Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

في المختبر التصوير والكمي لاستهداف الكفاءة المخدرات من النظائر نره Fluorescently إعتبر

Published: March 21, 2017 doi: 10.3791/55529
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 3, 2
1MTA-SE Pathobiochemistry Research Group, Semmelweis University, 2Department of Medical Chemistry, Molecular Biology and Pathobiochemistry, Semmelweis University, 3MTA-ELTE Research Group of Peptide Chemistry, Eötvös Loránd University

Summary

وصفت بشكل انتقائي نيون نره-I،-II و-III المشتقات هي أدوات موثوقة لتتبع وقياس امتصاص الخلوية الخاصة بهم. هذه المخطوطة يقدم تجارب لتصور وقياس ومقارنة كفاءة امتصاص هذه تقارن نره في خطوط الخلايا المختلفة.

Abstract

نظائرها نره هي الأنصاف تستهدف فعالة وقادرة على تقديم وكلاء المضادة للسرطان بشكل انتقائي في الخلايا السرطانية الخبيثة التي مستقبلات نره صريحة للغاية. ومع ذلك، فإن التحليل الكمي للامتصاص الخلوية نظائرها نره "وأنواع الخلايا التحقيق في أنظمة توصيل الدواء على أساس نره تقتصر حاليا. سبق عرضه، فلوري المسمى انتقائي نره الأول،-II و-III المشتقات نقدم الكشف العظيم، ولهم خصائص كيميائية مناسبة للتجارب متكررة وقوية. لقد وجدنا أيضا أن أساليب يصل إلى تاريخ المناسبة مع هذه نظائرها نره المسمى يمكن أن توفر معلومات جديدة حول أنظمة توصيل الدواء على أساس نره. هذه المخطوطة يقدم بعض التجارب بسيطة وسريعة فيما يتعلق امتصاص الخلوية من [D-ليز 6 (FITC)] - نره-I، [D-ليز 6 (FITC)] - نره-II و [ليز 8 (FITC)] - [نره] -III على EBC-1 (الرئة)، وBxPC-3 (البنكرياس) وعلى ديترويت-562- (البلعوم) ر الخبيثخلايا umor. بالتوازي مع هذه تقارن نره-FITC، تم فحص مستوى سطح الخلية من المستقبلات نره-I أيضا على هذه الخطوط الخلية قبل وبعد العلاج نره من قبل متحد البؤر المجهر الليزر. وكميا امتصاص الخلوي للتقارن نره-FITC بواسطة مضان تنشيط الخلايا الفرز. في هذه التجارب لوحظ اختلافات بسيطة بين نظائرها نره واختلافات كبيرة بين أنواع الخلايا. وترتبط الفوارق الكبيرة بين خطوط الخلايا مع مستوى متميز على سطح الخلايا مستقبلات نره-I. تحتوي على تجارب أدخلت أساليب عملية لتصور وقياس ومقارنة كفاءة امتصاص تقارن نره-FITC في وقت واحد، وبطريقة تعتمد على التركيز على مختلف الثقافات الخلايا الملتصقة. هذه النتائج يمكن التنبؤ تستهدف المخدرات كفاءة تقارن نره على ثقافة خلية معينة، وتوفر أساسا جيدا لمزيد من التجارب في فحص أنظمة توصيل الدواء على أساس نره.

Introduction

أصبحت تستند نظم تسليم المخدرات المستهدفة الببتيد ويتطور بسرعة ومنطقة واعدة في علاج السرطان خلال السنوات القليلة الماضية 1 و 2. موجهة الغدد التناسلية البشرية نوع الإفراج عن مستقبلات هرمون الأول (نره-IR) يقع في المقام الأول في الغدة النخامية ولكن موجود أيضا في العديد من الأنسجة الأخرى التي هي المسؤولة عن الاستنساخ الذاتي 3. وأعرب عن نره الأشعة تحت الحمراء أيضا في عدد من الأنسجة السرطانية، ذات الصلة، أو لا علاقة لها الجهاز التناسلي 4، 5. التعبير عال من نره الأشعة تحت الحمراء في العديد من الخلايا السرطانية الخبيثة مقارنة مع الأنسجة السليمة يوفر فرصة للعلاج المستهدفة 5، 6.

العديد من الهرمون المطلق لموجهة الغدد التناسلية وقد تم تطوير (نره]) نظائرها في العقود القليلة الماضية، والتي يمكن أن تستخدم استهداف الأنصافو "> 7، 8، 9، وهذه الببتيدات هي قادرة على تقديم وكلاء المضادة للسرطان مع الانتقائية العالية في الخلايا السرطانية الخبيثة التي الإفراط في التعبير عن نره الأشعة تحت الحمراء 6. عدة نره مترافق الأدوية المضادة للورم مع ارتفاع الانتقائية وأفضل كفاءة من اللامقترن المقابلة وقد تم الإبلاغ عن خال من المخدرات 7، 8، 9.

وذكرت المنشورات السابقة عن الببتيدات نره ومستقبلاتها أن نره الأشعة تحت الحمراء يمكن أن تتحمل مختلف التشكلات التي لها الانتقائية مختلفة لنظائرها نره 10. وقد وهبت لاختلافا كبيرا نره-IR مسارات الإشارات المعقدة والمختلفة مع نشاط مختلف ضد بروابط الطبيعية والاصطناعية من 11. هذه الحقائق تجعل التحقيق في النظم القائمة نره-تحديا. من ناحية أخرى، ذ تمتلك إمكانات علاجية واعدة. العديد من التجارب مع الببتيدات نره رديولبلد كانت أعلنت في وقت سابق 12، 13، 14، 15، ولكن التجارب التي استخدمت fluorescently المسمى نظائرها نره لا تزال محدودة. في حين يقدم وسم المشعة حساسية عالية، ووضع العلامات الفلورية ديها العديد من المزايا الأخرى، على سبيل المثال تسهيل التعامل، والقدرة على مباين مع fluorophores مختلفة. ثلاثة نظائر نره المشتركة التي استخدمت بنجاح لتسليم المخدرات هي [D-ليز 6] -GnRH-I، [D-ليز 6] -GnRH-II ونره الثاني والثالث، ولكن فعالية هذه الببتيدات كما الأنصاف الاستهداف نادرا مقارنة 16، 17. من ناحية أخرى، والنتائج من تجارب منفصلة استخدمت فيها الخلايا السرطانية المختلفة ونظائرها نره متنوعة.

