og pipette den fuldstændige medium fra eaCH af de syv brønde. Tilsæt 1 ml forvarmet komplet medium i den første brønd. Brug dette som en negativ kontrol. Tilsæt 1 ml hver af de seks forvarmes behandling medier (3 brønde med 1 pM og 3 brønde med 10 pM) i de næste seks brønde. Inkubér pladen i en fugtig, 5% _{CO2-atmosfære} inkubator ved 37 ° C i 5 timer.
      2. Pipette ud mediet fra hver brønd. Vask cellerne to gange med 2 ml PBS omhyggeligt. Tilføj 500 pi trypsin-EDTA-opløsning i hver brønde. Inkubér pladen ved 37 ° C, indtil cellerne løsnes (ca. 10 min).
      3. Der tilsættes 1 ml komplet medium i hver brønd for at stoppe trypsin. Ryst pladen. Hæng cellerne forsigtigt med en pipette, og overføre suspensionen fra hver brønd i FACS rør. Centrifuger rørene ved 150 xg i 4 min, ved 4 ° C.
      4. Hæld supernatanterne omhyggeligt, med et træk. Tilføj 500 pi iskold PBS i hvert FACS rør og forsigtigt re-suspendere cellerne. Hold rørene på is indtil udgangenaf eksperimentet.
   2. Analyse og beregning
      1. Analyser cellerne ved flowcytometri. Til excitation, bruge 488 nm argon-laser bølgelængde og til detektion anvende 530 nm bølgelængde. Oprette flowcytometeret parametre ved at køre de negative kontrolceller. Brug disse parametre til at analysere behandlede celler (figur 4A). Vurdere data med producentens software, fastlægge median fluorescerende intensitet (MFI) værdier, og beregne den relative MFI-værdier.

Representative Results

Billeder opnået ved konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) tilbyder spektakulære information om optagelsen af ​​GnRH-FITC-konjugater på den givne cellekultur i en tid og koncentrationsafhængig måde. Parallelt med disse GnRH-FITC-konjugater, tilstedeværelsen af ​​GnRH-IR på celleoverfladen er også kontrolleres af den CLSM eksperimentet. Desuden ved anvendelse af en langt-rød DNA-farvning fluorescerende probe, er det muligt at modfarve kernerne i celler foruden GnRH og GnRH-IR. Men mens den konfokale billede er ikke kvantificeres, den simple "GnRH optagelse metode" kan nemt vurdere, om de testede celler indeholder højere eller lavere mængde af GnRH-FITC-konjugater. De anvendte GnRH-FITC-konjugater, deres koncentration, tidspunktet for behandlingen er variable i denne fremgangsmåde, efter behov. Som vist i figur 1 forskellige cancerceller indeholder forskellige niveauer af GnRH-FITC i en koncentrationsafhængig måde. Den avancerede "GnRH-IR ekspressionsmetode" beskriver visualiseringen af ​​celleoverfladen GnRH-IR med immuncytokemi, før og efter GnRH-FITC behandling. I den første del af denne metode (før GnRH-FITC behandling), vi visualisere GnRH-IR ved immuncytokemi, uden GnRH-FITC behandling. I anden del af denne fremgangsmåde (efter GnRH-FITC behandling), vi behandler celler i 1 time med 10 pM GnRH-FITC. Efter behandlingen vi inkubere cellerne i komplet medium i yderligere 1 time og visualisere GnRH-IR ved immuncytokemi. Som vist i figur 2A, forskellige cancerceller udviser forskellige niveauer af GnRH-IR på deres overflade, før GnRH-FITC behandling. Som vist i figur 2B, efter at GnRH-FITC behandling, GnRH-IR udtrykkende celler vedligeholde (EBC-1) eller forøgelse (Detroit-562) GnRH-IR niveau på deres membraner. På dette punkt, opmærksom på, at vi tidligere har bekræftet, at BxPC-3 celler udtrykker også GnRH-IR, men ikke præsentere det på deres membran ^18. GnRH-IR kan visualiseres inde i BxPC-3-celler ved immunocytokemi, hvis deres membraner permeabiliseres. Dette fænomen forklarer den relativt lavere GnRH optagelse effektivitet BxPC-3-celler. Baseret på disse udsagn fokuserer vi kun på celleoverfladen GnRH-IR her. Sammenligning Figur 1 til figur 2, bekræfter, at niveauet af celleoverfladen GnRH-IR korrelerer med mængden af GnRH-FITC i de tilsvarende celler. Endvidere Figur 3C præciserer, at GnRH-FITC internaliseres i celler, fordi lokaliseringen af GnRH-FITC er adskilt fra signalet af celleoverfladen GnRH-I-Rafter 1 time af GnRH-FITC behandling. Vi konkluderer, at "GnRH-IR udtryk metoden" understøtter oplysningerne fra de "GnRH optagelse metode".

