I vitro Imaging och kvantifiering av det målsökande drog Effektivitet av fluorescerande GnRH-analoger

Summary

Selektivt märkt fluorescerande GnRH-I, -II och -III derivat är tillförlitliga verktyg för spårning och kvantifiering av deras cellulärt upptag. Detta manuskript introducerar experiment för att visualisera, kvantifiera och jämföra upptaget effektiviteten hos dessa GnRH-konjugat i olika cellinjer.

Abstract

GnRH-analoger är effektiva målsökande delar och kunna leverera anticancermedel selektivt i maligna tumörceller som är mycket express GnRH-receptorer. Men kvantitativ analys av GnRH-analoger "cellulärt upptag och de undersökta celltyper i GnRH-baserade läkemedlet leveranssystem för närvarande begränsad. Tidigare infördes, selektivt märkt fluorescerande GnRH I, -II och -III derivat ger stor detekterbarhet, och de har lämpliga kemiska egenskaper för reproducerbara och robusta experiment. Vi fann också att de up-to-date metoder med dessa märkta GnRH-analoger kan erbjuda nya information om GnRH-baserade läkemedlet leveranssystem. Detta manuskript introducerar några enkla och snabba experiment rörande det cellulära upptaget av [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-II och [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH -III på EBC-1 (lunga), den BxPC-3 (pankreas) och Detroit-562- (svalget) malignt tumor celler. Parallellt med dessa GnRH-FITC-konjugat, var cellytan nivån av GnRH-I-receptorer undersöktes också på dessa cellinjer före och efter GnRH-behandling genom konfokal laserscanningsmikroskopi. Det cellulära upptaget av GnRH-FITC-konjugat kvantifierades genom fluorescens-aktiverad cellsortering. I dessa experiment smärre skillnader mellan GnRH-analoger och stora skillnader mellan celltyper observerades. De betydande skillnaderna mellan cellinjer korrelerade med sin distinkta nivå på cellytan GnRH-I-receptorer. De införda experiment innehåller praktiska metoder för att visualisera, kvantifiera och jämföra upptagningen effektiviteten av GnRH-FITC-konjugat på ett tids- och koncentrationsberoende sätt på diverse vidhäftande cellkulturer. Dessa resultat kunde förutsäga det målsökande drog effektiviteten av GnRH-konjugat på den givna cellkulturen, och erbjuder en god grund för ytterligare experiment i granskningen av GnRH-baserade läkemedlet leveranssystem.

Introduction

Peptidbaserade Targeted Drug Delivery System har blivit en snabb utveckling och lovande område i cancerterapi under de senaste åren ^{1, 2.} Humant gonadotropin releasing hormone receptor typ I (GnRH-IR) är i första hand ligger i hypofysen men också i flera andra vävnader som är ansvariga för självreproduktion ^3. GnRH-IR uttrycks också i ett antal cancervävnader, relaterade eller orelaterade till det reproduktiva systemet ^{4, 5.} Den höga uttryck av GnRH-IR på flera maligna tumörceller jämfört med friska vävnader ger en möjlighet för riktad terapi ^{5, 6.}

Många gonadotropinfrisättande hormon (GnRH) analoger har utvecklats under de senaste decennierna, som skulle kunna användas som målsökande delarf "> ^{7, 8, 9.} Dessa peptider kan leverera anticancermedel med hög selektivitet till maligna tumörceller, vilka överuttrycker GnRH-IR ^6. Flera GnRH konjugerade anti-tumörläkemedel med högre selektivitet och bättre verkningsgrad än motsvarande okonjugerad fritt läkemedel har rapporterats ^{7, 8, 9.}

Tidigare publikationer om GnRH-peptider och deras receptorer rapporterade att GnRH-IR kan anta olika konformationer som har olika selektivitet för GnRH-analoger ^10. Den mycket varierande GnRH-IR har komplexa och olika signalvägar är utrustade med olika aktivitet mot deras naturliga och artificiella ligander ^11. Dessa fakta gör undersökning av GnRH-baserade system utmanande. Å andra sidan, den y har lovande terapeutisk potential. Flera experiment med radiomärkt GnRH-peptider har tidigare redovisats ^{12, 13, 14, 15,} men experiment där fluorescerande GnRH-analoger användes är fortfarande begränsad. Medan radioaktiv märkning ger hög känslighet, har fluorescerande märkning flera andra fördelar, till exempel enklare hantering, och förmågan att Motfärga med olika fluoroforer. Tre vanliga GnRH-analoger som framgångsrikt har använts för läkemedelstillförsel är [D-Lys ^6] -GnRH-I, [D-Lys ^6] -GnRH-II och GnRH-III, men effektiviteten av dessa peptider som målsökande delar är sällan jämfört ^{16, 17.} Å andra sidan, resulterar från separata experiment i vilka olika cancerceller och GnRH-analoger användes är varierande.

ntent "> Baserat på dessa överväganden har vi fokuserat på tumören inriktning och drug delivery potentialen hos dessa GnRH-peptider, och därigenom syntetiseras och karakteriseras [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys ⁶ (FITC )] - GnRH-II och [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH-III peptidkonjugat ¹⁸ Dessa analoger är selektivt märkta med FITC på sidokedjan av deras Lys eller D-Lys (peptid-FITC-förhållande 1: 1 vid varje. konjugat). tanken var att den selektiva fluorescensmärkning kan erbjuda nya information om dessa peptider, och låter deras goda spårning och pålitlig kvantifiering. dessa konjugat har säker hantering och tillförlitlig detekterbarhet, som gör det lättare att jämföra deras tumörmåls effektivitet, och screening av många typer av maligna tumörceller. Vi hoppas att up-to date experiment med dessa peptidkonjugat kan bidra till utvecklingen av nya cancer inriktning GnRH-läkemedelskonjugat, och bidra till att identifiera ny terapeutisk tjärablir liksom.

Den nuvarande manuskriptet visar några väl reproducerbara och snabba experiment med GnRH-FITC-konjugat. Cellytan uttryck av GnRH-R är ett avgörande villkor om GnRH-upptag, därför kan vi undersökas samtidigt cellytan nivån av GnRH-IR på de testade cellinjer. Vi visualiseras de GnRH-IR- och GnRH-FITC-konjugat från konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) och kvantifieras det cellulära upptaget av GnRH-FITC-konjugat med användning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS).

Protocol

1. Framställning av cellkulturer och reagenser

1. Upprätthålla cellkulturerna i tillverkarens rekommenderade mediet, kompletterad med 10% (volym / volym) fetalt bovint serum och antibiotika (som kallas komplett medium). Hålla cellodlingskolv i en fuktad, 5% CO ₂ atmosfär inkubator vid 37 ° C. Följ spridning och confluency av celler genom inverterat mikroskop (med 10X faskontrast mål).
2. När cellerna når tillräcklig confluency, avlägsna mediet och tvätta kultur med 2-3 ml sterilt fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Avlägsna PBS och tillsätt 0,5 ml, steril 0,25% trypsin-EDTA-lösning till cellodlings och inkubera vid 37 ° C tills cellerna lossnar (ca 10 min).
3. Suspendera cellerna i 3-4 ml sterilt fullständigt medium för att stoppa trypsin och överföra dem i en steril centrifugrör. Centrifugera cellerna vid 150 xg under 4 minuter vid rumstemperatur (RT). Kassera supernatanten försiktigt och avbryta pEllet i 2-3 ml sterilt komplett medium.
4. Ta ut 100 | il av cellsuspensionen och blanda med 100 mikroliter 0,4% (m / V) lösning av trypanblått, för att färga döda celler. Belastning 10 mikroliter av denna blandning i en hemocytometer och bestämma antalet livskraftiga celler genom inverterat mikroskop.
5. Späd den önskade mängden cellsuspension som framställts i steg 1,3-10 ml med sterilt komplett medium, som innehöll 4 x 10 ⁴ celler / ml.
6. Tillsätt 250 | il av cellsuspension (framställd i steg 1,5) per brunn (10 ⁴ celler / brunn) i sju brunnar av den första glasbotten 8-brunnars objektglas. Använd den här bilden i GnRH upptagningsmetoden.
7. Tillsätt 250 | il av cellsuspension (framställd i steg 1,5) per brunn (10 ⁴ celler / brunn) i fem brunnar av den andra 8-brunnars objektglas. Detta objektglas kommer att användas i GnRH-IR expressionsmetoden.
8. Lägg 1 ml cellsuspension (framställd i steg 1,5) per brunn (4 x 10 ⁴ celler / brunn) i sju wells av en 12-brunnars platta. Denna platta kommer att användas i GnRH kvantifiering metoden.
9. Låt cellerna fästa på de två mikroskopiska bilder och plattan. Inkubera dem i en fuktad, 5% CO ₂ atmosfär inkubator vid 37 ° C under 48 h.
10. Efter inkubation kontrollera cellerna genom inverterat mikroskop (med 10X faskontrast mål). Om cellerna är friska och fäst fortsätter med följande steg.
11. Förbered 10 mM GnRH-FITC stamlösning i dimetylsulfoxid (DMSO) från var och en av de tre konjugaten ^18. (Använd dessa utspädningskoncentrationer: 16,43 mikrogram / mikroliter [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I, 16,97 pg / pL [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-II och 16,47 pg / pL [Lys ⁸ ( FITC)] - GnRH-III) Förvara dessa stamlösningar i en mörk plats vid rumstemperatur och använd dem inom ett par veckor.
12. Späd 1,7 | il vardera av de tre 10 mM GnRH-FITC förrådslösningar i 1,7 ml fullständigt medium. Skaka dessa lösningar. (Tesse är 10 ^ M GnRH-FITC behandling media.) Späd 150 mikroliter vardera av de tre 10 ^ M GnRH-FITC behandlingsmedium i 1,35 ml komplett medium. Skaka dessa lösningar samt (dessa är en iM GnRH-FITC behandlingsmedium).
    OBS: Alla GnRH-FITC innehållande behandlingsmediet bör skyddas från ljus och användas inom ett par timmar.
13. Förvärma sex GnRH-FITC behandlingsmediet (framställd i steg 1,12) och 4 ml komplett medium till 37 ° C.
14. Späd 3 mikroliter av 5 mM fluorescerande sondlösning (nukleär motfärg som nämns i Materials List) i 3 ml PBS till 5 | iM. Denna lösning bör skyddas från ljus, hålla det vid RT och använda den inom några timmar.

2. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)

1. GnRH upptagningsmetoden
   1. Ta det första objektglaset som framställts i steg 1,6 och pipettera ut det kompletta mediet från var och en av de sju väl. Tillsätt 250 mikroliter av förvärms komplett medium i den första brunnen. Använda detta som en negativ kontroll. Tillsätt 250 mikroliter av den förvärmda GnRH-FITC behandlar media (från 1,13) till vart och ett av de kommande sex brunnar (3 brunnar med 1 ^ M och 3 med 10 ^ M). Inkubera objektglaset i en fuktad, 5% CO ₂ atmosfär inkubator vid 37 ° C under 5 h.
   2. Pipettera ut mediet från varje brunn och tvätta cellerna med 250 mikroliter PBS. Tillsätt 250 | il av fixeringslösning (10% neutral buffrad formalin) i varje brunn och inkubera objektglaset vid RT, under 10 min.
   3. Pipettera ut fixeringslösningen från varje brunn och tvätta cellerna med 250 mikroliter PBS. Tillsätt 250 | il av PBS innehållande 5 uM fluorescent sondlösning som framställts i steg 1,14 i varje brunn och inkubera objektglaset vid RT, under 10 min.
   4. Pipettera ut det fluorescerande sondlösningen från varje brunn, och tvätta cellerna två gånger med 250 mikroliter PBS försiktigt. Lägg 3-4 droppar monteringsmedium i varje brunn, slutligen. Håll bilden i mörker vid RT tills avbildning.
   5. GnRH-IR expressionsmetod
      1. Ta den andra 8-brunnars objektglas som framställts i steg 1,7 och pipettera ut det kompletta mediet från vardera av de fem brunnarna.
      2. Tillsätt 250 | il av förvärmt komplett medium i den första brunnen, använda detta som negativ kontroll. Tillsätt 250 mikroliter av förvärmda komplett medium i den andra bra också, och använda detta för att undersöka GnRH-IR uttryck före GnRH behandlingen.
      3. Tillsätt 250 mikroliter vardera av de tre förvärmd 10 um GnRH-FITC behandla material i de kommande tre brunnar. Använd dessa brunnar för att förbehandla cellerna med GnRH-FITC-konjugat innan undersöka GnRH-IR uttryck. Inkubera objektglaset i en fuktad, 5% CO ₂ atmosfär inkubator vid 37 ° C under 1 h.
      4. Pipettera ut behandlingsmediet från var och en av de tre brunnarna som kommer att användas för att undersöka GnRH-IR expression efter GnRH behandling och tvätta dessa brunnar med 250 | il av förvärmt komplett medium. Lägg 250mikroliter av förvärms fullständigt medium in i var och en av de tre brunnarna. Inkubera objektglaset i en fuktad, 5% CO ₂ atmosfär inkubator vid 37 ° C under 1 h.
      5. Pipettera ut mediet från var och en av de fem brunnarna och tvätta cellerna med 250 mikroliter PBS. Tillsätt 250 mikroliter av fixeringslösning i varje brunn och inkubera objektglaset vid RT, under 10 min.
      6. Pipettera ut fixeringslösningen från varje brunn och tvätta cellerna med 250 mikroliter av PBS. Tillsätt 250 | il av PBS innehållande 5% bovint serumalbumin (BSA) blockeringslösning i varje brunn och inkubera objektglaset vid RT, under 1 timme.
      7. Späd 10 mikroliter av GnRH-IR primär antikropp i 1 ml PBS (1: 100-förhållande). Håll det vid RT och använda den inom några timmar.
      8. Pipettera ut BSA blockerande lösningen från varje brunn, utom den negativa kontrollen (första brunnen). Tvätta cellerna med 250 mikroliter PBS (utom den negativa kontrollbrunnen). Tillsätt 250 mikroliter av PBS innehållande GnRH-IR primär antikropp framställd i steg 2.2.7 i EACh brunn (utom den negativa kontrollen). Inkubera bilden vid RT, under 1 timme i en mörk plats.
      9. Späd 2,5 mikroliter av Alexa 546 märkt sekundär antikropp i 1,25 ml PBS (1: 500 ratio).
         OBS: Denna lösning bör skyddas från ljus, hålla det vid RT och använda den inom några timmar.
      10. Pipett ut lösningar från var och en av de fem brunnarna och tvätta cellerna med 250 mikroliter PBS. Tillsätt 250 mikroliter PBS innehållande AF 546 märkt sekundär antikropp framställd i steg 2.2.9 i varje brunn. Inkubera bilden vid RT, under 1 timme i mörker.
      11. Pipettera ut lösningen från varje brunn och tvätta cellerna med 250 mikroliter PBS. Tillsätt 250 | il av PBS innehållande 5 uM fluorescent sondlösning som framställts i steg 1,14 i varje brunn och inkubera objektglaset under 10 min, vid RT.
      12. Pipettera ut det fluorescerande sondlösningen från varje brunn och tvätta cellerna två gånger med 250 mikroliter PBS försiktigt. Lägg 3-4 droppar monterings media i varje brunn, efteråt. Håll bilden i mörkretvid RT tills mikroskopisk avbildning.
   6. imaging
      1. Bild cellerna genom inverterad konfokala laserskanning mikroskop (med hjälp av 63x oljeimmersion mål)
         1. Använd följande excitation / emissionsvåglängder. GnRH-konjugat: 488/514 nm, Alexa 546 märkt antikropp: 488/546 nm (använd endast för GnRH-IR uttryck metoden), DRAQ5 fluorescerande sond: 633/680 nm.
         2. Inrättat avbildningsparametrarna med användning av de negativa kontrollcellerna. Använd dessa parametrar till bildbehandlade celler (Figur 3). Och justera avbildningsparametrar på varje objektglas vid början av analysen. Finjustera och exportera bilder med programvara som tillhandahålls av tillverkaren, om det behövs.

   3. Fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS)

   1. GnRH kvantifieringsmetod
      1. Ta plattan som framställts i steg 1,8 och pipettera ut det kompletta mediet från each av de sju brunnar. Lägg 1 ml förvärmd komplett medium i den första brunnen. Använda detta som en negativ kontroll. Tillsätt 1 ml vardera av de sex förvärmd behandla media (3 brunnar med 1 ^ M och 3 brunnar med 10 ^ M) i de kommande sex brunnar. Inkubera plattan i en fuktad, 5% CO ₂ atmosfär inkubator vid 37 ° C under 5 h.
      2. Pipettera ut mediet från varje brunn. Tvätta cellerna två gånger med 2 ml PBS försiktigt. Tillsätt 500 l av trypsin-EDTA-lösning till varje brunn. Inkubera plattan vid 37 ° C tills cellerna lossnar (ca 10 min).
      3. Tillsätt 1 ml av komplett medium i varje brunn för att stoppa trypsin. Skaka plattan. Suspendera cellerna försiktigt med en pipett och överföra suspensionen från varje brunn i FACS rör. Centrifugera rören vid 150 xg under 4 min, vid 4 ° C.
      4. Häll ut supernatanterna försiktigt, med ett drag. Tillsätt 500 mikroliter av iskall PBS i varje FACS rör och försiktigt återsuspendera cellerna. Hålla rören på is fram till slutetav experimentet.
   2. Analys och beräkning
      1. Analysera cellerna genom flödescytometri. För excitation, använd 488 nm argonlaser våglängd och för detektering använder 530 nm våglängd. Inrättat flödescytometern parametrarna genom att köra de negativa kontrollcellerna. Använder dessa parametrar för att analysera behandlade celler (Figur 4A). Utvärdera data med tillverkarens programvara, bestämma medianen fluorescensintensitet (MFI) värden och beräkna de relativa MFI-värden.

Representative Results

Bilder erhållna genom konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) erbjuder spektakulära information om upptaget av GnRH-FITC-konjugat på den givna cellkultur i en tid och koncentrationsberoende sätt. Parallellt med dessa GnRH-FITC-konjugat, är också verifierbar av CLSM experimentet närvaro av GnRH-IR på cellytan. Vidare, genom att använda ett långt röda DNA-färgning fluorescerande sond, är det möjligt att motfärga kärnorna hos cellerna förutom GnRH och GnRH-IR. Men medan konfokala bilden är inte mätbar, det enkla "GnRH upptagningsmetoden" kan lätt bedöma om de testade celler innehåller högre eller lägre mängd GnRH-FITC-konjugat. De applicerade GnRH-FITC-konjugat, deras koncentration, och tiden för behandlingen är variabla i denna metod, efter behov. Såsom visas i figur 1 olika cancerceller innehåller olika nivåer av GnRH-FITC i ett koncentrationsberoende sätt. Den avancerade "GnRH-IR uttryck metoden" beskriver visualisering av cellytan GnRH-IR genom immuncytokemi, före och efter GnRH-FITC behandling. I den första delen av denna metod (före GnRH-FITC behandling), visualisera vi GnRH-IR genom immuncytokemi, utan GnRH-FITC behandling. I den andra delen av denna metod (efter GnRH-FITC behandling), vi behandlar celler under 1 timme med 10 iM GnRH-FITC. Efter behandlingen, vi inkubera cellerna i fullständigt medium i ytterligare 1 h och visualisera GnRH-IR genom immuncytokemi. Såsom visas i fig 2A, olika cancerceller uppvisar olika nivåer av GnRH-IR på sin yta före GnRH-FITC-behandling. Såsom visas i fig 2B, efter GnRH-FITC behandling, GnRH-IR-uttryckande celler upprätthålla (EBC-1) eller öka (Detroit-562) GnRH-IR nivå på deras membran. Vid denna punkt, notera att vi tidigare bekräftat att BxPC-3-celler uttrycker också GnRH-IR, men inte presentera den på deras membran ^18. GnRH-IR kan visualiseras inuti BxPC-3-celler genom immuncytokemi om deras membran permeabilized. Detta fenomen förklarar den relativt lägre GnRH upptag effektivitet BxPC-3-celler. Baserat på dessa uttalande fokuserar vi bara på cellytan GnRH-IR här. Jämförelse av Figur 1 till Figur 2 bekräftar att nivån på cellytan GnRH-IR korrelerar med mängden av GnRH-FITC i motsvarande celler. Vidare förtydligar figur 3C som GnRH-FITC är internaliseras i celler eftersom lokaliseringen av GnRH-FITC separeras från signalen av cellytan GnRH-I-Rafter 1 h av GnRH-FITC-behandling. Vi drar slutsatsen att "GnRH-IR uttrycksmetod" stöder den information som erhållits från "GnRH upptagningsmetoden".

Det är viktigt att använda välanpassade uppsättningtings under avbildning. Såsom illustreras i figur 3A vid emissionsvåglängden för FITC (514 nm) och fluoroforen märkt sekundär antikropp (546 nm), de obehandlade negativa kontrollcellerna har också en svag autofluorescens. Denna oönskade fluorescens kan ge falskt positiva resultat. Därigenom, vid början av avbildnings är det viktigt att justera fluorescensintensiteten på kontrollcellerna, såsom visas i figur 3B. Det förväntas att en kommer att observera tydlig signal av kärnorna vid emissionsvåglängden för den nukleära fläcken (680 nm), med den fluorescerande signalen vid de två andra våglängder är precis synliga eller nära noll. Alla andra cellprover ska avbildas med dessa välanpassade och fasta parametrar. Detta sätt, är den signal som observeras vid 514 nm härrörande från signalen på endast FITC-GnRH, vid 546 nm från signalen av GnRH-IR särskilt och vid 680 nm från signalen av kärnor såsom visas i fig 3C. Bilder kan vara fine-tuned efter avbildning med programmet om det behövs.

Flödescytometri experiment ger kvantifierbar information om mängden GnRH-FITC-konjugat som togs upp av cellerna. De applicerade GnRH-FITC-konjugat, deras koncentrationer och tiden för behandlingen varierar också i denna metod, efter behov. De obehandlade cellerna användes som negativ kontroll för justering av flödescytometri parametrar och för att bestämma deras medianfluorescensintensitet (MFI) i början av analysen. Såsom visas på figur 4A MFI bestämdes för varje prov med användning av samma parametrar. De relativa MFI-värden beräknas från MFI-värden med hjälp av beräkningsformeln i Figur 4B. Med användning av denna formel, är den relativa MFI-värdet av kontrollceller alltid noll. De beräknade relativa MFI-värden kvantifiera fluorescensintensiteten av GnRH-FITC-konjugat, som är proportionella mot deras enverage koncentrationer i cellerna. Såsom illustreras i figur 5, med dessa data, kan en demonstrera och jämföra hur effektivt dessa cancerceller att ta upp de GnRH-FITC-konjugat. Således resultat som erhållits genom flödescytometri komplettera och stödja bilderna förvärvats av konfokalmikroskopi.

Figur 1: Confocal bilder av obehandlade och [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH-III behandlade cancercellerna. Blånad: kärnor; grön fläck: [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH-III. Dessa bilder erhålls med hjälp av "GnRH upptagningsmetoden". (A) De fluorescenssignaler av de obehandlade cellerna justeras till nära noll vid 514 nm (grön) på varje cellinje. Den DRAQ5 långt röd fluorescerande prob används för att färga kärnorna hos cellerna. (B) Efter applicering inställningarna EBC-1 lungcancer och Detroit-562 humansvalget cancerceller visar detekterbara men låg signal vid 514 nm (grön) efter 5 h behandling med 1 | iM [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH-III. (C) Efter 5 h behandling med 10 ^ M [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH-III, var och en av de tre cellinjerna föreliggande högre fluorescenssignal. Resultat från detta experiment tyder på att BxPC-3 pankreascancerceller tog upp GnRH-FITC med mycket lägre effektivitet jämfört med de andra två cellinjer som är lätt inriktningsbar med GnRH-konjugat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Confocal bilder av cellytan GnRH-IR före och efter [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I-behandling. Blånad: kärnor; grön fläck: [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I; röd fläck : GnRH-IR. Dessa bilder genereras med hjälp av "GnRH-IR uttrycksmetod". (A) Innan GnRH-FITC behandling behöver BxPC-3 celler inte har GnRH-IR på membranet, men EBC-1-celler uppvisar hög, och vissa Detroit-562-celler uppvisar måttlig nivå av GnRH-IR. (B) Efter GnRH-FITC behandling, BxPC-3-celler fortfarande inte uppvisar GnRH-IR på deras membran. EBC-1-celler bibehåller sin GnRH-IR uttryck och GnRH-FITC visas inne i dem. Detroit-562-celler verkar uppvisar högre GnRH-IR efter behandling och de tar upp GnRH-FITC, liksom. Detta experiment visar att olika typer av maligna tumörceller uppvisar olika grad av GnRH-IR på deras yta, och GnRH-FITC-upptag verkar vara nära relaterat till cellytan GnRH-IR-expression. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 3: Confocal bilder av EBC-1 lungcancerceller. Blånad: kärnor; grön fläck: [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH-III; röd fläck: GnRH-IR. Dessa bilder är gjorda av "GnRH-IR uttrycksmetod". (A) Obehandlade negativa kontrollceller (utan GnRH-FITC och Alexa 546) har detekterbara och oönskad fluorescens vid 514 nm och 546 nm vid användning av över förstärkta instrumentinställningar. (B) Justera inställningar instrument på de obehandlade negativa kontrollcellerna, den gröna (514 nm) och röd signal (546 nm) är nära noll. (C) Justerat parametrar resulterar i klara och tillförlitliga signaler för GnRH-FITC behandlade och GnRH-IR färgade celler. Efter GnRH-FITC behandling, är lokalisering av GnRH-FITC (grön) separerade från cellytan GnRH-IR (röd).529fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Utvärdering av flödescytometri data. (A) Histogram av det obehandlade och de behandlade Detroit-562-celler. MFI-värden för de cellprover bestäms från histogrammet. X-axeln visar den fluorescerande intensiteten hos celler, och y-axeln visar de räknas. Svart linje: MFI före GnRH-FITC behandling; grön streckad linje: MFI efter 5 h behandling med 1 | iM [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH-III; röd streckad linje: MFI efter 5 h behandling med 10 ^ M [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH-III. (B) Beräkningsformel av relativa MFI-värden. De relativa MFI-värden beräknas från MFI-värden. Med användning av denna beräkning är den relativa MFI-värdet för det obehandlade kontrollprovet alltid noll. den relat ive MFI-värden för de behandlade proverna representerar mängden GnRH-FITC-konjugat som är inuti cellerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Relativa MFI-värden av cancerceller efter 5 h behandling med 1 | iM av GnRH-FITC-konjugat. Relativa MFI-värden är jämförbara och definiera hur effektivt de givna celltyper kan ta upp GnRH-analoger. GnRH-IR icke uppvisar BxPC-3-celler innehåller endast spår av dessa GnRH-analoger. GnRH-IR uttrycker EBC-1 lungcancerceller innehåller måttlig och Detroit-562 svalget cancerceller innehåller höga halter av GnRH-analoger. Resultaten presenteras som medelvärde ± SD, N = 3."_blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Experiment som beskrivs häri använder selektivt märkta GnRH-analoger för screening vidhäftande cellodlingar in vitro. Konfokal mikroskopi och flödescytometri metoder är lämpliga för att spåra och kvantifiera det cellulära upptaget av dessa GnRH-FITC-konjugat i en tid och koncentrationsberoende sätt. Dessa experiment har följande kritiska steg: 1) upprätthålla en steril, frisk cellkultur; 2) GnRH-peptider måste vara av hög kvalitet; 3) rimliga koncentrationer och inkubationstider måste följas; 4) behandling och tvättningssteg; 5) välanpassade instrumentinställningar.

Celler bibehålls i tillverkarens rekommenderade medium kompletterat med 10% (vol / vol) fetalt bovint serum och antibiotika (komplett medium). Cellerna ska förvaras och hanteras i en steril miljö tills behandlingsstegen (med GnRH-FITC-konjugat). Innan experimenten, ta cellerna med hjälp av ett inverterat mikroskop. De bör vara friska, Fäst och måste nå de nödvändiga mängder.

Det är viktigt att använda GnRH-peptider med hög kvalitet och renhet. Vi syntetiserade dessa peptider och renas dem till över 98% ^18. Peptiden kan förvaras vid -25 ° C i ett kylskåp som ett lyofiliserat pulver. 10 mM GnRH-FITC förrådslösningar i DMSO bör förvaras i en mörk plats vid rumstemperatur och användas inom ett par veckor. Vi undersökte stabiliteten i dessa konjugat och fann att de är stabila i DMSO och deras fluorescensintensitet bibehålls efter en månad av riktig lagring. Koncentrationen av GnRH-FITC-konjugat och tiden för behandlingar är variabel i dessa experiment, som erbjuder stora fördelar, men med vissa begränsningar (se nedan). Tillämpade koncentrationer och inkubationstider i detta protokoll är endast rekommendationer, men de ger en god grund för de första försöken.

CLSM experiment kräver brytaal tvättsteg. Dessa steg bör utföras noggrant. Överför inte vätska direkt på cellerna. Snarare använder sidan eller hörnet av brunnarna för detta ändamål. Detta kan minimera borttvättning av och förlora de vidhäftade cellerna. Det rekommenderas också att undvika direkt ljus under hela experimentet, eftersom det kan okänsliga de fluorescerande prover (fotoblekning effekt). Håll de behandlade proverna på en mörk plats eller täckt med en bit aluminiumfolie under försöket. Baserat på tidigare fynd, märkte vi att den slutliga DMSO-koncentrationen i den applicerade behandlings media är försumbar (0,1% (V / V) DMSO i 10 iM behandling av media) och har ingen effekt på resultaten, är därmed DMSO fritt komplett medium också lämplig som negativ kontroll.

Det är viktigt att använda välanpassade instrumentparametrar under CLSM och FACS experiment. Dessa parametrar måste kalibreras på varje celltyp, innan båda analyserna. I CLSM experiment signal intensitet konfokala bilder beror på följande parametrar: laser intensitet, detektor förstärkning och offset, och hål storlek. Vid justering av dessa parametrar, använder den lägsta lasereffekt för att åstadkomma en acceptabel bild och undvika fotoblekning. Ställa in avbildningsparametrar för att justera bakgrundsfluorescens av ofärgade negativa kontrollcellerna till nära noll (figur 3B). Bildbehandlade celler med dessa justerade parametrar för att undvika falska positiva resultat. Ytterligare signaler som sänds ut från de behandlade cellerna vid 514 nm och 546 nm innehåller den information som krävs om GnRH eller GnRH-IR. Dessa steg kräver erfarenhet i CLSM experiment. I FACS experiment, skapa en standard framåtspridning sidan punktdiagram (linjär skala) och som spänningar för att justera huvud levande cellen befolkningen i mitten av tomten. Rita en region runt levande celler. Skapa ett histogram, ställa abskissan att kanalisera en (FL1-530 nm, logaritmisk skala) och ställa det tidigare definierade området som en grindför detta histogram. Ställa FL1 spänning för att bringa signalen av ofärgade negativa kontrollceller under 10 ¹ (Figur 4A). Analysera behandlade celler med dessa justerade parametrar.

Vidare är det viktigt att kontrollera mykoplasma statusen för cellkulturer från tid till annan. Olika analyser är tillgängliga för detta ändamål. I händelse av mykoplasma positivitet, kassera celler och börja arbeta med en ny kultur. Det rekommenderas att använda en antibiotisk blandning i odlingsmediet som är optimerad för att förhindra mykoplasma. Den applicerade koncentrationen av GnRH-FITC-konjugat, och tiden för behandlingar är variabel i dessa experiment, men applicera låga koncentrationer och korta inkubationstider kan resultera i för svaga signaler för fluorescensdetektion.

När avbildning GnRH-IR parallellt med GnRH-analoger, är högre GnRH-FITC koncentration rekommenderas (10 ^ M är optimalt). Anledningen till den högre koncentrationär den korta inkubationstiden (1 timme) och den relativt höga fluorescenssignal av den märkta antikroppen jämfört med GnRH-FITC-konjugat. Å andra sidan, var en mindre överlappning mellan de två fluorescerande färgämnes utsläpp (514 nm och 546 nm) fann, som bara förekommer vid 546 nm och är härledd från signalen av GnRH-FITC-konjugat. Däremot kan den relativt högre fluorescenssignal av Alexa 546 och välanpassade parametrar minimera denna effekt, som visas i figur 3. En annan möjlig lösning för att undvika överlappningen, är att tillämpa märkt sekundär antikropp som har olika excitationsvåglängd och / eller bättre separerade emissionsspektrum jämfört med FITC (om de tekniska parametrarna CLSM tillåter detta). Denna möjlighet erbjuder stor fördel för CLSM-metoden, som gör det möjligt att använda valfria fluorescerande prober parallellt med GnRH-FITC-konjugat. Till exempel, kan dessa alternativa fluorescerande prober användas för motfärgning andra organeller som behövs.

Den tillämpade koncentrationen av GnRH-FITC-konjugat har följande begränsningar. Maximal koncentrationsgräns på GnRH-FITC-konjugat är baserad på deras löslighet ^18. Dessa värden är följande i PBS vid rumstemperatur: GnRH-I: 90 ^ M; GnRH-II: 40 pm; GnRH-III: 200 iM. Å andra sidan, i tidigare experiment vi tänkt att upptaget av dessa GnRH-peptider skulle kunna ske på annat sätt än humana GnRH-I-receptorer receptorer; Detta upptag verkar vara större vid högre koncentrationer (över 10 M) ^18. Den lägre detektionsgränsen för GnRH-FITC-konjugat är baserad på en mängd olika parametrar, men i ideala inställningar är det cirka 1 pm för tecknad experiment. Vi fann att flödet erbjuder cytometry bättre känslighet än konfokalmikroskopi. Under idealiska inställningar, kunde kvantifieringsgräns av GnRH-FITC-konjugat vara lägre än 1 ^ M. Detektionsgränsen eller kvantifiering kundevara olika i varje experiment, eftersom de är beroende av celltyp och inkubationstiden. Observera att data som erhållits genom FACS är mer pålitlig än CLSM, eftersom den upptäcker tusentals celler per prov och den genomsnittliga signal av celler beräknas. Men i protokollet, FACS inte ge information om den cellulära lokaliseringen av GnRH-FITC-konjugat och cellytan uttryck av GnRH-IR. Baserat på dessa överväganden drar vi slutsatsen att det CLSM och FACS experiment har tydliga fördelar, och de kompletterar varandra. Å andra sidan, skulle hög halt bildanalys vara ett intressant och ett bra alternativ för FACS och CLSM-analys.

Sammanfattningsvis visar data erhållna från dessa experiment bekräftar att var och en av de tre GnRH-FITC-konjugat kan träda in i celler som uttrycker cellyt-GnRH-IR. Dessa GnRH-analoger har liknande inriktning potens vid samma koncentrationer. Emellertid GnRH-IR nivå på ytan av olika burkcer celler är mycket varierande. Resultaten beräknades från data i flödescytometrianalys möjliggör jämförelsen av cellinjer eller GnRH-analoger. På samma gång, kan bilder erhållna genom konfokal mikroskopi avslöjar nivån på cellytan GnRH-IR-expression och bekräftar att dessa konjugat internaliseras in i cellerna. Baserat på dessa resultat kan man bekräfta att de införda försöken innehåller praktiska och varierande metoder för undersökning av GnRH baserade system drug delivery och erbjuder en god grund för fortsatta experiment.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EBC-1	JCRB Cell Bank	JCRB0820	Human lung squamous cell carcinoma
BxPC-3	ATCC	CRL-1687	Human pancreatic adenocarcinoma
Detroit-562	ATCC	CCL-138	Human pharyngeal carcinoma
RPMI-1640 Medium with L-glutamine	Lonza	BE12-702F	Culture medium for BxPC-3 cells
Eagle's Minimum Essential Medium	Lonza	BE12-611F	Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0.1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells
Fetal Bovine Serum	Euro Clone	ECS0180L	Complements the culture medium
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2012	Complements the culture medium (antibiotics)
Standard Line Cell Culture Flasks	VWR	10062-872	Provide consistent, sterile growth environment for cells
Trypsin-EDTA Mixture	Lonza	BE17-161E	Remove attached cells
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Lonza	BE17-516F	Solvent
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	Solvent
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	Used to counting cells
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I	made by us	-	Purity ≥98% (HPLC)
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II	made by us	-	Purity ≥98% (HPLC)
[Lys8(FITC)]-GnRH-III	made by us	-	Purity ≥98% (HPLC)
glass bottom 8-well microscopic slide	Ibidi	80826	Use in CLSM experiment
Corning Costar cell culture plate, 12 well	Sigma-Aldrich	CLS3513-50EA	Use in FACS experiment
Fixing solution (10% neutral buffered formalin)	Bio-Optica	01V60P	Fix adherent cells
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-10G	Prevent the nonspecific binding of the antibodies
GnRHR Antibody	Proteintech	19950-1-AP	Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors
Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A11035	Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody
Fluorescent probe solution (Draq5)	Thermo Fisher Scientific	62254	Counterstain nuclei
Fluoromount Aqueous Mounting Medium	Sigma-Aldrich	F4680-25ML	Use in CLSM experiment, preserving fluorescence
Inverted microscope	Elektro-Optika Ltd.	Alpha XDS-2T	Check the phenotype and confluency of cell cultures
Inverted confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM-710	Use in CLSM experiment
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur	Use in FACS experiment