ntent "> وبناء على هذه الاعتبارات، ركزنا على الورم الاستهداف وإمكانية تسليم المخدرات من هذه الببتيدات نره، وبالتالي توليفها وتميزت [D-ليز 6 (FITC)] - نره-I، [D-ليز 6 (FITC )] - تقارن الببتيد نره الثالث 18 وصفت هذه نظائرها بشكل انتقائي مع FITC على سلسلة من الجانب اليس أو D-ليز (نسبة الببتيد FITC من 1 - [ليز 8 (FITC)] نره-II و: 1 في كل. وكانت فكرة المترافقة) أن وضع العلامات الفلورية انتقائية يمكن أن تقدم معلومات جديدة حول هذه الببتيدات، ويسمح لهم تتبع جيد وتقدير موثوق بها. هذه تقارن لها التعامل الآمن وكشف موثوق بها، مما يجعل من الاسهل لمقارنة الورم تستهدف كفاءتها، و فحص أنواع عديدة من الخلايا السرطانية الخبيثة، ونحن نأمل أن ما يصل إلى التجارب موعد مع هذه تقارن الببتيد يمكن أن تسهم في تطور سرطان رواية تستهدف تقارن نره من المخدرات، وتساعد على تحديد القطران العلاجي الجديديحصل أيضا.

يوضح هذا المخطوط بعض التجارب استنساخه بشكل جيد وسريع مع تقارن نره-FITC. التعبير سطح الخلية من نره-R هو شرط حاسمة من حول امتصاص نره، وبالتالي فإننا التحقيق في وقت واحد على مستوى سطح الخلية من نره الأشعة تحت الحمراء على خطوط الخلايا التي تم اختبارها. نحن تصور تقارن نره الأشعة تحت الحمراء ونره-FITC التي كتبها متحد البؤر المسح الضوئي ليزر المجهري (CLSM) وكمية امتصاص الخلوي للتقارن نره-FITC باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الثقافات الخلية والكواشف

  1. الحفاظ على الثقافات خلية في المتوسط ​​أوصت الشركة المصنعة، على أن تستكمل مع 10٪ (ت / ت) الجنين مصل بقري والمضادات الحيوية (وتسمى المتوسطة كاملة). حافظ على قارورة خلية زراعة في ترطيب، 5٪ CO 2 جو الحاضنة عند 37 درجة مئوية. اتبع انتشار وconfluency من الخلايا عن طريق مجهر مقلوب (باستخدام 10X الهدف النقيض المرحلة).
  2. عندما تصل الخلايا confluency المناسب، وإزالة المتوسطة، وغسل ثقافة 2-3 مع مل، الفوسفات معقمة المالحة (PBS). إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 0.5 مل، معقم 0.25٪ حل التربسين-EDTA لزراعة الخلايا واحتضان عند 37 درجة مئوية حتى الخلايا تنفصل (حوالي 10 دقيقة).
  3. تعليق الخلايا في 3-4 مل المتوسطة كاملة معقم لوقف التربسين ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي معقمة. الطرد المركزي الخلايا في 150 x ج لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). تجاهل طاف بعناية وتعليق عellet في 2-3 مل المتوسطة كاملة العقيمة.
  4. إخراج 100 ميكرولتر من تعليق خلية وتخلط مع 100 ميكرولتر 0.4٪ (م / V) التريبان حل الأزرق، وصمة عار على الخلايا الميتة. تحميل 10 ميكرولتر من هذا الخليط في عدادة الكريات وتحديد عدد خلايا قابلة للحياة من خلال مجهر مقلوب.
  5. تخفيف المبلغ المطلوب من تعليق خلية أعدت في الخطوة 1،3 حتي 10 مل مع المتوسطة كاملة العقيمة، التي تحتوي على 4 × 4 10 خلية / مل.
  6. إضافة 250 ميكرولتر من تعليق خلية (المعد في الخطوة 1.5) لكل بئر (10 4 خلية / جيد) في سبع آبار أول كوب أسفل 8 جيدا الشرائح المجهرية. استخدام هذه الشريحة في طريقة امتصاص نره.
  7. إضافة 250 ميكرولتر من تعليق خلية (المعد في الخطوة 1.5) لكل بئر (10 4 خلية / جيد) إلى خمسة آبار الثانية الشرائح المجهرية 8 جيدا. وسوف تستخدم هذه الشريحة في طريقة التعبير نره الأشعة تحت الحمراء.
  8. إضافة 1 مل من تعليق خلية (المعد في الخطوة 1.5) لكل بئر (4 × 10 4 خلية / جيد) إلى سبعة أهلا وسهلاليرة سورية من لوحة 12-جيدا. وسوف تستخدم هذه اللوحة في الأسلوب الكمي نره.
  9. السماح للخلايا التمسك على اثنين من الشرائح المجهرية ولوحة. احتضان لهم في ترطيب، 5٪ CO 2 جو الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  10. بعد حضانة تحقق الخلايا عن طريق مجهر مقلوب (باستخدام 10X الهدف النقيض المرحلة). إذا كانت الخلايا السليمة وتولى، مع الاستمرار في الخطوات التالية.
  11. إعداد 10 ملي نره-FITC حل الأسهم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) من كل من تقارن ثلاثة 18. (استخدم هذه التركيزات التخفيف: 16.43 ميكروغرام / ميكرولتر [D-ليز 6 (FITC)] - نره-I، 16.97 ميكروغرام / ميكرولتر [D-ليز 6 (FITC)] - نره-II و 16.47 ميكروغرام / ميكرولتر [ليز 8 ( FITC)] - نره-III) حافظ على هذه الحلول الأسهم في مكان مظلم في RT واستخدامها في غضون بضعة أسابيع.
  12. تمييع 1.7 ميكرولتر كل الحلول الأسهم ملم نره-FITC ثلاثة 10 في 1.7 مل المتوسطة كاملة. يهز هذه الحلول. (تساه هي 10 ميكرومتر نره-FITC علاج وسائل الإعلام.) تمييع 150 ميكرولتر كل من الثلاثة 10 ميكرومتر نره-FITC علاج المتوسطة في 1.35 مل المتوسطة كاملة. يهز هذه الحلول وكذلك (وهذه هي 1 ميكرومتر نره-FITC علاج المتوسطة).
    ملاحظة: جميع نره-FITC المحتوية على علاج المتوسطة يجب أن تكون محمية من الضوء وتستخدم ما يصل في غضون بضع ساعات.
  13. سخن ستة نره-FITC علاج المتوسطة (المعد في الخطوة 1.12) و 4 مل المتوسطة كاملة إلى 37 درجة مئوية.
  14. تمييع 3 ميكرولتر من 5 ملم حل مسبار فلوري (مباين النووية المذكورة في قائمة المواد) في 3 مل PBS إلى 5 ميكرومتر. يجب حماية هذا الحل من ضوء، ويبقيه في RT واستخدامه في غضون بضع ساعات.

2. متحد البؤر الليزر الضوئي المجهري (CLSM)

  1. نره طريقة امتصاص
    1. خذ الشريحة الأولى المجهرية التي أعدت في الخطوة 1.6 و ماصة من المتوسط ​​الكامل من كل واحد من سبعة أيضا. إضافة 250 ميكرولتر من ميدي الكامل مسخنأم في البئر الأول. استخدام هذا كوسيلة لمراقبة سلبية. إضافة 250 ميكرولتر من محمى نره-FITC علاج وسائل الإعلام (من 1.13) لكل من الآبار الستة المقبلة (3 آبار مع 1 ميكرومتر و 3 مع 10 ميكرومتر). احتضان الشريحة في ترطيب، 5٪ CO 2 جو الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات.
    2. ماصة من المتوسط ​​من كل بئر وغسل الخلايا مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. إضافة 250 ميكرولتر من محلول تحديد (10٪ محايد مخزنة الفورمالين) في كل بئر واحتضان الشريحة في RT، لمدة 10 دقيقة.
    3. ماصة من الحل تحديد من كل بئر وغسل الخلايا مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. إضافة 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تحتوي على 5 ميكرومتر حل التحقيق الفلورسنت المعد في الخطوة 1.14 في كل بئر واحتضان الشريحة في RT، لمدة 10 دقيقة.
    4. ماصة من الحل التحقيق الفلورسنت من كل جانب، وغسل الخلايا مرتين مع 250 ميكرولتر PBS بعناية. إضافة 3-4 قطرات من تصاعد المتوسط ​​في كل بئر، في نهاية المطاف. الحفاظ على الشرائح في الظلام في RT، حتى التصوير.
    5. نره-IR طريقة التعبير
      1. خذ الثانية الشرائح المجهرية 8 جيدا أعدت في الخطوة 1.7 و ماصة من المتوسط ​​الكامل من كل من الآبار الخمس.
      2. إضافة 250 ميكرولتر من المتوسط ​​كاملة مسخن في البئر الأول، استخدام هذا التحكم سلبية. إضافة 250 ميكرولتر من المتوسط ​​كاملة مسخن في البئر الثاني جدا، واستخدام هذا لدراسة التعبير نره الأشعة تحت الحمراء قبل العلاج نره.
      3. إضافة 250 ميكرولتر كل من مسخن 10 ميكرومتر نره-FITC وسائل الاعلام ثلاث علاج في الآبار الثلاث المقبلة. استخدام هذه الآبار ليمهد للمعالجة الخلايا مع تقارن نره-FITC قبل النظر في التعبير نره الأشعة تحت الحمراء. احتضان الشريحة في ترطيب، 5٪ CO 2 جو الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      4. ماصة من وسيلة علاج من كل من الآبار الثلاثة التي سيتم استخدامها لدراسة التعبير نره-IR بعد العلاج نره وغسل هذه الآبار مع 250 ميكرولتر من المتوسط ​​كاملة مسخن. إضافة 250ميكرولتر من مسخن المتوسطة كاملة إلى كل من الآبار الثلاثة. احتضان الشريحة في ترطيب، 5٪ CO 2 جو الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      5. ماصة من المتوسط ​​من كل من الآبار الخمس وغسل الخلايا مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. إضافة 250 ميكرولتر من تحديد الحل في كل بئر واحتضان الشريحة في RT، لمدة 10 دقيقة.
      6. ماصة من الحل تحديد من كل بئر وغسل الخلايا مع 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إضافة 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على الزلال 5٪ المصل البقري (BSA) حل عرقلة في كل بئر واحتضان الشريحة في RT، لمدة 1 ساعة.
      7. تمييع 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية-نره الأشعة تحت الحمراء في برنامج تلفزيوني مل 1 (1: 100 نسبة). يبقيه في RT واستخدامه في غضون بضع ساعات.
      8. ماصة من حل حجب BSA من كل بئر باستثناء سيطرة سلبية (وأيضا لأول مرة). غسل الخلايا مع 250 ميكرولتر PBS (باستثناء السيطرة السلبية أيضا). إضافة 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على الأجسام المضادة الأولية نره-IR أعدت في الخطوة 2.2.7 إلى مجموعة شرق افريقياح جيدا (باستثناء المراقبة السلبية). احتضان الشريحة في RT، لمدة 1 ساعة، في مكان مظلم.
      9. تمييع 2.5 ميكرولتر من اليكسا 546 الضد الثانوية وصفت في 1.25 مل برنامج تلفزيوني (1: 500 نسبة).
        ملاحظة: هذا الحل يجب أن تكون محمية من الضوء، ويبقيه في RT واستخدامه في غضون بضع ساعات.
      10. ماصة الحلول من كل من الآبار الخمس وغسل الخلايا مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. إضافة 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي AF 546 الضد الثانوية المسمى أعدت في الخطوة 2.2.9 في كل بئر. احتضان الشريحة في RT، لمدة 1 ساعة في الظلام.
      11. ماصة من حل من كل بئر وغسل الخلايا مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. إضافة 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تحتوي على 5 ميكرومتر حل التحقيق الفلورسنت المعد في الخطوة 1.14 في كل بئر واحتضان الشريحة لمدة 10 دقيقة، في RT.
      12. ماصة من الحل التحقيق الفلورسنت من كل بئر وغسل الخلايا مرتين مع 250 ميكرولتر PBS بعناية. إضافة 3-4 قطرات من وسائل الإعلام المتصاعدة في كل بئر، وبعد ذلك. الحفاظ على الشرائح في الظلامفي RT حتى التصوير المجهري.
    6. التصوير
      1. صورة الخلايا عن طريق متحد البؤر مقلوب المسح بالليزر المجهر (باستخدام 63X الهدف غمر النفط)
        1. استخدام موجات الإثارة / الانبعاثات التالية. تقارن نره: 488/514 نانومتر، اليكسا 546 المسمى الأجسام المضادة: 488/546 نانومتر (استخدام فقط للأسلوب التعبير نره-IR)، Draq5 الفلورسنت التحقيق: 633/680 نانومتر.
        2. إعداد معلمات التصوير باستخدام الخلايا السيطرة السلبية. استخدم هذه المعلمات لخلايا صورة المعالجة (الشكل 3). إعادة ضبط المعلمات التصوير على كل الشرائح المجهرية في بداية التحليل. لحن جيد وتصدير الصور مع البرامج المقدمة من قبل الشركة المصنعة إذا لزم الأمر.