Det er vigtigt at bruge veltilpassede sætlinger under billeddannelse. Som illustreret i figur 3A ved emissionsbølgelængden af FITC (514 nm) og fluorophoren mærket sekundært antistof (546 nm), de ubehandlede negative kontrolceller har også en lille autofluorescens. Denne uønskede fluorescens kan give falske positive resultater. Derved ved begyndelsen af det billeddannende er det vigtigt at justere fluorescensintensiteten på kontrolcellerne som vist i figur 3B. Det forventes, at man vil iagttage klart signal af kernerne ved emissionsbølgelængden for den nukleare farvning (680 nm), med det fluorescerende signal ved de to andre bølgelængder er lige synlige eller nær nul. Alle de andre celleprøver bør afbildes med disse veltilpassede og faste parametre. Denne måde er observeret ved 514 nm signal afledt fra signalet på kun FITC-GnRH, ved 546 nm fra signalet af GnRH-IR især og ved 680 nm fra signalet af kerner som vist i figur 3C. Billeder kan være fine-tunet efter billeddannelse ved hjælp af software, hvis nødvendigt.

Flowcytometri eksperimenter tilbyde kvantificerbare oplysninger om mængden af ​​GnRH-FITC-konjugater, som blev taget op af cellerne. De anvendte GnRH-FITC-konjugater, deres koncentrationer og tidspunktet for behandlingen er også variable i denne fremgangsmåde, efter behov. De ubehandlede celler anvendes som negativ kontrol til justering af flowcytometri parametre og bestemme deres median fluorescensintensitet (MFI) i begyndelsen af ​​analysen. Som illustreret på figur 4A MFI blev bestemt for hver prøve ved anvendelse af de samme parametre. De relative MFI-værdier beregnes ud fra MFI-værdier ved hjælp beregningen formlen i figur 4B. Ved anvendelse af denne formel, den relative MFI værdien af ​​kontrolceller altid er nul. De beregnede relative MFI-værdier kvantificere fluorescensintensiteten af ​​GnRH-FITC-konjugater, som er proportionale med deres aGennemsnitligt koncentrationer i cellerne. Som illustreret i figur 5, med disse data, kan man påvise og sammenligne, hvor effektivt disse cancerceller optager GnRH-FITC-konjugater. Således opnåede resultater ved flowcytometri supplere og stimulere billeder optaget ved konfokal mikroskopi.

Figur 1: Konfokal billeder af ubehandlede og [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH-III behandlede cancerceller. Blåsplint: kerner; grøn plet: [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH-III. Disse billeder opnås ved hjælp af "GnRH optagelsesmetode". (A) De fluorescenssignaler fra de ubehandlede celler indstilles til nær nul ved 514 nm (grøn) på hver cellelinie. Den DRAQ5 langt-rødt fluorescerende probe anvendt til at farve kerner af cellerne. (B) Efter anvendelse af indstillingerne, EBC-1 lungekræft og Detroit-562 menneskepharynx cancerceller viser detekterbar, men lav signal ved 514 nm (grøn) efter 5 timer behandling med 1 uM [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH-III. (C) Efter 5 h behandling med 10 pM [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH-III, hver af de tre cellelinier stede højere fluorescerende signal. Resultater fra dette forsøg antyder, at BxPC-3 bugspytkirtelkræftceller tog GnRH-FITC med meget lavere effektivitet i forhold til de andre to cellelinjer, som er let målrettes af GnRH konjugater. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Konfokal billeder af celleoverfladen GnRH-IR før og efter [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I-behandling. Blåsplint: kerner; grøn plet: [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I; rød plet : GnRH-IR. Disse billeder er genereret ved hjælp af "GnRH-IR ekspressionsmetode". (A) Før GnRH-FITC behandling, behøver BxPC-3 celler ikke GnRH-IR på membranen, men EBC-1 celler udviser høj, og visse Detroit-562 celler udviser moderat niveau af GnRH-IR. (B) Efter GnRH-FITC behandling, BxPC-3-celler stadig ikke udviser GnRH-IR på deres membran. EBC-1-celler bevarer deres GnRH-IR-ekspression og GnRH-FITC vises inde i dem. Detroit-562-celler synes at udvise højere niveau af GnRH-IR efter behandling og de optager GnRH-FITC, samt. Dette forsøg viser, at forskellige typer af maligne tumorceller udviser forskellige niveauer af GnRH-IR på deres overflade, og GnRH-FITC optagelse synes at være tæt forbundet til celleoverfladen GnRH-IR-ekspression. Klik her for at se en større version af dette tal.

