Summary
Sélectivement marqué fluorescent GnRH-I, -II et -III dérivés sont des outils fiables pour le suivi et la quantification de leur absorption cellulaire. Ce manuscrit présente des expériences pour visualiser, quantifier et comparer l'efficacité d'absorption de ces conjugués de GnRH dans diverses lignées cellulaires.
Abstract
analogues de la GnRH sont des fragments de ciblage efficaces et capables de délivrer des agents anti-cancéreux de manière sélective dans des cellules tumorales malignes qui expriment fortement les récepteurs de la GnRH. Cependant, l'analyse quantitative de l'absorption cellulaire des analogues de la GnRH et les types cellulaires étudiés dans les systèmes de délivrance de médicaments à base de GnRH sont actuellement limitées. Auparavant introduit, marqué par fluorescence sélective GnRH I, -II et -III dérivés fournir une grande détectabilité, et ils ont des propriétés chimiques appropriés pour des expériences reproductibles et robustes. Nous avons également constaté que les méthodes mises à jour appropriées avec ces analogues de la GnRH marqués pourraient offrir des informations inédites sur les systèmes de délivrance de médicaments à base de GnRH. Ce manuscrit présente quelques expériences simples et rapides en ce qui concerne l'absorption cellulaire de [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II et [Lys 8 (FITC)] - GnRH -III sur l'EBC-1 (poumon), le BxPC-3 (pancréas) et sur le Detroit 562- (pharynx) t malignesumor cellules. Parallèlement à ces conjugués au FITC GnRH, le niveau des récepteurs de la GnRH-I de surface cellulaire a également été examinée sur ces lignées cellulaires avant et après le traitement à la GnRH par microscopie confocale à balayage laser. L'absorption cellulaire des conjugués de GnRH-FITC a été quantifié par tri cellulaire activé par fluorescence. Dans ces expériences, des différences mineures entre les analogues de la GnRH et de grandes différences entre les types de cellules a été observée. Les différences significatives entre les lignées cellulaires sont mises en corrélation avec leur niveau distinct de récepteurs de surface cellulaire GnRH-I. Les expériences présentées contiennent des méthodes pratiques pour visualiser, quantifier et comparer l'efficacité de l'absorption de conjugués GnRH-FITC dans un temps et de manière dépendante de la concentration sur les différentes cultures de cellules adhérentes. Ces résultats pourraient prédire l'efficacité des médicaments ciblant des conjugués GnRH sur la culture cellulaire donné, et d'offrir une bonne base pour d'autres expériences dans l'examen des systèmes de délivrance de médicaments à base de GnRH.
Introduction
Systèmes de délivrance de médicaments peptidiques à base ciblées sont devenues un développement rapide et domaine prometteur dans le traitement du cancer au cours des dernières années 1, 2. La gonadotrophine humaine de type récepteur d'hormone de libération de I (GnRH-IR) est principalement situé dans la glande pituitaire , mais est aussi présent dans plusieurs autres tissus qui sont responsables de l' autoreproduction 3. GnRH-IR est également exprimée dans de nombreux tissus cancéreux, liés ou non au système reproducteur 4, 5. L'expression élevée de GnRH-IR sur plusieurs cellules tumorales malignes par rapport aux tissus sains est l'occasion pour la thérapie ciblée 5, 6.
Beaucoup gonadolibérine (GnRH) analogues ont été développés au cours des dernières décennies, qui pourraient être utilisés comme groupements de ciblagef "> 7, 8, 9. Ces peptides sont capables de délivrer des agents anticancéreux avec une sélectivité élevée dans les cellules tumorales malignes qui surexpriment GnRH-IR 6. Plusieurs médicaments anti-tumoraux conjugués GnRH avec une sélectivité plus élevée et une meilleure efficacité que le non conjugué correspondant sans drogue ont été signalés 7, 8, 9.
Les publications précédentes au sujet de peptides GnRH et leurs récepteurs ont indiqué que le GnRH-IR peut prendre différentes conformations qui ont sélectivité différente pour GnRH analogues de 10. La GnRH-IR très variable a des voies de signalisation complexes et diverses sont dotés d' une activité différente contre leurs ligands naturels et artificiels 11. Ces faits font enquête sur les systèmes basés sur la GnRH difficile. D'autre part, la y possèdent un potentiel thérapeutique prometteur. Plusieurs expériences avec des peptides GnRH radiomarqués ont été signalés précédemment 12, 13, 14, 15, mais des expériences dans lesquelles analogues de la GnRH marqués par fluorescence ont été utilisés sont encore limitées. Bien que le marquage radioactif offre une sensibilité élevée, un marquage fluorescent a plusieurs autres avantages, par exemple la manipulation plus facile, et la capacité de contre-colorer avec des fluorophores différents. Trois analogues de la GnRH communes qui ont été utilisées avec succès pour la délivrance de médicaments sont le [D-Lys 6] -GnRH-I, [D-Lys 6] -GnRH-II et GnRH-III, mais l'efficacité de ces peptides comme fragments de ciblage est rarement contre 16, 17. D'autre part, les résultats d'expériences distinctes dans lesquelles des cellules cancéreuses différentes et des analogues de la GnRH ont été utilisés sont divers.
