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Biochemistry

Multiplexado amplificação isotérmica com base em plataforma de diagnóstica para detectar Dengue 1, Chikungunya e Zika

Published: March 13, 2018 doi: 10.3791/57051
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 1,3
1Foundation for Applied Molecular Evolution (FfAME), 2Florida Medical Entomology Laboratory, University of Florida, 3Firebird Biomolecular Sciences LLC

Summary

Corrente multiplexado diagnósticos para detectar Zika, chikungunya, vírus da dengue exigem a preparação de amostras complexas e instrumentação cara e são difíceis de usar em ambientes de recursos baixos. Mostramos um diagnóstico que utiliza amplificação isotérmica com sondas displaceable vertente destino específico para detectar e diferenciar estes vírus com alta sensibilidade e especificidade.

Abstract

Zika, da dengue e o vírus chikungunya é transmitido por mosquitos, causando doenças com sintomas semelhantes do pacientes. No entanto, eles têm potenciais diferentes a jusante transmissão de paciente para paciente e requerem tratamentos muito diferentes pacientes. Assim, surtos recentes Zika torná-lo urgente para desenvolver ferramentas que rapidamente discriminam estes vírus em pacientes e presos os mosquitos, para selecionar o correto tratamento do paciente e para compreender e gerenciar sua epidemiologia em tempo real.

Infelizmente, testes de diagnóstico atual, incluindo aqueles emergência 2016 recebimento usar autorizações e acelerado estado, detectar o RNA viral por transcrição reversa cadeia da polimerase (RT-PCR), que requer instrumentação, treinou os usuários, e preparação da amostra considerável. Assim, devem ser enviadas para laboratórios de referência "aprovado", que requer tempo. Com efeito, em agosto de 2016, o Center for Disease Control (CDC) estava perguntando as mulheres grávidas, que tinha sido mordido por um mosquito e com sarna Zika-indicando que esperar uma inaceitável de 2 a 4 semanas antes de aprendizagem se eles foram infectados. Precisamos muito de testes que podem ser feitos no local, com poucos recursos e por pessoal treinado, mas não necessariamente licenciado.

Este vídeo demonstra um ensaio que atenda a estas especificações, trabalhando com urina ou soro (para pacientes) ou carcaças de mosquito esmagado (para vigilância ambiental), tudo sem muita preparação da amostra. Carcaças de mosquito são capturadas no papel carregando de amônio quaternário grupos (Q-papel) seguidos de um tratamento de amônia para gerenciar riscos biológicos. Estes são então diretamente, sem isolamento de RNA, colocados em tubos de ensaio contendo reagentes liofilizados que precisam sem cadeia de refrigeração. Uma forma modificada de amplificação isotérmica mediada por laço transcrição reversa com destino específico fluorescente etiquetadas sondas displaceable produz a leitura, em 30 min, como um sinal de fluorescência de três cores. Isto é visualizado com um dispositivo portátil, bateria com um filtro laranja. Contaminação direta é impedida com tubos selados e o uso de termolábil uracil DNA glycosylase (UDG) na presença de dUTP a mistura de amplificação.

Introduction

Infecções por vírus transmitidas por mosquitos, inclusive da dengue e chikungunya Zika vírus são sobre as estratégias de gestão imediata de ascensão e a demanda. Vírus da dengue e chikungunya já são endêmicas em muitas das regiões tropicais onde Zika está se espalhando no hemisfério ocidental1. Zika vírus, como a dengue, é um membro da família Flaviviridae e é nativa da África com um asiático e duas linhagens genéticas africanas2. Mesmo que a identificação do vírus Zika remonta a 1947, Zika infecção em humanos permaneceu esporádica há meio século antes de emergir no Pacífico e nas Américas. O primeiro surto relatado de Zika febre ocorreu na ilha de Yap, nos Estados Federados da Micronésia, em 2007, seguido de Polinésia francesa em 2013 e 2014. O primeiro grande foco nas Américas ocorreu em 2015 no Brasil.

Vírus da dengue, chikungunya e Zika são transmitidos principalmente pelo Aedes aegypti e Aedes albopictus. No entanto, Zika tem possibilidades adicionais a jusante transmissão de humano para humano, provavelmente sendo espalhadas através do contato sexual, interação mãe-para-feto e através do aleitamento materno3,4,5. Zika febre primeiro foi acreditado para causar doença apenas suave. No entanto, mais tarde foi associado com a síndrome de Guillain-Barré em adultos, microcefalia em recém-nascidos e crônicas doenças músculo-esqueléticas que podem últimos meses a anos. Diagnóstico de doença Zika pode ser um desafio, uma vez que os sintomas de uma infecção Zika são semelhantes de outros vírus de propagação do mosquito6. Co-infecções comuns destes vírus fazem diagnóstico diferencial ainda mais desafiador7,8. Portanto, deteção rápida e confiável dos ácidos nucleicos de Zika e outros vírus é necessária para compreender a epidemiologia em tempo real, para iniciar o controle e medidas preventivas e para gerenciar o atendimento ao paciente9.

Testes de diagnóstico atual para estes vírus incluem testes serológicos, isolamento do vírus, sequenciamento do vírus e PCR transcrição reversa (RT-PCR). Abordagens serológicas padrão muitas vezes sofrem de sensibilidade inadequada e resultados podem ser complicados por reatividade cruzada em pacientes que anteriormente foram infectados por outros flavivírus.

Portanto, o teste de ácido nucleico continua a ser a maneira mais confiável para detectar e diferenciar estes vírus. Deteção de Zika e outros vírus transmitidas por mosquitos é geralmente realizada usando RT-PCR ou RT-PCR em tempo real em uma variedade de fluidos biológicos, tais como soro, urina, saliva, sêmen, leite materno e fluido cerebral10,11. Amostras de urina e saliva são geralmente preferidas sobre sangue, uma vez que eles apresentam menos PCR-inibição, cargas virais, presença de vírus por longos períodos de tempo e maior facilidade de coleta e tratamento de12,13. Testes de diagnóstico baseados em RT-PCR, no entanto, compreendem as etapas de preparação de amostra extensa e caro equipamento de ciclismo térmico, tornando-se menos ideal para o local de tratamento.

Transcrição reversa mediada por loop de amplificação isotérmica (RT-lâmpada) surgiu como uma poderosa alternativa de RT-PCR, devido à sua alta sensibilidade e especificidade14,15, amostras de sua tolerância para substâncias inibidoras no biológico e operação em temperatura única, que significativamente reduz do ensaio de complexidade e custos associados, tornando-o adequado para ambientes de baixo recurso. RT-lâmpada, como classicamente é implementada, compreende seis primeiras demão que ligam a oito regiões distintas dentro da meta do RNA. Ele é executado em temperaturas constantes entre 60 ° C e 70 ° C e usa um transcriptase reversa e uma DNA polimerase com forte vertente deslocando atividade.

Durante os estágios iniciais do RT-lâmpada, avançar e retroceder internas Cartilhas (FIP e BIP, figura 1A) juntamente com o exterior para a frente e para trás as primeiras demão (F3 e B3) formam uma estrutura de haltere, a estrutura de sementes de amplificação exponencial de lâmpada. Amplificação é ainda mais acelerada por laço frente e para trás primers (LF e LB), que são projetados para ligar as regiões encalhadas única do haltere, e resulta na formação de concatemers com repetindo vários loops16. Ensaios de lâmpada clássica baseada na turbidez ou leitura por DNA intercalante corantes não é inteiramente adequada para deteção de point-of-care de Zika, onde algum nível de multiplexação é desejado17,18,19. Multiplexação não é facilmente obtida nestes sistemas, como eles são propensos a gerar falsos positivos devido amplificações fora do alvo.

Para gerenciar essas questões, a literatura adiciona um componente adicional sob a forma de uma "fio-deslocando sonda" para a arquitetura RT-lâmpada clássica20,21,22. Cada teste possui uma sequência específica dobro-costa e uma região de single-stranded escorva. A sonda com a região de single-stranded é marcada com um fluoróforo 5', e a sonda complementar é modificada com um quencher 3'-extremidade. Na ausência de um alvo, sem fluorescência é observada devido a hibridação das vertentes complementares sonda, que traz o fluoróforo e quencher em estreita proximidade. Na presença de um alvo, a parte single-stranded da sonda fluorescente vincula seu complemento no alvo e então é estendida por um fio, deslocando a polimerase. Nova prorrogação de polimerase por primers reversos provoca a separação da strand quencher de sua cadeia complementar fluorescente etiquetada, permitindo a emissão de fluorescência (figura 1B). Com este projeto, o sinal é gerado após a formação do haltere, reduzindo as chances de sinais falso-positivos.

A porção de dupla-hélice da vertente-deslocando sonda pode ser qualquer sequência, e quando a multiplexação é aplicada, a mesma sequência pode ser utilizada com pares diferentes fluoróforo-quencher. Com esta arquitetura, urina contaminada por vírus, soro ou mosquito esmagadas no papel de amostras foram introduzidas diretamente o ensaio sem preparação da amostra. Leituras de três cores fluorescência visíveis ao olho humano foram geradas dentro de 30-45 min, e os sinais foram visualizados por uma caixa de observação 3D-impresso que utiliza um LED azul e um filtro laranja. Os reagentes de RT-lâmpada de liofilização habilitado a implantação deste kit para diminuir as configurações de recursos sem a necessidade de refrigeração.

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Protocol

Nota: Os mosquitos foram os únicos animais diretamente utilizados neste estudo. Os procedimentos para gerenciar as galinhas, cujo sangue foi usado para alimentar os mosquitos infectados, foram aprovados como IACUC protocolo #201507682 pela propagação cuidados animais institucionais da Universidade da Flórida e Committee.Virus de uso e estudos de infecção do mosquito foram realizado nas instalações da BSL-3 do laboratório de Entomologia Médica de Florida em Vero Beach, FL. RT-lâmpada experimentos foram realizados em laboratório BSL-2 compartilhado por FfAME e LLC de Ciências biomoleculares Firebird em Alachua, FL.

1. projeto de Primers e Strand deslocando sondas

  1. Extrair sequências virais para Dengue 1 do banco de dados Instituto Broad23; sequências para Zika e chikungunya do NIAID vírus patógeno de banco de dados e recursos de análise de24.
    1. Crie alinhamentos múltiplos da sequência (MSAs) para sequências de interesse usando software músculo v3.8.3125. Use MSAs gerados para procurar conjuntos de primers lâmpada dentro de uma região conservada do alvo e evitar alvos não relevantes ou não intencionais, como distinções entre subtipos de um alvo.
  2. Siga as regras de design para as primeiras demão lâmpada como descrito on-line (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/) e permitir a utilização de bases misturadas em primers para cobrir o vírus divergência26. Para evitar a reactividade cruzada dos conjuntos da primeira demão, compare primers de lâmpada gerados para o banco de dados do NCBI RNA vírus usando NCBI BLAST27. Comparar cada conjunto para eliminar as primeiras demão que teriam dimerizam em um ensaio multiplexado usando NCBI BLAST também.
  3. A porção de dupla-hélice da vertente-deslocando sonda contra qualquer sequência do genoma viral e sequência genômica de mosquito da tela. Modifica o 5'-extremidades da ligação destino sonda com fluoresceína amidite (FAM), tintura HEX e 5-tetrametilrodamina (TAMRA) tintura para Zika, chikungunya e Dengue 1, respectivamente.
    1. Incluem uma cartilha de controle positivo para amostras de urina. Projetar primers de lâmpada para direcionar o DNA mitocondrial humano. Sonda de vertente-deslocando do rótulo com TET na extremidade 5'. Sondas de quencher de etiqueta que são parcialmente complementares a cada fluorescente etiquetado sonda com quencher (por exemplo, Iowa preto-FQ) em 3'-extremidade (tabela 1).