_content "fo: holde-together.within-side =" 1 ">
Figur 3: Konfokal billeder af EBC-1 lungecancerceller. Blåsplint: kerner; grøn plet: [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH-III; rød plet: GnRH-IR. Disse billeder er lavet med "GnRH-IR udtryk metoden". (A) Ubehandlede negative kontrol celler (uden GnRH-FITC og Alexa 546) har påviselige og uønsket fluorescens ved 514 nm og 546 nm ved brug af over-forstærkede instrumentindstillinger. (B) Justering af instrumentets på de ubehandlede negative kontrol celler, den grønne (514 nm) og rød (546 nm) signalet er nær nul. (C) Korrigeret parametre resulterer i klare og pålidelige signaler til GnRH-FITC behandlet og GnRH-IR farvede celler. Efter GnRH-FITC behandling, er lokalisering af GnRH-FITC (grøn) adskilt fra celleoverfladen GnRH-IR (rød).529fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Evaluering af flowcytometri data. (A) Histogram af ubehandlede og de behandlede Detroit-562 celler. MFI værdier af celleprøver bestemmes ud fra histogrammet. X-aksen viser fluorescensintensiteten af ​​celler, og y-aksen viser tællingerne. Sort linje: MFI før GnRH-FITC behandling; grøn stiplet linje: MFI efter 5 timer behandling med 1 uM [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH-III; rød stiplet linie: MFI efter 5 timer behandling med 10 pM [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH-III. (B) Beregning af relative formel MFI-værdier. De relative MFI-værdier beregnes ud fra MFI-værdier. Ved anvendelse af denne beregning, den relative MFI værdien af ​​den ubehandlede kontrolprøve altid er nul. Den vedrø ive MFI-værdier af de behandlede prøver repræsenterer mængden af ​​GnRH-FITC-konjugater, som er inde i cellerne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Relativ MFI værdier af cancerceller efter 5 timer behandling med 1 uM af GnRH-FITC-konjugater. Relative MFI-værdier er sammenlignelige og definere, hvor effektivt de givne celletyper kan tage op GnRH-analoger. De GnRH-IR ikke-udstille BxPC-3 celler indeholder kun spor af disse GnRH-analoger. GnRH-IR udtrykker EBC-1 lungekræft celler indeholder moderate og Detroit-562 svælget kræftceller indeholder stor mængde af GnRH-analoger. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SD, N = 3."_blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Eksperimenter beskrevet heri anvender selektivt mærkede GnRH-analoger til screening adhærent cellekulturer in vitro. Konfokal mikroskopi og flowcytometri metoder er egnede til sporing og kvantificering af cellulære optagelse af disse GnRH-FITC-konjugater i et tidsrum og koncentrationsafhængig måde. Disse eksperimenter har følgende kritiske trin: 1) opretholde en steril, sund cellekultur; 2) GnRH-peptider skal være af høj kvalitet; 3) rimelige koncentrationer og inkubationstider skal følges; 4) behandling og vasketrin; 5) veltilpassede instrumentindstillinger.

Cellerne holdes i producentens anbefalede medium suppleret med 10% (V / V) føtalt bovint serum og antibiotika (komplet medium). Cellerne skal holdes og håndteres i et sterilt miljø, indtil behandlingstrin (med GnRH-FITC-konjugater). Før forsøgene, kontrollere cellerne under anvendelse af et omvendt mikroskop. De bør være sunde, Fastgjort og skal nå de krævede mængder.

Det er vigtigt at bruge GnRH peptider med høj kvalitet og renhed. Vi syntetiserede disse peptider og oprenset dem til over 98% ^18. Peptidet kan opbevares ved -25 ° C i et køleskab som et lyofiliseret pulver. De 10 mM GnRH-FITC stamopløsninger i DMSO bør opbevares i et mørkt sted ved stuetemperatur og brugt op inden for et par uger. Vi undersøgte stabiliteten af ​​disse konjugater og fandt, at de er stabile i DMSO og deres fluorescensintensitet opretholdes efter 1 måneds korrekt opbevaring. Koncentrationen af ​​GnRH-FITC-konjugater og tidspunktet for behandlingerne er variable i disse eksperimenter, som tilbyder store fordele, men med visse begrænsninger (se nedenfor). De anvendte koncentrationer og inkubationstider i denne protokol er kun anbefalinger, men de giver et godt grundlag for de indledende forsøg.