MÉNAGEMENT "> Sur la base de ces considérations, nous nous sommes concentrés sur le ciblage de la tumeur et le potentiel de distribution de médicaments de ces peptides de la GnRH et, par conséquent synthétisé et caractérisé par la [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] - GnRH-II et [Lys 8 (FITC)] - peptides conjugués GnRH-III 18 Ces analogues sont sélectivement marqués par la FITC sur la chaîne latérale de la Lys ou D-Lys (rapport peptide-FITC 1: 1 à chacun. conjugué). l'idée était que le marquage fluorescent sélectif peut offrir des informations inédites sur ces peptides, et permet leur bonne suivi et une quantification fiable. ces conjugués ont une manipulation sûre et détectabilité fiable, ce qui rend plus facile de comparer leur tumeur efficacité du ciblage, et projection de nombreux types de cellules tumorales malignes. Nous espérons que la mise à jour des expériences avec ces conjugués peptidiques pourrait contribuer au développement de nouveaux cancer ciblant conjugués GnRH-médicaments, et d'aider à identifier de nouvelles tar thérapeutiqueobtient ainsi.Le présent manuscrit démontre quelques expériences bien reproductibles et rapides avec des conjugués GnRH-FITC. L'expression de surface cellulaire de la GnRH-R est une condition déterminante en ce qui concerne l'absorption de la GnRH, par conséquent, nous avons étudié simultanément le niveau de la GnRH-IR à la surface cellulaire sur les lignées cellulaires testées. Nous avons visualisé les conjugués GnRH-IR et GnRH-FITC par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) et quantifié l'absorption cellulaire des conjugués de GnRH-FITC en utilisant les cellules activées par fluorescence (FACS).
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Protocol
1. Préparation des cultures de cellules et réactifs
- Maintenir les cultures de cellules dans le milieu recommandé par le fabricant, supplémenté avec 10% (v / v) de sérum et d'antibiotiques de veau fœtal (milieu appelé complet). Maintenir la fiole de culture de cellules dans un humidifiée à 5% de CO 2 atmosphère incubateur à 37 ° C. Suivre la prolifération et la confluence des cellules au microscope inversé (en utilisant l'objectif 10X de contraste de phase).
- Lorsque les cellules atteignent la confluence adéquate, éliminer le milieu, et laver la culture avec 2-3 ml, solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Retirer le PBS et on ajoute 0,5 ml de solution stérile à 0,25% de trypsine-EDTA à la culture cellulaire et on incube à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules se détachent (environ 10 minutes).
- Suspendre les cellules dans 3-4 ml de milieu complet stérile pour arrêter la trypsine et de les transférer dans un tube à centrifuger stérile. Centrifuger les cellules à 150 g pendant 4 minutes à la température ambiante (TA). Jeter le surnageant avec soin et suspendre le pEllet dans 2-3 ml de milieu complet stérile.
- Sortez 100 pi de la suspension cellulaire et mélanger avec 100 pi de 0,4% (m / V) trypan solution bleu, pour colorer les cellules mortes. Charge 10 ul de ce mélange dans un hémocytomètre et déterminer le nombre de cellules viables par microscope inversé.
- Diluer la quantité requise de la suspension cellulaire préparée à l' étape 1.3 à 10 ml avec du milieu complet stérile contenant 4 x 10 4 cellules / ml.
- Ajouter 250 ul de suspension cellulaire (préparé à l' étape 1.5) par puits (10 4 cellules / puits) dans sept puits du premier fond de verre 8 puits lame microscopique. Utilisez cette diapositive dans la méthode d'absorption GnRH.
- Ajouter 250 ul de suspension cellulaire (préparé à l' étape 1.5) par puits (10 4 cellules / puits) dans cinq puits de la deuxième diapositive 8 puits microscopique. Cette glissière sera utilisée dans le procédé d'expression de la GnRH-IR.
- Ajouter 1 ml de suspension de cellules (préparé à l' étape 1.5) par puits (4 x 10 4 cellules / puits) en sept wells d'une plaque de 12 puits. Cette plaque sera utilisée dans la méthode de quantification de la GnRH.
- Que les cellules adhèrent sur les deux lames microscopiques et la plaque. Incuber dans un humidifiée à 5% de CO 2 atmosphère incubateur à 37 ° C pendant 48 heures.
- Après l'incubation de vérifier les cellules par microscope inversé (en utilisant 10X objectif à contraste de phase). Si les cellules sont en bonne santé et attaché, continuez avec les étapes suivantes.
- Préparer mM GnRH-FITC solution stock 10 dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) de chacun des trois conjugués 18. (Utilisez ces concentrations de dilution: 16,43 pg / pl [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, 16,97 pg / pl [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II et 16,47 pg / pl [Lys 8 ( FITC)] - GnRH-III) Gardez ces solutions mères dans un endroit sombre à la température ambiante et de les utiliser au sein de quelques semaines.
- Diluer 1,7 ul de chacun des trois 10 mM GnRH-FITC de solutions mères dans 1,7 ml de milieu complet. Agiter ces solutions. (These sont les 10 uM GnRH-FITC traitement de médias.) On dilue 150 ul de chacun des trois 10 uM GnRH-FITC milieu de traitement dans 1,35 mL de milieu complet. Agiter ces solutions ainsi (ce sont les 1 uM GnRH-FITC milieu de traitement).
NOTE: Toutes les GnRH-FITC milieu contenant le traitement doit être protégé de la lumière et utilisée au sein de quelques heures. - Préchauffer le-FITC GnRH moyenne six traitement (préparé à l'étape 1.12) et 4 ml de milieu complet à 37 ° C.
- Diluer 3 pl de solution de sonde fluorescente 5 mM (de contre-coloration nucléaire mentionné dans la liste des matières) dans 3 ml de PBS à 5 uM. Cette solution doit être protégé de la lumière, le garder à température ambiante et de l'utiliser au sein de quelques heures.
2. confocale à balayage laser (CLSM)
- GnRH méthode absorption
- Prenez la première lame microscopique préparée à l'étape 1.6 et pipette le milieu complet de chacun des sept puits. Ajouter 250 ul de medi complète préchaufféum dans le premier puits. Utilisez cela comme un contrôle négatif. Ajouter 250 ul de la GnRH préchauffé FITC traitement de médias (de 1,13) à chacun des six puits suivants (3 puits avec 1 uM et 3 à 10 pm). Incuber la lame dans une humidifiée de 5% de CO 2 incubateur à atmosphère à 37 ° C pendant 5 h.
- Pipeter le milieu de chaque puits et laver les cellules avec 250 ul de PBS. Ajouter 250 pi de solution de fixation (10% de formol tamponné neutre) dans chaque puits et incuber la lame à la température ambiante, pendant 10 minutes.
- Pipeter la solution de fixation de chaque puits et laver les cellules avec 250 ul de PBS. Ajouter 250 ul de PBS contenant 5 uM solution de sonde fluorescente préparée à l'étape 1.14 dans chaque puits et incuber la lame à la température ambiante, pendant 10 min.
- Pipeter la solution de sonde fluorescente de chaque puits, et laver les cellules deux fois avec 250 ul de PBS avec soin. Ajouter 3-4 gouttes de milieu de montage dans chaque puits, enfin. Gardez la lame dans l'obscurité à la température ambiante, jusqu'à ce que l'imagerie.
- Procédé d'expression de la GnRH-IR
- Prendre la deuxième lame de microscope 8 puits préparé à l'étape 1.7 et pipette le milieu complet de chacun des cinq puits.
- Ajouter 250 ul de milieu complet préchauffé dans le premier puits, utilisez ce contrôle négatif. Ajouter 250 ul de milieu complet préchauffé dans le second puits aussi, et l'utiliser pour examiner l'expression de la GnRH-IR avant le traitement GnRH.
- Ajouter 250 ul de chacun des trois préchauffée 10 uM GnRH-FITC médias traitement dans les trois prochains puits. Utilisez ces puits pour prétraiter les cellules avec des conjugués GnRH-FITC avant d'examiner l'expression de la GnRH-IR. Incuber la lame dans une humidifiée de 5% de CO 2 incubateur à atmosphère à 37 ° C pendant 1 h.
- Pipeter le milieu de traitement provenant de chacun des trois puits qui seront utilisés pour examiner l'expression de la GnRH-IR après le traitement de la GnRH et laver les puits avec 250 ul de milieu complet préchauffé. Ajouter 250ul de milieu complet préchauffé dans chacun des trois puits. Incuber la lame dans une humidifiée de 5% de CO 2 incubateur à atmosphère à 37 ° C pendant 1 h.
- Pipeter le milieu à partir de chacun des cinq puits et laver les cellules avec 250 ul de PBS. Ajouter 250 pi de fixation solution dans chaque puits et incuber la lame à la température ambiante, pendant 10 min.
- Pipeter la solution de fixation de chaque puits et laver les cellules avec 250 ul de PBS. Ajouter 250 pi de PBS contenant de l'albumine de sérum bovin à 5% (BSA) dans une solution de blocage dans chaque puits et incuber la lame à la température ambiante pendant 1 h.
- Diluer 10 ul d'anticorps primaire GnRH-IR dans 1 ml de PBS (1: 100 Ratio). Gardez-le à température ambiante et de l'utiliser au sein de quelques heures.
- Pipeter la solution de blocage BSA de chaque puits, sauf le contrôle négatif (premier puits). Laver les cellules avec 250 ul de PBS (sauf le contrôle négatif bien). Ajouter 250 ul de PBS contenant l'anticorps primaire GnRH-IR préparé à l'étape 2.2.7 en each bien (sauf le contrôle négatif). Incuber la lame à la température ambiante, pendant 1 h, dans un endroit sombre.
- Diluer 2,5 ul d'Alexa 546 anticorps secondaire marqué dans 1,25 ml de PBS (1: 500 ratio).
NOTE: Cette solution doit être protégé de la lumière, le garder à température ambiante et de l'utiliser au sein de quelques heures. - Pipeter des solutions de chacun des cinq puits et laver les cellules avec 250 ul de PBS. Ajouter 250 ul de PBS contenant 546 AF anticorps secondaire marqué préparé à l'étape 2.2.9 dans chaque puits. Incuber la lame à la température ambiante, pendant 1 h dans l'obscurité.
- Pipeter la solution de chaque puits et laver les cellules avec 250 ul de PBS. Ajouter 250 ul de PBS contenant 5 uM solution de sonde fluorescente préparée à l'étape 1.14 dans chaque puits et incuber la lame pendant 10 min, à la température ambiante.
- Pipeter la solution de sonde fluorescente de chaque puits et laver les cellules deux fois avec 250 ul de PBS avec soin. Ajouter 3-4 gouttes de milieu de montage dans chaque puits, par la suite. Gardez la lame dans l'obscuritéà la température ambiante jusqu'à ce que l'imagerie microscopique.
- Imaging
- Image cellules par confocal inversé à balayage laser (en utilisant 63X objectif à immersion d'huile)
- Utilisez les longueurs d'onde d'excitation / d'émission suivantes. conjugués de GnRH: 488/514 nm, Alexa 546 anticorps marqué: 488/546 nm (utiliser uniquement pour la méthode d'expression GnRH-IR), sonde fluorescente DRAQ5: 633/680 nm.
- Mettre en place les paramètres d'imagerie utilisant les cellules témoins négatives. Utilisez ces paramètres à des cellules d'image traitées (figure 3). Re-ajuster les paramètres d'imagerie sur chaque diapositive microscopique au début de l'analyse. Peaufinez et d'exportation des images avec le logiciel fourni par le fabricant si nécessaire.
- Image cellules par confocal inversé à balayage laser (en utilisant 63X objectif à immersion d'huile)
3. Fluorescence-tri cellulaire activé (FACS)
- Procédé de quantification de la GnRH
- Prenez la plaque préparée à l'étape 1.8 et pipette le milieu complet de each des sept puits. Ajouter 1 mL de milieu complet préchauffé dans le premier puits. Utilisez cela comme un contrôle négatif. Ajouter 1 ml de chacune des six préchauffée traitement de supports (3 puits avec 1 uM et 3 puits avec 10 uM) dans les six puits suivants. Incuber la plaque dans une humidifiée de 5% de CO 2 incubateur à atmosphère à 37 ° C pendant 5 h.
- Pipeter le milieu de chaque puits. Laver les cellules deux fois avec 2 ml de PBS avec soin. Ajouter 500 pi de solution de trypsine-EDTA dans chaque puits. Incuber la plaque à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules se détachent (environ 10 minutes).
- Ajouter 1 mL de milieu complet dans chaque puits pour arrêter la trypsine. Agiter la plaque. Suspendre les cellules doucement avec une pipette et transférer la suspension de chaque puits dans des tubes FACS. Centrifuger les tubes à 150 g pendant 4 min, à 4 ° C.
- Versez les surnageants soigneusement, avec un seul mouvement. Ajouter 500 pi de PBS glacé dans chaque tube FACS et doucement remettre en suspension les cellules. Gardez les tubes sur la glace jusqu'à la finde l'expérience.
- Analyse et calcul
- Analyser les cellules par cytométrie de flux. Pour l'excitation, utiliser 488 nm de longueur d'onde laser à l'argon et pour la détection utiliser 530 nm de longueur d'onde. Configurer les paramètres du cytomètre en exécutant les cellules témoins négatives. Utilisez ces paramètres pour analyser les cellules traitées (figure 4A). Évaluer les données avec le logiciel du fabricant, de déterminer l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) des valeurs, et de calculer les valeurs relatives des IFM.
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Representative Results
Les images obtenues par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) offrent de l'information spectaculaire l'absorption de conjugués GnRH-FITC sur la culture cellulaire donnée dans un temps et d'une manière dépendante de la concentration. Parallèlement à ces conjugués au FITC GnRH, la présence de la GnRH-IR sur la surface cellulaire est également vérifiée par l'expérience CLSM. En outre, en utilisant une coloration de l'ADN sonde fluorescente rouge lointain, il est possible de contre-colorer les noyaux des cellules en dehors de la GnRH et du GnRH-IR. Cependant, alors que l'image confocale est pas quantifiable, la «méthode GnRH d'absorption" simple peut facilement estimer si les cellules testées contiennent une quantité supérieure ou inférieure de conjugués GnRH-FITC. Les conjugués appliqués GnRH-FITC, leur concentration et le temps de traitement sont variables dans ce procédé, selon les besoins. Comme cela est représenté sur la figure 1 des cellules cancéreuses différentes contiennent des niveaux différents de la GnRH-FITC , d'une manière dépendante de la concentration. La «méthode d'expression de la GnRH-IR" avancée décrit la visualisation de la surface cellulaire GnRH-IR par immunocytochimie, avant et après le traitement à la GnRH-FITC. Dans la première partie de cette méthode (avant le traitement GnRH-FITC), nous visualisons GnRH-IR par immunocytochimie, sans traitement GnRH-FITC. Dans la deuxième partie de cette méthode (après le traitement GnRH-FITC), nous traitons les cellules pendant 1 h avec 10 uM GnRH-FITC. Après le traitement, on incuber les cellules dans un milieu complet pendant encore 1 h, et de visualiser la GnRH-IR par immunocytochimie. Comme on le voit sur la figure 2A, les cellules cancéreuses différentes présentent différents niveaux de GnRH-IR sur leur surface avant le traitement de la GnRH-FITC. Comme on le voit sur la figure 2B, après le traitement GnRH-FITC, le GnRH-IR maintenir des cellules exprimant (EBC-1) ou augmenter (Detroit-562) Niveau GnRH-IR sur leurs membranes. À ce stade, notons que nous avons précédemment confirmé que BxLes cellules PC-3 expriment également la GnRH-IR, mais ne présentent sur leur membrane 18. GnRH-IR peut être visualisé à l'intérieur des cellules BxPC-3 par immunocytochimie si leurs membranes sont perméabilisées. Ce phénomène explique la GnRH absorption d'efficacité relativement plus faible de BxPC-3 cellules. Sur la base de ces affirmations, nous nous concentrons uniquement sur la surface cellulaire GnRH-IR ici. On compare la figure 1 à la figure 2 confirme que le niveau de la surface cellulaire GnRH-IR est en corrélation avec la quantité de GnRH-FITC dans les cellules correspondantes. En outre, la figure 3C précise que la GnRH-FITC est internalisé dans les cellules , car la localisation de la GnRH-FITC est séparé du signal de surface cellulaire GnRH-I-1 h Raft du traitement GnRH-FITC. Nous concluons que «méthode d'expression GnRH-IR» prend en charge les informations obtenues à partir de la «méthode d'absorption de GnRH".
Il est important d'utiliser ensemble bien ajustéTings au cours de l'imagerie. Comme cela est illustré sur la figure 3A à la longueur d' onde d'émission de FITC (514 nm) et l'anticorps secondaire marqué par un fluorophore (546 nm), les cellules non traitées de contrôle négatif ont également une faible autofluorescence. Cette fluorescence indésirée peut donner des résultats faussement positifs. De ce fait, au début de l'image , il est important d'ajuster l'intensité de fluorescence sur les cellules témoins comme le montre la figure 3B. Il est prévu que l'on observera signal clair des noyaux à la longueur d'onde d'émission du colorant nucléaire (680 nm), avec le signal fluorescent aux deux autres longueurs d'onde est tout juste visible ou proche de zéro. Tous les autres échantillons de cellules doivent être imagées avec ces paramètres bien adaptés et fixes. De cette façon, le signal observé à 514 nm est dérivé du signal de FITC-GnRH uniquement, à 546 nm à partir du signal de GnRH-IR et en particulier à 680 nm à partir du signal de noyaux comme représenté sur la figure 3C. Images pourraient être fine-écoute après l'imagerie utilisant le logiciel si nécessaire.
Cytométrie de flux expériences offrent des informations quantifiables sur la quantité de conjugués GnRH-FITC qui ont été prises par les cellules. Les conjugués de GnRH-FITC appliquées, leur concentration et le temps de traitement sont également variables dans ce procédé, selon les besoins. Les cellules non traitées sont utilisées comme contrôle négatif pour régler la cytométrie en flux et les paramètres pour déterminer leur intensité de fluorescence médiane (MFI) au début de l'analyse. Comme cela est illustré sur la figure 4A MFI a été déterminé pour chaque échantillon en utilisant les mêmes paramètres. Les valeurs relatives des IFM sont calculées à partir des valeurs de MFI en utilisant la formule de calcul de la figure 4B. En utilisant cette formule, la valeur relative MFI des cellules de contrôle est toujours zéro. Les valeurs MFI relatives calculées à quantifier l'intensité de fluorescence des conjugués FITC GnRH, qui sont proportionnels à leur unLes concentrations mo yen dans les cellules. Comme le montre la Figure 5, avec ces données, on peut démontrer et comparer la façon dont efficacement ces cellules cancéreuses absorbent les conjugués de GnRH-FITC. Ainsi, les résultats obtenus par le flux complètent cytométrie et supportent les images acquises par microscopie confocale.
Figure 1: Les images confocales de la non traitée et de la [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III traité les cellules cancéreuses. Bleuissement: noyaux; tache verte: [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III. Ces images sont obtenues en utilisant la «méthode d'absorption de GnRH". (A) Les signaux de fluorescence des cellules non traitées sont ajustées à près de zéro à 514 nm (vert) sur chaque lignée cellulaire. La DRAQ5 sonde fluorescente rouge lointain est utilisé pour colorer les noyaux des cellules. (B) Après avoir appliqué les paramètres, le cancer et EBC-1 poumon humain Detroit-562cellules de cancer du pharynx montrent détectable, mais un signal faible à 514 nm (vert) après un traitement de 5 h à 1 um [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III. (C) Après un traitement de 5 h avec 10 uM de [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III, chacune des trois lignées cellulaires signal plus élevé fluorescent présent. Les résultats de cette expérience suggèrent que les BxPC-3, des cellules de cancer du pancréas ont pris la GnRH-FITC avec une efficacité beaucoup plus faible par rapport aux deux autres lignées cellulaires qui sont facilement ciblable par les conjugués de la GnRH. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Les images confocales de surface cellulaire GnRH-IR avant et après [D-Lys 6 (FITC)] - traitement GnRH-I. Bleuissement: noyaux; tache verte: [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I; tache rouge : GnRH-IR. Ces images sont générées en utilisant la «méthode d'expression GnRH-IR". (A) Avant le traitement GnRH-FITC, BxPC-3 cellules ne possèdent pas GnRH-IR sur la membrane, mais EBC-1 cellules présentent une forte, et certaines cellules Detroit-562 présentent niveau modéré de GnRH-IR. (B) Après le traitement GnRH-FITC, BxPC-3 cellules ne présentent toujours pas GnRH-IR sur leur membrane. EBC-1 des cellules conservent leur expression GnRH-IR et GnRH-FITC apparaît à l'intérieur d'eux. Detroit-562 cellules semblent se présentant niveau plus élevé de la GnRH-IR après le traitement et ils prennent la GnRH-FITC, ainsi. Cette expérience révèle que différents types de cellules tumorales malignes présentent des niveaux de GnRH-IR différent sur leur surface, et l'absorption de la GnRH-FITC semble être étroitement liée à l'expression de la GnRH-IR surface cellulaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: images confocale de cellules EBC-1 cancer du poumon. Bleuissement: noyaux; tache verte: [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III; tache rouge: GnRH-IR. Ces images sont prises par la «méthode d'expression GnRH-IR". (A) cellules témoins négatifs non traités (sans GnRH-FITC et Alexa 546) ont une fluorescence détectable et indésirable à 514 nm et 546 nm en utilisant les paramètres de l' appareil au-dessus-amplifiés. (B) Réglage des paramètres de l' instrument sur les cellules négatives non traitées de contrôle, le vert (514 nm) et rouge signal (546 nm) est proche de zéro. (C) des paramètres ajustés conduisent à des signaux clairs et fiables pour le GnRH-FITC traité et GnRH-IR cellules colorées. Après le traitement à la GnRH-FITC, la localisation de la GnRH-FITC (vert) est séparé de la surface de la cellule GnRH-IR (rouge).529fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Evaluation des données de cytométrie en flux. (A) Histogramme du non traité et les traités Detroit-562 cellules. Les valeurs MFI des échantillons de cellules sont déterminées à partir de l'histogramme. L'axe des x représente l'intensité de fluorescence des cellules, et l'axe des ordonnées représente les chiffres. Ligne noire: MFI avant le traitement GnRH-FITC; ligne pointillée verte: MFI après le traitement de 5 h avec 1 uM [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III; ligne pointillée rouge: MFI après le traitement de 5 h avec 10 uM [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III. (B) La formule de calcul des valeurs relatives des IFM. Les valeurs relatives des IFM sont calculées à partir des valeurs de MFI. En utilisant ce calcul, la valeur relative des IMF de l'échantillon témoin non traité est toujours zéro. Le relat valeurs ive MFI des échantillons traités représentent la quantité de conjugués GnRH-FITC qui sont à l'intérieur des cellules. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Les valeurs MFI relatif de cellules cancéreuses après un traitement de 5 h avec 1 uM de conjugués de GnRH-FITC. MFI relatives sont comparables et définissent comment efficacement les types cellulaires donnés pourraient prendre jusqu'à analogues de la GnRH. Les cellules de la GnRH-IR non-exposantes BxPC-3 ne contiennent que des traces de ces analogues de la GnRH. La GnRH-IR exprimant EBC-1 des cellules de cancer du poumon contiennent modérée et les cellules Detroit-562 cancer du pharynx contient grande quantité d'analogues de la GnRH. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart-type, n = 3."_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les expériences décrites ici utiliser analogues de la GnRH marqués sélectivement pour le dépistage adhérent des cultures de cellules in vitro. La microscopie confocale et cytométrie de flux méthodes sont appropriées pour le suivi et la quantification de l'absorption cellulaire de ces conjugués de GnRH-FITC en un temps et d'une manière dépendante de la concentration. Ces expériences ont les étapes essentielles suivantes: 1) maintenir une culture cellulaire stérile, en bonne santé; 2) des peptides GnRH doivent être de haute qualité; 3) des concentrations raisonnables et des temps d'incubation doivent être suivies; 4) traitement et des étapes de lavage; 5) bien ajusté les réglages de l'appareil.