    3. تنشيط الإسفار الفرز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية)

    1. نره طريقة القياس الكمي
      1. تأخذ لوحة أعدت في الخطوة 1.8 و ماصة خارج المتوسطة كاملة من عصامالفصل من الآبار السبعة. إضافة 1 مل من المتوسط ​​الشامل مسخن في البئر الأول. استخدام هذا كوسيلة لمراقبة سلبية. إضافة 1 مل لكل من ستة مسخن علاج وسائل الإعلام (3 آبار مع 1 ميكرومتر و 3 آبار مع 10 ميكرومتر) في الآبار الستة المقبلة. احتضان لوحة في ترطيب، 5٪ CO 2 جو الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات.
      2. ماصة من المتوسط ​​من كل جانب. غسل الخلايا مرتين مع 2 مل برنامج تلفزيوني بعناية. إضافة 500 ميكرولتر من محلول التربسين-EDTA في كل الآبار. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية حتى الخلايا تنفصل (حوالي 10 دقيقة).
      3. إضافة 1 مل من المتوسط ​​الشامل في كل بئر لوقف التربسين. يهز لوحة. تعليق الخلايا بلطف مع ماصة، ونقل تعليق من كل بئر في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية. أنابيب الطرد المركزي في 150 x ج لمدة 4 دقائق، في 4 درجات مئوية.
      4. من اجل الخروج من supernatants بعناية، مع خطوة واحدة. إضافة 500 ميكرولتر من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني في كل أنبوب FACS وبلطف اعادة تعليق الخلايا. إبقاء الأنابيب على الجليد حتى نهايةالتجربة.
    2. تحليل وحساب
      1. تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي. لالإثارة، استخدم 488 نانومتر الطول الموجي الأرجون ليزر وللكشف عن استخدام 530 نانومتر الطول الموجي. إعداد تدفق عداد الكريات المعلمات عن طريق تشغيل الخلايا السيطرة السلبية. استخدم هذه المعلمات لتحليل الخلايا المعالجة (الشكل 4A). تقييم البيانات مع برنامج الشركة المصنعة، وتحديد متوسط ​​كثافة الفلورسنت (MFI) القيم، وحساب القيم المؤسسة النسبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الصور التي تم الحصول عليها عن طريق الليزر متحد البؤر المسح المجهري (CLSM) تقدم معلومات مذهلة حول الإقبال على تقارن نره-FITC على الثقافة خلية معينة في وقت وتركيز بطريقة تعتمد. بالتوازي مع هذه تقارن-نره FITC، وجود نره الأشعة تحت الحمراء على سطح الخلية هو أيضا التحقق منه من التجربة CLSM. وعلاوة على ذلك، باستخدام الحمض النووي تلطيخ التحقيق الفلورسنت بعيدة الحمراء، فمن الممكن أن مباين نوى الخلايا إلى جانب نره ونره الأشعة تحت الحمراء. ومع ذلك، في حين أن صورة مبائر ليست قابلة للقياس، وبسيط "طريقة نره امتصاص" يمكن أن تقدر بسهولة ما إذا كانت الخلايا اختبار تحتوي على كمية أعلى أو أقل من تقارن نره-FITC. وينطبق تقارن نره-FITC، تركيزاتها، والوقت من العلاج هي متغيرة في هذه الطريقة، حسب الحاجة. كما هو مبين في الشكل رقم 1 الخلايا السرطانية المختلفة تحتوي على مستويات مختلفة من نره-FITC بطريقة تعتمد على التركيز. المتقدمة "نره-IR طريقة التعبير" يصف التصور من سطح الخلية نره الأشعة تحت الحمراء التي كتبها مناعية، قبل وبعد العلاج نره-FITC. في الجزء الأول من هذا الأسلوب (قبل العلاج نره-FITC)، ونحن تصور نره الأشعة تحت الحمراء التي كتبها مناعية، من دون علاج نره-FITC. في الجزء الثاني من هذه الطريقة (بعد العلاج نره-FITC)، ونحن علاج الخلايا لمدة 1 ساعة مع 10 ميكرومتر نره-FITC. بعد العلاج، ونحن احتضان خلايا في المتوسط ​​كاملة لمزيد من 1 ساعة وتصور نره الأشعة تحت الحمراء التي كتبها مناعية. كما هو مبين في الشكل 2A، الخلايا السرطانية المختلفة تبدي مستويات مختلفة من نره الأشعة تحت الحمراء على سطحها قبل العلاج نره-FITC. كما هو مبين في الشكل 2B، بعد العلاج نره-FITC، ونره-IR معربا عن الخلايا المحافظة (EBC-1) أو زيادة (ديترويت-562) مستوى نره الأشعة تحت الحمراء على الأغشية. عند هذه النقطة، لاحظ أن أكدنا سابقا أن عاشراخلايا PC-3 أيضا التعبير عن نره، الأشعة تحت الحمراء، ولكن لا تقدم على غشاء 18. يمكن تصور نره الأشعة تحت الحمراء داخل خلايا BxPC 3 من مناعية إذا permeabilized أغشيتها. هذه الظاهرة تفسر أقل نسبيا نره كفاءة امتصاص BxPC-3 خلايا. واستنادا إلى هذه البيانات ونحن نركز فقط على سطح الخلية نره-IR هنا. مقارنة الشكل 1 إلى الشكل 2 يؤكد أن مستوى سطح الخلية نره-IR يرتبط مع كمية من نره-FITC في الخلايا المناظرة. وعلاوة على ذلك، الشكل 3C يوضح أن نره-FITC والمنضوية داخل الخلايا ليتم فصل توطين نره-FITC من إشارة من سطح الخلية نره-I-رافتر 1 ساعة من العلاج نره-FITC. نخلص إلى أن "نره-IR طريقة التعبير" يدعم المعلومات التي حصلت عليها من "نره طريقة امتصاص".