2. vírus isolados e infectado o Mosquito amostras

  1. Uso isolados de vírus Zika (estirpe de Porto Rico), vírus Chikungunya (estirpe de La Réunion ou Ilhas Virgens Britânicas) e vírus de Dengue sorotipo-1 (estirpe de Key West). Determine a concentração viral usando a placa de ensaio28 ou de RT-PCR quantitativo29. Extraia o RNAs virais usando comercialmente disponíveis kits de extração de RNA.
    Nota: A tabela 2 representa os títulos virais de cada isolado de vírus usada neste estudo.
  2. Siga o artigo publicado por Yaren et al . para um protocolo detalhado sobre a infecção de fêmeas Ae. aegypti com Zika e chikungunya vírus20. Consulte a tabela 2 para o título viral da amostra mosquito infectado com vírus Zika.

3. RT-lâmpada juntamente com termolábil Uracil DNA Glycosylase

  1. 10 x preparação de mistura da primeira demão.
    1. Preparar a solução estoque de 100 µM de cada primer e sonda (Veja passo 1) adicionando-se água livre de nuclease. Vórtice bem e loja a-20 ° C até o uso.
    2. Para mistura de Primer X 10 para cada Zika, Dengue 1 ou alvo de DNA mitocondrial, que mistura 16 µ l da FIP, 16 µ l BIP, 2 µ l de F3, 2 µ l de B3, 5 µ l de se, 2 µ l de LB, 3 µ l de LB-fluorescente etiquetado sonda, 4 µ l de sonda quencher e 50 µ l de água nuclease livre para dar um total de volume de 100 µ l.
    3. Para mistura de Primer X 10 para Chikungunya, misture 16 µ l da FIP, 16 µ l BIP, 2 µ l de F3, 2 µ l de B3, 5 µ l de LB, 2 µ l de se, 3 µ l de se-fluorescente etiquetado sonda, 4 µ l de sonda quencher e 50 µ l de água nuclease livre para dar um total de volume de 100 µ l.
      Nota: A sonda concentração descrita acima usa 300 nM de sonda fluorescente final e 400 nM de sonda quencher. Como alternativa, uso 80 nM de sonda fluorescente etiquetada e 200 nM de sua sonda quencher para análise em tempo real.
  2. Adicionar 5 µ l de mistura da primeira demão de 10x (para 3-plex, adicionar 5 µ l de cada 10 X mistura primeira demão), 5 µ l de tampão de amplificação isotérmica de 10x (1 X composição de buffer: 20 mM Tris-HCl tampão pH 8.8, 50 mM KCl, 10mm (NH4)2SO4, 8mm MgSO4 0.1% Tween-20, 1 milímetro DTT), 7 µ l da mistura do dNTP (10 mM de dATP, dCTP e dGTP; 5 mM dTTP e dUTP), 16 unidades da DNA polimerase, 15 unidades de Transcriptase reversa, 80 unidades de inibidor do ribonuclease recombinantes, 2 unidades de termolábil UDG, 1-2 µ l de quantidades variáveis de vi RAL RNAs e água para trazer o volume total até 50 µ l em um 0,25 mL do PCR do tubo (ver Tabela de materiais).
  3. Inclua ensaios de controlo negativo, nesta fase, substituindo o volume de RNA viral com água. Incubar as amostras entre 65 e 68 ° C por 45 min a 1 h e, em seguida, analisar executando 5 µ l de cada amostra em gel de agarose de 2,5% em 1 tampão de X TBE contendo brometo de etídio (0,4 µ g/mL). Use um 25 bp ou escada de DNA 50 bp como marcador no gel.
    Nota: A adição de um modelo específico não-alvo é opcional.
  4. Para detectar a presença de RNA patogénico, testar cada conjunto da primeira demão e seu controle de não-modelo variando a concentração de temperatura e/ou magnésio, uma vez que cada conjunto de cartilha RT-lâmpada foi projetado para funcionar em diferentes temperaturas (65 ° C a 68 ° C) ou magnésio concentrações (final de 6 a 10 mM). Prepare as experiências à temperatura ambiente.

4. RT-lâmpada usando urina cravado de RNA Viral

  1. Teste as primeiras demão RT-lâmpada em diferentes concentrações finais de urina (0%, 10%, 20% e 50%) em 50 µ l de volume total de reação. Para 10% de concentração de urina final, adicione 1 µ l de RNA viral a 5 µ l de urina. Para 20% de concentração de urina final, adicione 1 µ l de RNA viral de 10 µ l de urina. Para 50% de concentração de urina final, adicione 1 µ l de RNA viral de 25 µ l de urina.
  2. Para monitoramento em tempo real de RT-lâmpada em 10% da urina, utilize um instrumento PCR em tempo real (ver Tabela de materiais) com fluoróforo diferentes filtros.
    1. Para ler os sinais de fluorescência de amplicons FAM-etiquetados para Zika, usar um filtro que variam de 483 a 533 nm; para amplicons HEX-etiquetados para chikungunya, use um filtro variando de 523 a 568 nm; para amplicons TAMRA-etiquetados para Dengue 1, use um filtro variando de 558 610 nm; e para TET-rotulado amplicons de DNA mitocondrial, use um filtro variando de 523 a 568 nm.
      Nota: FAM tem maxima de excitação e emissão de 495 nm e 520 nm, respectivamente. HEX tem maxima de excitação e emissão de 538 nm e 555 nm, respectivamente. TAMRA tem maxima de excitação e emissão de 559 nm e 583 nm, respectivamente. TET tem maxima de excitação e emissão de 522 nm e 539 nm, respectivamente.
  3. Placas de uso 96 poços selo o prato com uma folha de plástico transparente, incubar as amostras a 65-68 ° C por 60-90 min e gravar a fluorescência cada 30 s usando o reciclador de luz. Inicialmente, use 80 nM de sondas fluorescente etiquetadas e então teste a 300 nM de sondas fluorescente etiquetadas.
    1. Determine o limite de detecção para cada destino adicionando serialmente diluída RNAs virais na concentração de urina final de 10%.
      Nota: Use RT-lâmpada em tempo real para determinar a temperatura óptima, concentração de magnésio, concentração de sonda fluorescente etiquetadas e tempo de reação.
  4. Para visualizar a fluorescência gerada por sondas displaceable vertente pelo olho, use uma fonte de luz LED azul de um reciclador de luz com excitação a 470 nm (qualquer caixa de electroforese do gel com a fonte de luz azul irá trabalhar, consulte a tabela de materiais) e gravar a imagem com uma câmera de telefone celular a temperatura ambiente no escuro.
    Nota: Uso 300 nM de sondas fluorescente etiquetadas, quando é necessária a visualização de todas as três cores pelo olho usando LED azul.

5. RT-lâmpada na detecção de mosquitos infectados Zika usando a tecnologia Q-papel

  1. Prepare quaternários de amônio-modificado papel de filtro (Q-papel), de acordo com os métodos anteriormente publicados com pequenas modificações,30.
    1. Mergulhe 1 g de círculos de papel de filtro de celulose (ver Tabela de materiais) com diâmetros de 3,5 cm em 50 mL de 1,8% de solução aquosa de NaOH por 15 min para ativação.
    2. Recolher os círculos de papel ativado por filtração em vácuo e depois mergulhe-os em 40 mL de solução aquosa de cloreto de trimetilamónio (2,3-epoxipropílicos) (0,28 g) durante a noite à temperatura ambiente.
      Nota: Manter a proporção em massa de cloreto de trimetilamónio (2,3-epoxipropílicos) para o papel de filtro de 0,28 a 1.
    3. Recolher o papel catiônico resultante por filtração em vácuo e neutralizar com 50 mL de ácido acético a 1%.
    4. Lavar o papel três vezes com etanol e secar ao ar livre debaixo de um carro com fluxo de ar constante.
  2. Corte folhas de papel-Q em pequenos retângulos (3 x 4 mm) usando um perfurador de papel ou tesoura. Esmaga Ae. aegypti mosquitos fêmeas potencialmente infectados com Zika em cada papel com um pilão de micro.
  3. Adicionar a cada papel 20 µ l de solução de amônia aquosa de 1 M (pH ≈ 12) e espere 5 min. Em seguida, lave cada papel uma vez com 20 µ l de 50% EtOH e uma vez com 20 µ l de água livre de nuclease. Secar o papel em Biossegurança BSL-2 armário para cerca de 1 h.
    Nota: Neste momento, as amostras podem ser armazenadas a-20 ° C durante a noite até o uso.
  4. Usando uma pinça, coloque cada papel em 100 µ l da mistura de reação de RT-lâmpada e incubar a 65-68 ° C por 45 min. Certifique-se de submergir totalmente o papel na solução; Ele não deve ser flutuante. Ler e gravar a fluorescência decorrentes de vírus Zika usando a fonte de luz LED azul e filtro laranja ou amarelo.

6. liofilização dos reagentes RT-lâmpada para 100 µ l de Volume de reação

  1. Prepare 10 X lâmpada primeira demão mistura de acordo com a seção 3.1 e preparar a mistura do dNTP contendo dUTP de acordo com a seção 3.2. Loja da primeira demão mistura e dNTPs a-20 º C até o uso.
  2. Prepare-se 10 mL de tampão de diálise de enzima para remover o glicerol, misturando-se 100 µ l de 1 M Tris-HCl pH 7,5, 500 µ l de 1 M de KCl, 2 µ l de EDTA 0,5 M, 100 µ l de 10% Triton X-100, 100 µ l de 0,1 M DTT e 9,198 mL de água livre de nuclease. Armazenar o buffer de diálise a 4 ° C.
    Nota: Certifique-se de filtragem (filtros de 0.2 mícrons) todas as soluções de reagente tampão antes de usar e armazená-los em 4 ° C.
    1. Usar uma membrana de ultrafiltração com limite de corte 10 kDa (ver Tabela de materiais). Colocar 350 µ l de tampão de diálise, 4 µ l de 32 unidades da DNA polimerase, 2 µ l de 30 unidades de Transcriptase reversa e 2 µ l de 80 unidades de inibidor de RNase em membrana de ultrafiltração e centrifugação a 14.000 x g por 5 min a 4 ° C.
    2. Adicionar outro 350 μL de tampão de diálise para a membrana de ultrafiltração e centrifugue (14.000 x g) min. 5 outro vazio do tubo de coleta e repita este passo e, em seguida, centrifugar (14.000 x g) durante 3 min.
    3. Para a eluição, inverta a membrana e coloque em um novo tubo de coleta. Girar a 1.000 x g por 2 min. medida do volume de eluição; se a menos de 8 µ l, trazer o volume até 8 µ l pela adição de buffer de diálise. Armazenar a eluição a 4 ° C e imediatamente prosseguir para a próxima etapa.
      Nota: Este protocolo é para liofilização tubo único, mas preparar pelo menos 10 tubos de reação de cada vez usando a mesma membrana de ultrafiltração e usar a mesma quantidade de buffer de diálise.
  3. Misturar 10 µ l de 10 primer X lâmpada se singleplex (para 3-plex, adicionar 10 µ l de cada 10 X mistura primeira demão), 14 µ l da mistura do dNTP, 8 µ l de mistura de enzima dializados, 2 µ l de 2 unidades de UDG termolábeis e 66 µ l de nuclease livre de água (para 3-plex use 46 µ l) em um tubo de microcentrifugadora de 0,5 mL e deixe a tampa aberta. Em vez disso, adicione outra tampa perfurada com uma agulha para permitir que o vapor escapar.
  4. Imediatamente congelar os tubos a-80 ° C durante 2 h e lyophilize o tubo para 4 h. tampa da câmara de liofilização com folha de alumínio para a proteção da luz. Quando os reagentes são secas, retire as tampas perfuradas, feche a tampa original e armazenar os tubos com reagentes liofilizados a 4 ° C no escuro.
    Nota: Os reagentes podem ser liofilizados durante a noite, se necessário.

7. teste liofilizado RT-lâmpada reagentes na urina e Mosquito amostras contendo Zika

  1. Use os seguintes itens do kit (veja a Tabela de materiais) para Zika: uma caixa de observação 3D-impresso com filtro laranja (filtro de passa tempo, corte-em ~ 540 nm), 2 pilhas AAA para observar a caixa, liofilizado, tubos de reação rotulados ZV para a deteção de Zika, e 1.1 tubos de X reidratação Buffer na parte superior do parafuso de 1,5 mL.
  2. Preparar 50 mL de 1.1 X buffer de reidratação misturando 5,5 mL de 10x buffer de amplificação isotérmica que vem junto com o DNA polimerase (consulte a Tabela de materiais), 3,3 mL de MgSO4a 100 mM, 110 µ l de 0,5 M DTT e 41,09 mL de água livre de nuclease. Misture bem, alíquota 1 mL desta solução para tubos de 1,5 mL parte superior do parafuso e armazenar a 4 ° C até o uso.
  3. Adicione 90 µ l de tampão de reidratação X 1.1 para cada tubo de reação (0,5 mL). Certifique-se de que o líquido preenche o fundo do tubo contendo os reagentes liofilizados (dissolve-los com a mistura por agitação, então brevemente spin para baixo (x 1.000 g)). Adicione 10 µ l de amostra de urina cravada com RNA viral para os tubos de reação (ver seção 4.1 para obter detalhes).
    1. Se testando os mosquitos, adicionar um retângulo de papel Q segurar mosquito carcaças (como preparado nas etapas descritas nas seções 5.2 e 5.3), juntamente com 10 µ l purificado água em vez de amostras de urina.
      Nota: Como alternativa, adicione 10 µ l de amostras de saliva ou soro, em vez de urina. Se as amostras são extraído DNA ou RNA, adicione 2-5 µ l da amostra na mistura re-hidratada e completar com água livre de nuclease a 10 µ l de volume final da amostra.
  4. Feche a tampa do tubo de reação. Coloque-os num calor bloco/banho (ou incubadora) pré-ajuste a 65-68 ° C. Incube durante 30-45 min, mas não mais de 1 h. Após a incubação, retire o tubo do fogo. Para evitar a contaminação dos futuros ensaios, certifique-se de que esses tubos permanecem fechados.
  5. Coloque os tubos de reação na caixa observação; a temperatura vai cair para a temperatura ambiente (de preferência de 25 ° C). Ligue o interruptor na parte de trás da caixa de observação. Observar a amostra através do filtro laranja e capturar a imagem de uma câmera de telefone celular que é mantida a uma distância onde a imagem preenche 80% do campo de visão.
    Nota: A melhor visualização é alcançada em ambientes de luz baixas.
  6. Após visualização é concluída, desligue o interruptor. Armazene os tubos selados no escuro, de preferência com refrigeração, se houver necessidade de posterior visualização.

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Representative Results

Inicialmente, as performances de cada primer RT-lâmpada (tabela 1) , com sua correspondente substrato de RNA viral, bem como controles negativos foram avaliadas por eletroforese em gel. As primeiras demão RT-lâmpada foram projetadas para alvo NS5 região (RNA-dependente do RNA polimerase) para Zika e Dengue 1 e região nsP2 (proteínas não estruturais P2) para Chikungunya. Modelos foram RNA total extraído de estoques virais cultivadas em células de rim (Vero) do macaco verde africano. Em um caso, total de ácidos nucleicos (DNA e RNA) foi extraído de uma fêmea infectada Chikungunya Ae. aegypti (tabela 2).

Figura 2A mostra que alguns resultados representativos com RT-lâmpada realizado com estas amostras. Em ambos os singleplex e casos multiplexado (3-plexed), RT-lâmpada produtos aparecem como uma escada de concatemers quando executado em gel de agarose. Amostras de controlo negativo contendo água como amostra deu apenas as bandas para as primeiras demão se, incluindo o controle de destino específico onde total de ácidos nucleicos extraídos de um não-infectadas Ae. aegypti fêmea mosquito foi usado como modelo.

Para encontrar condições ideais de RT-lâmpada, magnésio diferentes concentrações e temperaturas de incubação foram testadas. Verificou-se que altas concentrações de magnésio e temperaturas mais baixas podem gerar amplicons específico, dando origem a falsos positivos. Portanto, 8 milímetros de magnésio e incubação a 65 ° C foram utilizados em todos os experimentos a partir daí (Figura 2B).

Electroforese do gel requer a abertura do tubo de reação, que pode originar a contaminação do próximo conjunto de experimentos por amplicons gerado anteriormente, levando a falsos positivos. Para evitar a contaminação direta, dTTP foi substituído por proporções iguais de dTTP e dUTP, que seria incorporada dUTP RT-lâmpada amplicons. Isto transforma a possível contaminação amplicon em um substrato para a DNA-uracil glycosylase (UDG) durante a preparação de qualquer subsequente RT-lâmpada reações31,32. Quando é usada uma versão termolábil do UDG, dU-contendo amplicons pode ser digerida em temperatura ambiente como as amostras do RT-lâmpada estão a ser criadas, e o UDG vai ser inativada durante a amplificação isotérmica. Além disso, o tubo de reação pode ser aberto para uma análise a jusante, quando necessário. Além do uso de digestão UDG, uma arquitetura usando sondas displaceable gera fluorescência que pode ser lido sem a necessidade de abrir o tubo de reação.

Figura 3A entrega o resultado do limite de detecção (LOD) para Zika utilizando sondas fluorescentes direcionamento Zika RNA. Estudos de diluição serial mostraram que tão baixo como pfu 1,42 poderia ser detectado dentro de 30 min em um ensaio de singleplex ou um plexed-3 ensaios. Quando amostras foram mais diluídas para 0,71 pfu, um sinal fluorescente foi observado após 40 min para um ensaio de singleplex e depois de 50 min para misturas de 3-plexed. RT-lâmpada em tempo real, além de fluorescência foi visualizada após 35 min através de um filtro laranja, depois que as amostras foram expostas ao azul diodo emissor de luz com um comprimento de onda de excitação de 470 nm (Figura 3B). Da mesma forma, limites de detecção foram medidos em 37,8 cópias e pfu 1.22 para Chikungunya e Dengue 1, respectivamente (Figura 3-D).

Para determinar a concentração de urina ideal, RNA viral Zika (2.85 pfu) foi adicionado à concentrações diferentes de uma amostra de urina humana autêntica (0%, 10%, 20% e 50%). Presumivelmente por causa de seus eletrólitos, o sinal de RT-lâmpada foi adiado de 15 a 35 min quando urina 50% foi usada no ensaio. 10% urina estava determinada a ser ideal devido a apresentar um plano de fundo mais baixo. Na ausência de metas Zika, sem amplificação foi observada em qualquer concentração, mas maior fluorescência de fundo foi observada em amostras com concentrações mais elevadas de urina (Figura 3E).

Para permitir a multiplexação com leituras de cores diferentes de fluorescência, 80 nM de sondas displaceable vertente foram rotulados com diferente fluorophores (FAM para Zika, HEX para Chikungunya e TAMRA para Dengue 1), mas acompanhado o quencher mesmo (Iowa preto-FQ) com uma concentração de 200 nM. Células extraídas por meio de cultura virais RNAs (pfu 2,85 para Zika, 242 cópias de RNA virais para Chikungunya e pfu 1.22 para Dengue 1) foram usados como alvos, diluídos em urina de 10%. Análise em tempo real dos dados de fluorescência mostrou um atraso na geração do sinal (cerca de 10 min) para ensaios de 3-plexed, onde os primers para todos os destinos estavam presentes. Em casos de singleplex, por outro lado, a reação foi concluída no prazo de 10-15 min (Figura 4A-C). Quando a fluorescência foi visualizada usando um LED azul e filtro laranja, na força do sinal foram observadas diferenças para diferente fluorophores, onde FAM-rotulado amplicons foram mais visíveis. Isso é esperado, desde a excitação a 470 nm é mais próximo ao máximo do espectro de excitação FAM (Figura 4).

Para habilitar a visualização de todas as três cores com um único comprimento de onda de excitação de LED (470 nm), as concentrações de sondas displaceable foram aumentadas para 300 nM e a quencher complementares da sonda a 400 nM. Em casos de singleplex, geração de sinal foi concluída dentro de 10 min para Zika, 20 min para Chikungunya e 40 min para 1 de Dengue. Em ensaios de plexed-3, no entanto, ele foi ainda mais adiado por 20 min em todos os ensaios (Figura 5A- C). No entanto, sacrifício a tempo de geração de sinal habilitado a visualização de todas as três cores usando luz de LED azul com filtro laranja. Fluorescência verde é observada por Zika usando sondas extremidade 5'-rotulada com FAM, luz verde-amarelo fluorescência é atribuída a Chikungunya onde a sonda é extremidade 5'-rotulada com HEX, e fluorescência laranja-vermelho é usada para Dengue 1, onde sua sonda é extremidade 5'-rotulada com TAMRA (Figura 5).

Para testar amostras de mosquito com possível infecção Zika, laboratório infectados por Ae. aegypti fêmeas mosquitos (tabela 2) foram esmagados em um retângulo do papel-Q, seguido de um tratamento de amônia para esterilizar o vírus e vincular o exposto viral RNA em carga positiva Q-papel. O papel foi brevemente lavado com etanol para remover Pterina compostos presentes em carcaças de mosquito que podem interferir com a leitura de fluorescência33,34. Q-papéis contendo os mosquitos foram submersos em seguida diretamente na mistura RT-lâmpada e após a incubação a 65 ° C por 30 min, fluorescência verde brilhante foi observada na presença de vírus Zika (Figura 6).

Para entregar o kit de deteção sem uma cadeia de refrigeração e para fazer o ensaio fácil de usar, RT-lâmpada reagentes foram liofilizados e acompanhados por um buffer de reidratação e levou uma caixa de observação 3D-impresso que usa uma emissão de 470 nm e um filtro laranja (Figura 7a). 9 usando volumes de tampão de reidratação e 1 volume de amostra de urina, fluorescência verde visível pode ser gerada dentro de 30 min e a imagem pode ser capturada por qualquer câmera de telefone celular (Figura 7B). Alternativamente, amostras de mosquito na Q-papel podem ser usadas pelo mesmo ensaio, adicionando 1 volume de água em vez de amostra de urina.

Figure 1
Figura 1: projeto de ensaio da lâmpada (A) RT-lâmpada primers e formação de uma estrutura de haltere por um fio, deslocando a DNA polimerase. (B) introdução de sondas vertente-deslocando para permitir a leitura de multiplexação e fluorescência e monitorar o progresso de RT-lâmpada em tempo real. Reproduzido com permissão de Yaren et al . 201720. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: análise de eletroforese de amplicons do Gel. (A) primeiras demão de lâmpada de teste em singleplex ou multiplex (3-plex) formato com adequados controles positivos e negativos. Positivo de controles incluem purificado RNA viral com os seguintes títulos: 2.85 pfu para Zika (ZV), 242 cópias genômicas para Chikungunya (CH) e pfu 1.22 para Dengue 1 (D1). NTC-z, NTC-c e NTC-d tolerar nenhum controle de modelo para as primeiras demão Zika, Chikungunya e Dengue 1 no formato singleplex, respectivamente. NSC defende controle de destino específico onde total xNA (DNA e RNA) é extraído da infecção-livre Ae. aegypti. M significa marcador (escada de DNA de 50 pares de base). (B) otimização de ensaio condições testando uma temperaturas de incubação intervalo de RT-lâmpada (de 55 ° C a 70 ° C) e alvo de MgSO4 concentrações (a partir de 4 mM a 10 mM) no multiplex formato na ausência de RNA. Reproduzido com permissão de Yaren et al . 201720. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: RT-lâmpada em tempo real. (A) Singleplex e multiplexada limite de detecção (LOD) para Zika (ZV) usando 80 sonda nM FAM-rotulado vertente-deslocando em tempo real usando instrumento PCR em tempo real (canal 483-533 nm). As amostras foram incubadas a 65° C por cerca de 50 min. fluorescência (B) observou-se que um filtro laranja seguido a excitação das amostras a 470 nm, com luz azul. Amostras da foram utilizadas para visualização. (C) análise em tempo real para LOD no alvo de Chikungunya (CH) usando 80 nM HEX-rolamento lâmpada sondas em formato de singleplex, usando o canal de fluorescência de 523-568 nm num instrumento de PCR em tempo real. (D) análise em tempo real para LOD Dengue 1 (D1) alvos usando 80 nM de lâmpada TAMRA-rolamento sondas em formato de singleplex, usando o canal de fluorescência de 558-610 nm num instrumento de PCR em tempo real. (E) determinação do teor de urina máxima na reação de RT-lâmpada. Uma gama de concentrações de urina final (0%-50%) foram testados usando 80 sonda FAM-rotulado nM na presença de 2.85 pfu de vRNA.NTC Zika não = nenhum modelo de controle em todos os painéis. Reproduzido com permissão de Yaren et al . 201720. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Singleplex e multiplex de detecção de vírus na urina usando sonda de nM 80. (A) deteção Zika na urina de 10% no formato singleplex e multiplex usando 2.85 pfu de RNA viral Zika (ZV) com sonda FAM-rotulado (80 nM). (B) deteção de Chikungunya na urina de 10% no formato singleplex e multiplex usando 242 cópias de RNA viral de Chikungunya (CH) com sonda HEX-rotulado (80 nM). (C) deteção de Dengue 1 na urina de 10% no formato singleplex e multiplex usando pfu 1.22 do RNA viral de Dengue 1 (D1) com sonda TAMRA-rotulado (80 nM). (D) reações de visualização de RT-lâmpada através de filtro laranja após excitação a 470 nm, com luz de LED azul. Reproduzido com permissão de Yaren et al . 201720. NTC não = nenhum modelo de controle em todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Singleplex e multiplex de detecção de vírus na urina usando sonda de 300 nM. (A) deteção Zika na urina de 10% no formato singleplex e multiplex usando 2.85 pfu de RNA viral Zika (ZV) com sonda FAM-rotulado (300 nM). (B) deteção de Chikungunya na urina de 10% no formato singleplex e multiplex usando 242 cópias de RNA viral de Chikungunya (CH) com sonda HEX-rotulado (300 nM). (C) deteção de Dengue 1 na urina de 10% no formato singleplex e multiplex usando 1.22 pfu de Dengue1 do RNA viral (D1) com sonda TAMRA-rotulado (300 nM). (D) reações de visualização de RT-lâmpada através de filtro laranja após excitação a 470 nm, com luz de LED azul. Como controle positivo em experimentos de urina, uma cartilha de lâmpada definida como alvo humano DNA mitocondrial (mtDNA) foi usada com sonda TET-rotulado (300 nM). NTC não = nenhum modelo de controle em todos os painéis. Reproduzido com permissão de Yaren et al . 201720. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Fluxo de trabalho para a deteção de Zika de amostras de mosquito infectado utilizando a tecnologia Q-papel com saudáveis e infectados Zika Ae. aegypti (ZV 9, tabela 2). Reproduzido com permissão de Yaren et al . 201720. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: caixa observando. (A) a observar caixa utiliza duas pilhas AAA na base. Estas baterias energia quatro luzes azuis de LED que iluminam as amostras realizadas em tubos de 0,5 mL colocados nos quatro buracos. As luzes LED estão ativadas com um interruptor. As amostras são visualizadas através do filtro laranja. Fluorescência (B) na caixa da observação. Da esquerda para a direita: negativo, positivo para Zika, negativo e positivo para Zika. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vírus de alvo Nome Sequência (5' - 3') Comprimento Posição inicial Posição final
Zika ZV-F3 GAGACTGCTTGCCTAG 16 9905 9920
ZV-B3 CTGGGGTCTTGTCTTC 16 10145 10130
ZV-SE CAGTTGGAACCCAGTCAAC 19 10028 10010
ZV-LB GTGGAACAGAGTGTGGATTG 20 10093 10112
ZV-FIP CCATGGATTGACCAGGTAGTTTTTTCGACTGATGGCCAATG 41 9974 10053
ZV-BIP ACCACTGARGACATGCTTGTTTTTCATGTGGTCGTTYTCC 40 10070 10129
ZV-LB_NatTail FAM-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
GTGGAACAGAGTGTGGATTG		 60 10093 10112
Chikungunya CH-F3 CGTCAACGTACTCCTAAC 18 2891 2908
CH-B3 ACGTTGGCTTTRTTTTGG 18 3094 3077
CH-SE AGCGTCTTTATCCACGGG 18 2968 2951
CH-LB AYGCATCRATAATGGCGGG 19 3025 3043
CH-FIP GAAGTTTCCTTTCGGTGGGTTTTTGGAAGACACTYTCYGG 40 2932 2993
CH-BIP AAGGAGTGGGAGGTGGATTTTTTCAYTTGGTGACTGCAG 39 3006 3063
CH-LF_NatTail HEX-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
AGCGTCTTTATCCACGGG		 58 2968 2951
Dengue-1 D1-F3 ACAGCYCTGAATGAYATGG 19 9583 9601
D1-B3 GCAGTTTCTCTCAGGC 16 9803 9788
D1-SE CACTTGYTGCCARTCATTCC 20 9666 9647
D1-LB CCATGCCGYAACCAAG 16 9727 9742
D1-FIP CTGGTGGAARTGGTGTGATTTTTTGGGAACCTTCAAAAGG 40 9628 9693
D1-BIP GAAGGAYGGGAGGGAAATAGTTTTTTTAGCCCTRCCCA
CAAG		 42 9702 9763
D1-LB_NatTail TAMRA-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
CCATGCCGYAACCAAG		 56 9727 9742
DNA mitocondrial DNA mitocondrial-F3 AGCCTACGTTTTCACAC 17 9183 9199
DNA mitocondrial-B3 GCGCCATCATTGGTAT 16 9410 9395
DNA mitocondrial-LB GCCTAGCCATGTGATTTCAC 20 9322 9341
DNA mitocondrial-se GGCATGTGATTGGTGGGT 18 9254 habitantes 9237
DNA mitocondrial-FIP GTCATGGGCTGGGTTTTACTTTTTCTACCTGCACGACAAC 40 9213 9228
DNA mitocondrial-BIP CTCAGCCCTCCTAATGACCTTTTTGAGCGTTATGGAGTGG 40 9359 9344
DNA mitocondrial-LB_NatTail TET-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
GCCTAGCCATGTGATTTCAC		 60 9322 9341
Quencher comum CTGACCTGACGGACTGAACGGATGGCTGAGCGCA
AACCCG-Iowa FQ preto		 40

