Summary
現在では、複雑なサンプル準備と高価な計測器が必要し、低リソース環境では使用しにくいジカ、チクングニア ウイルスおよびデング ウイルスを検出する診断機能を多重化します。ターゲット固有の鎖移動できるプローブと等温増幅を使用して検出し、高い感度と特異性を持つこれらのウイルスを区別する診断を示します。
Abstract
ジカ、デング熱、チクングニヤ ウイルスは、同様の患者の症状を病気の原因、蚊によって送信されます。しかし、異なる下流患者 - 伝送ポテンシャルがある、非常に異なる患者さんの治療を必要とします。したがって、最近のジカの発生は急速に患者でこれらのウイルスを区別するツールの開発が急務し、閉じ込められた蚊は、正しい患者の治療を選択し理解し、リアルタイムで彼らの疫学を管理します。
残念ながら、それらの受信 2016年の緊急電話を含む現在の診断テスト承認を使用、ファーストトラックの状態、計測を必要とする逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) によるウイルス RNA 訓練、ユーザーを検出し、かなりサンプル準備。したがって、彼らは時間を必要とする「承認」参照研究所に送られなければなりません。確かに、2016 年 8 月に (CDC) 疾病対策センターを求めていた妊娠中の女性いた蚊に噛まれ、感染しているかどうか、学習する前に受け入れの 2 〜 4 週間を待たなければジカを示す発疹を開発しました。我々 は非常にテスト サイト、いくつかのリソースと訓練を受けたが、必ずしも認可されなかった者にすることができる必要があります。
このビデオは、多くのサンプルの準備もすべて分析 (環境調査) の押しつぶされた蚊の死体 (患者) のための血清または尿の使用、これらの仕様を満たしていることを示します。蚊の死骸は、第四級アンモニウム (Q 紙) アンモニア処理順を管理するグループ石綿を運ぶ紙にキャプチャされます。これら直接 RNA 分離せずに入れているアッセイ チューブ冷凍のチェーンを必要としない凍結乾燥試薬を含みます。逆のトランスクリプション ループ lamp 法ターゲット固有蛍光タグ移動できるプローブとの変更されたフォームは、3 色の蛍光信号として 30 分内の読み出しを生成します。これはオレンジ色のフィルターを持つハンドヘルド、バッテリ駆動のデバイスで可視化します。シール チューブ不耐熱ウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG) dUTP 増幅混合物の存在下での使用と前方の汚染は防がれます。
Introduction
蚊媒介性ウイルス感染症、デング熱、チクングニア、ジカ ウイルスなどは上昇と需要の即時管理戦略では。デング熱とチクングニア ウイルスがすでにジカは西半球に1で広がって熱帯地域の多くで流行。ジカ、デング熱のようなフラビ家族のメンバーである、1 つのアジアと 2 つのアフリカの遺伝的系統2アフリカ原産。ジカ ウイルスの同定は 1947 年にさかのぼる、にもかかわらず人間のジカ感染散発的な太平洋とアメリカ大陸に出現する前に、の半世紀のために残った。2007 年、ミクロネシアのヤップ島に発生した熱ジカの最初の報告された発生は続いてフランス領ポリネシア、2013、2014アメリカの最初の主要な発生は、2015 年にブラジルで発生しました。
ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング ウイルスは、主にネッタイシマカとヒトスジシマカによって送信されます。しかしジカ母-胎児の相互作用、性的接触を介して、授乳3,4,5を介して可能性が広がっている、追加下流ヒト-ヒト感染の可能性があります。ジカ熱は、最初唯一の軽度の病気を引き起こすと考えられていた。しかし、それは後で大人のギランバレー症候群、新生児、および最後の月への年を可能性があります慢性の筋骨格系疾患の小頭症に関連付けられています。ジカの感染症の症状は他のウイルスの蚊拡散6に似ているので、ジカの病気の診断に挑戦することができます。これらのウイルスの一般的な共同感染は、鑑別診断もより挑戦的な7,8を作る。したがって、コントロールと予防措置を開始し、患者のケア9を管理する、リアルタイムで疫学を理解するからジカと他のウイルス核酸の迅速かつ信頼性の高い検出が必要です。
これらのウイルスの現在の診断テストには、血清学的検査、ウイルス分離、ウイルス シーケンシング、および逆転写 PCR (RT-PCR) が含まれます。標準的な血清学的手法がしばしば不十分な感度に苦しんで、結果以前他の発現によって感染している患者での交差反応性によって複雑になることができます。
したがって、核酸テストを検出し、これらのウイルスを区別する最も信頼性の高い方法になります。ジカと他蚊媒介ウイルスの検出が通常、RT-PCR 法やリアルタイム RT-PCR 体液、血清、尿、唾液、精液、母乳、脳液10,11などの様々 なを使用して実行されます。彼らは以下の PCR 阻害、高ウイルス量、長期間とコレクションと12,13を処理の簡易化のためのウイルスの存在を示すので、尿および唾液のサンプルは、血液より一般に優先されます。RT-PCR ベースの診断テストは、ただし、広範なサンプル準備のステップと少ないポイント ・ オブ ・ ケアなどに最適、高価な熱サイクリング機器を構成します。
逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) は、その高い感度と特異性14のための強力な RT-PCR の代替として登場した、生物の阻害物質のための許容のサンプル15、大幅削減分析複雑さとコスト、低い資源の環境に適している単一の温度の操作。RT ランプ、クラシックで実装されている、6 種類のプライマー RNA ターゲット内で 8 つの異なる領域にバインドで構成されます。60 ° C 〜 70 ° C の一定温度で実行して強い鎖置換活性と逆転写酵素と DNA ポリメラーゼを使用しています。
RT ランプの初期段階では、前方と後方内部プライマー (FIP と BIP、図 1 a) 外側前方と後方のプライマー (F3 と B3) と一緒にはダンベル構造、ランプの指数関数的増幅の種子構造を形成します。増幅はループ前方と後方のプライマー (LF と LB)、ダンベルの単一の孤立した地域にバインドするように設計は、促進、複数の繰り返しのあるコンカテマーの形成の結果ループ16。クラシック ランプに基づいて濁度の試金または DNA 間の染料をインターカ レートによる読み出しは多重化のいくつかのレベルが、ジカのポイント ・ オブ ・ ケア検出希望17,18,19完全に適しています。オフのターゲット増幅による偽陽性を生成する傾向があると多重は簡単に得これらのシステムでないです。
これらの問題を管理するには、は、文学は、古典的な RT ランプ アーキテクチャ20,21,22に「鎖置換プローブ」の形で追加コンポーネントを追加します。各プローブにはシーケンス固有の二重鎖領域と一本鎖プライミング領域。一本鎖領域にプローブが付いている 5'-fluorophore と 3' 末端クェンチャーで相補的プローブを変更します。ターゲットがない場合は、近くに fluorophore とクエンチャをもたらす相補的プローブ ストランドの交配による蛍光は認められなかった。ターゲットの存在下で蛍光プローブの一本鎖部分はターゲットの補数にバインドし、変位ポリメラーゼ鎖によっては拡張されます。逆のプライマーによってさらにポリメラーゼ伸張蛍光(図 1 b)の排出量をできるように、その相補的な蛍光に分類されたストランドからクェンチャー鎖の分離を原因します。この設計では、誤検知信号の可能性を減らすこと、ダンベル形成後信号が生成されます。
