Nuværende multipleksede diagnostics hen til opdager Zika, chikungunya og dengue virus kræver komplekse forberedelsen og dyre instrumentering, og er vanskelige at bruge i lavt ressource miljøer. Vi viser en diagnose, der bruger isotermisk forstærkning med target-specifikke strand displaceable sonder til at registrere og skelne disse vira med høj følsomhed og specificitet.
Zika, denguefeber og chikungunya virus overføres af myg, forårsager sygdomme med lignende patientens symptomer. Men de har forskellige downstream patient til patient transmission potentialer, og kræver meget forskellige patientbehandlingen. Således, de seneste Zika udbrud gør det tvingende nødvendigt at udvikle værktøjer, som hurtigt diskriminerer disse vira hos patienter og fanget myg, at vælge den rigtige patient behandling, og for at forstå og administrere deres epidemiologi i realtid.
Desværre, nuværende diagnostiske test, herunder de modtagende 2016 nødsituation bruge godkendelser og fast-track status, opdage viral RNA ved reverse transkription polymerase kæde reaktion (RT-PCR), som kræver instrumentation, uddannet brugere, og betydelig prøveforberedelse. Således, de skal sendes til “godkendte” referencelaboratorier, der kræver tid. Faktisk, i August 2016, Center for Disease Control (CDC) spurgte gravide kvinder der var blevet bidt af en myg og udviklet en Zika-angivelse udslæt vente en uacceptabel 2 til 4 uger før læring, uanset om de var smittet. Vi har brug meget for test, der kan ske på stedet, med få ressourcer, og af uddannede, men ikke nødvendigvis autoriseret personale.
Denne video viser en analyse, der opfylder disse specifikationer, arbejder med urin eller serum (for patienter) eller knust myg kroppe (om miljømæssige overvågning), alle uden megen forberedelse af prøver. Myg slagtekroppe er fanget på papir transporterer kvaternære ammonium grupper (Q-papir) efterfulgt af ammoniak behandling for at håndtere biologiske. Disse er derefter direkte, uden RNA isolering, bragt i assay rør der indeholder frysetørret reagenser, der behøver ingen kæde af køleanlæg. En modificeret form af reverse transkription loop-medieret isotermisk forstærkning med target-specifikke fluorescently mærket displaceable sonder producerer udlæsning i 30 min, som en trefarvet fluorescens signal. Dette er visualiseret med en håndholdt, batteridrevet enhed med et orange filter. Fremad kontaminering forhindres med forseglet rør, og brugen af termolabile uracil DNA glycosylase (UDG) under tilstedeværelse af dUTP i forstærkning blanding.
Myg-bårne virusinfektioner, herunder dengue, chikungunya og Zika virus er på anledning og kræve øjeblikkelig forvaltningsstrategier. Dengue og chikungunya-virus er endemisk i mange af de tropiske regioner hvor Zika nu spreder sig i den vestlige halvkugle1. Zika virus, ligesom dengue, er medlem af familien Flaviviridae og er naturligt hjemmehørende til Afrika med en asiatisk og to afrikanske genetiske lineages2. Selv om identifikation af virussen Zika daterer sig tilbage til 1947, forblev Zika infektion hos mennesker sporadisk for et halvt århundrede før fremvækst i Stillehavet og Amerika. Den første rapporterede udbrud af Zika feber opstod på øen bjæffe i Mikronesiens Forenede Stater i 2007, efterfulgt af Fransk Polynesien i 2013 og 2014. Det første store udbrud i Amerika opstod i 2015 i Brasilien.
Zika, chikungunya og dengue virus er primært overføres af Aedes aegypti og Aedes albopictus. Zika har dog yderligere downstream menneske til menneske transmission muligheder, sandsynligvis spredes gennem seksuel kontakt, moderen til fosteret interaktion, og via amning3,4,5. Zika feber var først menes at forårsage kun mild sygdom. Men det blev senere tilknyttet Guillain-Barre syndrom hos voksne, microcephalus i nyfødte og kroniske muskel sygdomme, der kan sidste måneder til år. Diagnosticering af Zika sygdom kan være udfordrende, da symptomerne på en Zika infektion ligner dem af andre myg-spredning virus6. Fælles co-infektioner af disse vira gøre differentialdiagnosticering endnu mere udfordrende7,8. Derfor, hurtig og pålidelig detektion af nukleinsyrer fra Zika og andre vira er nødvendig for at forstå epidemiologi i realtid, at indlede kontrol og forebyggende foranstaltninger, og til at administrere patientpleje9.
Nuværende diagnostiske test for disse vira omfatter serologiske tests, virusisolation, virus sekvensering og omvendt-transskription PCR (RT-PCR). Standard serologiske metoder lider ofte under utilstrækkelig følsomhed og resultaterne kan være kompliceret af krydsreaktivitet i patienter, der er tidligere blevet smittet af andre flavivira.
Derfor forbliver nukleinsyre test den mest pålidelige måde at registrere og skelne disse vira. Påvisning af Zika og andre myg-bårne vira er normalt udføres ved hjælp af RT-PCR eller real-time RT-PCR i bred vifte af biologiske væsker, såsom serum, urin, spyt, sæd, modermælk og cerebral væske10,11. Urin og spyt prøver er generelt foretrækkes over blod, da de udviser mindre PCR-hæmning, højere viral belastning, virus tilstedeværelse for længere perioder, og øget brugervenlighed indsamling og håndtering af12,13. RT-PCR-baserede diagnostiske tests, omfatter imidlertid omfattende stikprøve præparationstrin og dyre termisk Cykling udstyr, hvilket gør det mindre optimal for punkt af pleje.