من المهم استخدام مجموعة متكيفالرنين أثناء التصوير. كما هو موضح في الشكل 3A في الطول الموجي انبعاث FITC (514 نانومتر) وfluorophore الأجسام المضادة الثانوية المسمى (546 نانومتر)، لديها خلايا السيطرة السلبية غير المعالجة أيضا تألق ذاتي طفيف. هذا مضان غير مرغوب فيها يمكن أن توفر نتائج إيجابية كاذبة. وبالتالي، في بداية التصوير من المهم لضبط كثافة مضان على الخلايا السيطرة كما هو مبين في الشكل 3B. ومن المتوقع أن أحدا لن يلاحظ إشارة واضحة من نوى في الطول الموجي الانبعاثات من وصمة عار النووية (680 نانومتر)، مع إشارة الفلورسنت على اثنين من الأطوال الموجية الأخرى هي مجرد مرئية أو قريبة من الصفر. يجب تصوير جميع العينات خلية أخرى مع هذه المعايير المعدلة بشكل جيد وثابت. بهذه الطريقة، مشتق إشارة لوحظ في 514 نانومتر من إشارة FITC-نره فقط، في 546 نانومتر من إشارة من نره الأشعة تحت الحمراء بشكل خاص، وعلى 680 نانومتر من إشارة من نوى كما هو مبين في الشكل 3C. الصور يمكن أن تكون فايشمال شرق ضبطها بعد التصوير باستخدام البرنامج إذا لزم الأمر.

التدفق الخلوي التجارب تقدم معلومات قابلة للقياس حول كمية تقارن نره-FITC التي تم تناولها من قبل الخلايا. وينطبق تقارن نره-FITC، تركيزاتها والوقت من العلاج هي أيضا متغيرة في هذه الطريقة، حسب الحاجة. وتستخدم الخلايا غير المعالجة سيطرة سلبية لضبط التدفق الخلوي المعلمات وتحديد كثافة الفلورسنت متوسط ​​من (MFI) في بداية التحليل. كما هو موضح في الشكل 4A تم تحديد مؤسسات التمويل الأصغر لكل عينة باستخدام نفس المعلمات. يتم احتساب القيم المؤسسة النسبية من القيم المؤسسة باستخدام صيغة حسابية في الشكل 4B. باستخدام هذه الصيغة، وقيمة التمويل الأصغر النسبية للخلايا السيطرة دائما صفر. قيم المؤسسة النسبية تحسب قياس كثافة الفلورسنت من تقارن نره-FITC، حيث يتناسب إلى بهمتركيزات verage في الخلايا. كما هو موضح في الشكل (5)، مع هذه البيانات، يمكن للمرء أن التظاهر ومقارنة مدى كفاءة تأخذ هذه الخلايا السرطانية حتى تقارن-نره FITC. وهكذا، والنتائج التي تم الحصول عليها عن طريق التدفق الخلوي تكمل وتدعم الصور التي حصل عليها الفحص المجهري متحد البؤر.