Les cellules sont maintenues dans le milieu recommandé par le fabricant complété de 10% (V / V) de sérum de veau foetal et des antibiotiques (milieu complet). Les cellules doivent être conservées et traitées dans un environnement stérile jusqu'à ce que les étapes de traitement (avec des conjugués de GnRH-FITC). Avant les expériences, vérifier les cellules en utilisant un microscope inversé. Ils doivent être en bonne santé, Ci-joint et doit atteindre les quantités requises.
Il est important d'utiliser des peptides de la GnRH avec une haute qualité et de pureté. Nous avons synthétisé ces peptides et les purifiés à plus de 98% 18. Le peptide peut être stocké à -25 ° C dans un réfrigérateur sous forme de poudre lyophilisée. Les mM GnRH-FITC solutions mères 10 dans le DMSO doivent être conservés dans un endroit sombre à la température ambiante et utilisés au sein de quelques semaines. Nous avons étudié la stabilité de ces conjugués et avons constaté qu'ils sont stabile dans du DMSO et leur intensité de fluorescence sont maintenues après 1 mois de stockage approprié. La concentration des conjugués de GnRH-FITC et le temps de traitement sont variables dans ces expériences, ce qui offre de grands avantages, mais avec certaines limites (voir ci-dessous). Les concentrations appliquées et des temps d'incubation de ce protocole ne sont que des recommandations, mais ils constituent une bonne base pour les expériences initiales.
expériences CLSM exigent several étapes de lavage. Ces étapes doivent être effectuées avec soin. Ne pas transférer le liquide directement sur les cellules. Au contraire, utiliser le côté ou le coin des puits à cette fin. Cela peut réduire au minimum le lavage au large et de perdre les cellules adhérentes. Il est également recommandé d'éviter la lumière directe pendant toute l'expérience, car il peut désensibiliser les échantillons fluorescents (effet photoblanchiment). Garder les échantillons traités dans un endroit sombre ou recouvert d'un morceau de papier d'aluminium pendant l'expérience. D'après les résultats précédents, nous avons remarqué que la concentration finale de DMSO dans les médias traitement appliqué est négligeable (0,1% (V / V) DMSO dans les 10 uM médias traitant) et n'a aucun effet sur les résultats, milieu complet ainsi DMSO-libre est conviennent également comme témoin négatif.
Il est important d'utiliser des paramètres de l'instrument bien ajusté au cours des expériences CLSM et FACS. Ces paramètres doivent être re-calibré sur chaque type de cellule, avant les deux analyses. Dans l'expérience CLSM, le siintensité gnal d'images confocale dépend des paramètres suivants: l'intensité du laser, le gain de détecteur et offset, et la taille sténopé. Lors du réglage de ces paramètres, utiliser la puissance du laser le plus bas pour produire une image acceptable et éviter photoblanchiment. Définissez les paramètres d'imagerie pour ajuster la fluorescence des cellules de contrôle négatif non colorées à près de zéro (figure 3B) de fond. Image cellules traitées avec ces paramètres ajustés pour éviter des résultats faussement positifs. Des signaux additionnels émis par les cellules traitées à 514 nm et 546 nm contiennent les informations nécessaires sur GnRH ou GnRH-IR. Ces étapes exigent une expérience dans les expériences de CLSM. Dans l'expérience FACS, créer un terrain standard avant de disperser la dispersion du côté (échelle linéaire) et les tensions établies pour ajuster la principale population de cellules vivantes au milieu de la parcelle. Tracez une région autour de cellules vivantes. Créer un histogramme, réglez abscisse pour canaliser un (FL1-530 nm, échelle logarithmique) et définir la région précédemment définie comme une porteà cet histogramme. Régler la tension FL1 pour amener le signal de cellules négatives non colorées de commande sous 10 1 (figure 4A). Analyser les cellules traitées avec ces paramètres ajustés.
En outre, il est important de vérifier l'état des mycoplasmes des cultures de cellules de temps à autre. Différents dosages sont disponibles à cette fin. En cas de positivité mycoplasmes, jeter les cellules et commencer à travailler avec une nouvelle culture. Il est recommandé d'utiliser un mélange d'antibiotiques dans le milieu de culture qui est optimisé pour éviter mycoplasmes. La concentration des conjugués appliqués GnRH-FITC, et le temps de traitement sont variables dans ces expériences, mais l'application de faibles concentrations et des temps d'incubation courts peut entraîner des signaux trop faibles pour une détection par fluorescence.
Lorsque l'imagerie de la GnRH-IR en parallèle avec analogues de la GnRH, une concentration plus élevée de GnRH-FITC est recommandé (10 uM est optimal). La raison de la concentration plus élevéeest le temps d'incubation court (1 heure) et le signal de fluorescence relativement élevée de l'anticorps marqué par comparaison avec les conjugués FITC-GnRH. D'autre part, un chevauchement limité entre les deux émissions de colorant fluorescent (514 nm et 546 nm) a été trouvé, ce qui se produit uniquement à 546 nm et est dérivé du signal de conjugués de GnRH-FITC. Cependant, le signal fluorescent relativement plus élevé de Alexa 546 et les paramètres bien ajustés pourrait minimiser cet effet, comme le montre la figure 3. Une autre solution possible pour éviter le chevauchement est d'appliquer un anticorps secondaire marqué qui a différentes longueurs d'onde d'excitation et / ou le spectre d'émission mieux séparés par rapport à la FITC (si les paramètres techniques le permettent CLSM). Cette possibilité offre un grand avantage pour le procédé CLSM, ce qui permet d'utiliser des sondes fluorescentes en option en parallèle avec les conjugués FITC-GnRH. Par exemple, ces sondes fluorescentes alternatives peuvent être utilisées pour d'autres organites contre-coloration au besoin.
La concentration des conjugués appliqués GnRH-FITC présente les limitations suivantes. Limite maximale de concentration de conjugués GnRH-FITC est basée sur leur solubilité 18. Ces valeurs sont les suivantes dans du PBS à température ambiante: GnRH-I: 90 uM; GnRH-II: 40 uM; GnRH III: 200 um. D'autre part, dans des expériences précédentes, nous avons supposé que l'absorption de ces peptides GnRH pourrait avoir lieu par des récepteurs autres que les récepteurs humains GnRH-I; cette absorption semble être plus importante à des concentrations plus élevées (supérieures à 10 uM) 18. La limite inférieure de détection des conjugués de GnRH-FITC est basée sur un certain nombre de paramètres, mais dans un cadre idéal, il est d'environ 1 pM pour CLMS expériences. Nous avons constaté que l'écoulement offre cytométrie meilleure sensibilité que la microscopie confocale. Dans un cadre idéal, la limite de quantification de conjugués GnRH-FITC pourrait être inférieure à 1 uM. La limite de détection ou de quantification pourraitêtre différent dans chaque expérience, car elles dépendent du type de cellule et du temps d'incubation. A noter que les données obtenues par FACS est plus fiable que CLSM, car il détecte des milliers de cellules par échantillon et le signal moyen des cellules est calculé. Toutefois, dans le protocole, FACS ne fournit pas d'informations sur la localisation cellulaire des conjugués de GnRH-FITC, et l'expression de surface cellulaire de la GnRH-IR. Sur la base de ces considérations nous concluons que, CLSM et expériences FACS ont des avantages distincts, et ils se complètent mutuellement. D'autre part, le contenu haute analyse d'image pourrait être un intéressant et une bonne alternative pour FACS et l'analyse des CLSM.
En résumé, les données obtenues à partir de ces expériences confirment que chacun des trois conjugués de GnRH-FITC peut entrer dans des cellules qui expriment la surface cellulaire GnRH-IR. Ces analogues de la GnRH ont pour cible une activité similaire aux mêmes concentrations. Cependant, le niveau de la GnRH-IR à la surface des différentes peuventcellules cer est très variable. Les résultats calculés à partir des données de cytométrie en flux permet la comparaison des lignées cellulaires ou des analogues de la GnRH. En même temps, les images obtenues par microscopie confocale peuvent révéler le niveau d'expression de la GnRH-IR surface cellulaire et confirmer que ces conjugués sont internalisés dans les cellules. Sur la base de ces résultats, on peut confirmer que les expériences introduites contiennent des méthodes pratiques et variables pour l'étude des systèmes de délivrance de médicaments à base de GnRH et offrent une bonne base pour d'autres expériences.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0.1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
References
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