Summary
Selektivt fluorescerende GnRH-I, -II og iii derivater er pålitelige verktøy for sporing og kvantifisere deres cellulært opptak. Dette manuskriptet introduserer eksperimenter for å visualisere, kvantifisere og sammenligne opptak effektiviteten av disse GnRH konjugater i ulike cellelinjer.
Abstract
GnRH-analoger er effektive rettet mot gruppene og i stand til å levere legemidler mot kreft selektivt til maligne tumorceller som sterkt uttrykte GnRH reseptorer. Imidlertid er kvantitativ analyse av GnRH analoger 'cellulært opptak og de undersøkte celletyper i GnRH-basert medikament leveringssystemer for tiden begrenset. Tidligere innført, selektivt fluorescerende GnRH jeg, -II og iii derivater gir stor detectability, og de har egnede kjemiske egenskaper for reproduserbare og robuste eksperimenter. Vi fant også at de aktuelle up-to-date metoder med disse merkede GnRH-analoger kan tilby roman informasjon om GnRH-basert medikament leveringssystemer. Dette manuskriptet introduserer noen enkle og raske eksperimenter om cellulært opptak av [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II og [Lys 8 (FITC)] - GnRH -III på EBC-1 (lunge), den BxPC-3 (bukspyttkjertelen) og på Detroit-562- (svelget) ondartet tumor celler. Parallelt med disse GnRH-FITC-konjugater ble celleoverflatenivået av GnRH-I-reseptorer også undersøkt på disse cellelinjene før og etter den GnRH behandling av konfokal laser-skanning mikroskopi. Den cellulære opptak av GnRH-FITC-konjugater ble kvantifisert ved fluorescens-aktivert cellesortering. I disse eksperimentene små forskjeller mellom GnRH-analoger og store forskjeller mellom celletyper ble observert. De betydelige forskjeller mellom cellelinjer er korrelert med deres distinkte nivå av celleoverflate-GnRH-I-reseptorer. De innførte Forsøkene inneholde praktiske metoder for å visualisere, kvantifisere og sammenligne opptakseffektiviteten av GnRH-FITC-konjugater i en tids- og konsentrasjonsavhengig måte på forskjellige adherente cellekulturer. Disse resultatene kan forutsi legemiddelmålretting effektiviteten av GnRH konjugater på den gitte cellekultur, og gir et godt grunnlag for videre eksperimenter i undersøkelsen av GnRH-baserte stoffet leveringssystemer.
Introduction
Peptide basert målrettede stoffet leveringssystemer har blitt en rask utvikling og lovende område i kreftbehandling i løpet av de siste årene med 1, 2. Menneskelig gonadotropin frigjørende hormon reseptor type I (GnRH-IR) er først og fremst ligger i hypofysen, men er også til stede i flere andre vev som er ansvarlig for selv reproduksjon tre. GnRH-IR er også uttrykt i et antall av kreftvev, relatert eller urelatert til det reproduktive system 4, 5. Den høye ekspresjon av GnRH-IR på flere maligne tumorceller sammenlignet med friskt vev gir en mulighet for målrettet terapi 5, 6.
Mange gonadotropin-frigjørende hormon (GnRH) analoger har blitt utviklet i de siste tiårene, som kan brukes som målgruppe andelerf "> 7, 8, 9. Disse peptidene er i stand til å levere anticancermidler med høy selektivitet til maligne tumorceller som overuttrykker GnRH-IR-6. En rekke GnRH-konjugerte anti-tumor medikamenter med høyere selektivitet og bedre effektivitet enn den tilsvarende ukonjugerte fritt medikament er blitt rapportert 7, 8, 9.
Tidligere publikasjoner om GnRH peptider og deres reseptorer rapportert at GnRH-IR kan anta ulike konformasjoner som har forskjellig selektivitet for GnRH analoger 10. Den svært variabel GnRH-IR har komplekse og ulike signalveier er utstyrt med forskjellig aktivitet mot sine naturlige og kunstige ligander 11. Disse fakta gjør etterforskningen av GnRH-baserte systemer utfordrende. På den annen side, y besitte lovende terapeutisk potensiale. En rekke forsøk med radiomerkede GnRH-peptider ble tidligere rapportert 12, 13, 14, 15, men eksperimenter hvor fluorescensmerkede GnRH-analoger ble brukt er fortsatt begrenset. Mens radioaktiv merking gir høy følsomhet, har fluorescerende markør flere andre fordeler, for eksempel den lettere håndtering, og evnen til å counterstain med forskjellige fluoroforer. Tre vanlige GnRH-analoger som har med hell blitt brukt til levering av legemidler er den [D-Lys 6] -GnRH-I, [D-Lys 6] -GnRH-II og GnRH-III, men effektiviteten av disse peptidene som er målrettet mot molekyldelene ligger sjelden sammenlignet 16, 17. På den annen side er resultatene fra separate forsøk hvor ulike kreftceller og GnRH-analoger ble brukt er mangfoldig.