Reverse transkription loop-medieret isotermisk forstærkning (RT-lampe) opstået som en kraftfuld RT-PCR alternativ på grund af sin høje følsomhed og specificitet14, dens tolerance over for hæmmende stoffer i biologiske prøver15, og operation på indre temperatur, som væsentligt sænker assay kompleksitet og omkostninger, hvilket gør den velegnet til miljøer med lav ressource. RT-lampe, består som den implementeres klassisk, af seks primere, som binder til otte forskellige regioner inden for mål RNA. Det kører på konstante temperaturer mellem 60 ° C og 70 ° C, og bruger en reverse transkriptase og en DNA-polymerase med stærk strand fortrænger aktivitet.
I de indledende faser af RT-lampe danner fremad- og bagudrettet interne primere (FIP og BIP, figur 1A) sammen med ydre fremad- og bagudrettet primere (F3 og B3) en håndvægt struktur, frø opbygning af eksponentielle lampe forstærkning. Forstærkning er yderligere accelereret af de sløjfe frem og tilbage primere (LF og LB), som er designet til at binde de enkelt strandede regioner af dumbbell, og resulterer i dannelsen af concatemers med flere gentagne sløjfer16. Klassisk lampe-undersøgelser baseret på turbiditet eller udlæsning af DNA intercalating farvestoffer er ikke helt egnet for punkt af pleje påvisning af Zika, hvor nogle niveau af multiplexing er ønskede17,18,19. Multiplexing opnås ikke nemt i disse systemer, som de er tilbøjelige til at generere falske-positiver på grund af off-target redegoerelser.
For at håndtere disse spørgsmål, tilføjer litteraturen en ekstra komponent i form af en “strand-fortrænger sonde” til klassisk RT-lampe arkitektur20,21,22. Hver sonde har en sekvens-specifikke dobbelt-strenget region og en enkeltstrenget priming region. Sonden med regionen enkeltstrenget er markeret med en 5′-fluorophore, og den supplerende sonden er ændret med en 3′-enden quencher. I mangel af et mål, er uden fluorescens observeret på grund af hybridisering af de supplerende sonde tråde, som bringer fluorophore og quencher i umiddelbar nærhed. I overværelse af et mål, enkeltstrenget del af fluorescerende sonden binder sig til sit supplement på målet, og derefter udvides med en strand, fortrænger polymerase. Yderligere polymerase udvidelse af reverse primere forårsager adskillelse af quencher strand fra dets komplementære fluorescently mærket strand, giver mulighed for emission af fluorescens ()figur 1B). Med dette design, er signalet genereret efter håndvægt dannelse, at reducere chancerne for falsk-positive signaler.
Den dobbelt-strenget del af strand-fortrænger sonden kan være enhver sekvens, og når multiplexing er anvendt, den samme sekvens kan anvendes med forskellige fluorophore-quencher par. Med denne arkitektur, virus-inficeret urin, serum eller myg var prøver squished på papiret direkte introduceret til assay uden forberedelse af prøver. Trefarvet fluorescens udlæsning synlige for menneskelige øje blev genereret i 30-45 min, og signaler blev visualiseret ved en 3D-trykt observation boks, der bruger en blå LED og en orange filter. Frysetørring RT-lampe reagenser aktiveret installation af dette kit til at sænke ressourceindstillinger uden behov for køling.
Myg-bårne vira herunder Zika, chikungunya og dengue truer folkesundheden og de seneste Zika udbrud fremhæve behovet for lavpris-punkt af pleje påvisning alternativer for patientens diagnostik samt for myg overvågning. Isotermisk forstærkning metoder blev udviklet som overkommelige alternativer til PCR-baserede systemer. Især, er RT-lampe-baserede platforme blevet anvendt til påvisning af en bred vifte af patogener. Brugen af isotermisk platforme har imidlertid primært begrænset til enkelt target detection. Metod…
The authors have nothing to disclose.
Værket var delvist understøttet af FDOH-7ZK15 og NIAID 1R21AI128188-01. Forskning rapporteret i denne publikation blev delvist understøttet af nationale institutter for allergi og smitsomme sygdomme, og dels af biomedicinsk forskning Program fra Florida Department of Health. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af NIH eller Florida Department of Health. Dynamisk kombinatorisk kemi LLC er anerkendt for deres støtte og bidrag til dette projekt.
Dengue 1 virus (stamme BOL-KW010) var venligst leveret af Florida Department af sundhed Præsidiet af laboratorier. Zika virus og den asiatisk afstamning af chikungunya virus var nådigt fastsat af Centers for Disease Control og forebyggelse. Det Indiske Ocean afstamning af chikungunya-virus blev venligst leveret af Robert Tesh (World Reference Center for Emerging vira og Arboviruses, gennem University of Texas Medical branche i Galveston, Texas) til UF-FMEL. Vi takker S. Bellamy, B. Eastmond, S. Ortiz, D. Velez, K. Wiggins, R. ZimLer og K. Zirbel for bistand med infektion undersøgelser. Vi takker også M. S. Kim for at levere Q-papir.
SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |