Summary
현재 다중화 Zika, chikungunya, 뎅 그 열 바이러스 복잡 한 샘플 준비 및 비싼 장비를 요구 하 고 저 리소스 환경에서 사용 하기 어려운 검출 하는 진단. 우리는 감지 하 여 높은 감도와 특이성이이 바이러스를 차별화 대상 특정 가닥 displaceable 프로브 등온 증폭을 사용 하는 진단을 보여줍니다.
Abstract
Zika, 뎅기열, chikungunya 바이러스는 전송 모기에 의해 유사한 환자 증상을 가진 질병을 일으키는. 그러나, 다른 다운스트림 환자 환자 전송 잠재력와 매우 다른 환자 치료를 필요로 합니다. 따라서, 최근 Zika 발생 긴급 환자에서 이러한 바이러스를 신속 하 게 차별 하는 도구를 개발 하 게 하 고 모기, 올바른 환자 치료를 선택 하 고 이해 하 고 실시간으로 자신의 역학 관리 갇혀.
불행 하 게도, 그 수신 2016 비상을 포함 하는 현재 진단 테스트 사용 권한 및 긴급 상태, 바이러스 성 RNA 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-PCR) 계측을 요구 하 여 훈련, 사용자 감지 및 상당한 샘플 준비입니다. 따라서, 그들은 "승인 된" 기준 실험실, 요구 시간에 전송 되어야 합니다. 실제로, 2016 년 8 월, 센터 질병 통제 (CDC)에 대 한 요청 했다 임산부 누가 왔다 모기에 의해 물리 고 그들이 감염 했다 허용 되지 않는 2 ~ 4 주 학습 전에 기다려야 Zika 나타내는 발진을 개발. 우리는 아주 많이 테스트 사이트, 몇 가지 리소스와 훈련 하지만 반드시 허가 된 직원에 의해 할 수 있는 필요 합니다.
이 비디오는 많은 샘플 준비 없이 소변 또는 (환자)에 대 한 혈 청 또는 짓 눌린된 모기 시체 (대 한 환경 감시), 이러한 규격을 만족 하는 분석 결과 보여 줍니다. 모기 시체 4 급 암모늄 그룹 (Q-종이) 암모니아 처리 뒤에 생물 학적 관리를 들고 종이에 캡처됩니다. 이 다음 직접, RNA 격리 없이 넣고 냉동의 아무 사슬 필요 동결된 시 약을 포함 하는 분석 결과 튜브. 수정 된 형태의 특정 대상 붙일 태그가 displaceable 프로브 루프 중재 등온 증폭 반전 녹음 방송 3 색 형광 신호 판독, 30 분에 생성합니다. 이 오렌지 필터 휴대용, 배터리 구동 장치 시각 이다. 밀봉 된 튜브와 dUTP 증폭 혼합물에 존재 thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG)를 사용 하 여 앞으로 오염 방지 된다.
Introduction
모기 품 어진 바이러스 감염, 뎅기열, Zika 바이러스, chikungunya, 등 상승 및 수요 즉시 관리 전략에 있다. 뎅 그 열과 chikungunya 바이러스는 이미 많은 Zika 서반구1확산 지금 열 대 지역에서 발병. Zika 바이러스, 뎅기열, 같은 Flaviviridae 가족의 멤버 이며 한 아시아와 아프리카 유전 계보2개의 아프리카 출신 이다. Zika 바이러스의 식별 거슬러 1947, 비록 인간에서 Zika 감염 태평양 및 아메리카에서 신흥 전에 반세기에 대 한 산발적 남아. 2007 년에 미크로네시아 야프 섬에 발생 하는 발열 Zika의 첫 번째 보고 발발 뒤 2013과 2014 년에 프랑스령 폴리네시아. 아메리카에 있는 첫 번째 주요 발발 2015 년에서 브라질에서 발생 했습니다.
Zika, chikungunya, 뎅 기 바이러스는 주로 Aedes aegypti Aedes albopictus에의해 전송 됩니다. 그러나, Zika 추가 다운스트림 인간에 인간 전송 가능성, 아마 성적 접촉, 어머니 태아 상호 작용, 및3,,45모유를 통해 확산 되 고 있다. Zika 발열만 가벼운 질병을 처음으로 알려졌다. 그러나, 그것은 나중 어른에 Guillain-바레 증후군, 신생아, 그리고 지난 달에 년 수 있습니다 만성 musculoskeletal 질환 microcephaly 연관. Zika 질병의 진단 Zika 감염의 증상은 다른 모기 확산 바이러스6의 것과 유사 하기 때문에, 도전적 일 수 있습니다. 이러한 바이러스의 일반적인 공동 감염 확인 차별 진단 더욱 도전7,8. 따라서, Zika와 다른 바이러스 핵 산의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 검색 실시간으로, 제어 및 예방 측정을 시작 하 고 환자 치료9를 관리 하는 역학을 이해 하는 것 필요 합니다.
이 바이러스에 대 한 현재 진단 테스트는 혈 청 학적인 검사, 바이러스, 바이러스 시퀀싱, 고립과 반전 전사 PCR (RT-PCR) 포함 됩니다. 표준 혈 청 학적인 접근은 종종 부적 절 한 감도에서 고통 그리고 결과 다른 flaviviruses에 의해 이전에 감염 환자에서 분에 의해 복잡 하 게 될 수 있습니다.
따라서, 핵 산 테스트 감지 하 고이 바이러스를 차별화 하는 가장 신뢰할 수 있는 방법에 남아 있다. Zika 다른 모기 품 어진 바이러스의 검출은 일반적으로 RT-PCR 또는 생물 학적 체액, 혈 청, 소변, 타 액, 정액, 모유, 그리고 대뇌 유체10,11등의 다양 한 실시간 RT-PCR를 사용 하 여 수행 됩니다. 소변과 타 액 샘플은 그들은 전시 적은 PCR 저해, 높은 바이러스 부하, 오랜 시간, 그리고 수집 및 처리12,13의 증가 용이성에 대 한 바이러스 존재 하기 때문에 혈액, 동안 일반적으로 선호. 그러나, RT-PCR 기반 진단 테스트를 구성 하는 광범위 한 샘플 준비 단계와 덜 포인트의 케어에 대 한 최적의 만드는 비싼 열 사이클링 장비.
반전 녹음 방송 루프 중재 등온 증폭 (RT-램프) 높은 감도 및 특이성14강력한 RT-PCR 대 안으로 떠오르고 있다, 생물에 금지 물질에 대 한 관용 샘플링15, 그리고 단일 온도 크게 낮춘 다 시험의 복잡성 및 관련 된 비용, 낮은 자원 환경에 적합 하에 작업. RT-램프, 고전적인 구현 6 뇌관 대상 RNA 내에서 8 가지 영역에 바인딩되는 구성 되어 있습니다. 60 ° C 및 70 ° C, 사이 일정 한 온도에서 실행 하 고 활동을 전치 하는 강한 가닥으로는 역전사 효소 및 DNA 중 합 효소를 사용 하 여.
RT-램프의 초기 단계 동안 앞뒤로 내부 뇌관 (FIP, BIP, 그림 1A) 외부 앞뒤로 뇌관 (f 3와 B3) 함께 아령 구조 지 수 램프 증폭의 씨앗 구조를 형성합니다. 증폭 루프 앞뒤로 뇌관 (LF와 파운드), 아령의 단일 좌초 지역 바인딩할 설계에 의해 더욱 가속 그리고 여러 반복 concatemers의 형성에서 결과16루프. 클래식 램프에 따라 탁도 분석 실험 또는 Zika, 다중화의 어느 정도 포인트의 케어 탐지 원하는17,18,19대 한 DNA intercalating 염료에 의해 판독은 완전히 적합 하지 않습니다. 멀티플렉싱은 하지 쉽게 얻을 이러한 시스템은 오프 대상 확대로 인해 가양성을 생성 하는 경향이.
이러한 문제를 관리 하기 위해 문학 클래식 RT 램프 아키텍처20,,2122"물가 전치 프로브"의 형태로 추가 구성 요소를 추가 합니다. 각 프로브는 시퀀스 관련 이중 가닥 지역 및 단일 가닥 못쓰게 지역. 단일 가닥 지역 조사는 5'-fluorophore, 태그입니다 그리고 보완 조사 3'-끝 끄는 수정 됩니다. 대상의 부재에서 아무 형광 근접에 fluorophore 및 끄는 보완 조사 가닥의 교 잡 때문에 관찰 된다. 대상 존재 형광 프로브의 단일 가닥 부분 대상에서의 보완을 하 고 중 합 효소를 전치 하는 물가 의해 확장 됩니다. 반전 뇌관에 의해 더 중 합 효소 확장 하면 형광 (그림 1B)의 방출을 허용의 보완 붙일 레이블된 스트랜드에서 끄는 가닥의 분리. 이 디자인으로, 신호는 긍정 신호의 가능성을 감소 아령 형성 후 생성 됩니다.
더블-좌초 부분의 물가 전치 프로브 어떤 시퀀스 수 있으며 멀티플렉싱 적용 될 때 동일한 시퀀스가 다른 fluorophore-끄는 쌍 함께 사용할 수 있습니다. 이 아키텍처, 바이러스에 오염 된 소변, 혈 청, 또는 모기 샘플 종이에 지기까지 직접 샘플 준비 없이 분석 결과를 소개 했다. 3 색 형광 지요 인간의 눈에 보이지는 30-45 분 내에서 생성 된 고 신호 3D 인쇄 관찰 상자 블루 LED와 오렌지 필터를 사용 하 여 시각화 했다. RT-램프 시 약 freeze-drying 냉장에 대 한 필요 없이 리소스 설정을 낮은이 키트의 배포를 사용할 수 있습니다.
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Protocol
참고: 모기는이 연구에 직접 사용 하는 유일한 동물 이었다. 누구의 혈액 감염 된 모기를 피드 하는 데 사용 되었다, 닭을 관리 하는 절차 플로리다 대학 기관 동물 관리 및 사용 Committee.Virus 전파 IACUC 프로토콜 # 201507682로 승인 했다 및 모기 감염 연구 했다 층 RT-램프 실험 FfAME와 건배, 플로리다에서 파이어 버드 바이오 과학 LLC BSL-2 실험실에서 수행한 Vero 비치에서 플로리다 의학 곤충학 실험실의 BSL-3 시설에서 수행
1. 디자인의 뇌관과 가닥 프로브를 전치
- 광범위 한 연구소 데이터베이스23;에서 뎅기열 1 바이러스 시퀀스를 추출 Zika 및 NIAID 바이러스 병원 체 데이터베이스와 분석 리소스24chikungunya 시퀀스.
- 여러 시퀀스 정렬 (MSAs) 시퀀스에 대 한 관심 소프트웨어 근육 v3.8.3125를 사용 하 여 만듭니다. 생성 된 MSAs를 사용 하 여 대상의 보존된 영역 내 램프 뇌관 세트에 대 한 검색 하 고 관련 없는 또는 의도 하지 않은 대상, 대상의 하위 사이의 구분 등을 피하십시오.
- 설명된 온라인 (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/)로 램프 뇌관에 대 한 설계 규칙을 따라 하 고 바이러스 발산26커버에 뇌관에서 혼합된 기지의 사용을 허용. 뇌관 세트의 분을 피하기 위해, NCBI 폭발27을 사용 하 여 NCBI RNA 바이러스 데이터베이스에 생성 된 램프 뇌관을 비교 합니다. 뿐만 NCBI 폭발을 사용 하 여 분석 결과 다중화에 dimerize 것 뇌관을 제거 하기 위해 각 집합을 비교 합니다.
- 어떤 바이러스 성 게놈 시퀀스 및 모기 게놈 시퀀스에 대 한 가닥을 전치 프로브의 더블-좌초 부분 화면. 각각 5'-끝 fluorescein amidite (FAM), 16 진수 염료, Zika, chikungunya, 뎅 그 열의 1, 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) 염료와 대상 바인딩 프로브를 수정 합니다.
- 긍정적인 통제 뇌관을 소변 샘플에 대 한 설정 포함 됩니다. 인간의 미토 콘 드리 아 DNA를 대상으로 램프 뇌관 디자인. 레이블 가닥 displacing 프로브 TET 5'-끝에. 각각 부분적으로 보완 붙일 레이블 끄는 프로브 3'-끝 (표 1)에 (예를 들어, 아이오와 블랙 FQ)을 끄는 프로브 표시.
2. 바이러스 격리 및 감염 모기 샘플
- 사용은 Zika 바이러스 (푸에르토리코 스트레인), Chikungunya 바이러스 (라 레위니옹 또는 영국령 버진 아일랜드 스트레인)와 뎅기열 serotype-1 (키 웨스트 스트레인)의 분리합니다. 상 패 분석 결과28 또는 정량 RT-PCR29를 사용 하 여 바이러스 titers를 확인 합니다. 바이러스 성 RNAs를 상용 RNA 추출 키트를 사용 하 여 압축을 풉니다.
참고: 표 2 이 연구에 사용 된 각 바이러스 분리의 바이러스 titers을 나타냅니다. - 의해 Yaren 외. Ae aegypti 여성 Zika과 chikungunya 바이러스20의 감염에 대 한 자세한 프로토콜에 대 한 문서를 따르십시오. Zika 바이러스에 감염 된 모기 샘플의 바이러스 titer 표 2 를 참조 하십시오.
3. RT-램프 Thermolabile Uracil DNA Glycosylase와 결합
-
뇌관 믹스 준비 X 10입니다.
- 각 뇌관의 100 µ M 재고 솔루션을 준비 하 고 (단계 1 참조) 프로브 nuclease 무료 수를 추가 하 여. 잘 소용돌이 그리고 저장소 사용까지-20 ° C에서.
- 각 Zika, 뎅기열 1 또는 미토 콘 드리 아 DNA 대상 혼합 16 µ L FIP, 16 µ BIP, L의 10 X 뇌관 믹스에 대 한 f 3, b 3, LF, 파운드, 파운드-형광의 3 µ L의 2 µ L의 5 µ L의 2 µ L의 2 µ L 분류 조사, 끄는 프로브 4 µ L 그리고 50 µ L 100 µ L 볼륨의 총을 주고 nuclease 무료 물.
- 10 X 뇌관 믹스 Chikungunya, FIP, 16 µ L BIP, F3, B3, 파운드, LF의 2 µ L의 5 µ L의 2 µ L의 2 µ L의 16 µ L을 혼합에 대 한 조사, 끄는 조사의 4 µ L 및 100 µ L 볼륨의 총을 주고 nuclease 무료 물 50 µ L LF-형광의 3 µ L 표시.
참고: 최종 형광 프로브 및 400의 사용 300 nM 위에서 설명한 프로브 농도 끄는 프로브의 nM. 붙일 레이블된 프로브 및 200의 사용 80 nM 또는 실시간 분석을 위한 그것의 끄는 프로브의 nM.