CLSM eksperimenter kræver several vasketrin. Disse trin skal udføres omhyggeligt. Må ikke overføre væske direkte på cellerne. Snarere bruge siden eller hjørnet af brøndene til dette formål. Dette kan minimere afvaskning og miste adhærerede celler. Det anbefales også at undgå direkte lys under hele forsøget, da det kan desensitize de fluorescerende prøver (fotoblegning effekt). Hold de behandlede prøver på et mørkt sted eller dækket med et stykke aluminiumsfolie under eksperimentet. Baseret på tidligere resultater, bemærkede vi, at slutkoncentrationen DMSO i den anvendte behandling medier er ubetydelig (0,1% (V / V) DMSO i 10 uM behandling medier) og har ingen indflydelse på resultaterne, hvorved DMSO-fri komplet medium er også velegnet som negativ kontrol.

Det er vigtigt at bruge veltilpassede instrumentparametre under CLSM og FACS eksperimenter. Disse parametre skal re-kalibreres på hver celletype, før begge analyser. I CLSM eksperiment blev signal intensitet konfokale billeder afhænger af følgende parametre: laser intensitet, detektor gain og offset, og pinhole størrelse. Ved justering af disse parametre, skal du bruge laveste laser magt til at producere et acceptabelt billede og undgå fotoblegning. Indstil de billeddannende parametre for at justere baggrundsfluorescens af ufarvede negative kontrolceller til nær nul (figur 3B). Dette billede er behandlet celler med disse justerede parametre for at undgå falske positive resultater. Yderligere signaler, der udsendes fra de behandlede celler ved 514 nm og 546 nm indeholder de nødvendige oplysninger om GnRH eller GnRH-IR. Disse trin kræver erfaring i CLSM eksperimenter. I FACS eksperiment oprette en standard fremadrettet spredning-sidespredning plot (lineær skala) og indstille spændinger til at justere det primære opholdsrum cellepopulationen i midten af ​​plottet. Tegn en region omkring levende celler. Opret et histogram, sætte abscisse at kanalisere en (FL1-530 nm, logaritmisk skala) og indstille den tidligere definerede region som en portfor dette histogram. Indstil FL1 spænding for at bringe signalet fra ufarvede negative kontrolceller under 10 ¹ (figur 4A). Analyser behandlede celler med disse justerede parametre.

Endvidere er det vigtigt at kontrollere mycoplasma status cellekulturerne fra tid til anden. Forskellige assays er tilgængelige til dette formål. I tilfælde af mycoplasma positivitet, kassere celler og begynde at arbejde med en ny kultur. Det anbefales at anvende en antibiotisk blanding i dyrkningsmediet, som er optimeret til at forhindre mycoplasma. Den anvendte koncentration af GnRH-FITC-konjugater, og tidspunktet for behandlingerne er variable i disse eksperimenter imidlertid at anvende lave koncentrationer og korte inkuberingstider kan resultere i alt for svage signaler for fluorescens detektion.

Når afbildning af GnRH-IR parallelt med GnRH-analoger, anbefales højere GnRH-FITC koncentration (10 uM er optimalt). Årsagen til den højere koncentrationer den korte inkubationstid (1 time) og den relativt høje fluorescenssignal af det mærkede antistof sammenlignet med GnRH-FITC-konjugater. På den anden side blev en mindre overlapning mellem de to fluorescerende farvestof emissioner (514 nm og 546 nm) fundet, som kun forekommer ved 546 nm og er afledt fra signalet af GnRH-FITC-konjugater. Den forholdsvis højere fluorescerende signal af Alexa 546 og veltilpassede parametre kunne imidlertid minimere denne effekt, som vist i figur 3. En anden mulig løsning til at undgå overlapning, er at anvende mærket sekundært antistof, der har forskellige excitationsbølgelængde og / eller bedre adskilt emissionsspektret sammenlignet med FITC (hvis CLSM tekniske parametre tillader dette). Denne mulighed giver stor fordel for CLSM fremgangsmåde, som muliggør anvendelse af valgfrie fluorescerende prober parallelt med GnRH-FITC-konjugater. For eksempel kunne disse alternative fluorescerende prober anvendes til kontrafarvning andre organeller efter behov.

Den anvendte koncentration af GnRH-FITC-konjugater har følgende begrænsninger. Maksimal koncentrationsgrænse på GnRH-FITC-konjugater er baseret på deres opløselighed ^18. Disse værdier er følgende i PBS ved stuetemperatur: GnRH-I: 90 uM; GnRH-II: 40 pM; GnRH-III: 200 uM. På den anden side, i tidligere forsøg formodes vi, at optagelsen af ​​disse GnRH peptider kunne finde sted på andre måder end humane GnRH-I-receptorer receptorer; Denne optagelse synes at være mere signifikant ved højere koncentrationer (over 10 uM) ^18. Den nedre detektionsgrænse GnRH-FITC-konjugater er baseret på en række parametre, men i ideelle rammer den er omtrent 1 pM for CLMS eksperimenter. Vi fandt, at flowcytometri giver bedre følsomhed end konfokal mikroskopi. Under ideelle indstillinger, kunne kvantificeringsgrænsen af ​​GnRH-FITC-konjugater være lavere end 1 uM. Detektionsgrænsen eller kvantificering kunnevære forskellige i hvert forsøg, fordi de er afhængige af celletype og inkubationstid. Bemærk, at data opnået ved FACS er mere pålidelig end CLSM, fordi den detekterer tusindvis af celler pr prøve og den gennemsnitlige signal af celler beregnes. Men i protokollen, FACS ikke give oplysninger om den cellulære lokalisering af GnRH-FITC-konjugater og celleoverfladeekspression af GnRH-IR. Baseret på disse overvejelser konkluderer vi, at den CLSM og FACS eksperimenter har forskellige fordele, og de supplerer hinanden. På den anden side kan høje indhold billedanalyse være en interessant og et godt alternativ til FACS og CLSM-analyse.

Sammenfattende opnået fra disse eksperimenter data bekræfter, at hver af de tre GnRH-FITC-konjugater kan træde ind i celler, der udtrykker celleoverflade GnRH-IR. Disse GnRH-analoger har lignende styrke målretning ved de samme koncentrationer. Men den GnRH-IR niveau på overfladen af ​​forskellige dåseCER-celler er meget varierende. Resultater beregnet ud fra dataene for flowcytometrianalyse muliggør sammenligning af cellelinier eller GnRH-analoger. Samtidig kunne billeder opnået ved konfokal mikroskopi afslører niveauet af celleoverfladen GnRH-IR ekspression og bekræfte, at disse konjugater internaliseres i cellerne. Baseret på disse resultater, kan man bekræfte, at de introducerede forsøgene indeholder praktiske og variable metoder til undersøgelse af GnRH baserede lægemiddeltilførselssystemer og tilbyder et godt grundlag for yderligere forsøg.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EBC-1	JCRB Cell Bank	JCRB0820	Human lung squamous cell carcinoma
BxPC-3	ATCC	CRL-1687	Human pancreatic adenocarcinoma
Detroit-562	ATCC	CCL-138	Human pharyngeal carcinoma
RPMI-1640 Medium with L-glutamine	Lonza	BE12-702F	Culture medium for BxPC-3 cells
Eagle's Minimum Essential Medium	Lonza	BE12-611F	Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0.1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells
Fetal Bovine Serum	Euro Clone	ECS0180L	Complements the culture medium
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2012	Complements the culture medium (antibiotics)
Standard Line Cell Culture Flasks	VWR	10062-872	Provide consistent, sterile growth environment for cells
Trypsin-EDTA Mixture	Lonza	BE17-161E	Remove attached cells
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Lonza	BE17-516F	Solvent
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	Solvent
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	Used to counting cells
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I	made by us	-	Purity ≥98% (HPLC)
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II	made by us	-	Purity ≥98% (HPLC)
[Lys8(FITC)]-GnRH-III	made by us	-	Purity ≥98% (HPLC)
glass bottom 8-well microscopic slide	Ibidi	80826	Use in CLSM experiment
Corning Costar cell culture plate, 12 well	Sigma-Aldrich	CLS3513-50EA	Use in FACS experiment
Fixing solution (10% neutral buffered formalin)	Bio-Optica	01V60P	Fix adherent cells
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-10G	Prevent the nonspecific binding of the antibodies
GnRHR Antibody	Proteintech	19950-1-AP	Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors
Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A11035	Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody
Fluorescent probe solution (Draq5)	Thermo Fisher Scientific	62254	Counterstain nuclei
Fluoromount Aqueous Mounting Medium	Sigma-Aldrich	F4680-25ML	Use in CLSM experiment, preserving fluorescence
Inverted microscope	Elektro-Optika Ltd.	Alpha XDS-2T	Check the phenotype and confluency of cell cultures
Inverted confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM-710	Use in CLSM experiment
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur	Use in FACS experiment