ntent "> Basert på disse vurderingene, vi fokusert på svulsten målretting og levering av legemidler potensialet i disse GnRH peptider, og dermed syntetisert og karakterisert den [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] - GnRH-II og [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III-peptid konjugater 18 Disse analogene blir selektivt merket med FITC på sidekjeden av deres Lys eller D-Lys (peptid-FITC-forhold på 1: 1 i hver. konjugat). Tanken var at den selektive fluorescerende merking kan tilby roman informasjon om disse peptidene, og gjør deres gode sporing og pålitelig kvantifisering. disse konjugater har sikker håndtering og pålitelig detectability, noe som gjør det lettere å sammenligne deres svulst målretting effektivitet, og screening av mange typer ondartede kreftceller. Vi håper at up-to date eksperimenter med disse peptidkonjugater kunne bidra til utvikling av nye kreft målretting GnRH-legemiddelkonjugater, og bidra til å identifisere nye terapeutiske tjæreblir i tillegg.Den nåværende manuskriptet viser noen godt reproduserbare og raske eksperimenter med GnRH-FITC konjugater. Celleoverflate-ekspresjon av GnRH-R er en avgjørende betingelse angående GnRH-opptaket, derfor samtidig undersøkt celleoverflatenivået av GnRH-IR på de testede cellelinjer. Vi visualisert GnRH-IR og GnRH-FITC konjugater av konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) og kvantifisert cellulært opptak av GnRH-FITC konjugater med fluorescens-aktivert celle sortering (FACS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av cellekulturer og reagenser
- Opprettholde cellekulturene i produsentens anbefalte medium, supplert med 10% (v / v) føtalt bovint serum og antibiotika (kalt komplett medium). Hold celledyrking kolben i en fuktet, 5% CO2 atmosfære inkubator ved 37 ° C. Flg spredning og sammenflytning av celler ved invertert mikroskop (ved hjelp av fasekontrast 10X objektiv).
- Når cellene når konfluens tilstrekkelig, fjern mediet og vask kulturen med 2-3 ml steril fosfatbufret saltløsning (PBS). Fjern PBS og tilsett 0,5 ml, steril 0,25% trypsin-EDTA-oppløsning til cellekulturen og inkuberes ved 37 ° C inntil cellene løsner (ca. 10 min).
- Suspendere cellene i 3-4 ml sterilt fullstendig medium for å stoppe trypsin og overføre dem til et sterilt sentrifugerør. Sentrifuger cellene ved 150 xg i 4 min ved romtemperatur (RT). Kast supernatanten forsiktig og suspendere pellet i 2-3 ml sterilt komplett medium.
- Ta ut 100 ul av cellesuspensjonen og blandes med 100 pl 0,4% (m / V) trypan blå løsning, å farge døde celler. Belastning 10 ul av denne blandingen inn i et hemocytometer og bestemme antallet levedyktige celler ved invertert mikroskop.
- Fortynn den nødvendige mengde av cellesuspensjonen fremstilt i trinn 1,3 til 10 ml med sterilt komplett medium, inneholdende 4 x 10 4 celle / ml.
- Tilsett 250 ul cellesuspensjon (fremstilt i trinn 1.5) per brønn (10 fire celle / brønn) i syv brønner av den første glassbunn 8-brønns mikroskopisk lysbilde. Bruk dette lysbildet i GnRH opptak metoden.
- Tilsett 250 ul cellesuspensjon (fremstilt i trinn 1.5) per brønn (10 fire celle / brønn) i fem brønner i den andre 8-brønns mikroskopisk lysbilde. Dette lysbildet vil bli brukt i den GnRH-IR uttrykk metode.
- Tilsett 1 ml cellesuspensjon (fremstilt i trinn 1.5) per brønn (4 x 10 4 celle / brønn) i syv WELls av en 12-brønns plate. Denne plate vil bli brukt i den GnRH kvantifisering metoden.
- La cellene holder seg på de to mikroskopiske objektglass og platen. Inkuber dem i en fuktet, 5% CO2 atmosfære inkubator ved 37 ° C i 48 timer.
- Etter inkuberingen kontrollere cellene ved invertert mikroskop (ved hjelp av fasekontrast 10X objektiv). Hvis cellene er friske og festet, fortsetter du med følgende trinn.
- Forbered 10 mM GnRH-FITC stamløsning i dimetylsulfoksid (DMSO) fra hver av de tre konjugater 18. (Bruk disse fortynning konsentrasjoner: 16,43 g / mL [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, 16,97 g / mL [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II og 16,47 mg / mL [Lys 8 ( FITC)] - GnRH-III) Oppbevar disse stamløsninger i et mørkt sted ved romtemperatur og bruke dem opp i løpet av få uker.