鎖置換プローブの二重鎖の部分は、任意のシーケンスをすることができ、多重化が適用されると、同じシーケンスが使用異なる fluorophore クェンチャーのペア。このアーキテクチャやウイルスに汚染された尿、血清、蚊にサンプル紙に踏み付け直接試験サンプル準備なしに導入されました。30-45 分以内で生成された人間の目に目に見える三色の蛍光進み、信号が青色 LED とオレンジ色のフィルターを使用して、3 D プリントされた観測ボックスによって想像されたもの。RT ランプ試薬を凍結乾燥、冷凍を必要としないリソース設定を下げるキットの展開が有効になっています。
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Protocol
注: 蚊が直接この研究で使用される唯一の動物です。血液感染した蚊を飼料に使用している鶏を管理する手順は、フロリダ大学機関動物のケアと使用 Committee.Virus 伝搬による IACUC プロトコル #201507682 として承認され、蚊の感染症研究ベロ ビーチにフロリダ医療昆虫研究室の BSL 3 施設で実施され、フロリダ州 RT ランプ実験 FfAME とフロリダ州アラチュアの Firebird 生体分子科学 LLC によって共有 BSL 2 研究室で行った
1 プローブを移動させるプライマーとストランドのデザイン
- ブロード研究所データベース23; からデング熱 1 ウイルス シーケンスを抽出します。ジカとチクングンヤ NIAID ウイルス病原体データベースと解析リソース24からのシーケンス。
- 多重配列アライメント (MSAs) シーケンス ソフトウェア筋 v3.8.3125を使用して興味を作成します。使用には、ターゲットの保存領域内のランプのプライマー セットを検索し、関連のない、または意図しないターゲット、ターゲットのサブタイプの違いなどを避けるために MSAs が生成されます。
- 説明オンライン (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/) としてランプのプライマーの設計規則に従うし、ウイルス発散26をカバーするプライマーの混合基地の使用を許可します。プライマー セットの交差を避けるためには、NCBI RNA ウイルス データベース NCBI BLAST27を使用して生成されたランプ プライマーを比較します。同様 NCBI BLAST を使用して多重アッセイで dimerize とプライマーを除去するために各セットを比較します。
- 画面の任意のウイルスのゲノム シーケンスと蚊ゲノム配列に対して鎖置換プローブの二本鎖部分。5' - フルオレセイン amidite (FAM)、16 進数の染料と、ジカ、チクングニア、デング熱 1 5 carboxytetramethylrhodamine (耽羅) 染料標的結合プローブの端をそれぞれ変更します。
- プライマー尿の肯定的な制御にはが含まれます。人間のミトコンドリア DNA を対象とするランプ プライマーを設計します。5' 末端にテトの鎖置換プローブをラベルします。それぞれを部分的に補足蛍光ラベル クェンチャー プローブ プローブ (例えば、アイオワ州ブラック FQ) を癒す 3' 末端 (表 1) のラベルの付いた。
2. ウイルス分離および感染蚊のサンプル
- ジカ (プエルトリコ株)、チクングニア ウイルス (ラ レユニオンや英領バージン諸島ひずみ) とデング ウイルス血清型 1 (キーウェストひずみ) の使用を分離します。プラクの試金28または定量的 RT-PCR 法29を使用してウイルスの抗体価を決定します。市販の RNA 抽出キットを使用してウイルスの Rna を抽出します。
注:表 2本研究で使用される各ウイルス分離株のウイルス抗体価を表します。 - ジカとチクングンヤ ウイルス20ネッタイシマカ Ae。女性の感染について詳細なプロトコルのヤレンらによって出版される記事に従ってください。ジカ ウイルスに感染した蚊サンプルのウイルス価は表 2を参照してください。
3. RT ランプ不耐熱ウラシル DNA グリコシラーゼと相まって
-
10 × プライマー ミックスの準備。
- 各プライマーの 100 μ M 原液を準備し、(手順 1 を参照) をプローブ ヌクレアーゼ フリー水を追加することによって。よく渦と使用するまで-20 ° C でストア。
- 10 X プライマー ミックス各ジカ、デング熱 1、またはミトコンドリア DNA ターゲット ミックス 16 μ 16 μ L BIP、FIP の F3、B3、LF、LB、LB 蛍光の 3 μ L の 2 μ L の 5 μ L の 2 μ L の 2 μ L 標識プローブ、プローブ クェンチャーの 4 μ L、と 100 μ L のボリュームの合計を与えるためにヌクレアーゼ フリー水を 50 μ l 添加します。
- チクングニア、10 X プライマー ミックス ミックス FIP、16 μ L BIP、F3、B3、lb 膜、LF の 2 μ L の 5 μ L の 2 μ L の 2 μ L の 16 μ L の LF 蛍光の 3 μ L ラベル プローブ、クェンチャー プローブの 4 μ L、100 μ L のボリュームの合計を与えるためにヌクレアーゼ フリー水を 50 μ l 添加します。
メモ: 最終的な蛍光プローブと 400 の使用 300 nM 上記プローブ濃度クェンチャー プローブの nM。また、使用 80 nM の蛍光に分類されたプローブと 200 nM のリアルタイム解析、クェンチャー プローブの。
- プライマー ミックス X 10 の 5 μ L を追加 (3-プレックス、プライマー ミックス X ごとの 10 の 5 μ L を追加)、等温増幅バッファー X 10 の 5 μ L (1 X バッファー組成: 20 mM トリス塩酸バッファー pH 8.8, 50 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4、8 mM MgSO4、0.1 %1 mM DTT、トゥイーン 20)、dNTP の混合物 (dATP、dCTP dGTP ・ 10 mM; dTTP の dUTP 5 mM) の 7 μ L、DNA ポリメラーゼ、逆転写酵素、遺伝子組換えリボヌクレアーゼ阻害剤の 80 台、不耐熱 UDG、vi の様々 な量の 1-2 μ L の 2 台の 15 単位 16 単位Rna、ral と 0.25 mL PCR に 50 μ L まで容量をもたらす水チューブ (材料の表を参照してください)。
- ウイルス RNA 量を水に置き換えることによりこの段階で陰性対照試金が含まれます。65-68 ° C、1 時間に 45 分間のサンプルをインキュベートし、臭化エチジウム (0.4 μ G/ml) を含む 1 X TBE バッファーに 2.5% の agarose のゲルの各サンプルの 5 μ L を実行して、分析します。25 を使用して bp またはゲル上のマーカーとして 50 bp DNA の梯子。
注: 非ターゲットの特定のテンプレートの追加はオプションです。 - 病原性 RNA の存在を検出するために変化する温度 (68 ° C への 65 ° C) またはマグネシウムで動作する各 RT ランプ プライマー セットを設計して以来、温度やマグネシウム濃度を変化させることにより各プライマー セットと、いいえテンプレート コントロールをテストします。濃度 (6 から 10 ミリメートル最後)。室温で実験を準備します。
4. RT ランプ ウイルス RNA スパイク尿を使用して