- 뇌관 믹스 X 10의 5 µ L을 추가 (3-플렉스, 뇌관 믹스 배 각 10의 5 µ L 추가) 등온 증폭 버퍼 X 10의 5 µ L (1 X 버퍼 구성: 20 mM Tris HCl 버퍼 pH 8.8, 50 m m KCl, 10mm (NH4)2등4, 8 mM MgSO4 0.1% 트윈-20, 1 mM DTT), dNTP 혼합물 (dATP, dCTP, dGTP의 10 m m, 5mm dTTP 및 dUTP)의 7 µ L, 16 대의 DNA 중 합 효소, 역전사, 재조합 ribonuclease 억제제의 80 단위, 2 단위 thermolabile UDG, vi의 다양 한 금액의 1-2 µ L의 15 단위 ral RNAs, 및 0.25 mL PCR에서에서 50 µ L까지 총 볼륨을가지고 물 튜브 ( 재료의 표참조).
- 물으로 바이러스 성 RNA 볼륨을 대체 하 여이 단계에서 부정적인 제어 분석을 포함 합니다. 1 시간 45 분 65-68 ° C 사이 샘플을 품 어 다음 ethidium 평범한 사람 (0.4 µ g/mL)를 포함 하는 1 X TBE 버퍼에 2.5 %agarose 젤에 각 샘플의 5 µ L을 실행 하 여 분석 합니다. 25 사용 하 여 혈압 또는 젤에 마커로 50 bp DNA 사다리.
참고: 한 비 대상 서식 파일의 추가 선택 사항입니다. - 병원 성 RNA를 검출, 테스트 각 뇌관 세트 및 그것의 아니오 템플릿 제어 각 RT 램프 뇌관 세트는 다양 한 온도 (65 ° C 68 ° c) 또는 마그네슘에서 작동 하도록 설계 되었습니다 때문에, 온도 및 마그네슘 농도 변화 하 여 농도 (최종 6 ~ 10 mM)입니다. 실 온에서 실험을 준비 합니다.
4. RT-램프 바이러스 성 RNA 아군 소변을 사용 하 여
- 총 반응 볼륨의 50 µ L에서 소변 (0%, 10%, 20%, 그리고 50%)의 최종 농도 변화에 실시간 램프 뇌관을 테스트 합니다. 10% 마지막 소변 농도, 소변의 5 µ L를 바이러스 성 RNA의 1 µ L를 추가 합니다. 20% 최종 소변 농도, 바이러스 성 RNA의 1 µ L 소변 10 µ L를 추가 합니다. 50% 마지막 소변 농도, 소변의 25 µ L를 바이러스 성 RNA의 1 µ L를 추가 합니다.
- 실시간 모니터링 RT 램프의 소변의 10%에 대 한 실시간 PCR 악기를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 다른 fluorophore 필터.
- Zika 위해 팸 표시 amplicons에서 형광 신호를 읽고, 483에서 533까지 필터 사용 하 여 nm; 523에서 568에 이르기까지 필터를 사용 하는 16 진수 표시 amplicons chikungunya에 대 한, 대 한 nm; TAMRA 표시 된 뎅기열 1 amplicons, 558에서 610에 이르기까지 필터 사용 nm; TET 표시 된 미토 콘 드리 아 dna amplicons, 568 523에서까지 필터 사용 nm.
참고: 팸은 495의 여기 및 방출 최대 및 520 nm, 각각. 16 진수는 538의 여기 및 방출 최대 및 555 nm, 각각. TAMRA는 559의 여기 및 방출 최대 및 583 nm, 각각. TET는 522의 여기 및 방출 최대 및 539 nm, 각각.
- Zika 위해 팸 표시 amplicons에서 형광 신호를 읽고, 483에서 533까지 필터 사용 하 여 nm; 523에서 568에 이르기까지 필터를 사용 하는 16 진수 표시 amplicons chikungunya에 대 한, 대 한 nm; TAMRA 표시 된 뎅기열 1 amplicons, 558에서 610에 이르기까지 필터 사용 nm; TET 표시 된 미토 콘 드리 아 dna amplicons, 568 523에서까지 필터 사용 nm.
- 사용 96 잘 접시와 인감 투명 한 플라스틱 시트와 플레이트 65-68 ° C에서 60-90 분에 대 한 샘플을 품 어 그리고 기록 형광 각 30 s 빛 자전거 타는 사람을 사용 하 여. 처음 80 nM 붙일 레이블 프로브, 그리고 붙일 레이블 프로브 테스트 300 nM를 사용 합니다.
- 직렬로 추가 하 여 각 대상에 대 한 검출 한도 10%의 마지막 소변 농도에 바이러스 성 RNAs 희석 결정 합니다.
참고: 실시간 RT-램프를 사용 하 여 최적의 온도, 마그네슘 농도, 붙일 레이블된 프로브 농도, 반응 시간 결정.
- 직렬로 추가 하 여 각 대상에 대 한 검출 한도 10%의 마지막 소변 농도에 바이러스 성 RNAs 희석 결정 합니다.
- 눈으로 가닥 displaceable 프로브에 의해 생성 된 형광 시각화, 470에 여기 빛 cycler에서 파란색 LED 광원을 사용 nm (내장 블루 광원으로 어떤 젤 전기 이동 법 상자 것입니다 작업 참조 하십시오 자료의 테이블), 이미지를 기록 하 고 함께 어둠 속에서 실 온에서 휴대 전화 카메라.
참고: 사용 300 nM 붙일 레이블된 프로브 때 모든 3의 시각화 푸른 LED를 사용 하 여 눈으로 색의 필요 합니다.
5. Q-종이 기술을 사용 하 여 Zika 감염 모기의 탐지 RT-램프
- 약간의 수정을30이전 게시 된 방법에 따라 4 급 암모늄 수정 필터 종이 (Q-종이)를 준비 합니다.
- 정품 인증에 대 일 분 NaOH 용액의 1.8%의 50 mL에 3.5 c m의 직경을 가진 섬유 필터 종이 원 ( 재료의 표참조)의 1 g을 담가.
- 진공 여과 의해 활성화 된 종이 동그라미를 수집 하 고 그들에 담가 (2, 3-epoxypropyl) trimethylammonium 염화 (0.28 g)의 수 용액 40 mL 하룻밤 실 온에서.
참고: 필터 종이 0.28 1 (2, 3-epoxypropyl) trimethylammonium 염화의 대량 비율을 유지. - 진공 여과 의해 결과 양이온 종이 수집 하 고 1%의 아세트산 50 mL와 중화.
- 종이 세 번 에탄올으로 세척 하 고 지속적인 공기 흐름이 후드 건조.
- 종이 펀치 또는 위를 사용 하 여 작은 사각형 (3 x 4 mm)으로 Q 종이 시트를 잘라. Ae aegypti 여성 모기 잠재적으로 감염 된 Zika 각 종이에 마이크로 유 봉과 호감.
- 1 M 수성 암모니아 용액 (pH ≈ 12)의 각 종이 20 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 기다립니다. 다음에 각 종이 한 번 50% EtOH 20 µ L 20 µ L nuclease 무료 물 한 번 씻으십시오. BSL-2 biosafety 1 시간 약에 대 한 캐비닛에 종이 건조
참고:이 시점에서 샘플을 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 사용까지 하룻밤. - 핀셋을 사용 하 여, 각 종이에 RT 램프 반응 혼합물의 100 µ L 하 고 45 분 완전히 솔루션;에 종이 잠수함을 확실히 확인에 대 한 65-68 ° C에서 품 어 그것은 부동 하지 해야 합니다. 읽기와 블루 LED 광원을 사용 하 여 Zika 바이러스와 오렌지색 이나 노란색 필터에서 발생 하는 형광을 기록.
6. 동결은 반응 볼륨의 100 µ L에 대 한 실시간-램프 시 약의
- 섹션 3.1에 따라 10 X 램프 뇌관 혼합물을 준비 하 고 포함 하는 섹션 3.2에 따라 dUTP dNTP 혼합물을 준비. 뇌관의 혼합물 및 dNTPs-20 ° C에서 사용까지 저장 합니다.
- 1 M Tris HCl pH 7.5, 1 M KCl, 0.5 M EDTA, 10%의 100 µ L의 2 µ L의 500 µ L의 100 µ L를 혼합 하 여 글리세롤, 제거 효소 투 버퍼의 10 mL를 준비 Triton X-100, 100 µ L 0.1 M DTT의과 nuclease 무료 물 9.198 mL. 4 ° c.에 투 석 버퍼 저장
참고: 필터링 (0.2 미크론 필터) 사용 및 4 ° c.에서 그들을 저장 하기 전에 모든 버퍼 시 약 솔루션 확인- 외 막 10 kDa 차단 제한 사용 하 여 ( 재료의 표참조). 투 석 버퍼의 350 µ L, DNA 중 합 효소의 32 단위 4 µ L, 역전사, 30 단위로 2 µ L 및 RNase 억제제의 80 단위 2 µ L 장소 외 막 및 4 ° c.에서 5 분 14000 x g에서 원심 분리기
- 외 막 및 원심 분리기 (14000 x g) 또 다른 5 분 빈 컬렉션 튜브에 대 한 투 석 버퍼의 또 다른 350 µ L을 추가 하 고이 단계를 반복 다음 3 분 (14000 x g) 원심.
- 차입, 막 반전 하 고 새로운 컬렉션 튜브에. 1000 x g 2 분 측정 차입 볼륨;에 스핀 만약 투 석 버퍼를 추가 하 여 8 µ L까지 볼륨을가지고 8 µ L 보다 작은. 4 ° C에서 차입을 저장 하 고 즉시 다음 단계를 수행 하십시오.
참고:이 프로토콜은 단일 튜브 동결은, 하지만 같은 한 멤브레인을 사용 하 여 한 번에 적어도 10 반응 튜브를 준비 하 고 투 석 버퍼의 동일한 금액을 사용 하 여.
- 경우 10 X 램프 뇌관의 10 µ L을 혼합 singleplex (3-플렉스, 뇌관 믹스 배 각 10의 10 µ L 추가) dNTP 혼합물의 14 µ L, dialyzed 효소 혼합의 8 µ L, thermolabile UDG의 2 대의 2 µ L 및 물 (3-플렉스에 대 한 무료 nuclease의 66 µ L 46 µ L를 사용 하 여) 0.5 mL microcentrifuge 튜브와 뚜껑 열어 두고. 대신, 다른 뚜껑 증기 탈출 수 있도록 바늘으로 구멍을 추가 합니다.
- 즉시-80 ° C 2 h에서 튜브를 고정 하 고 lyophilize 4 h. 커버 튜브 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일로 동결은 챔버. 시 약, 건조 하면 구멍이 뚜껑을 제거, 원래 뚜껑 닫고 어둠 속에서 동결 건조 된 약 4 ° C에서 튜브를 저장 합니다.
참고: 시 약 수 수 lyophilized, 필요한 경우.
7. 테스트 동결 건조 된 소변 및 모기 샘플 Zika 포함 시 약 실시간 램프
- 키트에서 다음 항목을 사용 하 여 참조 테이블의 자료Zika에 대 한: 오렌지 필터 (긴 패스 필터, 컷에 ~ 540 nm), 상자, 관찰 2 AAA 배터리 3 차원 인쇄 관찰 상자 동결 건조 된 반응 관 ZV Zika 검출, 분류 및 1.1 1.5 mL 나사 상단에 X 재 버퍼 튜브합니다.
- DNA 중 합 효소와 함께 제공 되는 등온 증폭 버퍼 X 10의 5.5 mL를 혼합 하 여 재 버퍼 X 1.1의 50 mL를 준비 ( 재료의 표참조), 100 mM MgSO4의 3.3 mL, 110 µ L의 0.5 M DTT, 그리고 nuclease 무료 물 41.09 mL. 잘, 1.5 mL 나사 탑 튜브에이 솔루션의 aliquot 1 mL를 혼합 하 고 사용까지 4 ° C에서 저장.
- 각 반응 관 (0.5 mL)를 1.1 X 재 버퍼의 90 µ L를 추가 합니다. 액체 (디졸브 간단히 다음 흔들어, 혼합과 그들 스핀 (1000 x g) 다운) 동결 건조 된 시 약을 포함 하는 관의 바닥을 채우고 있는지 확인 합니다. (자세한 내용은 4.1 절 참조) 반응 관에 바이러스 성 RNA와 아군 소변 샘플의 10 µ L를 추가 합니다.
- 모기를 테스트 하는 경우 사각형을 추가 질문 종이의 소변 샘플 대신 물 정화 모기 시체 (로 준비 단계에서에서 설명한 섹션 5.2 및 5.3), 10 µ L 함께 들고.
참고: 또는, 소변 대신 타 액 이나 혈 청 샘플의 10 µ L를 추가 합니다. 샘플 추출 된 DNA 또는 RNA는, rehydrated 혼합물으로 2-5 µ L의 샘플을 추가 하 고 nuclease 무료 물 10 µ L 최종 샘플 볼륨의로 완료.
- 모기를 테스트 하는 경우 사각형을 추가 질문 종이의 소변 샘플 대신 물 정화 모기 시체 (로 준비 단계에서에서 설명한 섹션 5.2 및 5.3), 10 µ L 함께 들고.
- 반응 관의 뚜껑을 닫습니다. 전 65-68 ° c.에 설정 열 블록/욕조 (또는 인큐베이터)에 넣어 30-45 분, 하지만 더 이상의 1 시간을 품 어. 부 화, 후 열에서 튜브를 제거 합니다. 오염을 방지 하기 위해 미래 분석 실험의,이 관 폐쇄 유지 확인 합니다.
- 관찰 상자; 있는 장소 반응 관 온도 주위 온도 (선호 25 ° C) 떨어질 것 이다. 관찰 상자 뒷면에 있는 스위치를 켭니다. 오렌지 필터를 통해 샘플을 관찰 하 고 휴대 전화 카메라 이미지 보기의 필드의 80%를 채우고 거리에서 개최 되는 이미지를 캡처하십시오.
참고: 더 나은 시각화 낮은 조명 환경에서 이루어집니다. - 시각화 완료 되 면, 스위치를 해제 합니다. 나중 시각화 필요한 경우 냉동, 가령 어둠 속에서 밀봉 된 튜브를 저장 합니다.
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Representative Results
처음에, 각 RT 램프 뇌관 (표 1)는 해당 바이러스 성 RNA 기판 뿐만 아니라 부정적인 컨트롤의 젤 전기 이동 법으로 평가 됐다. RT-램프 뇌관 Chikungunya에 대 한 대상 NS5 (RNA 의존 RNA 중 합 효소) Zika 및 뎅기열 1, 지역과 nsP2 지역 (비 구조 단백질 P2) 하도록 설계 되었습니다. 서식 파일 총 RNA 바이러스 주식 교양된 아프리카 녹색 원숭이 신장 (Vero) 세포에서에서 추출 했다. 한 경우, 총 핵 산 (DNA와 RNA) Chikungunya에 감염 된 여성에서 추출 된 Ae aegypti (표 2).
그림 2A RT 램프와 몇 가지 대표적인 결과 수행이 샘플을 보여 줍니다. Singleplex 및 다중화 (3-plexed)의 경우, RT-램프 제품 concatemers agarose 젤에 달릴 때의 사다리로 나타납니다. 네거티브 제어 샘플 샘플 뇌관 총 핵 산은 감염 되지 않은 Ae aegypti 여성에서 추출 하는 일반적인 대상 컨트롤을 포함 하 여, 자신에 대 한만 밴드를 준 물에 포함 된 모기 서식 파일로 사용 되었다.
최적의 실시간 램프 상태를 찾으려면 다른 마그네슘 농도 및 부 화 온도 시험 되었다. 그것은 높은 마그네슘 농도 낮은 온도 가양성을 야 기한 일반적인 amplicons 생성할 수 있는 발견 되었습니다. 따라서, 8 m m 마그네슘 및 65 ° C에 외피 다음에서 모든 실험 (그림 2B)에 사용 되었다.
젤 전기 이동 법을 야기할 수 있습니다 다음 세트의 실험 오염 이전에 생성 된 amplicons, 가양성을 선도 하 여 반응 관의 개통을 필요 합니다. 앞으로 오염 방지 하기 위해, dTTP dUTP RT 램프 amplicons에 통합 될 것 이다 있도록 dTTP와 dUTP, 동등한 비율에 의해 대체 되었다. 이 모든 후속 반응 RT 램프31,32의 준비 동안 amplicon uracil DNA glycosylase (UDG)에 대 한 기판에 오염 가능한을 변합니다. UDG의 thermolabile 버전을 사용 하는 경우 RT 램프 샘플, 설정 되 고 UDG 등온 증폭 하는 동안 비활성화 될 것입니다 뒤 포함 amplicons 실내 온도에 소화 수 있습니다. 또한, 반응 관 필요할 때 다운스트림 분석에 대 한 열 수 있습니다. UDG 소화의 사용 이외에 displaceable 프로브를 사용 하 여 아키텍처 반응 관을 열 필요가 없이 읽을 수 있는 형광을 생성 합니다.
그림 3A Zika RNA를 대상으로 하는 형광 프로브를 사용 하 여 탐지 (LOD) Zika의 제한의 결과 제공 합니다. 직렬 희석 연구는 낮은 1.42 pfu singleplex 분석 결과 또는 3 plexed에서 30 분 이내에 검출 될 수 분석 실험 했다. 0.71 pfu 샘플 희석 추가 했다 때 singleplex 분석 결과 대 일 분 후와 3 plexed 혼합물에 대 일 분 후 형광 신호 관찰 되었다. 뿐만 아니라 실시간 RT-램프, 형광 샘플 블루에 드러낸 후 오렌지 필터를 통해 35 분 470의 여기 파장을 가진 빛 LED 후 가시화 했다 nm (그림 3B). 마찬가지로, 탐지의 한계 측정 되었다 37.8 복사본 및 1.22 pfu Chikungunya, 뎅 그 열의 1에 대 한 각각 (그림 3C-D).
최적의 소변 농도, Zika 바이러스 성 RNA를 확인 하려면 (2.85 pfu)는 본격적인 인간 소변 샘플 (0%, 10%, 20% 및 50%)의 다양 한 농도에 추가 되었습니다. 아마도 그 전해질 때문에 RT 램프 신호 지연 됐다 15에서 35 분에 50% 소변 분석 결과에 사용 된 때. 10% 소변 수 낮은 배경 제시 때문에 결정 했다. Zika 목표의 부재에서 더 증폭 어떤 농도에서 관찰 되었다 하지만 높은 배경 형광 높은 소변 농도 (그림 3E)와에서 관찰 되었다.
다른 형광 색, 80의 지요와 멀티플렉싱 있도록 가닥 displaceable 프로브 nM 다른 fluorophores Zika, Chikungunya, 대 한 16 진수 및 TAMRA 뎅기열 1 대 (식구 들),으로 표시 하지만 같은 끄는 (아이오와 블랙-FQ) 동반 200의 농도와 nM. 셀 문화 추출 바이러스 성 RNAs (Zika 위한 2.85 pfu, Chikungunya, 242 바이러스 성 RNA 복사본 및 뎅기열 1 1.22 pfu) 대상, 10% 소변에 희석으로 사용 되었다. 형광 데이터의 실시간 분석 모든 대상에 대 한 뇌관 참석 했다 3-plexed 분석 실험을 위한 신호 생성 (약 10 분) 지연을 보였다. Singleplex의 경우, 다른 한편으로, 반응이 10-15 분 (그림 4A-C) 내에서 완료 되었다. 형광 블루 LED와 오렌지 필터를 사용 하 여 시각 이었다 때 신호 강도 차이 amplicons 팸 표시 했다 가장 눈에 띄는 다른 fluorophores에 대 한 관찰 되었다. 470에 여기부터,이 예상은 nm은 식구 들 여기 스펙트럼 (그림 4D)의 최대에 가까운.
단일 LED 여기 파장으로 모든 세 가지 색상의 시각화를 사용 하도록 설정 하려면 (470 nm), displaceable 프로브 농도 300으로 증가 했다 및 보완 끄는 프로브 400 nM. Singleplex의 경우, 신호 생성 Zika 대 10 분, Chikungunya에 대 일 분 및 뎅기열 1 40 분 이내 완료 되었다. 그러나 3-plexed 분석 실험에서, 그것은 더 연기 되었다 모든 분석 (그림 5A에서 20 분-C). 그럼에도 불구 하 고, 신호 발생 시간에 희생 오렌지 필터와 파란색 led가 빛을 사용 하 여 모든 세 가지 색상의 시각화를 사용할 수 있습니다. 녹색 형광 Zika 프로브 5'-끝 식구 들, 녹색-황색 형광 Chikungunya 프로브는 5'-끝 16 진수, 표시 및 오렌지-붉은 형광 뎅기열 1, 어디 그것의 조사는 5'-끝 레이블이 사용 됩니다 할당 된 빛으로 표시를 사용 하 여에 대 한 관찰 함께 TAMRA (그림 5D).
테스트 가능한 Zika 감염 모기 샘플, 실험실 감염 된 Ae aegypti 여성 모기 (표 2) Q-종이, 암모니아 처리는 바이러스를 소독 하 고 바인딩하는 노출에 의해 다음의 사각형에 짓 눌린 했다 바이러스 성 충전 된 Q-종이에 RNA 종이 형광 판독33,34을 방해할 수 있는 모기 시체에 pterin 화합물을 제거 하는 에탄올으로 씻어 짧게 했다. Q 논문 포함 모기 했다 다음 직접 잠수 RT 램프 혼합물에서 30 분 동안 65 ° C에서 부 화 후, 밝은 녹색 형광 Zika 바이러스 (그림 6)의 관찰 되었다.
냉장, 그리고 쉽게 분석 결과 사용 하려면 RT-램프 시 약 동결 건조 된 rehydration 버퍼 함께 고 470 nm 발광을 사용 하는 3D 인쇄 관찰 상자 LED 체인와 오렌지 필터 (그림 없이 검출 키트를 제공 하 7A). 재 버퍼의 9를 사용 하 여 볼륨 및 소변 샘플의 1 볼륨, 보이는 녹색 형광 30 분 이내에 생성 될 수 있습니다 및 어떤 휴대 전화 카메라 (그림 7B) 하 여 이미지를 캡처할 수 있습니다. 또한, 모기 견본 질문 종이에 물 대신 소변 샘플의 1 볼륨을 추가 하 여 동일한 분석 결과 의해 사용할 수 있습니다.
그림 1: 램프 분석 결과 디자인 (A) 실시간 램프 뇌관 및 DNA 중 합 효소를 전치 한 가닥으로 아령 구조 형성. (B)의 소개 가닥 displacing 프로브 RT 램프 실시간으로 진행 상황을 모니터를 멀티플렉싱 및 형광 판독 하 고. Yaren 외. 201720허가 매 판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 젤 전기 이동 법 분석 amplicons. (A) singleplex 또는 멀티플렉스 (3-플렉스)에서 테스트 램프 뇌관 적절 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 형식. 컨트롤 포함 다음 titers와 순화 된 바이러스 성 RNA 긍정적인: 2.85 pfu Zika (ZV), 242 게놈 복사본 Chikungunya (CH) 및 뎅기열 1 (D1) 1.22 pfu에 대 한. NTC z, NTC c와 NTC d singleplex 형태로 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 뇌관에 대 한 템플릿 제어에 대 한 각각 서 있다. NSC는 일반적인 대상 컨트롤에 대 한 총 xNA (DNA와 RNA) 감염 무료 Ae aegypti에서 추출 됩니다 의미 합니다. M 마커 (50의 기본적인 쌍 DNA 사다리)를 뜻한다. 분석 결과 (B) 최적화 (에서 55 ° C ~ 70 ° C) 범위의 RT-램프 부 화 온도 테스트 하 여 조건 그리고4 농도 (10 m m 4 m m)에서 다중 포맷의 부재에서 MgSO 대상 RNA. Yaren 외. 201720허가 매 판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 실시간 RT 램프. (A) Singleplex 및 다중화 제한 감지 (LOD)에 대 한 Zika (ZV) 실시간 사용 하 여 80 nM 가닥 displacing 팸 표시 된 프로브를 사용 하 여 실시간 PCR 악기 (채널 483-533 nm). 샘플은 알을 품을 65 ° C에서 약 50 분 (B) 형광 관찰 되었다 그러나 470에서 샘플의 여기 뒤 오렌지 필터에 대 한 파란색 빛 nm. A에서 샘플 시각화를 위해 사용 되었다. (C) 80을 사용 하 여 Chikungunya (CH) 대상에 LOD에 대 한 실시간 분석 실시간 PCR 장비에서 523-568 nm의 형광 채널을 사용 하 여 singleplex 형식의 16 진수 베어링 램프의 nM 프로브. (D) 80을 사용 하 여 뎅기열 1 (D1) 대상에 LOD에 대 한 실시간 분석 TAMRA 베어링 램프의 nM 실시간 PCR 장비에서 558-610 nm의 형광 채널을 사용 하 여 singleplex 형태로 조사. RT-램프 반응에서 최대 소변 콘텐츠 (E) 결정. 마지막 소변 농도 (0%-50%)의 범위 Zika vRNA.NTC의 2.85 pfu 존재 80 nM 팸 표시 된 프로브를 사용 하 여 테스트 했다 모든 패널에 템플릿 컨트롤 없음 =. Yaren 외. 201720허가 매 판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: Singleplex 다중화 80 nM 프로브를 사용 하 여 소변에서 바이러스 탐지 및. (A) Zika 팸 표시 된 프로브 Zika (ZV) 바이러스 성 RNA의 2.85 pfu를 사용 하 여 singleplex 및 멀티플렉스 형식의 10% 소변에서 검출 (80 nM). (B) 16 진수 표시 된 프로브 Chikungunya (CH) 바이러스 성 RNA의 242 복사본을 사용 하 여 singleplex 및 멀티플렉스 형식의 10% 소변에서 Chikungunya 탐지 (80 nM). (C) singleplex 멀티 플렉스 형식 뎅기열 1 (D1) 바이러스 성 RNA의 1.22 pfu TAMRA 표시 된 프로브와 함께 사용 하 여 10% 소변에서 뎅기열 1 검출 (80 nM). (D) 470에서 여기 후 오렌지 필터를 통해 시각화의 RT-램프 반응 블루 LED 빛 nm. Yaren 외. 201720허가 매 판. NTC 모든 패널에 템플릿 컨트롤 없음 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: Singleplex 다중화 300 nM 프로브를 사용 하 여 소변에서 바이러스 탐지 및. (A) Zika 팸 표시 된 프로브 Zika (ZV) 바이러스 성 RNA의 2.85 pfu를 사용 하 여 singleplex 및 멀티플렉스 형식의 10% 소변에서 검출 (300 nM). (B) 16 진수 표시 된 프로브 Chikungunya (CH) 바이러스 성 RNA의 242 복사본을 사용 하 여 singleplex 및 멀티플렉스 형식의 10% 소변에서 Chikungunya 탐지 (300 nM). (C) 1.22 pfu의 Dengue1 사용 하 여 singleplex 및 멀티플렉스 형식의 10% 소변에서 뎅기열 1 감지 TAMRA 표시 된 프로브 (D1) 바이러스 성 RNA (300 nM). (D) 470에서 여기 후 오렌지 필터를 통해 시각화의 RT-램프 반응 블루 LED 빛 nm. 소변 실험에서 긍정적인 컨트롤로, 인간의 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA)를 대상으로 설정 하는 램프 뇌관 TET 표시 된 프로브와 함께 사용 되었다 (300 nM). NTC 모든 패널에 템플릿 컨트롤 없음 =. Yaren 외. 201720허가 매 판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 워크플로 건강과 Zika 감염 Ae aegypti (ZV 9, 표 2)와 Q 종이 기술을 사용 하 여 감염 된 모기 견본의 Zika 검출. Yaren 외. 201720허가 매 판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 관찰 상자. (A)는 관찰 상자 사용 하 여 두 개의 AAA 배터리 베이스에. 이러한 배터리 전원 0.5 mL 튜브 4 개의 구멍에 배치에서 개최 하는 샘플을 밝히는 4 블루 LED 조명. LED 조명 스위치가 켜져 있습니다. 샘플 오렌지 필터를 통해 시각화 됩니다. 관찰 상자에의 (B) 형광 왼쪽에서 오른쪽: 부정, Zika, 부정, 및 긍정적인 Zika에 대 한에 대 한 긍정적인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 대상 바이러스 | 이름 | 시퀀스 (5'-3') | 길이 | 시작 위치 | 끝 위치 | |||
| Zika | ZV-F3 | GAGACTGCTTGCCTAG | 16 | 9905 | 9920 | |||
| ZV-B3 | CTGGGGTCTTGTCTTC | 16 | 10145 | 10130 | ||||
| ZV-LF | CAGTTGGAACCCAGTCAAC | 19 | 10028 | 10010 | ||||
| ZV-파운드 | GTGGAACAGAGTGTGGATTG | 20 | 10093 | 10112 | ||||
| ZV-FIP | CCATGGATTGACCAGGTAGTTTTTTCGACTGATGGCCAATG | 41 | 9974 | 10053 | ||||
| ZV BIP | ACCACTGARGACATGCTTGTTTTTCATGTGGTCGTTYTCC | 40 | 10070 | 10129 | ||||
| ZV-LB_NatTail |
식구 들-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG GTGGAACAGAGTGTGGATTG |
60 | 10093 | 10112 | ||||
| Chikungunya | CH-F3 | CGTCAACGTACTCCTAAC | 18 | 2891 | 2908 | |||
| 채널 B 3 | ACGTTGGCTTTRTTTTGG | 18 | 3094 | 3077 | ||||
| 채널-LF | AGCGTCTTTATCCACGGG | 18 | 2968 | 2951 | ||||
| 채널-파운드 | AYGCATCRATAATGGCGGG | 19 | 3025 | 3043 | ||||
| 채널-FIP | GAAGTTTCCTTTCGGTGGGTTTTTGGAAGACACTYTCYGG | 40 | 2932 | 2993 | ||||
| CH BIP | AAGGAGTGGGAGGTGGATTTTTTCAYTTGGTGACTGCAG | 39 | 3006 | 3063 | ||||
| 채널-LF_NatTail |
16 진수-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG AGCGTCTTTATCCACGGG |
58 | 2968 | 2951 | ||||
| 뎅기열-1 | D1-F3 | ACAGCYCTGAATGAYATGG | 19 | 9583 | 9601 | |||
| D1-B3 | GCAGTTTCTCTCAGGC | 16 | 9803 | 9788 | ||||
| D1-LF | CACTTGYTGCCARTCATTCC | 20 | 9666 | 9647 | ||||
| D1-파운드 | CCATGCCGYAACCAAG | 16 | 9727 | 9742 | ||||
| D1-FIP | CTGGTGGAARTGGTGTGATTTTTTGGGAACCTTCAAAAGG | 40 | 9628 | 9693 | ||||
| D1 BIP | GAAGGAYGGGAGGGAAATAGTTTTTTTAGCCCTRCCCA CAAG |
42 | 9702 | 9763 | ||||
| D1-LB_NatTail |
TAMRA-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG CCATGCCGYAACCAAG |
56 | 9727 | 9742 | ||||
| 미토 콘 드리 아 DNA | MtDNA F3 | AGCCTACGTTTTCACAC | 17 | 9183 | 9199 | |||
| MtDNA B3 | GCGCCATCATTGGTAT | 16 | 9410 | 9395 | ||||
| MtDNA 파운드 | GCCTAGCCATGTGATTTCAC | 20 | 9322 | 9341 | ||||
| MtDNA LF | GGCATGTGATTGGTGGGT | 18 | 9254 | 9237 | ||||
| MtDNA FIP | GTCATGGGCTGGGTTTTACTTTTTCTACCTGCACGACAAC | 40 | 9213 | 9228 | ||||
| MtDNA BIP | CTCAGCCCTCCTAATGACCTTTTTGAGCGTTATGGAGTGG | 40 | 9359 | 9344 | ||||
| MtDNA-LB_NatTail |
TET-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG GCCTAGCCATGTGATTTCAC |
60 | 9322 | 9341 | ||||
| 일반적인 끄는 | CTGACCTGACGGACTGAACGGATGGCTGAGCGCA AACCCG-아이오와 검은 FQ |
40 | ||||||
표 1: 뇌관 및 스트랜드 displaceable 프로브. Yaren 외. 201720허가 매 판. 굵게 시퀀스 프로브를 전치 하는 물가의 더블-좌초 지역 대표. 식구 들 표시 (녹색 형광 본), 16 진수 표시 (빛 녹색-노란색 형광 볼), TAMRA 표시 (오렌지-붉은 형광 본), TET 표시 (노란색 형광으로 본) 프로브 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1, 검출에 할당 된 및 소변, 미토 콘 드리 아 DNA 각각. FAM 495에서 여기 및 방출 맥시 마는 및 520 nm, 각각. 16 진수는 여기 및 방출 맥시 마 538에서 및 555 nm, 각각. TAMRA 559에 여기 및 방출 맥시 마는 nm 및 583 nm, 각각. TET는 522에서 여기 및 방출 최대 및 539 nm, 각각. 모든 fluorophores에 대 한 단일 끄는의 사용할 수 있도록, 아이오와 블랙 FQ 넓은 흡수 범위 (420-620 nm)으로 사용 되었다.
| 바이러스, 스트레인 (은행 승인 번호) | 가족/속 | 바이러스 titers |
| Zika 바이러스 (ZV), 푸에 르 토 리코 (PRVABC59, KU501215.1) | Flaviviridae/Flavivirus 그룹 IV, 긍정적인, ssRNA | 108 pfu/mL x 2.85 |
| Chikungunya 바이러스 (채널), 영국령 버진 아일랜드 (아시아 혈통, KJ451624) | Togaviridae/Alphavirus 그룹 IV, 긍정적인, ssRNA | 8 유전자/10ml x 2.42 |
| Chikungunya 바이러스 (채널), 라 레위니옹 (인도양 혈통, LR2006-OPY1, KT449801) | Togaviridae/Alphavirus 그룹 IV, 긍정적인, ssRNA | 8 유전자/10ml x 1.89 |
| Chikungunya 바이러스 (CH), 라 레위니옹 추출 Aedes aegypti 여성에서 총 없음 (인도양 혈통, LR2006 OPY1, KT449801) | Togaviridae/Alphavirus 그룹 IV, 긍정적인, ssRNA | 5 게놈/10ml x 3.85 |
| 뎅기열 serotype 1 (D-1), 키 웨스트 (FL) (JQ675358) | Flaviviridae/Flavivirus 그룹 IV, 긍정적인, ssRNA | 106 pfu/mL x 1.22 |
| Zika (ZV) 모기 정체성, 스트레인 | 다리 titer pfu/mL | |
| ZV 9, 푸에 르 토 리코 | 4.76 x 103 |
표 2: 세포 배양에 감염 된 모기 바이러스 titers. pfu: 플 라크 형성 단위. Yaren 외. 201720허가 매 판.
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Discussion
Zika, chikungunya, 뎅기열 등 모기 매개 바이러스 위협 공중 보건 및 최근 Zika 확산 강조 저가 포인트의 케어 탐지 대안 모기 감시 뿐만 아니라 환자 진단에 대 한 필요 합니다. 등온 증폭 방법 저렴 한 대안 PCR 기반 시스템으로 개발 되었다. 특히, RT-램프-기반 플랫폼 다양 한 병원 체 검출 적용 되었습니다. 그러나, 등온선 플랫폼의 사용 주로 단일 대상 검색 제한 되었습니다. 보고 하는 방법 여기를 사용 하 여 수정된 RT 램프 특히 편리한 입증 적당 한 온도 (65-68 ° C)의 범위에서 실행 되는 단일 반응 혼합물에 세 개의 다른 대상의 동시 탐지를 허용 하기 때문에 보다 높은 온도 60 ° C 렌더링 Zika 및 다른 바이러스 전염 성 비30,35.
또한, 여기에 제시 된 데이터 실시간 램프는 다양 한 생물 학적 체액15에 있을 수 있는 물질을 억제 하는 견 뎌 능력을 보여줍니다. 바이러스 성 RNAs를 RNA 정화의 추가 단계 없이 직접 반응 혼합물에 샘플을 추가 하 여 증폭 될 수 있습니다. 샘플의 종류에 따라 샘플의 최대 볼륨 허용 하지 반응을 억제 하 고 배경 형광 (거짓 양성)을 일으키지 결정된 해야. 연구 발표 여기 소변 샘플에 대 한 10% 최종 볼륨의 사용에 초점을 맞추고. 그러나, 타 액과 혈 청 샘플 같은 방식으로20에 분석 결과에 적용할 수 있습니다. 탐지의 한계는 환자 소변13, 뿐만 아니라 바이러스에 감염 된 모기20,,3637보고 된 바이러스 중 위에 잘 발견 됐다.
그래서 저렴 다중화 가구 조사 키트 또는 공공 특별 한 가치를 했 모기 감시는 일반적으로 공중 보건 자원에 대 한 우선 순위가 낮은 있다. 따라서,이 키트는 Q-종이 시체 모기에 바이러스의 검출을 허용 하도록 추가 수정 했습니다. Q-종이 포함 covalently 연결 된 4 급 암모늄 그룹의 높은 수준의 coulombic 상호 작용을 통해 그것의 표면에 바이러스 성 핵 산의 캡처 수 있도록 합니다. 비록 질문 종이 RT 램프를 억제 수 있습니다 우려, 그것은 RT 램프 혼합물에 직접 Q-종이 들고 모기 시체를 추가 하 여 성공적인 바이러스 탐지 달성 될 수 있다고 30 분 이내 하는 것이 밝혀졌다. 성공적인 신호 생성, Q-종이 작이 필요가 충분 한 (예를 들어, 100 µ L 반응 볼륨 3 x 4 mm로 크기) RT 램프 반응 혼합물에 빠져들 수를. 반응 관에 대 한 너무 큰 경우 남은 액체에 몰입 하는 대신 부동 시작, 반응 수 있습니다 하지 고 결과 허위 제외 어로 나타날 수 있습니다.
성공적인 탐지 및 각 바이러스의 차별화, 각 뇌관 RT 램프 뇌관 디자인, 프로브, 변위에 대 한 설계 규칙에 대 한 지침을 따라 다중화 fluorophores의 선택을 포함 하는 요구를 설정 합니다. 각 뇌관을 분을 피하기 위해 다른 대상에 대 한 상영 요구를 설정 합니다. 또한, 마그네슘 농도 배양 온도 각 집합에 대 한 최적화가 필요 합니다. 여기에 제시 된 방법 RT 램프 건축 가닥 displaceable 프로브를 도입 하 여 달성 되었다 눈으로 형광 표시기 표시를 사용 합니다. 3 색 다른 fluorophores 각 대상 바이러스에 할당 된 때 다중화 분석 결과에 구상 될 수 있다. 이 비해 장점이 기존 등온선 Zika 탐지 방법, 이후 게시 된 메서드의 대부분 단일 대상 검색 및 시퀀스 관련 되지 않습니다 하 고 생성 하는 경향이 있다 intercalating 또는 형광 염료의 사용 일반적인 amplicons입니다.
고려해 야 할 중요 한 단계 붙일 레이블된 전치 프로브의 최종 농도의 결심 이다. 그것은 발견 했다 80 ~ 100 nM 프로브 displacing의 15-20 분 이내 형광 신호를 생성할 수 있는 때 300 시간 신호를 지연 했다 반면 nM 프로브 농도의 사용 되었다. 다중화 방식에서에서 분석 실행 때에 더 반응 시간 지연 됐다. 80에서 전환에 대 한 이유를 300 nM nM 단일 LED 소스를 사용 하 여 모든 3 개의 fluorophores의 시각화를 가능 하 게 하는 것 이었다. 470에서 여기 LED를 블루 nm 팸 표시 된 프로브에 적합 하지만 덜 16 진수 또는 TAMRA 표시 된 프로브에 적합. 따라서, 모든 3 개의 목표를 시각화 수 부 화 시간에 희생이 되었다.
RT-램프에 대 한 문제 중 하나는 앞으로 오염입니다. RT-램프 짧은 보육 시간에 amplicon의 다량을 생성 하 고 amplicons 졸으로 쉽게 풀릴 수 있습니다. 이 문제를 줄이기 위해 dUTP 분석 결과 설정 동안 UDG 소화 다음 다른 dNTPs 함께 포함 되었다. 그것은 이후 새로 생성 된 실시간-램프 amplicons 소화를 방지 하기 위해 UDG를 비활성화 하는 데 필요한 UDG의 열 불안정 버전을 사용 해야 합니다.
냉장 없이 키트의 배포도 허용, 분석 결과의 모든 구성 하는 데 필요한 수 동결 건조 된 고 키트 보충 재 버퍼. 따라서, 어떤 글리세롤 상업적으로 이용 가능한 효소에 적용 하 여 글리세롤 동결은에 의해 제거할 수 없습니다 때문에 제거 되었습니다. 혼합물에 높은 농도에서 글리세롤 효소 활동을 방해할 수 있습니다. 글리세롤 제거 프로세스에 포함 되지 않은 유일한 효소 thermolabile UDG를 했다. UDG는 24.6 kDa의 분자량과 작은 효소 한 실험에 대 한 부적 절 한 있습니다. 따라서, 구입 동결은 혼합물에 추가 되었습니다. 잔여 글리세롤은 부정적인 분석 결과 결과 미치지 않았다.
이 형광 RT 램프 기술의 한계 중 하나는 단일 LED 소스의 사용 이다. 분석 singleplex 또는 다중 형식에서 실행 했다, 모든 대상의 신호 시각화를 위한 프로브 displacing의 높은 농도 필요 했다. 그러나, 이러한 변경 지연 시간 신호 생성 발생합니다. 이 극복 하기 위해 한 가지 가능한 방법은 더 나은 다른 fluorophores (16 진수 및 TAMRA)에 맞게 두 개의 LED 소스를 사용 하 여 수 있습니다. 이 이렇게 낮은 프로브 농도 부 화 시간 단축으로 신호를 생성 하는 사용 될 수 있습니다.
고려 하는 또 다른 한계는 어렴풋이 조명된 환경에 눈으로 형광 색을 판단 하 고 있다. 그것은 하나의 대상에 있으면 singleplex 또는 다중 형식, 뇌관 하지 서로 상호 작용 하도록 설계 되었습니다 때문에 쉽게. 분석 결과 여러 대상을 모기 또는 하나 이상의 바이러스 성 감염을 가진 환자는 수영장 단일 분석 결과 튜브에 존재 한다면 해석 어렵게 될 것 이다. 이 눈으로 판단 하는 것 보다는 디지털 디스플레이 등 읽어 아키텍처의 변화를 요구할 것입니다.
가능한 미래 접근법 모기 부담 arboviruses의 더 큰 패널을 생성 하 여 멀티플렉싱의 수준을 증가 하는 것입니다. 이 뇌관 뇌관 뇌관 상호 작용을 피하기 위해 디자인 하 고 수정된 핵 산 유사 체 자체 피하는 분자 인식 시스템 (SAMRS) 등의 사용을 요구할 수 있습니다 인위적으로 유전 정보 시스템 (이지스) 확장 주의 필요 더 나은38멀티플렉싱의 높은 수준을 수용 합니다. 따라서, 높은 다중 시스템에 신호 읽기 위한 솔루션 각 displacing 프로브에 대 한 단일 fluorophore를 사용 하 고 각 대상에 대 한 독특한 난민된 시퀀스를 할당 하 고 DNA에 의해 고체 표면에 난민된 프로브를 캡처 것 교 잡입니다. 이 단일 fluorophore와 자극, LED 배열 형식의 플랫폼을 만들 것 이다 하지만 각 대상의 존재를 판단39배열의 위치에 따라 것입니다.
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Disclosures
저자 및 그들의 기관의 몇몇이 분석 결과와 관련 된 지적 재산권을 소유.
Acknowledgments
일은 FDOH-7ZK15, NIAID 1R21AI128188-01 일부 지원 했다. 이 간행물에 보고 된 연구 알레르기의 국가 학회 및 감염 증 그리고 부분에서 생물 의학 연구 프로그램의 플로리다의 건강 부에 의해 부분에서 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 NIH 또는 플로리다 보건 공식 의견을 대표 하지 않는다. 동적 조합 화학 LLC는 그들의 지원 및이 프로젝트에 기여 인정 받고 있습니다.
뎅기열 1 바이러스 (스트레인 BOL-KW010) 친절 하 게 하 여 플로리다 학과의 건강 국 실험실을 제공 했다. Zika 바이러스, chikungunya 바이러스의 아시아 혈통 기꺼이 제공 되었다 센터 질병 관리 및 예방에 대 한. Chikungunya 바이러스의 인도양 혈통 UF-FMEL에 로버트 Tesh (신흥 바이러스와 Arboviruses, Galveston, 텍사스에서 텍사스 대학 의료 지점 통해 세계 참조 센터)에 의해 친절 하 게 제공 되었다. 우리를 통해 감염 연구 S. 벨라미, B. Eastmond, S. 오티 스, 디 벨 레즈, K. Wiggins, R. ZimLer, 그리고 K. Zirbel 감사합니다. 우리는 또한 Q-종이 제공 하기 위한 M. S. 김 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
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