- Fortynne 1,7 ul av hver av de tre 10 mM GnRH-FITC stamløsninger i 1,7 ml komplett medium. Rist disse løsningene. (These er 10 pM GnRH-FITC behandlende media.) Fortynn 150 ul av hver av de tre 10 pM GnRH-FITC behandling medium i 1,35 ml fullstendig medium. Rist disse løsningene også (disse er 1fiM GnRH-FITC behandling medium).
MERK: All GnRH-FITC inneholder behandling medium bør beskyttes mot lys og brukes opp i løpet av noen få timer. - Forvarm seks GnRH-FITC behandling medium (fremstilt i trinn 1.12) og 4 ml fullstendig medium til 37 ° C.
- Fortynn 3 mL av 5 mM fluorescerende probe-oppløsning (atom counterstain nevnt i Materials List) i 3 ml PBS til 5 uM. Denne løsningen skal beskyttes mot lys, ha den på RT og bruke den opp i løpet av få timer.
2. Confocal Laser Scanning Mikroskopi (CLSM)
- GnRH opptak metode
- Ta det første mikroskopiske lysbilde fremstilt i trinn 1.6 og pipettere ut den komplette mediet fra hver av de syv brønnen. Tilsett 250 mL av forvarmes komplett medium inn i den første brønnen. Bruk dette som en negativ kontroll. Tilsett 250 ul av den forvarmede GnRH-FITC behandling media (fra 1,13) til hver av de neste seks brønnene (3 brønner med 1 uM og 3 med 10 uM). Inkuber objektglasset i en fuktet, 5% CO2 atmosfære inkubator ved 37 ° C i 5 timer.
- Pipetter ut mediet fra hver brønn og vask av cellene med 250 ul PBS. Tilsett 250 ul av fikseringsoppløsning (10% nøytral buffret formalin) til hver brønn og inkuber sleiden ved romtemperatur i 10 min.
- Pipetter ut fikseringsoppløsningen fra hver brønn og vask av cellene med 250 ul PBS. Tilsett 250 ul av PBS inneholdende 5 uM fluorescerende probe oppløsningen fremstilt i trinn 1,14 til hver brønn og inkuber sleiden ved romtemperatur i 10 min.
- Pipetter ut fluorescerende probe løsning fra hver brønn, og vaske cellene to ganger med 250 mL PBS nøye. Legg 3-4 dråper monteringsmedium til hver brønn, til slutt. Hold raset i mørket ved RT, til bildebehandling.
- GnRH-IR uttrykk metode
- Ta den andre 8-brønns mikroskopisk lysbilde fremstilt i trinn 1.7 og pipettere ut den komplette mediet fra hver av de fem brønner.
- Tilsett 250 ul forvarmet komplett medium i den første brønnen, bruke dette som negativ kontroll. Tilsett 250 ul av fullstendig medium forvarmet inn i den andre brønnen for, og bruke dette til å undersøke GnRH-IR ekspresjon før GnRH-behandling.
- Tilsett 250 mL hver av de tre forvarmet 10 um GnRH-FITC behandling medier i løpet av de neste tre brønner. Bruk disse brønner for å forbehandle cellene med GnRH-FITC konjugater før undersøke GnRH-IR uttrykk. Inkuber objektglasset i en fuktet, 5% CO2 atmosfære inkubator ved 37 ° C i 1 time.
- Pipetter ut den behandlende medium fra hver av de tre brønner som vil bli brukt til å undersøke GnRH-IR-ekspresjon etter GnRH behandling og vaske disse brønnene med 250 ul av fullstendig medium forvarmet. Legg 250mL av forvarmet komplett medium i hver av tre brønner. Inkuber objektglasset i en fuktet, 5% CO2 atmosfære inkubator ved 37 ° C i 1 time.
- Pipetter ut mediet fra hver av de fem brønner og vaske cellene med 250 ul PBS. Tilsett 250 ul av fikseringsløsning til hver brønn og inkuber sleiden ved romtemperatur i 10 min.
- Pipetter ut fikseringsoppløsningen fra hver brønn og vask cellene med 250 ul PBS. Tilsett 250 ul PBS inneholdende 5% bovint serumalbumin (BSA) blokkeringsløsning i hver brønn og inkuber sleiden ved romtemperatur i 1 time.
- Fortynn 10 ul av GnRH-IR primære antistoff i 1 ml PBS (1: 100 forhold). Hold det på RT og bruke den opp i løpet av få timer.
- Pipetter ut BSA blokkering løsning fra hver brønn, bortsett fra den negative kontrollen (første brønn). Vask cellene med 250 ul PBS (bortsett fra den negative kontrollen brønn). Tilsett 250 ul PBS inneholdende GnRH-IR primære antistoff fremstilt i trinn 2.2.7 inn i each vel (bortsett fra den negative kontrollen). Inkuber objektglasset ved romtemperatur i 1 time, på et mørkt sted.
- Fortynn 2,5 mL av Alexa 546 merket sekundære antistoff i 1,25 ml PBS (1: 500 ratio).
MERK: Denne løsningen skal beskyttes mot lys, ha den på RT og bruke den opp i løpet av få timer. - Pipetter ut løsninger fra hver av de fem brønner og vaske cellene med 250 ul PBS. Tilsett 250 ul PBS inneholdende AF-546-merket sekundært antistoff fremstilt i trinn 2.2.9 inn i hver brønn. Inkuber raset ved RT, for 1 time i mørket.
- Pipetter ut løsningen fra hver brønn og vaske cellene med 250 mL PBS. Tilsett 250 ul av PBS inneholdende 5 uM fluorescerende probe oppløsningen fremstilt i trinn 1,14 til hver brønn og inkuber sleiden i 10 min ved RT.
- Pipetter ut den fluorescerende probe løsning fra hver brønn og vaske cellene to ganger med 250 ul PBS nøye. Legg 3-4 dråper monterings media i hver brønn, etterpå. Hold raset i mørketved RT inntil mikroskopisk bildebehandling.
- Imaging
- Bilde cellene ved omvendt konfokal laser scanning mikroskop (ved hjelp 63X oljeneddyppingsobjektivet)
- Bruk følgende eksitasjon / utslipp bølgelengder. GnRH konjugater: 488/514 nm, Alexa 546 merket antistoff: 488/546 nm (brukes kun for GnRH-IR uttrykk metode), Draq5 fluorescerende probe: 633/680 nm.
- Sett opp bildeparametere ved hjelp av de negative kontrollcellene. Bruk disse parametrene til bilde behandlede celler (figur 3). Etterjustere avbildningsparametre på hver mikroskopisk lysbilde ved begynnelsen av analysen. Fine-tune og eksportere bilder med programvaren som leveres av produsenten om nødvendig.
- Bilde cellene ved omvendt konfokal laser scanning mikroskop (ved hjelp 63X oljeneddyppingsobjektivet)
3. fluorescens-aktivert celle sortering (FACS)
- GnRH kvantifisering metode
- Ta platen forberedt i trinn 1,8 og pipetter ut fullstendig medium fra each av de syv brønner. Tilsett 1 ml forvarmet komplett medium inn i den første brønnen. Bruk dette som en negativ kontroll. Tilsett 1 ml av hver av de seks forvarmet behandlende media (3 brønner med 1 uM og 3 brønner med 10 mm) inn i de neste seks brønner. Inkuber platen i en fuktet, 5% CO2 atmosfære inkubator ved 37 ° C i 5 timer.
- Pipetter ut mediet fra hver brønn. Vask cellene to ganger med 2 ml PBS nøye. Legg 500 mL av trypsin-EDTA løsning i hver brønner. Inkuber platen ved 37 ° C inntil cellene løsner (ca. 10 min).
- Tilsett 1 ml fullstendig medium i hver brønn for å stoppe trypsin. Rist platen. Suspendere cellene forsiktig med en pipette, og overfører suspensjonen fra hver brønn inn i FACS-rør. Sentrifuger rørene ved 150 xg i 4 min, ved 4 ° C.
- Hell ut supernatantene forsiktig, med ett trekk. Tilsett 500 ul iskald PBS i hvert FACS rør og forsiktig re-suspendere cellene. Hold rørene på is fram til sluttenav forsøket.
- Analyse og beregning
- Analyser cellene ved flowcytometri. For eksitasjon, bruker 488 nm argon laser bølgelengde og for påvisning bruke 530 nm bølgelengde. Sett opp strømningscytometeret parametere ved å kjøre de negative kontrollcellene. Bruk disse parametere for å analysere behandlede celler (figur 4A). Evaluere dataene med produsentens programvare, bestemme median fluorescerende intensitet (MFI) verdier, og beregne de relative MFI verdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bilder innhentet av konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) tilbyr spektakulær informasjon om opptaket av GnRH-FITC konjugater på den gitte cellekultur i en tid og konsentrasjonsavhengig måte. Parallelt med disse GnRH-FITC-konjugater, tilstedeværelse av den GnRH-IR på celleoverflaten er også verifiserbar ved CLSM eksperimentet. Videre, ved anvendelse av en langt-rød DNA flekker fluorescerende probe, er det mulig å counterstain kjerner av cellene i tillegg til GnRH og GnRH-IR. Men mens konfokal bildet ikke er kvantifiserbar, er enkel "GnRH opptak metoden" kan lett anslå om de testede cellene inneholder høyere eller lavere beløp av GnRH-FITC konjugater. De anvendte GnRH-FITC konjugater, deres konsentrasjoner, og tidspunktet for behandlingen er variable i denne metoden, etter behov. Som vist i figur 1 forskjellige kreftceller inneholde forskjellige nivåer av GnRH-FITC på en konsentrasjonsavhengig måte. Den avanserte "GnRH-IR uttrykk metoden" beskriver visualisering av celleoverflaten GnRH-IR med immunocytokjemi, før og etter at GnRH-FITC behandling. I den første delen av denne fremgangsmåte (før den GnRH-FITC behandling), visualisere vi GnRH-IR med immunocytokjemi, uten GnRH-FITC behandling. I den andre delen av denne fremgangsmåten (etter at GnRH-FITC behandling), vi behandler cellene i 1 time med 10 uM GnRH-FITC. Etter behandlingen, inkuber vi cellene i komplett medium for ytterligere 1 time og visualisere GnRH-IR med immunocytokjemi. Som vist i figur 2A, forskjellige kreftceller utviser forskjellige nivåer av GnRH-IR på sin overflate før den GnRH-FITC behandling. Som vist i figur 2B, etter at GnRH-FITC behandling, GnRH-IR-uttrykkende celler opprett (EBC-1) eller økning (Detroit-562) GnRH-IR-nivå på sine membraner. På dette punktet, oppmerksom på at vi tidligere har bekreftet at BxPC-3 celler uttrykker også GnRH-IR, men ikke presentere det på deres membran 18. GnRH-IR kan visualiseres på innsiden av BxPC-3-celler ved immunocytokjemi hvis deres membraner er permeabilisert. Dette fenomenet forklarer det relativt nedre GnRH opptak effektivitet av BxPC-3-celler. Basert på disse uttalelsene fokuserer vi bare på celleoverflaten GnRH-IR her. Sammenligning av figur 1 med figur 2 bekrefter at nivået av celleoverflate-GnRH-IR korrelerer med mengden av GnRH-FITC i de tilsvarende cellene. Videre klargjør figur 3C som GnRH-FITC blir internalisert inn i cellene på grunn lokalisering av GnRH-FITC er adskilt fra signalet fra celleoverflaten GnRH-I sperrene 1 h av den GnRH-FITC behandling. Vi konkluderer med at "GnRH-IR uttrykk metoden" støtter informasjon innhentet fra "GnRH opptak metoden".
Det er viktig å bruke veltilpasset setTings under bildebehandling. Som illustrert i figur 3A ved emisjonsbølgelengden til FITC (514 nm) og det fluorofor-merket sekundært antistoff (546 nm), de ubehandlede negative kontrollcellene har også en svak autofluorescens. Dette uønsket fluorescens kan gi falske positive resultater. Derved, ved begynnelsen av den avbildning er det viktig å justere fluorescensintensiteten på kontrollcellene som vist i figur 3B. Det er forventet at man vil observere klart signal av kjernene ved emisjonsbølgelengden for den kjernefysiske flekk (680 nm), med det fluorescerende signal på de andre to bølgelengder er bare synlig eller nær null. Alle de andre celleprøver skal avbildes med disse veltilpassede og faste parametere. På denne måten blir signal observert ved 514 nm avledet fra signalet på bare FITC-GnRH, ved 546 nm fra signal av GnRH-IR spesielt og ved 680 nm fra signal av kjerner, som vist i figur 3C. Bilder kan være fine-innstilt etter bildebehandling ved hjelp av programvare om nødvendig.
Flowcytometri eksperimenter gi kvantifiserbare informasjon om mengden av GnRH-FITC konjugater som ble tatt opp av cellene. De anvendte GnRH-FITC konjugater, deres konsentrasjoner og tiden for behandlingen er også variable i denne metoden, etter behov. De ubehandlede celler blir anvendt som negativ kontroll for regulering av flowcytometri parametere og for å bestemme deres midlere fluorescensintensitet (MFI) ved begynnelsen av analysen. Som illustrert på figur 4A MFI ble bestemt for hver prøve ved anvendelse av de samme parametrene. De relative MFI verdiene beregnes fra MFI verdier ved hjelp av beregningsformel i 4B. Ved hjelp av denne formel, er den relative MFI-verdien for kontrollceller alltid null. De beregnede relative MFI-verdier kvantifisere den fluorescerende intensitet av GnRH-FITC konjugater, som er proporsjonale med deres adrikkevare konsentrasjoner i cellene. Som vist i figur 5, med disse data, kan man påvise og sammenligne hvor effektivt disse kreftcellene ta opp GnRH-FITC-konjugater. Dermed resultatene oppnådd ved flowcytometri utfylle og støtte bildene kjøpt av konfokal mikroskopi.
Figur 1: Confocal bilder av ubehandlede og [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III behandlede kreftceller. Blåved: kjerner; grønn flekk: [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III. Disse bildene blir oppnådd ved hjelp av "GnRH-opptaket metoden". (A) De fluorescenssignaler av ubehandlede celler er justert til nær null ved 514 nm (grønn) på hver cellelinje. Den Draq5 langt-rødt fluorescerende probe brukes til å farge kjerner av cellene. (B) Etter at innstillingene, den EBC-en lungekreft og Detroit-562 menneskesvelg kreftceller viser påviselig, men lavt signal på 514 nm (grønn) etter fem timers behandling med 1 mikrometer [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III. (C) Etter 5 timers behandling med 10 uM [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III, hver av de tre cellelinjene liggende høyere fluorescerende signal. Resultater fra dette forsøket tyder på at BxPC-3 kreft i bukspyttkjertelen celler tok opp GnRH-FITC med mye lavere effektivitet i forhold til de andre to cellelinjer som er lett søkes i med GnRH konjugater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Confocal bilder av celleoverflate GnRH-IR før og etter at [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I-behandling. Blåved: kjerner; grønn flekk: [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I; rød flekk : GnRH-IR. Disse bildene er generert ved hjelp av "GnRH-IR uttrykk metoden". (A) før den GnRH-FITC behandling, gjør BxPC-3-celler ikke har GnRH-IR på membranen, men EBC-1-celler utviser høy, og visse Detroit-562-celler utviser moderat nivå av GnRH-IR. (B) Etter at GnRH-FITC behandling, BxPC-3-celler fremdeles ikke oppviser GnRH-IR på sin membran. EBC-1-celler opprettholde sin GnRH-IR ekspresjon og GnRH-FITC vises på innsiden av dem. Detroit-562-celler synes å være som oppviser høyere grad av GnRH-IR etter behandling, og de tar opp GnRH-FITC, så vel. Dette forsøk viser at forskjellige typer av maligne tumorceller oppviser forskjellig grad av GnRH-IR på sin overflate, og den GnRH-FITC opptak ser ut til å være nært knyttet til celleoverflaten GnRH-IR-ekspresjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Confocal bilder av EBC-en lungekreftceller. Blåved: kjerner; grønn flekk: [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III; rød flekk: GnRH-IR. Disse bildene er laget av "GnRH-IR uttrykk metoden". (A) Ubehandlet negative kontrollceller (uten GnRH-FITC og Alexa 546) har påvisbare og uønsket fluorescens ved 514 nm og 546 nm ved bruk av over-forsterkede instrumentinnstillinger. (B) Justering av instrumentinnstillingene på de ubehandlede negative kontrollceller, den grønne (514nm) og røde (546 nm) signal er nær null. (C) Justert parametre resulterer i klare og pålitelige signaler for GnRH-FITC behandlede og GnRH-IR-fargede celler. Etter at GnRH-FITC behandling, lokalisering av GnRH-FITC (grønn) separert fra celleoverflaten GnRH-IR (rød).529fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Evaluering av flowcytometri data. (A) Histogram av det ubehandlede og de behandlede Detroit-562-celler. MFI-verdiene for de celleprøvene blir bestemt fra histogrammet. X-aksen viser den fluorescerende intensitet av celler, og y-aksen viser tellingene. Svart linje: MFI før GnRH-FITC behandling; grønn stiplet linje: MFI etter fem timers behandling med 1 mikrometer [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III; rød stiplet linje: MFI etter fem timers behandling med 10 mikrometer [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III. (B) Beregning av formel relative MFI-verdier. De relative MFI-verdiene beregnes fra de MFI-verdier. Ved hjelp av denne beregningen, er den relative MFI-verdien for den ubehandlede kontrollprøven alltid null. den relat ive MFI-verdiene for de behandlede prøver representerer mengden av GnRH-FITC konjugater som er inne i cellene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Relative MFI-verdiene for kreftceller etter 5 timers behandling med 1 uM av GnRH-FITC-konjugater. Relative MFI verdier er sammenlignbare og definere hvor effektivt de gitte celletyper kan ta opp GnRH analoger. GnRH-IR ikke-utstilling BxPC-3 celler inneholder bare spor av disse GnRH analoger. GnRH-IR uttrykker EBC-1 lungekreftceller inneholde moderat og Detroit-562 svelg kreftceller inneholde høye mengder av GnRH analoger. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD, N = 3."_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksperimenter beskrevet her bruke selektivt merket GnRH analoger for screening tilhenger cellekulturer in vitro. Konfokal mikroskopi og flowcytometri metoder er egnet for sporing og kvantifisering av cellulært opptak av disse GnRH-FITC-konjugater i en tid og konsentrasjonsavhengig måte. Disse forsøk har følgende viktige trinn: 1) å opprettholde en steril, frisk cellekultur; 2) GnRH peptider må være av høy kvalitet; 3) rimelige konsentrasjoner og inkubasjonstider må følges; 4) behandle og vasketrinn; 5) veltilpasset instrumentinnstillinger.
Celler blir opprettholdt i produsentens anbefalte medium supplert med 10% (V / V) føtalt bovint serum og antibiotika (komplett medium). Celler bør holdes og håndteres i et sterilt miljø inntil trinnene behandling (med GnRH-FITC konjugater). Før forsøkene, sjekk celler ved hjelp av en invertert mikroskop. De bør være sunn, Festet og må nå de nødvendige mengder.
Det er viktig å bruke GnRH-peptider med høy kvalitet og renhet. Vi syntetisert disse peptidene og renset dem til over 98% 18. Peptidet kan oppbevares ved -25 ° C i et kjøleskap som et lyofilisert pulver. De 10 mM GnRH-FITC stamløsninger i DMSO bør holdes på et mørkt sted ved romtemperatur og brukt opp i løpet av få uker. Vi undersøkte stabiliteten av disse konjugater, og funnet at de er stabile i DMSO og deres fluorescens-intensitet opprettholdes etter en måned med riktig lagring. Konsentrasjonen av GnRH-FITC konjugater og tidspunktet for behandlinger er variable i disse forsøk, noe som byr på store fordeler, men med visse begrensninger (se nedenfor). De anvendte konsentrasjoner og inkubasjonstider i denne protokollen er bare anbefalinger, men de gir et godt grunnlag for de første forsøkene.
CLSM eksperimenter krever several vasketrinnene. Disse trinnene bør utføres nøye. Ikke overfør væske direkte på cellene. Heller bruke siden eller hjørnet av brønnene for dette formålet. Dette kan redusere vaske av og miste følges celler. Det anbefales også å unngå direkte lys under hele forsøket, så det kan desensitize fluorescerende prøver (fotobleking effekt). Holde de behandlede prøvene på et mørkt sted eller dekket med et stykke aluminiumfolie under forsøket. Basert på tidligere funn, oppdaget vi at den endelige DMSO-konsentrasjon i den anvendte behandling av mediet er ubetydelig (0,1% (v / v) DMSO i 10 uM behandlende media), og har ingen virkning på resultatene, er derved DMSO-fritt fullstendig medium også egnet som negativ kontroll.
Det er viktig å bruke veltilpasset instrumentparametre i løpet av CLSM og FACS-eksperimenter. Disse parametrene må re-kalibreres på hver celletype, før begge analysene. I CLSM eksperiment, SIgnal intensitet confocal bilder avhenger av følgende parametre: laser intensitet, detektor forsterkning og offset, og pinhole størrelse. Når du justerer disse parametrene, bruker den laveste laser makt til å produsere et akseptabelt bilde og unngå fotobleking. Sett imaging parametere for å justere bakgrunns fluorescens av ufargede negative kontrollceller til nær null (figur 3B). Bilde behandlede celler med disse parametre justeres for å unngå falske positive resultater. Andre signaler som sendes ut fra de behandlede cellene ved 514 nm og 546 nm inneholder nødvendig informasjon om GnRH eller GnRH-IR. Disse trinnene krever erfaring i CLSM eksperimenter. I FACS eksperiment, skape en standard fremover scatter-side spredningsdiagram (lineær skala) og satt spenninger for å justere de viktigste levende cellepopulasjonen i midten av tomten. Tegn en region rundt levende celler. Lag et histogram, satt abscisse å kanalisere en (FL1-530 nm, logaritmisk skala) og sette den tidligere definerte regionen som en gatefor dette histogram. Satt FL1 spenning for å bringe signalet til ufargede negative kontrollceller i henhold til en 10 (figur 4A). Analyser behandlede celler med disse justerte parametere.
Videre er det viktig å sjekke status mycoplasma av cellekulturer fra tid til annen. Ulike analyser er tilgjengelige for dette formål. Ved mycoplasma positivitet, kast celler og begynne å jobbe med en ny kultur. Det anbefales å bruke et antibiotikum blanding i dyrkningsmediet som er optimalisert for å forhindre mycoplasma. Den anvendte konsentrasjon av GnRH-FITC konjugater, og tiden for behandlinger er variable i disse eksperimentene, men anvende lave konsentrasjoner og korte inkubasjonstider kan resultere i altfor svake signaler for fluorescensdeteksjon.
Ved avbildning av GnRH-IR parallelt med GnRH-analoger, er høyere GnRH-FITC-konsentrasjonen anbefalt (10 uM er optimalt). Årsaken til den høyere konsentrasjoner den korte inkubasjonstid (1 time) og det forholdsvis høye fluorescens signal av det merkede antistoff, sammenlignet med GnRH-FITC-konjugater. På den annen side ble en liten overlapp mellom de to fluorescerende fargestoff utslipp (514 nm og 546 nm) ble funnet, noe som skjer bare ved 546 nm og er avledet fra det signal av GnRH-FITC-konjugater. Imidlertid kunne den relativt høyere fluorescente signalet fra Alexa 546 og de godt regulerte parametere minimalisere denne effekten, som vist i figur 3. En annen mulig løsning for å unngå overlapping, er å bruke merket sekundært antistoff som har forskjellig eksitasjon bølgelengde og / eller bedre adskilt emissjonsspekteret forhold til FITC (hvis CLSM tekniske parametere tillate dette). Denne mulighet byr stor fordel for den CLSM metoden, som gjør det mulig ved hjelp av valgfrie fluorescerende prober parallelt med GnRH-FITC-konjugater. For eksempel kan disse alternative fluorescerende prober anvendes for kontra andre organeller etter behov.
Den anvendte konsentrasjon av GnRH-FITC konjugater har følgende begrensninger. Maksimale konsentrasjonsgrense av GnRH-FITC konjugater er basert på deres oppløselighet 18. Disse verdiene er de følgende i PBS ved romtemperatur: GnRH-I: 90 uM; GnRH-II: 40 mikrometer; GnRH-III: 200 mikrometer. På den annen side, i tidligere eksperimenter antok vi at opptaket av disse GnRH peptider kan finne sted ved andre enn humane GnRH-I-reseptorer reseptorer; Dette opptaket synes å være av større betydning ved høyere konsentrasjoner (over 10 uM) 18. Den nedre deteksjonsgrense av GnRH-FITC konjugater er basert på et utvalg av parametre, men i en optimal innstilling er det omtrent 1 uM for CI MS eksperimenter. Vi fant ut at flyten tilbyr cytometri bedre følsomhet enn konfokalmikroskopi. I ideelle innstillinger, kan kvantifiseringsgrensen av GnRH-FITC konjugater være lavere enn 1 mikrometer. Deteksjonsgrensen eller kvantifisering kunnevære forskjellig i hvert eksperiment, fordi de er avhengig av celletype og inkubasjonstid. Merk at data innhentet ved hjelp av FACS er mer pålitelig enn CLSM, fordi den detekterer tusener av celler per prøve og gjennomsnittlig signal av celler beregnes. Men i protokollen, FACS gir ikke informasjon om den cellulære lokalisering av GnRH-FITC konjugater og celleoverflate-ekspresjon av GnRH-IR. Basert på disse vurderingene vi konkludere med at den CLSM og FACS eksperimenter har klare fordeler, og de utfyller hverandre. På den annen side, kan høyt innhold bildeanalyse være et interessant og et godt alternativ for FACS og CLSM analyse.
Oppsummert viser dataene oppnådd fra disse forsøk bekrefter at hver av de tre GnRH-FITC konjugater kan gå inn i celler som uttrykker celleoverflate GnRH-IR. Disse GnRH-analoger har lignende målretting potens ved de samme konsentrasjoner. Imidlertid GnRH-IR-nivå på overflaten av forskjellige boksCER-celler er svært variabel. Resultatene beregnet fra dataene for strømningscytometri-analyse muliggjør sammenligning av cellelinjer eller GnRH-analoger. På samme tid, kan bildene innhentet av konfokal mikroskopi avslører nivået av celleoverflate-GnRH-IR ekspresjon og bekrefte at disse konjugater blir internalisert inn i cellene. Basert på disse resultatene, kan man bekrefte at de innførte eksperimenter inneholde praktiske og variable metoder for undersøkelse av GnRH basert stoffet leveringssystemer og tilbyr et godt grunnlag for videre eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0.1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
References
- Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11 (2016).
- Majumdar, S., Siahaan, T. J.
- Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K.
- Schally, A. V., et al.
- Limonta, P., et al. GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies. Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).
- Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances. J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).
- Manea, M., et al. In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice. Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).
- Argyros, O., et al. Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth. Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).
- Karampelas, T., et al. GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery. Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).
- Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -L. Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling. Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).
- Millar, R. P., et al. Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).
- Olberg, D. E., et al. Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression. Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).
- Zoghi, M., et al. Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging. Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).
- Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging. Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).
- Nederpelt, I., et al. Characterization of 12 GnRH peptide agonists - A kinetic perspective. Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).
- Szabo, I., et al. Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting. J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).
- Leurs, U., et al. GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate. Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).
- Murányi, J., et al. Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells. J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).