- 全反応量 50 μ L の尿 (0%、10%、20%、50%) の最終濃度を変動で RT ランプ プライマーをテストします。10% の最終的な尿濃度 5 μ L の尿にウイルス RNA の 1 μ L を追加します。最終的な尿濃度が 20%、尿の 10 μ L にウイルス RNA の 1 μ L を追加します。最終的な尿中濃度が 50%、尿を 25 μ l 添加するウイルス RNA の 1 μ L を追加します。
- リアルタイム尿の 10% で RT ランプの監視、リアルタイム PCR 装置を使用 (材料の表を参照してください) 異なる蛍光フィルターを使用します。
- FAM ラベル amplicons からジカの蛍光信号を読み取る、483 から 533 に至るまでフィルターを使用して nm;チクングニアの HEX 標識 amplicons、568 523 に至るフィルターを使用 nm;デング熱 1 の耽羅ラベル amplicons、558 から 610 に至るまでフィルターを使用 nm;ミトコンドリア DNA のテト ラベル amplicons、568 523 に至るフィルターを使用し、nm。
注: FAM は、495 の励起と放射のマキシマ nm、520 nm、それぞれ。16 進数は 538 の励起と放射のマキシマ nm と 555 nm、それぞれ。耽羅は 559 の励起と放射のマキシマ nm と 583 nm、それぞれ。テトは 522 の励起と放射のマキシマ nm と 539 nm、それぞれ。
- FAM ラベル amplicons からジカの蛍光信号を読み取る、483 から 533 に至るまでフィルターを使用して nm;チクングニアの HEX 標識 amplicons、568 523 に至るフィルターを使用 nm;デング熱 1 の耽羅ラベル amplicons、558 から 610 に至るまでフィルターを使用 nm;ミトコンドリア DNA のテト ラベル amplicons、568 523 に至るフィルターを使用し、nm。
- 使用 96年ウェルのプレート シール透明なプラスチック シートでプレート 60-90 分の 65-68 ° C でサンプルをインキュベートし、すべての 30 の蛍光を記録 s 光のサーマルサイクラーを使用しています。当初 80 nM の蛍光に分類されたプローブとテスト、300 nM の蛍光に分類されたプローブを使用します。
- 直列に追加することによって各ターゲットの検出限界希釈 10% の最終的な尿濃度におけるウイルス Rna を決定します。
注: は、最適な温度、マグネシウムの集中、蛍光に分類されたプローブの濃度、反応時間を決定するのにリアルタイム RT ランプを使用します。
- 直列に追加することによって各ターゲットの検出限界希釈 10% の最終的な尿濃度におけるウイルス Rna を決定します。
- 目でストランド移動プローブによって生成された蛍光を視覚化する 470 で励起光サーマルサイクラーから青色 LED 光源を使用して、nm (青色光源内蔵のゲルの電気泳動ボックスが動作、材料の表を参照)、画像を記録し、暗闇の中で常温携帯電話カメラ。
注: 使用 300 nM の蛍光に分類されたプローブ、青色 LED を使って目ですべての 3 つの色の可視化が必要な場合。
5. Q 紙技術を使用してジカ感染蚊の検出の RT ランプ
- わずかな変更30以前に発行されたメソッドによると第四アンモニウム変更フィルター紙 (Q 紙) を準備します。
- 50 ml の NaOH 水溶液で、活性化のため 15 分の 1.8% の 3.5 cm の直径を持つセルロースろ紙円 (材料の表を参照) の 1 g を浸します。
- 真空濾過により活性紙サークルを収集し、沈ま 40 mL (2, 3-エポキシプロピル) トリメチル アンモニウム塩化物 (0.28 g) の水溶液に一晩室温で。
注: は、ろ紙は 0.28 1 (2, 3-エポキシプロピル) トリメチル アンモニウム塩化物の質量の比を保持します。 - 真空濾過により結果として得られるカチオン性の紙を収集し、50 ml の 1% 酢酸の中和します。
- エタノールで 3 回紙を洗うし、一定の気流のあるフードの下で風乾します。
- 紙パンチやはさみを使用して小さな長方形 (3 mm × 4 mm) に Q 紙シートをカットします。マイクロ乳棒で各用紙にジカ潜在的感染Ae。 ネッタイシマカのメスの蚊をつぶします。
- 1 M アンモニア溶液 (pH ≒ 12) の各用紙の 20 μ L を追加し、5 分待ちます。50% エタノールの 20 μ L で一度各紙、ヌクレアーゼ フリー水の 20 μ L で一度洗います。BSL 2 バイオ セーフティ キャビネット約 1 時間用の用紙を風乾します。
注: この時点で、サンプル保存できます-20 ° C で使用するまで一晩。 - ピンセットを使用して、RT ランプ反応混合物の 100 μ L の各用紙を配置し、45 分のソリューションで紙が完全に水没してください 65-68 ° C でインキュベートそれを浮動しない必要があります。読み、青色 LED 光源を用いたジカ ・ オレンジ色または黄色のフィルターから生じる蛍光を記録します。
6. 反応体積の 100 μ L 用 RT ランプ試薬の凍結乾燥
- セクション 3.1 によると 10 X ランプ プライマーの混合物を準備し、dNTP 混合セクション 3.2 によると dUTP を準備します。使用するまでプライマーの混合物および-20 ° C で dNTPs を格納します。
- 10 ml、グリセリンを 1 M トリス-HCl pH 7.5、1 M KCl、0.5 M の EDTA、10% の 100 μ L の 2 μ L の 500 μ L の 100 μ L を混合することによって削除する酵素透析バッファーのトリトン X-100 の 0.1 M の DTT の μ L、ヌクレアーゼ フリー水 9.198 mL の 100。4 ° C で透析バッファーを格納します。
注: を使用し、4 ° C で保存する前にすべての緩衝試薬溶液 (0.2 ミクロン フィルター) をフィルター処理することを確認します。- 10 kDa カットオフ制限で限外ろ過膜を使用 (材料の表を参照してください)。透析バッファーの場所 350 μ L、4 μ L の DNA ポリメラーゼの 32 単位、逆転写酵素の 30 台の 2 μ L、限外ろ過膜および 14,000 x g で 4 ° C で 5 分間遠心に RNase 阻害剤の 80 単位の 2 μ L
- 限外ろ過膜および別 5 分空コレクション チューブ (14,000 x g) 遠心分離機に透析バッファーの別の 350 μ L を追加し、この手順を繰り返します (14,000 x g) を 3 分間遠心します。
- 溶出、膜を反転し、新しいコレクション チューブに配置します。1,000 x g で 2 分間測定溶出ボリュームでスピンします。場合 8 μ L、透析バッファーを追加して 8 μ L にボリュームをもたらすより少ない。4 ° C で溶出を格納し、すぐに次のステップに進みます。
メモ: このプロトコルは、単管の凍結乾燥が同じの限外ろ過膜を使用して、一度に少なくとも 10 の反応管を準備し、透析バッファーの同じ量を使用します。
- 場合 10 X ランプ プライマーの 10 μ L を混合 singleplex (3-プレックス、プライマー ミックス × 各 10 の 10 μ L を追加)、自由水 (3 プレックスのヌクレアーゼの 66 μ L 不耐熱 UDG の 2 単位の 2 μ L、8 μ L 透析酵素ミックスの dNTP の混合物の 14 μ L、46 μ L を使用して) 0.5 mL 遠心チューブの蓋を開いたまま。代わりに、蒸気をエスケープするを許可するように針で穴を開けて別の蓋を追加します。
- すぐに-80 ° C 2 時間で管を凍結し、凍結チャンバー内に光からの保護用アルミ箔 4 h カバー用チューブを凍乾します。試薬を乾燥すると、パンクチャド蓋を削除、元のふたを閉じるし、暗闇の中で 4 ° C で凍結乾燥試薬とチューブを格納します。
注: 試薬でく凍結乾燥一晩、必要に応じて。
7 RT ランプ試薬尿とジカを含む蚊サンプルを凍結乾燥テスト
- キットから次の項目を使用 (材料の表を参照してください) ジカの: 3 D プリントされた観察ボックス オレンジ フィルター (ロングパス フィルター、カット上 ~ 540 nm)、ボックスを観察するため 2 つの AAA 電池 ZV のジカ検出ラベル反応管を凍結乾燥し、1.1 X 復元バッファー 1.5 mL スクリュー トップ チューブします。
- DNA ポリメラーゼと一緒に来る等温増幅バッファー X 10 の 5.5 mL を混合することによって水分補給バッファー X 1.1 の 50 mL を準備 (材料の表を参照)、100 mm MgSO43.3 mL、110 の 0.5 M の DTT、μ とヌクレアーゼ フリー水 41.09 mL。よく、1.5 mL スクリュー トップ チューブにこのソリューションの因数の 1 mL を混合し、使用するまで 4 ° C で保存します。
- 1.1 X 復元バッファーの 90 μ L を各反作用の管を (0.5 mL) に追加します。液体が管内凍結乾燥試薬 (ディゾルブ (1,000 x g) は振動によって、簡単に混合にスピンダウン) の下部を塗りつぶしますを確認します。(詳細についてはセクション 4.1 参照) 反応管にウイルス RNA とスパイクの尿サンプルの 10 μ L を追加します。
- 蚊をテストした場合は、四角形を追加 Q 紙の蚊の死骸 (5.2 と 5.3 で説明したセクションの手順で準備) として、一緒に 10 μ L を保持している尿の代わりに水を浄化します。
注: また、尿ではなく唾液や血清サンプルの 10 μ L を追加します。場合は、サンプル抽出した DNA や RNA、水分を補給された混合物に 2-5 μ L のサンプルを追加とヌクレアーゼ フリー水最終サンプル ボリュームの 10 μ L を。
- 蚊をテストした場合は、四角形を追加 Q 紙の蚊の死骸 (5.2 と 5.3 で説明したセクションの手順で準備) として、一緒に 10 μ L を保持している尿の代わりに水を浄化します。
- 反応チューブの蓋を閉じる。熱ブロック/バス (またはインキュベーター) それらは 65-68 ° C で事前設定場所30-45 分、1 時間以上インキュベートします。インキュベーション後、チューブを熱から削除します。将来の試金の汚染を防ぐためには、これらの管は閉じたままことを確認します。
- 観察ボックスに反応管を配置します。温度は、周囲温度 (できれば 25 ° C) に分類されます。観察のボックスの背面にスイッチを入れます。オレンジ色のフィルターを通してサンプルを観察し、距離のイメージいっぱいの視野の 80% にどこで開催されている携帯電話のカメラで画像をキャプチャします。
注: より良い可視化は、低照度環境で実現されます。 - 可視化が完了した後は、スイッチを切ります。後の可視化が必要な場合、冷蔵が好ましいと、暗闇の中で密封された管を格納します。
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Representative Results
当初、各 RT ランプ プライマー (表 1)に対応するウイルス RNA 基板ネガティブ コントロールの性能はゲル電気泳動によって評価しました。RT ランプのプライマーは、チクングニア ジカとデング熱 1 ターゲット NS5 領域 (RNA 依存性 RNA ポリメラーゼ) と nsP2 領域 (非構造タンパク質 P2) に設計されました。テンプレートはアフリカミドリザル腎臓 (ベロ) の細胞で培養ウイルス株から抽出した総 RNA でした。チクングニア感染女性から抽出された総核酸 (DNA ・ RNA) 1 つのケースでAe。 ネッタイシマカ (表 2)。
図 2 aは、RT ランプいくつかの代表的な結果はこれらのサンプルを実行を示します。両方の singleplex と多重化 (3-plexed) の場合、RT ランプ製品は agarose のゲルで実行されたときコンカテマーの梯子として表示されます。否定的な制御サンプル サンプル プライマー総核酸が、非感染Ae。 ネッタイシマカ女性から抽出された非特定対象のコントロールを含む、自身のバンドだけを与えた水を含む蚊は、テンプレートとして使用されました。
RT ランプの最適の条件を見つける異なるマグネシウム濃度と培養温度を調べた。マグネシウム濃度が高いと低温が偽陽性に上昇を与える非特異的産物を生成することがわかった。したがって、マグネシウムの 65 ° C で培養 8 mM は、すべて実験から (図 2 b) で使用されました。
ゲル電気泳動では、以前に生成された amplicons、誤診につながるによって実験の次のセットの汚染を生む可能性があります反応管の開口部が必要です。前方の汚染を防ぐためには、dTTP の RT ランプ amplicons に組み込まれる dUTP、dTTP の dUTP、率と等しいと取替えられました。ウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG) のための基板にあらゆるそれに続く RT ランプ反応31,32の準備中に私アンプリコンを汚染可能になります。UDG の不耐熱バージョンを使用すると、RT ランプ サンプルのセットアップは、UDG が lamp 法の中に不活性化するとデュ含む amplicons が室温で消化することができます。また、必要なときは、反応管下流解析のため開くことができます。UDG 消化の使用、に加えて移動できるプローブを用いたアーキテクチャは、反応管を開くことがなく読み取ることができる蛍光を生成します。
図 3 aは、ジカ RNA をターゲット蛍光プローブを用いたジカの検出 (LOD) の制限の結果を提供します。シリアル希釈研究する低 singleplex のアッセイまたは 3 plexed で 30 分以内 1.42 pfu を検出できる試金を示した。0.71 pfu に希釈したさらに、蛍光信号は、singleplex の試金のための 40 分後と 3-plexed の混合物のための 50 分後に観察されました。サンプルはブルーにさらされた後、オレンジ色のフィルターを通して 35 分 LED ライト励起波長 470 の後に加えてリアルタイム RT-ランプ、蛍光は可視化した nm (図 3 b)。同様に、検出限界で測定した 37.8 コピーと 1.22 pfu チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 のそれぞれ (図 3-D)。
最適な尿中濃度、ジカ ウイルス RNA (0%、10%、20%、50%) 本格的な尿サンプルの様々 な濃度 (2.85 pfu) が追加されました。おそらくその電解質のため RT ランプ信号が遅れた 15 から 35 分 50% 尿は試金で使用されたとき。10% の尿より低い背景を提示により最適に決定されました。ジカ ターゲットがない場合は、任意の濃度で増幅が認められず、尿中濃度が高い (図 3 e) 試料中高いバック グラウンド蛍光が観察されました。
NM 繊維移動できるプローブの異なる蛍光色、80 の読み出しの多重化を許可するには、(ジカ、チクングニア、HEX およびデング熱 1 の耽羅の FAM)、異なった fluorophores が付いているラベルしますが、同じクェンチャー (アイオワ州ブラック FQ) を伴う濃度 200 nM。細胞培養抽出ウイルス Rna (ジカの 2.85 pfu、チクングニア、242 のウイルス RNA のコピーおよびデング熱 1 1.22 pfu) が 10% 尿中希釈目標として使用されました。蛍光データのリアルタイム解析は、すべてのターゲットのためのプライマーのあった 3 plexed 試金のため信号生成 (約 10 分) の遅延を示した。Singleplex の場合、その一方で、反応が 10-15 分 (図 4 aC) 以内完成。蛍光は、青色 LED とオレンジ色のフィルターを使用して視覚化され、信号強度の違いが、FAM ラベル amplicons が最も目に見える異なった fluorophores の観察されました。470 で励起以来、これは予想が nm は FAM 励起スペクトル (図 4) の最大値に近いです。
単一 LED 励起波長とすべての 3 つの色の可視化を有効にする (470 nm)、移動できるプローブの濃度が 300 に増加した nM と相補的なクエンチャ プローブ 400 nM。Singleplex の場合、ジカの 10 分、チクングニア、20 分、40 分デング熱 1 内信号生成を竣工されました。3 plexed の試金、しかし、さらに遅れたすべて試金(図 5 aで 20 分で- C)。それにもかかわらず、信号生成に時間の犠牲には、オレンジ色のフィルターにブルー LED ライトを使用してすべての 3 つの色の可視化が有効になります。エンドを使用してプローブ 5' - FAM、チクングニア、プローブは 5' 末端の 16 進数、ラベルし、デング熱 1, そのプローブが 5' 末端ラベルの赤オレンジ色の蛍光を使用に割り当てられた緑黄色蛍光ライトの付いたジカの緑色蛍光が観察されます。耽羅 (図 5)。
ジカ感染が考えられた蚊のサンプルをテストするには、研究室に感染したAe ネッタイシマカQ 紙のアンモニア処理ウイルスを殺菌すると、露出をバインドする続いて四角形に押しつぶされた女性蚊(表 2)ウイルス。正荷電 Q 紙の上に RNA。紙は、プテリン化合物の蛍光読み出し33,34を妨げる蚊枝肉の存在を削除するエタノールで簡単に洗浄しました。Q ・ ペーパー含んでいる蚊、直接水に浸かった RT ランプの混合物で、30 分の 65 ° C で培養後、ジカ (図 6) の存在下で明るい緑色の蛍光が観察されました。
冷凍、およびアッセイを 470 nm の発光を使用する 3 D プリントされた観測ボックス LED を使用して、RT ランプ試薬が凍結乾燥し水分補給のバッファーを伴うと簡単にチェーンとオレンジ色のフィルター (図なし検出キットを提供するには7 a). 水分補給バッファーの使用 9 ボリュームおよび尿サンプルの 1 ボリューム、30 分以内表示緑色蛍光を生成でき、(図 7 b) 任意の携帯電話のカメラで画像を取り込むことができます。また、尿の代わりに水の 1 ボリュームを追加することによって同じアッセイによって Q 紙に蚊のサンプルを使用できます。
図 1: ランプ アッセイ デザイン(A) RT ランプ プライマーと DNA ポリメラーゼを変位ストランドによるダンベル構造の形成。(B) 導入鎖置換プローブの多重化と蛍光の読み出しを許可し、RT ランプ進行状況をリアルタイムで監視します。ヤレンら201720から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ゲルの電気泳動分析 amplicons 。(A) singleplex の多重化 (3-プレックス) テスト ランプ プライマーの適切な正と負のコントロールと書式を設定します。陽性コントロールには次抗体の精製ウイルス RNA が含まれます: ジカ (ZV)、242 ゲノム コピー チクングニア (CH)、デング熱 1 (D1) 1.22 pfu に 2.85 pfu。NTC z、NTC c および NTC d singleplex 形式でジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 プライマーのないテンプレート コントロールのそれぞれ立っています。NSC は、感染無料Ae。 ネッタイシマカから合計 xNA (DNA および RNA) を抽出する、非固有のターゲット コントロールの略です。M マーカー (50 塩基対の DNA の梯子) の略します。(B) 測定法の最適化条件 (55 ° C 〜 70 ° C) から RT ランプ範囲の培養温度をテストすることによってと MgSO4濃度 (4 mM ~ 10 mM) から多重の不在でフォーマット ターゲット RNA。ヤレンら201720から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: リアルタイムで RT ランプ。(A) Singleplex、多重数検出 (LOD) のジカ (ZV) リアルタイムを使用して 80 nM FAM というラベルの付いた鎖置換プローブを用いたリアルタイム PCR 装置 (チャネル 483 533 nm)。約 50 分(B)蛍光が観察されたも 470 でサンプルの励起に続いてオレンジ フィルターの 65 ° C で培養サンプル青い光の nm。A からのサンプルは、可視化のため使用されました。(C)チクングニア (CH) ターゲット 80 を使用して LOD のリアルタイム分析 nM 六角ベアリング ランプのプローブ 523 568 nm の蛍光チャネルを使用してリアルタイム PCR 機器に singleplex 形式で。(D)デング熱 1 (D1) の目標は 80 を使用して LOD のリアルタイム分析 558-610 nm の蛍光チャネルを使用してリアルタイム PCR 機器に singleplex 形式でプローブの耽羅軸受ランプの nM。RT ランプ反応の最大尿定量(E) 。最終的な尿濃度 (0% 50%) の範囲は 2.85 pfu ジカ vRNA.NTC の存在下で 80 nM FAM 標識プローブを使用してテストされました = すべてのパネルでテンプレート コントロールはありません。ヤレンら201720から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: Singleplex、80 nM プローブを用いた尿のウイルス検出を多重化します。(A) FAM 標識プローブをジカ (ZV) ウイルス RNA の 2.85 pfu を使用して singleplex と多重化の形式で 10% 尿中ジカ検出 (80 nM)。(B) HEX 標識プローブ (CH) チクングニア ウイルス RNA の 242 のコピーを使用して singleplex と多重の形式で 10% 尿中チクングニア検出 (80 nM)。(C) 耽羅標識プローブを用いたデング熱 1 (D1) ウイルス RNA の 1.22 pfu を使用して singleplex と多重化の形式で 10% 尿中にデング熱 1 検出 (80 nM)。(D) 470 で励起後オレンジ色のフィルターを通して RT ランプ可視化の反応 nm の青色 LED 光。ヤレンら201720から許可を得て転載。NTC = すべてのパネルでテンプレート コントロールはありません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: Singleplex、300 nM のプローブを用いた尿のウイルス検出を多重化します。(A) FAM 標識プローブをジカ (ZV) ウイルス RNA の 2.85 pfu を使用して singleplex と多重化の形式で 10% 尿中ジカ検出 (300 nM)。(B) HEX 標識プローブ (CH) チクングニア ウイルス RNA の 242 のコピーを使用して singleplex と多重の形式で 10% 尿中チクングニア検出 (300 nM)。(C) 1.22 pfu を Dengue1 を使用して singleplex と多重化の形式で 10% 尿中にデング熱 1 検出 (D1) 耽羅標識プローブを用いたウイルス RNA (300 nM)。(D) 470 で励起後オレンジ色のフィルターを通して RT ランプ可視化の反応 nm の青色 LED 光。尿の実験でポジティブ コントロールとしてヒトのミトコンドリア DNA (mtDNA) をターゲット設定ランプ プライマーを併用したテト プローブ (300 nM)。NTC = すべてのパネルでテンプレート コントロールはありません。ヤレンら201720から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Q ペーパー技術を用いた健康とジカに感染したAe ネッタイシマカ(ZV 9、表 2) 感染した蚊サンプルのジカ検出のため図 6: ワークフロー。 。ヤレンら201720から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 観察ボックス。(A) の遵守、ボックス 2 つ AAA 電池を使用してベースに。これらの電池は、4 つの穴は、0.5 mL チューブで開催された試料を照らす 4 つの青色 LED ライトを電源します。LED ライトがスイッチ オンします。サンプルは、オレンジ色のフィルターを通して視覚化されます。(B) 蛍光観察ボックス。左から右へ: 負、ジカ、ジカの正および負、陽性。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ターゲットにするウイルス | 名 | シーケンス (5' 3') | 長さ | 開始位置 | 終了位置 | |||
| ジカ | ZV F3 | GAGACTGCTTGCCTAG | 16 | 9905 | 9920 | |||
| ZV B3 | CTGGGGTCTTGTCTTC | 16 | 10145 | 10130 | ||||
| ZV LF | CAGTTGGAACCCAGTCAAC | 19 | 10028 | 10010 | ||||
| ZV LB | GTGGAACAGAGTGTGGATTG | 20 | 10093 | 10112 | ||||
| ZV FIP | CCATGGATTGACCAGGTAGTTTTTTCGACTGATGGCCAATG | 41 | 9974 | 10053 | ||||
| ZV BIP | ACCACTGARGACATGCTTGTTTTTCATGTGGTCGTTYTCC | 40 | 10070 | 10129 | ||||
| ZV LB_NatTail |
ファム CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG GTGGAACAGAGTGTGGATTG |
60 | 10093 | 10112 | ||||
| チクングニア | CH F3 | CGTCAACGTACTCCTAAC | 18 | 2891 | 2908 | |||
| CH B3 | ACGTTGGCTTTRTTTTGG | 18 | 3094 | 3077 | ||||
| CH LF | AGCGTCTTTATCCACGGG | 18 | 2968 | 2951 | ||||
| CH LB | AYGCATCRATAATGGCGGG | 19 | 3025 | 3043 | ||||
| CH FIP | GAAGTTTCCTTTCGGTGGGTTTTTGGAAGACACTYTCYGG | 40 | 2932 | 2993 | ||||
| CH BIP | AAGGAGTGGGAGGTGGATTTTTTCAYTTGGTGACTGCAG | 39 | 3006 | 3063 | ||||
| CH LF_NatTail |
六角 CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG AGCGTCTTTATCCACGGG |
58 | 2968 | 2951 | ||||
| デング熱 1 | D1 F3 | ACAGCYCTGAATGAYATGG | 19 | 9583 | 9601 | |||
| D1 B3 | GCAGTTTCTCTCAGGC | 16 | 9803 | 9788 | ||||
| D1 LF | CACTTGYTGCCARTCATTCC | 20 | 9666 | 9647 | ||||
| D1 LB | CCATGCCGYAACCAAG | 16 | 9727 | 9742 | ||||
| D1 FIP | CTGGTGGAARTGGTGTGATTTTTTGGGAACCTTCAAAAGG | 40 | 9628 | 9693 | ||||
| D1 BIP | GAAGGAYGGGAGGGAAATAGTTTTTTTAGCCCTRCCCA CAAG |
42 | 9702 | 9763 | ||||
| D1 LB_NatTail |
タムラ CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG CCATGCCGYAACCAAG |
56 | 9727 | 9742 | ||||
| ミトコンドリア DNA | MtDNA F3 | AGCCTACGTTTTCACAC | 17 | 9183 | 9199 | |||
| MtDNA B3 | GCGCCATCATTGGTAT | 16 | 9410 | 9395 | ||||
| MtDNA LB | GCCTAGCCATGTGATTTCAC | 20 | 9322 | 9341 | ||||
| MtDNA LF | GGCATGTGATTGGTGGGT | 18 | 9254 | 9237 | ||||
| MtDNA FIP | GTCATGGGCTGGGTTTTACTTTTTCTACCTGCACGACAAC | 40 | 9213 | 9228 | ||||
| MtDNA BIP | CTCAGCCCTCCTAATGACCTTTTTGAGCGTTATGGAGTGG | 40 | 9359 | 9344 | ||||
| MtDNA LB_NatTail |
テト CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG GCCTAGCCATGTGATTTCAC |
60 | 9322 | 9341 | ||||
| 一般的なクェンチャー | CTGACCTGACGGACTGAACGGATGGCTGAGCGCA AACCCG アイオワ州黒 FQ |
40 | ||||||