شكل 1
الشكل 1: صور متحد البؤر من دون علاج و[ليز 8 (FITC)] - تعامل نره الثالث الخلايا السرطانية. الزرقاء وصمة عار: نوى. وصمة عار الخضراء: [ليز 8 (FITC)] - [نره] الثالث. ويتم الحصول على هذه الصور باستخدام "نره طريقة امتصاص". (أ) يتم تعديل الإشارات مضان من الخلايا غير المعالجة إلى ما يقرب من الصفر في 514 نانومتر (الأخضر) على كل خط الخلية. يتم استخدام Draq5 بعيدة الحمراء التحقيق الفلورسنت وصمة عار على نوى الخلايا. (ب) بعد تطبيق الإعدادات، وسرطان الرئة EBC-1 والإنسان ديترويت-562تظهر الخلايا السرطانية البلعوم اكتشافها، ولكن انخفاض إشارة في 514 نانومتر (الخضراء) بعد العلاج 5 ساعات مع 1 ميكرومتر [ليز 8 (FITC)] - [نره] الثالث. (C) بعد العلاج 5 ساعات مع 10 ميكرومتر [ليز 8 (FITC)] - [نره] الثاني والثالث، كل من خطوط الخلايا الثلاث الحالية إشارة أعلى الفلورسنت. نتائج هذه التجربة تشير إلى أن الخلايا السرطانية في البنكرياس BxPC 3 اتخذوا نره-FITC مع أقل بكثير كفاءة بالمقارنة مع خطين الخلايا الأخرى التي استهدافه بسهولة عن طريق تقارن نره. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: صور متحد البؤر من سطح الخلية نره الأشعة تحت الحمراء قبل وبعد [D-ليز 6 (FITC)] - العلاج نره-I. الزرقاء وصمة عار: نوى. وصمة عار الخضراء: [D-ليز 6 (FITC)] - نره-I. بقعة حمراء : نره الأشعة تحت الحمراء. يتم إنشاء هذه الصور باستخدام "نره-IR طريقة التعبير". (A) قبل العلاج نره-FITC، BxPC-3 خلايا لا يكون نره الأشعة تحت الحمراء على الغشاء، ولكن EBC-1 الخلايا تظهر ارتفاع، وبعض خلايا ديترويت-562 تظهر مستوى معتدل من نره الأشعة تحت الحمراء. (ب) بعد العلاج نره-FITC، BxPC-3 خلايا زال لا يحمل نره الأشعة تحت الحمراء على غشاء. الحفاظ على EBC-1 خلايا يبدو التعبير نره الأشعة تحت الحمراء ونره-FITC داخل منهم. يبدو ديترويت-562 الخلايا لاظهار مستوى أعلى من نره-IR بعد العلاج وتأخذ نره-FITC، كذلك. هذه التجربة كشفت أن أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية الخبيثة تبدي مستوى مختلف من نره الأشعة تحت الحمراء على سطحها، ويبدو أن هذا الإقبال نره-FITC أن ترتبط ارتباطا وثيقا سطح الخلية التعبير نره الأشعة تحت الحمراء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الشكل (3)
الشكل (3): صور متحد البؤر الخلايا EBC-1 سرطان الرئة. الزرقاء وصمة عار: نوى. وصمة عار الخضراء: [ليز 8 (FITC)] - نره-الثالث؛ بقعة حمراء: نره الأشعة تحت الحمراء. وتتكون هذه الصور من قبل "نره-IR طريقة التعبير". (A) غير المعالجة الخلايا السيطرة السلبية (بدون نره-FITC واليكسا 546) يكون مضان كشفها وغير مرغوب فيها في 514 نانومتر و 546 نانومتر عند استخدام إعدادات أداة الإفراط في تضخيم. (ب) ضبط إعدادات الأداة على الخلايا السيطرة السلبية غير المعالجة، والأخضر (514nm) والأحمر (546 نانومتر) إشارة هي قريبة من الصفر. (ج) المعايير المعدلة تؤدي إلى إشارات واضحة وموثوقة لنره-FITC المعالجة ونره-IR الخلايا الملون. بعد العلاج نره-FITC، يتم فصل توطين نره-FITC (الخضراء) من سطح الخلية نره الأشعة تحت الحمراء (الحمراء).529fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: تقييم التدفق الخلوي البيانات. (A) رسم بياني من دون علاج وتعامل خلايا ديترويت-562. يتم تحديد القيمة مؤسسات التمويل الأصغر من العينات خلية من الرسم البياني. محور س يصور كثافة الفلورسنت من الخلايا، والمحور الصادي يصور التهم الموجهة إليه. الخط الأسود: مؤسسات التمويل الأصغر قبل العلاج نره-FITC. خط منقط الأخضر: مؤسسات التمويل الأصغر بعد العلاج 5 ساعات مع 1 ميكرومتر [ليز 8 (FITC)] - نره-الثالث؛ أحمر متقطع السطر: مؤسسات التمويل الأصغر بعد العلاج 5 ساعات مع 10 ميكرومتر [ليز 8 (FITC)] - [نره] الثالث. (ب) صيغة حساب القيم المؤسسة النسبية. يتم احتساب القيم المؤسسة النسبية من القيم المؤسسة. باستخدام هذا الحساب، وقيمة التمويل الأصغر النسبية للعينة ضابطة هو دائما صفر. وتعصب قيم إيف مؤسسات التمويل الأصغر من العينات المعالجة تمثل كمية تقارن نره-FITC التي هي داخل الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: القيم المؤسسة النسبية من الخلايا السرطانية بعد العلاج 5 ساعات مع 1 ميكرومتر من تقارن نره-FITC. قيم المؤسسة النسبية قابلة للمقارنة وتحديد مدى كفاءة أنواع خلية معينة يمكن أن يستغرق فترة تصل نظائرها نره. والخلايا نره الأشعة تحت الحمراء غير العارضة BxPC 3 تحتوي على آثار فقط من هذه نظائرها نره. والأشعة تحت الحمراء نره معربا عن EBC-1 خلايا سرطان الرئة تحتوي المعتدلة والخلايا السرطانية البلعوم ديترويت-562 تحتوي على كمية عالية من نظائرها نره. يتم عرض النتائج على النحو يعني ± SD، ن = 3."_blank"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التجارب وصفت هنا استخدام المسمى انتقائي نظائرها نره لتمسكا فحص مزارع الخلايا في المختبر. المجهر متحد البؤر والتدفق الخلوي طرق مناسبة لتتبع وقياس امتصاص الخلوية من هذه تقارن-نره FITC في وقت وتركيز بطريقة تعتمد. هذه التجارب لها الخطوات الهامة التالية: 1) الحفاظ على والثقافة خلية صحية معقمة. 2) يجب أن يكون الببتيدات نره من جودة عالية؛ 3) يجب اتباعها تركيزات معقولة وحضانة مرات. 4) علاج وغسل الخطوات. 5) إعدادات أداة متكيف.

يتم الاحتفاظ الخلايا في المتوسط ​​أوصت الشركة المصنعة تستكمل مع 10٪ (V / V) الجنين مصل بقري والمضادات الحيوية (المتوسط ​​الشامل). يجب أن تبقى الخلايا والتعامل في بيئة معقمة حتى الخطوات العلاج (مع تقارن نره-FITC). قبل التجارب، والتحقق من الخلايا باستخدام مجهر مقلوب. يجب أن تكون صحية، المرفق ويجب أن تصل الكميات المطلوبة.

من المهم أن استخدام الببتيدات نره ذات جودة عالية ونقاء. نحن تجميع هذه الببتيدات وطهرتهم إلى أكثر من 98٪ 18. الببتيد يمكن تخزينها في -25 درجة مئوية في ثلاجة على شكل مسحوق مجفف بالتجميد. يجب أن تبقى الحلول الأسهم ملم نره-FITC 10 في DMSO في مكان مظلم في درجة حرارة الغرفة واستخدامها في غضون بضعة أسابيع. نحن التحقيق في استقرار هذه تقارن وجدت أنهم مستقر في DMSO ويتم الاحتفاظ كثافة مضان على بعد 1 شهر التخزين السليم. تركيز تقارن-نره FITC والوقت من العلاجات هي المتغير في هذه التجارب، والتي توفر مزايا كبيرة، ولكن مع بعض القيود (أنظر أدناه). تركيزات التطبيقية وحضانة مرات في هذا البروتوكول هي توصيات فقط، ولكنها توفر أساسا جيدا للتجارب الأولية.

التجارب تتطلب CLSM قطعآل خطوات الغسيل. وينبغي إجراء هذه الخطوات بعناية. لا نقل السوائل مباشرة على الخلايا. بدلا من ذلك، استخدام الجانب أو ركن من الآبار لهذا الغرض. هذا يمكن أن تقلل غسله وفقدان الخلايا الالتزام. فمن المستحسن أيضا لتجنب ضوء المباشر خلال التجربة برمتها، لأنها يمكن أن توعي عينات الفلورسنت (photobleaching من تأثير). الحفاظ على عينات عولجوا في مكان مظلم أو مغطاة بقطعة من ورق الألمنيوم أثناء التجربة. وبناء على النتائج السابقة، لاحظنا أن تركيز DMSO النهائية في وسائل الإعلام علاج تطبيق لا يكاد يذكر (0.1٪ (V / V) DMSO في 10 ميكرومتر علاج وسائل الإعلام) وليس لديها تأثير على النتائج، المتوسطة كاملة وبالتالي مجانا DMSO هو مناسبة أيضا السيطرة السلبية.

ومن المهم استخدام المعلمات أداة متكيف خلال التجارب CLSM ونظام مراقبة الأصول الميدانية. لا بد من إعادة معايرة على كل نوع من الخلايا، قبل يحلل كل من هذه المعايير. في التجربة CLSM، والاشتراكيةكثافة gnal من الصور مبائر تعتمد على المعايير التالية: كثافة الليزر، وزيادة كاشف وتعويض، وحجم الثقب. عند ضبط هذه المعايير، استخدام أقل قوة الليزر لإنتاج صورة مقبولة وتجنب photobleaching من. تعيين المعلمات التصوير لضبط مضان الخلفية من الخلايا السيطرة السلبية غير ملوثين إلى الصفر تقريبا (الشكل 3B). صورة تعامل الخلايا مع هذه المعايير تعديلها لتجنب نتائج إيجابية كاذبة. إشارات إضافية المنبعثة من الخلايا المعالجة في 514 نانومتر و 546 نانومتر تحتوي على المعلومات المطلوبة حول نره أو نره الأشعة تحت الحمراء. تتطلب هذه الخطوات الخبرة في التجارب CLSM. في تجربة نظام مراقبة الأصول الميدانية، خلق معيار الأمام مؤامرة مبعثر الجانب مبعثر (مقياس خطي) وتعيين الفولتية لضبط السكان الخلية الحية الرئيسي في منتصف المؤامرة. رسم المنطقة حول الخلايا الحية. إنشاء الرسم البياني، تعيين الإحداثي السيني لقناة واحدة (FL1-530 نانومتر، مقياس لوغاريتمي) وتعيين المنطقة المحددة سابقا كبوابةلهذا الرسم البياني. تعيين FL1 الجهد لجعل إشارة من الخلايا السيطرة السلبية غير ملوثين تحت 10 1 (الشكل 4A). تحليل الخلايا تعامل مع هذه المعايير المعدلة.

وعلاوة على ذلك، فمن المهم للتحقق من حالة الميكوبلازما من مزارع الخلايا من وقت لآخر. تتوفر فحوصات مختلفة لهذا الغرض. في حالة من الإيجابية الميكوبلازما، تجاهل الخلايا وبدء العمل مع ثقافة جديدة. فمن المستحسن استخدام خليط المضادات الحيوية في مستنبت الذي هو الأمثل لمنع الميكوبلازما. تركيز التطبيقية تقارن نره-FITC، والوقت من العلاجات هي المتغير في هذه التجارب، ولكن تطبيق تركيزات منخفضة والأوقات حضانة قصيرة يمكن أن يؤدي إلى إشارات ضعيفة للغاية للكشف عن مضان.

عندما التصوير نره-IR بالتوازي مع نظائرها نره، فمن المستحسن أعلى تركيز نره-FITC (10 ميكرومتر هو الأمثل). والسبب في تركيز أعلىهو وقت قصير الحضانة (1 ساعة) وعالية نسبيا إشارة مضان من الأجسام المضادة المسمى مقارنة تقارن نره-FITC. من ناحية أخرى، تم العثور على تداخل بسيط بين اثنين من انبعاثات صبغة الفلورسنت (514 نانومتر و 546 نانومتر)، والذي يحدث فقط في 546 نانومتر، ومشتق من إشارة تقارن نره-FITC. ومع ذلك، يمكن للإشارة الفلورسنت أعلى نسبيا من اليكسا 546 و المعلمات متكيف تقليل هذا التأثير، كما هو موضح في الشكل (3). حل آخر ممكن لتجنب التداخل، هو تطبيق المسمى الأجسام المضادة الثانوية التي لديها مختلفة الطول الموجي الإثارة و / أو طيف الانبعاث أفضل منفصل مقابل FITC (إذا كانت المعايير الفنية CLSM تسمح بذلك). تقدم هذا الاحتمال ميزة كبيرة للأسلوب CLSM، والتي تمكن باستخدام تحقيقات الفلورسنت اختياري بالتوازي مع تقارن-نره] FITC. على سبيل المثال، هذه التحقيقات الفلورسنت بديلة يمكن أن تستخدم لcounterstaining العضيات الأخرى حسب الحاجة.

تركيز التطبيقية تقارن نره-FITC للقيود التالية. ويستند حد أقصى تركيز تقارن نره-FITC على ذوبانها 18. تلك القيم هي التالية في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة: نره-I: 90 ميكرومتر. نره-II: 40 ميكرومتر. نره-III: 200 ميكرومتر. من ناحية أخرى، في التجارب السابقة نحن من المفترض أن الإقبال على هذه الببتيدات نره يمكن أن يتم من خلال مستقبلات أخرى من مستقبلات نره-I الإنسان؛ يبدو أن هذا الإقبال أن يكون أكثر أهمية في تركيزات أعلى (فوق 10 ميكرومتر) 18. ويستند حد الكشف أقل من تقارن نره-FITC على مجموعة متنوعة من المعلمات، ولكن في ظروف مثالية هو ما يقرب من 1 ميكرومتر للتجارب CLMS. وجدنا أن تدفق يقدم الخلوي حساسية أفضل من متحد البؤر المجهري. في إعدادات مثالية، يمكن الحد الكمي لتقارن نره-FITC أن يكون أقل من 1 ميكرومتر. الحد من الكشف أو الكمي يمكنتكون مختلفة في كل تجربة، لأنها تعتمد على نوع من الخلايا وفترة حضانة. لاحظ أن البيانات التي تم الحصول عليها عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية هو أكثر موثوقية من CLSM، لأنه يكتشف الآلاف من الخلايا في العينة ويتم حساب متوسط ​​إشارة من الخلايا. ومع ذلك، في البروتوكول، FACS لا يوفر معلومات حول توطين الخلوية تقارن نره-FITC والتعبير سطح الخلية من نره الأشعة تحت الحمراء. وبناء على هذه الاعتبارات فإننا نستنتج أن وCLSM والتجارب FACS لها مزايا متميزة، وأنها تكمل بعضها البعض. من ناحية أخرى، يمكن أن ارتفاع تحليل الصور المحتوى تكون مثيرة للاهتمام وبديل جيد لنظام مراقبة الأصول الميدانية وتحليل CLSM.

وباختصار، فإن البيانات التي تم الحصول عليها من هذه التجارب تؤكد أن كل من تقارن ثلاثة نره FITC يمكن أن تدخل إلى الخلايا التي تعبر عن سطح الخلية نره الأشعة تحت الحمراء. هذه نظائرها نره لها قوة استهداف مماثلة في نفس التركيزات. ومع ذلك، فإن مستوى نره الأشعة تحت الحمراء على سطح العلبة مختلفةخلايا حدات خفض الانبعاثات المعتمدة هي شديدة التباين. النتائج المحسوبة من بيانات تحليل التدفق الخلوي تمكن المقارنة من خطوط الخلايا أو نظائرها نره. وفي الوقت نفسه، يمكن أن الصور التي تم الحصول عليها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر تكشف عن مستوى سطح الخلية التعبير نره الأشعة تحت الحمراء وتؤكد التي استوعبت هذه تقارن في الخلايا. وبناء على هذه النتائج، يمكن للمرء أن تأكد من أن التجارب قدم تحتوي على أساليب عملية والمتغيرة للتحقيق في أنظمة توصيل الدواء نره مقرها وتوفر أساسا جيدا لمزيد من التجارب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EBC-1 JCRB Cell Bank JCRB0820 Human lung squamous cell carcinoma
BxPC-3 ATCC CRL-1687 Human pancreatic adenocarcinoma
Detroit-562 ATCC CCL-138 Human pharyngeal carcinoma
RPMI-1640 Medium with L-glutamine Lonza BE12-702F Culture medium for BxPC-3 cells
Eagle's Minimum Essential Medium Lonza BE12-611F Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0.1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells
Fetal Bovine Serum Euro Clone ECS0180L Complements the culture medium
MycoZap Plus-CL  Lonza VZA-2012 Complements the culture medium (antibiotics)
Standard Line Cell Culture Flasks VWR 10062-872 Provide consistent, sterile growth environment for cells
Trypsin-EDTA Mixture  Lonza BE17-161E Remove attached cells
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza BE17-516F Solvent
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418-100ML Solvent
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061 Used to counting cells
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I made by us - Purity ≥98% (HPLC)
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II made by us - Purity ≥98% (HPLC)
[Lys8(FITC)]-GnRH-III made by us - Purity ≥98% (HPLC)
glass bottom 8-well microscopic slide Ibidi 80826 Use in CLSM experiment
Corning Costar cell culture plate, 12 well Sigma-Aldrich CLS3513-50EA Use in FACS experiment
Fixing solution (10% neutral buffered formalin) Bio-Optica 01V60P Fix adherent cells
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-10G Prevent the nonspecific binding of the antibodies
GnRHR Antibody Proteintech 19950-1-AP Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors
Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate Thermo Fisher Scientific A11035 Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody
Fluorescent probe solution (Draq5) Thermo Fisher Scientific 62254 Counterstain nuclei
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML Use in CLSM experiment, preserving fluorescence
Inverted microscope Elektro-Optika Ltd.  Alpha XDS-2T Check the phenotype and confluency of cell cultures
Inverted confocal laser scanning microscope Zeiss LSM-710 Use in CLSM experiment
Flow cytometer BD Biosciences BD FACSCalibur Use in FACS experiment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11 (2016).
  2. Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
  3. Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K. GnRH in non-hypothalamic reproductive tissues. Anim Reprod Sci. 88 (1-2), 95-113 (2005).
  4. Schally, A. V., et al. Hypothalamic hormones and cancer. Front Neuroendocrinol. 22 (4), 248-291 (2001).
  5. Limonta, P., et al. GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies. Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).
  6. Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances. J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).
  7. Manea, M., et al. In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice. Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).
  8. Argyros, O., et al. Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth. Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).
  9. Karampelas, T., et al. GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery. Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).
  10. Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -L. Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling. Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).
  11. Millar, R. P., et al. Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).
  12. Olberg, D. E., et al. Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression. Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).
  13. Zoghi, M., et al. Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging. Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).
  14. Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging. Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).
  15. Nederpelt, I., et al. Characterization of 12 GnRH peptide agonists - A kinetic perspective. Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).
  16. Szabo, I., et al. Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting. J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).
  17. Leurs, U., et al. GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate. Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).
  18. Murányi, J., et al. Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells. J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 121، استهدف العلاج، والسرطان، والخلايا السرطانية، المكورات، الفحص المجهري متحد البؤر، نره، FITC، نظام مراقبة الأصول الميدانية، CLSM
<em>في المختبر</em> التصوير والكمي لاستهداف الكفاءة المخدرات من النظائر نره Fluorescently إعتبر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murányi, J., Varga, A., Gurbi,… More

Murányi, J., Varga, A., Gurbi, B., Gyulavári, P., Mező, G., Vántus, T. In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues. J. Vis. Exp. (121), e55529, doi:10.3791/55529 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter