Summary
Selectief gemerkte fluorescerende GnRH-I, -II en -III derivaten betrouwbare middelen voor het opsporen en kwantificeren van de cellulaire opname. Dit manuscript introduceert experimenten te visualiseren, kwantificeren en te vergelijken de opname efficiëntie van deze GnRH conjugaten in diverse cellijnen.
Abstract
GnRH-analogen zijn effectief doelgerichte eenheden en in staat om antikanker middelen te leveren selectief in kwaadaardige tumorcellen die zeer uitdrukkelijke GnRH-receptoren. Echter, de kwantitatieve analyse van cellulaire opname GnRH analogen en de onderzochte celtypen in-GnRH gebaseerde geneesmiddelafgiftesystemen momenteel beperkt. Eerder introduceerde, selectief gelabeld fluorescerende GnRH I, -II en -III derivaten zorgen voor een grote detecteerbaarheid, en ze hebben voldoende chemische eigenschappen voor reproduceerbare en robuuste experimenten. We vonden ook dat de nodige up-to-date methoden met deze gelabeld GnRH-analogen roman informatie over de GnRH-based drug delivery systemen kon bieden. Dit manuscript introduceert een aantal eenvoudige en snelle experimenten met betrekking tot de cellulaire opname van [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II en [Lys 8 (FITC)] - GnRH -III op de EBC-1 (long), de BxPC-3 (alvleesklier) en de Detroit-562- (farynx) maligne tumor cellen. Parallel aan deze GnRH-FITC-conjugaten werd het celoppervlak niveau van GnRH-I receptoren onderzocht in de volgende cellijnen voor en na de behandeling met GnRH confocale laser scanning microscopie. De cellulaire opname van GnRH-FITC-conjugaten werd gekwantificeerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering. In deze experimenten kleine verschillen tussen GnRH analogen en grote verschillen tussen celtypes waargenomen. De significante verschillen tussen cellijnen worden gecorreleerd met hun verschillende niveau van celoppervlakte GnRH-I receptoren. De geïntroduceerde experimenten bevatten praktische methoden te visualiseren, kwantificeren en vergelijk de opname-efficiëntie van GnRH-FITC-conjugaten in een tijd- en concentratieafhankelijke wijze op verschillende hechtende celculturen. Deze resultaten kunnen de drug targeting efficiëntie van GnRH conjugaten op de gegeven celkweek te voorspellen, en bieden een goede basis voor verdere experimenten in het onderzoek van GnRH-gebaseerde drug delivery systemen.
Introduction
Peptide-gebaseerde gerichte toediening van medicijnen systemen zijn uitgegroeid tot een snelle ontwikkeling en veelbelovend gebied in de behandeling van kanker in de afgelopen jaren 1, 2. Menselijke gonadotropin-releasing hormone receptor type I (GnRH-IR) is voornamelijk in de hypofyse, maar is ook aanwezig in verschillende andere weefsels die verantwoordelijk zijn voor zelfreproductie 3 zijn. GnRH-IR zich ook in een aantal kankerweefsels, al dan niet verbonden met het voortplantingssysteem 4, 5. De hoge expressie van GnRH-IR verschillende kwaadaardige tumorcellen in vergelijking met gezonde weefsels biedt een gelegenheid voor gerichte therapie 5, 6.
Veel gonadotropin-releasing hormone (GnRH) analogen ontwikkeld in de afgelopen decennia, die kunnen worden gebruikt als richtende delenf "> 7, 8, 9. Deze peptiden kunnen antikankermiddelen met hoge selectiviteit geven in kwaadaardige tumorcellen die overexpressie GnRH-IR 6. Verscheidene GnRH geconjugeerd anti-tumor geneesmiddelen met hogere selectiviteit en hoger rendement dan de corresponderende niet-geconjugeerde vrije geneesmiddel gerapporteerd 7, 8, 9.
Vorige publicaties over GnRH-peptiden en hun receptoren gemeld dat de GnRH-IR verschillende conformaties die verschillende selectiviteit hebben voor GnRH analogen 10 kan aannemen. De sterk wisselende GnRH-IR is complex en diverse signaalwegen zijn begiftigd met verschillende activiteiten tegen hun natuurlijke en kunstmatige liganden 11. Deze feiten maken onderzoek naar GnRH-gebaseerde systemen uitdagend. Anderzijds, de y bezitten veelbelovende therapeutisch potentieel. Verschillende experimenten met gelabeld GnRH peptiden werden eerder gemeld 12, 13, 14, 15, maar experimenten waarbij fluorescent gelabelde GnRH analogen werden nog beperkt. Terwijl radioactief merken biedt een hoge gevoeligheid, fluorescente labeling heeft een aantal andere voordelen, zoals de eenvoudige bediening en de mogelijkheid om tegenkleuring met verschillende fluoroforen. Drie gemeenschappelijke GnRH-analogen die met succes zijn gebruikt voor geneesmiddelafgifte zijn [D-Lys 6] -GnRH-I, [D-Lys 6] -GnRH-II en GnRH-III, maar de doeltreffendheid van deze peptiden als doelgerichte eenheden is zelden vergeleken 16, 17. Aan de andere kant, resultaten van afzonderlijke experimenten waarin verschillende kankercellen en GnRH analogen werden gebruikt divers.
ntent "> Op basis van deze overwegingen hebben we ons gericht op de tumor targeting en geneesmiddelafgifte potentieel van deze GnRH peptiden en daardoor gesynthetiseerd en gekarakteriseerd het [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] - GnRH-II en [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III peptideconjugaten 18 Deze analogen worden selectief gelabeld met FITC aan de zijketen van hun Lys of D-Lys (peptide-FITC verhouding 1: 1 naar elkaar. conjugaat). het idee was dat de selectieve fluorescentielabelling nieuwe informatie over deze peptiden kunnen bieden, en maakt hun goede tracking en betrouwbare kwantificatie. deze conjugaten veilig hanteren en betrouwbaar detecteerbaarheid, die het gemakkelijker om hun tumor targeting efficiëntie te vergelijken, en de screening van verschillende typen kwaadaardige tumorcellen. We hopen dat up-to-date experimenten met deze peptide-conjugaten kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe kanker gericht GnRH-geneesmiddel conjugaten en helpen nieuwe therapeutische tar identificerenkrijgt ook.De huidige manuscript toont een aantal goed reproduceerbare en snelle experimenten met GnRH-FITC conjugaten. Het celoppervlak expressie van GnRH-R bepalende voorwaarde van GnRH opname dus we gelijktijdig onderzocht het celoppervlak niveau van GnRH-IR van de geteste cellijnen. We gevisualiseerd de GnRH-IR en GnRH-FITC conjugaten van confocale laser scanning microscopie (CLSM) en gekwantificeerd de cellulaire opname van GnRH-FITC conjugaten middels fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van celkweken en reagentia
- Handhaaf de celkweken de fabrikant aanbevolen medium, aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum en antibiotica (zogenaamde volledig medium). Houd de celcultuur kolf in een bevochtigde, 5% CO2 atmosfeer incubator bij 37 ° C. Volg de proliferatie en samenvloeiing van de cellen door omgekeerde microscoop (met behulp van 10X fase objectieve contrast).
- Wanneer de cellen voldoende samenvloeiing bereiken, verwijder het medium, en was de cultuur met 2-3 ml, steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de PBS en voeg 0,5 ml steriel 0,25% trypsine-EDTA oplossing aan de celkweek en incubeer bij 37 ° C tot cellen los (ongeveer 10 min).
- Hang de cellen in 3-4 ml steriel compleet medium om trypsine te stoppen en zet ze in een steriele centrifugebuis. Centrifugeer de cellen bij 150 g gedurende 4 min bij kamertemperatuur (RT). Verwijder het supernatant voorzichtig op te schorten en de pEllet in 2-3 ml steriel compleet medium.
- Haal 100 pi van de celsuspensie en meng met 100 pl 0,4% (m / V) trypan blauwe oplossing, om de dode cellen te kleuren. Belasting 10 pi van dit mengsel in een hemocytometer en het bepalen van het aantal levensvatbare cellen door omgekeerde microscoop.
- Verdun de vereiste hoeveelheid celsuspensie bereid in stap 1,3-10 ml met steriel compleet medium, bevattende 4 x 10 4 cellen / ml.
- Voeg 250 ul van celsuspensie (bereid in stap 1.5) per putje (10 4 cellen / putje) in zeven putjes van de eerste glazen bodem 8-well microscopische slide. Gebruik deze dia in de GnRH opname methode.
- Voeg 250 ul van celsuspensie (bereid in stap 1.5) per putje (10 4 cellen / putje) in vijf putjes van de tweede 8-well microscopische slide. Deze dia wordt gebruikt in de GnRH-IR methode expressie.
- Voeg 1 ml celsuspensie (bereid in stap 1.5) per putje (4 x 10 4 cellen / putje) in zeven wells van een 12-wells plaat. Deze plaat wordt gebruikt in de GnRH kwantificeringsmethode.
- Laat de cellen hechten aan de twee microscoopglaasjes en de plaat. Incubeer ze in een bevochtigde, 5% CO2 atmosfeer incubator bij 37 ° C gedurende 48 uur.
- Na de incubatie controleren de cellen door omgekeerde microscoop (met behulp van 10X fase objectieve contrast). Als de cellen gezond zijn en aangesloten, gaat u verder met de volgende stappen.
- Bereid 10 mM GnRH-FITC voorraadoplossing in dimethylsulfoxide (DMSO) van elk van de drie conjugaten 18. (Gebruik deze verdunningen: 16,43 ug / ul [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, 16,97 ug / ul [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II en 16,47 ug / ul [Lys 8 ( FITC)] - GnRH-III) Houd deze voorraad oplossingen in een donkere plaats bij kamertemperatuur en gebruik ze binnen een paar weken.
- Verdun 1,7 pi elk van de drie 10 mM GnRH-FITC voorraadoplossingen in 1,7 ml compleet medium. Schud deze oplossingen. (These zijn de 10 pM GnRH-FITC behandelen media.) Verdun 150 pi elk van de drie 10 uM GnRH-FITC behandelen medium in 1,35 ml compleet medium. Schud deze oplossingen en (dit zijn de 1 uM GnRH-FITC behandelen medium).
LET OP: Alle GnRH-FITC met de behandeling van medium dient te worden beschermd tegen licht en gebruik binnen een paar uur. - Verwarm de zes GnRH-FITC behandelen medium (bereid in stap 1,12) en 4 ml volledig medium tot 37 ° C.
- Verdun 3 pl van 5 mM fluorescente probe oplossing (nucleaire tegenkleuring in de lijst genoemde materialen) in 3 ml PBS tot 5 uM. Deze oplossing moet worden beschermd tegen licht, houd het bij kamertemperatuur en gebruik het binnen een paar uur.
2. confocale laser scanning microscopie (CLSM)
- GnRH opname methode
- Neem de eerste microscopische dia bereid in stap 1.6 en pipet het compleet medium uit elk van die zeven. Voeg 250 ul van voorverwarmd volledige medium in het eerste putje. Gebruik dit als een negatieve controle. Voeg 250 pi van de voorverwarmde GnRH-FITC behandelen media (van 1,13) aan elk van de volgende zes putjes (3 putjes met 1 uM en 3 met 10 uM). Incubeer de schuif in een bevochtigde, 5% CO2 atmosfeer incubator bij 37 ° C gedurende 5 uur.
- Pipet uit het medium uit elk putje en was de cellen met 250 pi PBS. Voeg 250 pl fixeeroplossing (10% neutraal gebufferde formaline) in elk putje en incubeer de schuif bij KT gedurende 10 min.
- Pipetteer uit de vaststelling oplossing uit elk putje en was de cellen met 250 pi PBS. Voeg 250 ul PBS bevattende 5 uM fluorescerende probe bereid in stap 1,14 in elk putje en incubeer de schuif bij KT gedurende 10 min.
- Pipetteer uit de fluorescerende probe-oplossing van elk putje, en was de cellen tweemaal met 250 pi PBS voorzichtig. Voeg 3-4 druppels montage medium in elk putje, eindelijk. Houd de glijbaan in het donker bij kamertemperatuur, totdat de beeldvorming.
- GnRH-IR expressie methode
- Neem de tweede 8-well microscopische slide bereid in stap 1.7 en pipet het compleet medium uit elk van de vijf putten.
- Voeg 250 ul van voorverwarmde compleet medium in de eerste put, gebruik dit als negatieve controle. Voeg 250 ul van voorverwarmde compleet medium in de tweede ook goed, en dit gebruiken om GnRH-IR expressie te onderzoeken alvorens de behandeling GnRH.
- Voeg 250 pi elk van de drie voorverwarmde 10 uM GnRH-FITC behandelen medium in de komende drie putjes. Gebruik deze bronnen om de cellen met GnRH-FITC conjugaten voorbehandelen alvorens de GnRH-IR expressie. Incubeer de schuif in een bevochtigde, 5% CO2 atmosfeer incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Pipetteer de behandeling van medium uit elk van de drie putjes die zal worden gebruikt om GnRH-IR expressie na behandeling GnRH onderzoeken en was deze putjes met 250 ul voorverwarmde compleet medium. Voeg 250ui voorverwarmd compleet medium in elk van de drie putjes. Incubeer de schuif in een bevochtigde, 5% CO2 atmosfeer incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Pipetteer het medium uit elk van de vijf putjes en spoel de cellen met 250 pi PBS. Voeg 250 pl fixeeroplossing in elk putje en incubeer de schuif bij KT gedurende 10 min.
- Pipetteer uit de vaststelling oplossing uit elk putje en was de cellen met 250 ul van PBS. Voeg 250 ul PBS die 5% runderserumalbumine (BSA) blokkeeroplossing in elk putje en incubeer de schuif bij KT gedurende 1 uur.
- Verdun 10 pi van GnRH-IR primair antilichaam in 1 mL PBS (1: 100 ratio). Hou het bij kamertemperatuur en gebruik het binnen een paar uur.
- Pipetteer de BSA blokkerende oplossing uit elk putje met uitzondering van de negatieve controle (eerst ook). Was de cellen met 250 pi PBS (met uitzondering van de negatieve controle well). Voeg 250 ul PBS dat GnRH-IR primair antilichaam werd bereid in stap 2.2.7 in each goed (met uitzondering van de negatieve controle). Incubeer de glijbaan bij KT, gedurende 1 uur, op een donkere plaats.
- Verdun 2,5 pl Alexa 546 gelabelde secundaire antilichaam in 1,25 ml PBS (1: 500 ratio).
LET OP: Deze oplossing moet worden beschermd tegen licht, houd het bij kamertemperatuur en gebruik het binnen een paar uur. - Pipet uit oplossingen van elk van de vijf putjes en spoel de cellen met 250 pi PBS. Voeg 250 ul PBS dat AF 546 gelabeld secundair antilichaam werd bereid in stap 2.2.9 in elk putje. Incubeer de schuif bij KT gedurende 1 uur in het donker.
- Pipet uit de oplossing uit elk putje en was de cellen met 250 pi PBS. Voeg 250 ul PBS bevattende 5 uM fluorescerende probe bereid in stap 1,14 in elk putje en incubeer de glijbaan voor 10 min bij kamertemperatuur.
- Pipetteer uit de fluorescerende probe-oplossing van elk putje en was de cellen tweemaal met 250 pi PBS voorzichtig. Voeg 3-4 druppels montage media in elk putje, na afloop. Houd de glijbaan in het donkerbij KT totdat de microscopische beeldvorming.
- In beeld brengen
- Het imago van de cellen door omgekeerde confocale laser scanning microscoop (met behulp van 63x olie-immersie objectief)
- Gebruik de volgende excitatie / emissie-golflengten. GnRH conjugaten: 488/514 nm, Alexa 546 gemerkt antilichaam: 488/546 nm (alleen gebruiken voor het GnRH-IR expressie methode), DRAQ5 fluorescente probe: 633/680 nm.
- Stel de imaging parameters met de negatieve controle cellen. Gebruik deze parameters om het behandelde cellen (figuur 3). Bijstellen beeldparameters op elk microscopisch preparaat aan het begin van de analyse. Fine-tunen en export beelden met de software die door de fabrikant als dat nodig is.
- Het imago van de cellen door omgekeerde confocale laser scanning microscoop (met behulp van 63x olie-immersie objectief)
3. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)
- GnRH kwantificeermethode
- Neem de plaat bereid in stap 1.8 en pipet het compleet medium van EAch van zeven putjes. Voeg 1 ml voorverwarmde compleet medium in het eerste putje. Gebruik dit als een negatieve controle. Voeg 1 ml elk van de zes voorverwarmd behandelen media (3 putjes met 1 uM en 3 putjes met 10 uM) in de volgende zes putjes. Incubeer de plaat in een bevochtigde, 5% CO2 atmosfeer incubator bij 37 ° C gedurende 5 uur.
- Pipet uit het medium uit elk putje. Was de cellen tweemaal met 2 ml PBS zorgvuldig. Voeg 500 pi van trypsine-EDTA-oplossing in elk putjes. Incubeer de plaat bij 37 ° C tot cellen los (ongeveer 10 min).
- Voeg 1 mL volledig medium in elk putje om trypsine te stoppen. Schud de plaat. Hang de cellen voorzichtig met een pipet en overdracht van de schorsing uit elk putje in FACS buizen. Centrifugeer de buizen bij 150 g gedurende 4 min bij 4 ° C.
- Giet de bovenstaande vloeistoffen voorzichtig, met één beweging. Voeg 500 ul van ijskoude PBS in elk FACS buis en voorzichtig resuspendeer de cellen. Houd de buizen op ijs tot het eindevan het experiment.
- Analyse en berekening
- Analyseer de cellen door flowcytometrie. Voor excitatie, 488 nm gebruikt argon laser golflengte en voor detectie gebruiken 530 nm golflengte. Stel de flowcytometer parameters door uitvoering van de negatieve controlecellen. Gebruik deze parameters behandelde cellen (Figuur 4A) geanalyseerd. Evalueer de data software van de fabrikant Bepaal gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) waarden en berekent de relatieve MFI waarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Afbeeldingen verkregen door confocale laser scanning microscopie (CLSM) bieden een spectaculair informatie over de opname van GnRH-FITC conjugaten van de gegeven celkweek in een tijd en concentratie afhankelijke wijze. Parallel aan deze GnRH-FITC conjugaten, de aanwezigheid van de GnRH-IR op het celoppervlak ook controleerbaar door de CLSM experiment. Verder kan door toepassing van een ver-rode kleuring DNA fluorescente probe, is het mogelijk om de kernen van cellen tegenkleuring naast GnRH en GnRH-IR. Echter, terwijl de confocale beeld niet kwantificeerbaar, de eenvoudige "GnRH opname methode" kan gemakkelijk schatten of de onderzochte cellen bevatten hogere of lagere hoeveelheid GnRH-FITC conjugaten. De toegepaste GnRH-FITC-conjugaten, hun concentraties en de tijd van de behandeling zijn variabel in deze werkwijze, indien nodig. Zoals getoond in figuur 1 verschillende kankercellen verschillende GnRH-FITC in een concentratie afhankelijke wijze. De geavanceerde "GnRH-IR methode uitdrukking" beschrijft de visualisatie van het celoppervlak GnRH-IR door immunocytochemie, voor en na de behandeling GnRH-FITC. In het eerste deel van deze (vóór de behandeling GnRH-FITC), visualiseren we GnRH-IR door immunocytochemie, zonder GnRH-FITC behandeling. In het tweede deel van deze werkwijze (na de behandeling GnRH-FITC), we behandelen cellen gedurende 1 uur met 10 uM GnRH-FITC. Na de behandeling, incubeer we de cellen in compleet medium gedurende nog 1 uur en visualiseren GnRH-IR door immunocytochemie. Zoals getoond in Figuur 2A, verschillende kankercellen vertonen verschillende GnRH-IR op het oppervlak vóór de behandeling GnRH-FITC. Zoals getoond in figuur 2B, na de behandeling GnRH-FITC, het GnRH-IR tot expressie brengende cellen te handhaven (EBC-1) of toename (Detroit-562) GnRH-IR niveau op hun membranen. Op dit punt, er rekening mee dat we eerder bevestigd dat BxPC-3 cellen brengen ook GnRH-IR, maar niet presenteren op hun membraan 18. GnRH-IR kan in de BxPC-3 cellen worden gevisualiseerd door middel van immunocytochemie als hun membranen worden gepermeabiliseerd. Dit fenomeen verklaart de relatief lagere GnRH opname-efficiëntie van BxPC-3-cellen. Op basis van deze verklaring alleen richten we ons op het celoppervlak GnRH-IR hier. Vergeleken Figuur 1 tot figuur 2 bevestigt dat het niveau van celoppervlak GnRH-IR correleert met de hoeveelheid GnRH-FITC in de betreffende cellen. Verder Figuur 3C verduidelijkt dat GnRH-FITC wordt geïnternaliseerd in cellen omdat de lokalisatie van GnRH-FITC wordt gescheiden van het signaal van celoppervlak GnRH-I dakspanten 1 uur van de behandeling GnRH-FITC. We concluderen dat "GnRH-IR methode uitdrukking" ondersteunt de van de "GnRH opnamemethode die" informatie.
Het is belangrijk om goed aangepaste set gebruikentings tijdens de beeldvorming. Zoals geïllustreerd in figuur 3A de emissiegolflengte van FITC (514 nm) en de fluorofoor gelabeld secundair antilichaam (546 nm), de onbehandelde negatieve controlecellen ook licht autofluorescentie. Deze ongewenste fluorescentie kan vals-positieve resultaten opleveren. Daardoor bij het begin van de beeldvorming is het belangrijk om de fluorescentie-intensiteit aanpassen op controlecellen zie figuur 3B. Verwacht wordt dat een duidelijk signaal van de kernen wordt nageleefd de emissiegolflengte van de nucleaire kleuring (680 nm), met het fluorescentiesignaal bij de andere twee golflengten net zichtbaar of bijna nul. Alle andere cel monsters moeten worden afgebeeld met deze goed aangepast en vaste parameters. Zo signaal waargenomen bij 514 nm wordt afgeleid uit het signaal van slechts FITC-GnRH bij 546 nm van het signaal van GnRH-IR bijzonder en bij 680 nm van het signaal van kernen zoals weergegeven in figuur 3C. Afbeeldingen kunnen fi zijnne-tuned na de beeldvorming met behulp van software indien nodig.
Flowcytometrie experimenten bieden kwantificeerbare informatie over de hoeveelheid GnRH-FITC conjugaten die door de cellen werden genomen. De toegepaste GnRH-FITC-conjugaten, hun concentraties en de tijd van de behandeling ook variabel in deze werkwijze, indien nodig. De onbehandelde cellen als negatieve controle voor het instellen van de flowcytometrie parameters en hun gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) aan het begin van de analyse te bepalen. Zoals geïllustreerd in figuur 4A de MFI werd voor elk monster bepaald met behulp van dezelfde parameters. De relatieve MFI-waarden worden berekend op basis van de MFI-waarden met de berekeningsformule in figuur 4B. Volgens deze formule, de relatieve MFI waarde van controlecellen is altijd nul. De berekende relatieve MFI waarden kwantificeren de fluorescentie-intensiteit van GnRH-FITC conjugaten, die evenredig is met hun a zijnverage concentraties in de cellen. Zoals weergegeven in figuur 5, met deze gegevens kan men demonstreren en vergelijken hoe efficiënt deze kankercellen nemen van het GnRH-FITC conjugaten. Dus, de resultaten verkregen door flowcytometrie aanvulling en ondersteuning van de foto's overgenomen door confocale microscopie.
Figuur 1: Confocale beelden van de onbehandelde en [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III behandelde kankercellen. Verblauwen: kernen; groene vlek: [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III. Deze beelden worden verkregen met de "GnRH opnamemethode die". (A) De fluorescentiesignalen van de onbehandelde cellen aangepast tot bijna nul bij 514 nm (groen) op elke cellijn. De DRAQ5 ver-rode fluorescente probe wordt gebruikt om de kernen van cellen vlek. (B) Na het aanbrengen van de instellingen, de EBC-1 longkanker en de Detroit-562 menselijkekeelholte kankercellen tonen detecteerbaar, maar lage signaal bij 514 nm (groen) na 5 uur behandeling met 1 uM [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III. (C) Na 5 uur behandeld met 10 pM [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III, elk van de drie cellijnen onderhavige hoger fluorescentiesignaal. Resultaten van dit experiment suggereren dat de BxPC-3 alvleesklierkankercellen nam GnRH-FITC met veel lagere efficiëntie in vergelijking met de andere twee cellijnen die gemakkelijk mogelijk doel voor GnRH conjugaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Confocale beelden van celoppervlak GnRH-IR voor en na [D-Lys 6 (FITC)] - behandeling GnRH-I. Verblauwen: kernen; groene vlek: [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I; rode vlek : GnRH-IR. Deze beelden worden gegenereerd met de "GnRH-IR methode uitdrukking". (A) Voor de behandeling GnRH-FITC, hoeft BxPC-3 cellen geen GnRH-IR op het membraan echter EBC-1 cellen vertonen hoge en bepaalde Detroit-562 cellen vertonen matig GnRH-IR. (B) Na de behandeling GnRH-FITC, BxPC-3-cellen nog steeds niet GnRH-IR vertonen op hun membraan. EBC-1-cellen behouden hun GnRH-IR expressie en GnRH-FITC blijkt binnenkant van hen. Detroit-562 cellen lijken te vertonen hoger niveau van GnRH-IR na de behandeling en ze nemen GnRH-FITC, als goed. Dit experiment laat zien dat verschillende typen kwaadaardige tumorcellen ander niveau van GnRH-IR op het oppervlak en de GnRH-FITC opname lijkt nauw verwant aan het celoppervlak GnRH-IR expressie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Confocale beelden van EBC-1 longkankercellen. Verblauwen: kernen; groene vlek: [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III; rode vlek: GnRH-IR. Deze beelden worden door de "GnRH-IR methode uitdrukking". (A) Onbehandelde negatieve controle cellen (zonder GnRH-FITC en Alexa 546) worden waargenomen en ongewenste fluorescentie bij 514 nm en 546 nm bij het gebruik van over-versterkte instrumenten instellingen. (B) het instrument aanpassen op de onbehandelde negatieve controlecellen, de groene (514 nm) en rode (546 nm) signaal bijna nul. (C) Aangepast parameters resulteren in duidelijke en betrouwbare signalen voor het GnRH-FITC behandeld en GnRH-IR gekleurde cellen. Na de behandeling GnRH-FITC wordt lokalisatie van GnRH-FITC (groen) gescheiden van het celoppervlak GnRH-IR (rood).529fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Evaluatie van doorstroomcytometrie gegevens. (A) Histogram van de onbehandelde en de behandelde Detroit-562 cellen. MFI waarden van de celmonsters worden bepaald uit het histogram. De x-as geeft de fluorescentie-intensiteit van cellen, en de y-as toont de tellingen. Zwarte lijn: MFI vóór de behandeling GnRH-FITC; groene stippellijn: MFI na de 5 uur behandeling met 1 uM [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III; rode stippellijn: MFI na de 5 uur behandeling met 10 uM [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III. (B) berekening formule van relatieve MFI waarden. De relatieve MFI-waarden worden berekend uit de MFI waarden. Gebruik van deze berekening, de relatieve MFI waarde van het onbehandelde controlemonster is altijd nul. de relat ive MFI waarden van de behandelde monsters vertegenwoordigen de hoeveelheid GnRH-FITC conjugaten die in de cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Relatieve MFI waarden van kankercellen na 5 uur behandeld met 1 uM van GnRH-FITC conjugaten. Relatieve MFI-waarden zijn vergelijkbaar en bepalen hoe efficiënt de gegeven celtypen kunnen nemen GnRH-analogen. De GnRH-IR niet vertoont BxPC-3 cellen bevatten slechts sporen van deze GnRH analogen. De GnRH-IR tot expressie EBC-1 longkankercellen bevatten matig en de Detroit-562 keelholte kankercellen bevatten een hoog bedrag van GnRH-analogen. Resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SD, n = 3."_blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Experimenten hierin beschreven gebruiken selectief gelabeld GnRH analogen voor screening hechtende celculturen in vitro. Confocale microscopie en flowcytometrie werkwijzen zijn geschikt voor het volgen en kwantificeren van de cellulaire opname van deze GnRH-FITC-conjugaten in een tijd en concentratie afhankelijke wijze. Deze experimenten hebben de volgende belangrijke stappen: 1) handhaven van een steriele, gezonde celkweek; 2) GnRH-peptiden moet van hoge kwaliteit zijn; 3) redelijke concentraties en incubatietijden moeten worden gevolgd; 4) het behandelen en wasstappen; 5) goed aangepaste instrument instellingen.
De cellen worden gehandhaafd in de fabrikant aanbevolen medium aangevuld met 10% (V / V) foetaal runderserum en antibiotica (compleet medium). De cellen moeten worden bewaard en verwerkt in een steriele omgeving, totdat de behandeling stappen (met GnRH-FITC conjugaten). Voorafgaand aan de experimenten, controleer dan de cellen met behulp van een omgekeerde microscoop. Zij moeten gezond, Aangesloten en moet de benodigde hoeveelheden te bereiken.
Het is belangrijk om GnRH peptiden gebruiken met een hoge kwaliteit en zuiverheid. We gesynthetiseerde deze peptiden en gezuiverd ze dan 98% 18. Het peptide kan worden opgeslagen bij -25 ° C in een koelkast als een gevriesdroogd poeder. De 10 mM GnRH-FITC stockoplossingen in DMSO moeten op een donkere plaats bij kamertemperatuur worden bewaard en gebruikt worden binnen een paar weken. Wij onderzochten de stabiliteit van deze conjugaten en vonden dat ze stabiel in DMSO en de fluorescentie-intensiteit worden gehandhaafd na 1 maand correcte opslag. De concentratie van GnRH-FITC conjugaten en het tijdstip van de behandelingen zijn variabel in deze experimenten, die grote voordelen biedt, maar met bepaalde beperkingen (zie hieronder). De toegepaste concentraties en incubatietijden in dit protocol zijn slechts aanbevelingen, maar ze bieden een goede basis voor de eerste experimenten.
CLSM experimenten vereisen verbrekenal wasstappen. Deze stappen moeten zorgvuldig worden uitgevoerd. Niet direct vloeibare overzetten naar de cellen. Gebruik liever de zijkant of de hoek van de putjes daartoe. Dit kan minimaliseren afspoelen en de aangehechte cellen te verliezen. Het is ook aan te raden om direct licht gedurende de hele experiment te vermijden, omdat het de fluorescerende monsters (fotobleken effect) kunnen ongevoelig. Houd de behandelde monsters op een donkere plaats of bedekt met een stuk aluminiumfolie tijdens het experiment. Op basis van eerdere bevindingen hebben we geconstateerd dat de uiteindelijke DMSO-concentratie in de toegepaste behandeling van media te verwaarlozen (0,1% (v / v) DMSO in 10 uM behandelen media) en heeft geen effect op de resultaten, waardoor DMSO-vrij compleet medium ook geschikt als negatieve controle.
Het is belangrijk om goed aangepaste instrumentparameters tijdens de CLSM en FACS experimenten. Deze parameters moeten opnieuw worden gekalibreerd op elk type cel, voordat beide analyses. In de CLSM experiment werd de signaal intensiteit van confocale beelden afhankelijk van de volgende parameters: laser intensiteit detector versterking en offset, en pinhole grootte. Bij het aanpassen van deze parameters, gebruikt u het laagste laservermogen tot een acceptabel beeld te produceren en fotobleken te vermijden. Stel de beeldvormingsparameters de achtergrondfluorescentie van ongekleurde negatieve controlecellen tot bijna nul (figuur 3B) passen. Afbeelding behandelde cellen met deze aangepaste parameters vals positieve resultaten te vermijden. Additionele signalen uitgezonden door de behandelde cellen bij 514 nm en 546 nm de vereiste informaties GnRH en GnRH-IR bevatten. Deze stappen vereisen vaardigheid in de CLSM experimenten. In de FACS experiment, maakt u een standaard forward scatter-side scatter plot (lineaire schaal) en stel spanningen naar de belangrijkste levende cel populatie aan te passen in het midden van het perceel. Teken een regio rond levende cellen. Maak een histogram, ingesteld abscis op kanaal één (FL1-530 nm, logaritmische schaal) en stel de eerder gedefinieerde regio als een poortdit histogram. FL1 ingesteld voltage op het signaal van ongekleurde negatieve controle cellen onder 10 1 (Figuur 4A) brengen. Analyseer behandelde cellen met deze aangepaste parameters.
Verder is het belangrijk om de mycoplasma status van de celkweken van tijd tot tijd te controleren. Verschillende assays zijn beschikbaar voor dit doel. In het geval van mycoplasma positiviteit, gooi cellen en begint te werken met een nieuwe cultuur. Het wordt aanbevolen een antibiotisch mengsel gebruikt in het kweekmedium is geoptimaliseerd om mycoplasma te voorkomen. De toegepaste concentratie van GnRH-FITC conjugaten en het tijdstip van de behandelingen zijn variabel in deze experimenten echter toepassen lage concentraties en korte incubatietijden kunnen tot een te zwakke signalen voor fluorescentiedetectie.
Bij beeldvorming van de GnRH-IR parallel aan GnRH analogen, is hoger GnRH-FITC concentratie aanbevolen (10 uM optimaal). De reden voor de hogere concentratieis de korte incubatietijd (1 uur) en de relatief hoge fluorescentiesignaal van het gemerkte antilichaam in vergelijking met GnRH-FITC conjugaten. Anderzijds, een kleine overlap tussen de twee fluorescente kleurstof emissie (514 nm en 546 nm) bleek dat alleen optreedt bij 546 nm en is afgeleid van het signaal van GnRH-FITC conjugaten. Echter, de relatief hogere fluorescentiesignaal van Alexa 546 en goed aangepaste parameters dit effect te minimaliseren, zoals aangetoond in figuur 3. Een andere mogelijke oplossing om de overlapping te voorkomen, is van toepassing voor gekenmerkt tweede antilichaam dat verschillende excitatie golflengte en / of beter gescheiden emissiespectrum vergelijking met FITC (als de CLSM technische parameters dit toelaten) heeft. Deze mogelijkheid biedt grote voordelen voor de CLSM werkwijze, waardoor het gebruik van optionele fluorescerende probes gelijktijdig met GnRH-FITC conjugaten. Zo kunnen deze alternatieve fluorescerende probes worden gebruikt voor tegenkleuring andere organellen zoals nodig.
De toegepaste concentratie van GnRH-FITC conjugaten heeft de volgende beperkingen. Maximale concentratiegrens van GnRH-FITC conjugaten berust op de oplosbaarheid 18. Deze waarden zijn de volgende in PBS bij kamertemperatuur: GnRH-I: 90 uM; GnRH-II: 40 uM; GnRH-III: 200 uM. Anderzijds, in eerdere experimenten veronderstelde we dat de toename van deze GnRH peptiden kan plaatsvinden door andere dan menselijke GnRH-I receptoren receptoren; Deze opname lijkt significant bij hogere concentraties te zijn (boven 10 uM) 18. De onderste detectiegrens van GnRH-FITC conjugaten is gebaseerd op verschillende parameters, maar in ideale verblijfplaats is ongeveer 1 uM voor CLMS experimenten. We vonden dat flowcytometrie biedt betere gevoeligheid dan confocale microscopie. In de ideale instellingen, zou de kwantificatie limiet van GnRH-FITC conjugaten van minder dan 1 urn. De detectiegrens of kwantificatie kanverschillend in elk experiment, omdat ze afhankelijk zijn van het type cel en incubatietijd zijn. Merk op dat, verkregen door FACS is betrouwbaarder dan CLSM, omdat detecteert duizenden cellen per monster en het gemiddelde signaal van cellen berekend. In het protocol FACS geeft geen informatie over de cellulaire lokalisatie van GnRH-FITC conjugaten en de celoppervlak expressie van GnRH-IR. Op basis van deze overwegingen concluderen wij dat, de CLSM en FACS experimenten hebben duidelijke voordelen, en ze vullen elkaar aan. Anderzijds zou hoog gehalte beeldanalyse zijn interessant en een goed alternatief voor FACS-analyse en CLSM.
Samenvattend, de resultaten van deze experimenten gegevens bevestigen dat elk van de drie GnRH-FITC conjugaten in cellen die celoppervlak GnRH-IR tot expressie kan komen. Deze GnRH analogen vergelijkbare targeting potentie in dezelfde concentraties. De GnRH-IR niveau op het oppervlak van verschillende cancer cellen is zeer variabel. Resultaten berekend uit de gegevens van flowcytometrie analyse maakt de vergelijking van cellijnen of GnRH analogen. Tegelijkertijd kan beelden verkregen door confocale microscopie het niveau van celoppervlak GnRH-IR expressie openbaren en bevestigen dat deze conjugaten worden geïnternaliseerd in de cel. Op basis van deze resultaten kan men controleren of de ingevoerde experimenten bevatten praktische en variabele methoden voor het onderzoeken van GnRH gebaseerde geneesmiddelafgiftesystemen en bieden een goede basis voor verdere experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0.1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
References
- Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11 (2016).
- Majumdar, S., Siahaan, T. J.
- Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K.
- Schally, A. V., et al.
- Limonta, P., et al. GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies. Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).
- Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances. J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).
- Manea, M., et al. In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice. Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).
- Argyros, O., et al. Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth. Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).
- Karampelas, T., et al. GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery. Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).
- Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -L. Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling. Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).
- Millar, R. P., et al. Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).
- Olberg, D. E., et al. Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression. Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).
- Zoghi, M., et al. Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging. Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).
- Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging. Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).
- Nederpelt, I., et al. Characterization of 12 GnRH peptide agonists - A kinetic perspective. Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).
- Szabo, I., et al. Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting. J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).
- Leurs, U., et al. GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate. Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).
- Murányi, J., et al. Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells. J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).