表 1: プライマーとストランド移動プローブします。ヤレンら201720から許可を得て転載。太字のシーケンスは、プローブを変位鎖の二本鎖領域を表します。FAM ラベル (蛍光グリーンと見られる)、HEX 標識 (緑黄色蛍光として見られる)、耽羅ラベル (橙赤色蛍光と見られる)、テト ラベル (黄色蛍光として見られる) ジカ、チクングニア デング熱 1 を検出するプローブが割り当てられたとミトコンドリア DNA 尿、それぞれ。FAM は、495 の励起と放射のマキシマ nm、520 nm、それぞれ。16 進数は、538 の励起と放射のマキシマ nm と 555 nm、それぞれ。耽羅は、559 励起と放射のマキシマ nm と 583 nm、それぞれ。テトは、522 の励起と放射マキシマ nm と 539 nm、それぞれ。すべて fluorophores の単一クェンチャーの使用を有効にするには、アイオワ州ブラック FQ はその広い吸収範囲 (420 620 nm) のため使用されました。
| ウイルス株 (GenBank 加盟番号) | 家族/属 | ウイルス抗体価 |
| ジカ (ZV)、プエルトリコ (PRVABC59、KU501215.1) | フラビ/フラビ ウイルス グループ IV、肯定的な宿主 | 108 pfu/mL x 2.85 |
| チクングニア ウイルス (CH)、イギリス領ヴァージン諸島 (アジア系統、KJ451624) | トガウイルス科アルファウイルス/グループ IV、肯定的な宿主 | 108ゲノム/mL x 2.42 |
| チクングニア ウイルス (CH)、ラ レユニオン (インド洋系統、LR2006-OPY1、KT449801) | トガウイルス科アルファウイルス/グループ IV、肯定的な宿主 | 8ゲノム/mL の 10 倍 1.89 |
| チクングニア ウイルス (CH)、ラ レユニオン抽出ネッタイシマカ女性から合計 NA (インド洋系統、LR2006 OPY1、KT449801) | トガウイルス科アルファウイルス/グループ IV、肯定的な宿主 | 105ゲノム/mL × 3.85 |
| デング熱血清型 1 (D-1)、キーウェスト (FL) (JQ675358) | フラビ/フラビ ウイルス グループ IV、肯定的な宿主 | 106 pfu/mL x 1.22 |
| ジカ (ZV) 蚊アイデンティティ、ひずみ | 脚価 pfu/mL | |
| ZV 9、プエルトリコ | 4.76 x 103 |
表 2: 培養細胞および感染した蚊のウイルス価。pfu: プラーク形成単位。ヤレンら201720から許可を得て転載。
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Discussion
ジカ、チクングニア、デング熱などの蚊媒介ウイルスは、低コストのポイント ・ オブ ・ ケア検出選択肢蚊サーベイランスのためだけでなく、患者の診断のための必要性公衆衛生と最近ジカ発生ハイライトを脅かします。等温増幅法は、PCR ベースのシステムを手頃な価格の代替として開発されました。特に、RT ランプ ベースのプラットフォームは、幅広い病原体の検出に適用されています。ただし、等温プラットフォームの使用は、単一のターゲット検出に主に制限されています。報告方法はここで特に便利であることが証明されて適度な温度 (65-68 ° C) の範囲で実行される単一の反作用の混合物の 3 つの異なるターゲットの同時検出を許可する変更された RT-ランプを使用してのでより高い温度ジカと他のウイルス非感染性30,3560 ° C をレンダリングします。
さらに、ここで表示されるデータは、RT ランプは様々 な体液15に存在する物質を抑制できることを示しています。これにより、ウイルス Rna の RNA の浄化の余分な手順なし直接反応混合物にサンプルを追加することによって増幅されます。サンプルの種類によっては、サンプルの最大音量は反応を阻害しないと背景の蛍光性 (偽陽性) が発生する決定する必要がありますを許可しました。研究は、尿の 10% 最終巻の使用に焦点を当ててを紹介しました。しかし、唾液や血清サンプルは同じ方法20のアッセイにも適用できます。検出限界は患者尿中13日だけでなく、ウイルスに感染した蚊20,36,37報告されたウイルスの量を上回ることがわかった。
安価な多重世帯を調査するキットや公共エリアに特別な価値があるので、蚊のサーベイランスは通常公衆衛生のリソース、優先度の低いを持っています。したがって、このキットは、死体の蚊でウイルスの検出を許可する Q 紙の追加によって変更されました。Q 紙にはクーロン相互作用によって表面にウイルスの核酸のキャプチャを可能にする共有添付アンモニウム グループの高レベルが含まれています。Q 紙が RT ランプを阻害する可能性があります懸念であったそれにもかかわらず RT ランプの混合物に直接追加する Q 紙運ぶ蚊の死体と、成功したウイルス検出を 30 分以内達成する可能性がありますが分かった。小さくする必要があります成功した信号を生成、Q 紙十分な (例えば、100 μ L 反応ボリュームの 3 × 4 mm サイズ) RT ランプ反応混合物で浸水すること。反応管の大きすぎるまたは残りの液体に浸漬ではなく浮動小数点を開始した場合、反応が起こらないし、結果が偽陰性として表示されます可能性があります。
成功した検出およびウイルスごとの分化、各プライマーは RT ランプ プライマー設計、プローブを移動させる設計ルールのガイドラインに従って、多重蛍光物質の選択肢が含まれてする必要がありますを設定します。各プライマーは、交差反応を避けるために異なるターゲットに対してスクリーニングする必要がありますを設定します。さらに、マグネシウム濃度と培養温度は各セット用に最適化する必要があります。紹介した方法は、RT LAMP アーキテクチャへの鎖移動できるプローブの導入によって達成された目で蛍光リードアウト表示を使用します。3 つの異なる色は、異なった fluorophores が付いていたそれぞれのターゲットのウイルスに割り当てられている場合、多重アッセイで視覚化できます。公開メソッドのほとんどは単一のターゲット検出と間をインターカ レートまたは蛍光染料、シーケンス固有ではなくを生成する傾向があるの使用に依存している、これは既存等温ジカ検出方法上の利点を提供します非特異的産物。
考慮する重要なステップは、変位の蛍光に分類されたプローブの最終濃度の測定です。分かった 80 に 100 プローブを変位の nM は 15-20 分以内蛍光信号を生成することが、信号に時間が遅れたときに 300 に対しプローブ濃度の nM が使われました。反応時間は、法が多重化された方法で実行されたときにさらに遅れた。80 からの切り替えの理由 nM 〜 300 nM 単一 LED 光源を使用してすべての 3 つ fluorophores の可視化を有効にするのには。470 で励起による青色 LED nm FAM ラベル プローブに適していますが、16 進数または耽羅標識プローブはあまり適してです。したがって、犠牲しましたインキュベーション時間をすべての 3 つの目標を可視化することができます。
RT ランプの問題の 1 つは、前方の汚染です。RT ランプが短い培養時間で私アンプリコンの大量を生成し、amplicons をエアロゾルとして簡単に解放できます。この問題を軽減するために dUTP は他の dNTPs のアッセイ作成する際に UDG 消化が続くと共に含まれていた。新しく生成された RT ランプ amplicons の消化力を防ぐために UDG を非アクティブ化する必要があるので、UDG の熱不安定なバージョンを使用することが重要です。
冷凍せずキットの配布、凍結乾燥するために必要な測定と水分補給のバッファーを添加したキットのすべてのコンポーネントをできるようにします。したがって、任意のグリセロールの市販酵素の存在は、凍結乾燥によってグリセリンを削除できないために、限外濾過法による削除されました。混合物に高濃度でグリセロールは酵素活性を妨げる可能性があります。グリセリン除去プロセスに含まれていない唯一の酵素は、不耐熱 UDG をだった。UDG は 24.6 kDa の分子量の小さな酵素限外濾過実験には不向きです。したがって、購入した凍結乾燥混合物に追加されました。残留グリセロール試験の結果が否定的に影響しませんでした。
この蛍光ランプ RT 法の制限の 1 つは、単一の LED 光源の使用です。アッセイは、singleplex または多重形式で実行された、displacing プローブの高濃度がすべてのターゲットの信号の可視化の必要でした。ただし、この変更は信号の時間の遅れを引き起こします。これを克服する 1 つの方法より良いその他のフルオロ (16 進数と耽羅) に対応する 2 つの LED 光源の使用可能性があります。このように、プローブの低濃度は短い培養時間信号を生成される可能性があります。
考慮するもう一つの制限は、薄暗い環境で目から蛍光色を判断します。プライマーは、互いに相互作用が設計されていたので、単一のターゲットが singleplex または多重形式で存在する場合、それは簡単です。アッセイは、蚊、または 1 つ以上のウイルス感染患者のプールなどの単一のアッセイ チューブに存在していた複数のターゲットの場合に解釈しにくくなります。目で判断するのではなく、デジタル表示などの読み出しアーキテクチャの変更が必要になります。
可能な今後の取り組みは、媒介蚊のアルボ ウイルスの大きなパネルを作成することによって多重化のレベルを上げることでしょう。これはプライマー プライマー プライマーの相互作用を避けるために設計分子認識システム (SAMRS) を自己回避など変更された核酸類縁体を使用する必要がありする遺伝情報システム (イージス) を人工的に拡大に注意が必要です。良い38を多重化の高レベルに対応します。したがってより高い多重システムの信号読み出しのためのソリューションの各変位プローブの一分子蛍光を使用して、ターゲットごとにユニークな避難の順序を割り当てるおよび DNA による固体表面上避難プローブをキャプチャだろう交配。一分子蛍光と興奮させる LED 配列フォーマットのプラットフォームを作成これが39配列内での位置に基づいている各ターゲットの存在を判断するでしょう。
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Disclosures
著者とその機関のいくつかはこの試金に関連する知的財産を所有します。
Acknowledgments
仕事は、FDOH 7ZK15、NIAID 1R21AI128188-01 によって部分的に支えられました。この出版物で報告された研究は、国立研究所のアレルギーと感染症、一部生物医学研究プログラムのフロリダ保健省によって部分で支えられました。内容は著者の責任と NIH やフロリダ保健省の公式見解を必ずしも表さない。動的コンビナトリアル化学 LLC は彼らのサポートおよびこのプロジェクトへの貢献を認めています。
1 デング熱ウイルス (ひずみボル KW010) は親切でフロリダ部の健康局の研究所を提供します。ジカとチクングニア ウイルスのアジア家系は、疾病管理・予防センターに提供された優雅。チクングニア ウイルスのインド洋系統親切ロバート ・ テッシュ (新興ウイルスやテキサス大学医学部ガルベストン、テキサス州からのアルボ ウイルス世界参照センター) から UF FMEL に提供されました。感染症研究の支援、s. ベラミー、B. ・ イーストモンド、s. オルティス、+ ベレス、k. ウィギンス、r. ZimLer と克ザーベルに感謝します。我々 はまた、Q 紙を提供するため m. s. キムを感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
References
- Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
- Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636 (2014).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
- Musso, D., Gubler, D. J.
- Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
- Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
- Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
- Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
- Shukla, S., Hong, S. -Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685 (2016).
- Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295 (2016).
- Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
- Musso, D., et al.
- Gourinat, A. C., O'Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M.
- Notomi, T.
- Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
- Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
- Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
- Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
- Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
- Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
- Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
- Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
- Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605 (2016).
- Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
- Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
- Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
- Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22 (2010).
- Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226 (2015).
- Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
- Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , 62,381,759 (2016).