Tabela 1: Primers e vertente sondas displaceable. Reproduzido com permissão de Yaren et al . 201720. Sequências em negrito representam a região de dupla-hélice de strand deslocando sondas. FAM-rotulado (visto como fluorescência verde), HEX-rotulado (visto como luz fluorescência verde-amarelo), TAMRA-rotulado (visto como fluorescência laranja-vermelho) e TET-rotulado (visto como fluorescência amarela) sondas foram designadas para detectar Zika, Chikungunya, Dengue 1, e DNA mitocondrial na urina, respectivamente. FAM tem maxima de excitação e emissão de 495 nm e 520 nm, respectivamente. HEX tem maxima de excitação e emissão em 538 nm e 555 nm, respectivamente. TAMRA tem maxima de excitação e emissão em 559 nm e 583 nm, respectivamente. TET tem os máximos da excitação e emissão em 522 nm e 539 nm, respectivamente. Para habilitar o uso de um quencher único para todos os fluorophores, Iowa preto-FQ foi utilizado devido a sua gama ampla de absorção (420-620 nm).

Vírus, estirpe (GenBank número de adesão) Família/gênero Títulos virais
Zika vírus (ZV), Puerto Rico (PRVABC59, KU501215.1) Flaviviridae/Flavivirus grupo IV, positivo, ssRNA 2.85 x 108 pfu/mL
Vírus Chikungunya (CH), das Ilhas Virgens Britânicas (estirpe asiática, KJ451624) Por Togaviridae/Alphavirus grupo IV, positivo, ssRNA 2,42 x 108 genomas/mL
Vírus Chikungunya (CH), La Reunion (linhagem do Oceano Índico, LR2006-OPY1, KT449801) Por Togaviridae/Alphavirus grupo IV, positivo, ssRNA 1.89 x 108 genomas/mL
Vírus Chikungunya (CH), extraído de La Reunion at total de Aedes aegypti fêmea (linhagem do Oceano Índico, LR2006-OPY1, KT449801) Por Togaviridae/Alphavirus grupo IV, positivo, ssRNA 3,85 x 105 genomas/mL
Sorotipo da dengue 1 (D-1), Key West (FL) (JQ675358) Flaviviridae/Flavivirus grupo IV, positivo, ssRNA 1,22 x 106 pfu/mL
Identidade de Mosquito Zika (ZV), tensão Título de perna pfu/mL
ZV 9, Puerto Rico 4,76 x 103

Tabela 2: concentração Viral em culturas celulares e mosquito infectado. Pfu: unidade de deformação. Reproduzido com permissão de Yaren et al . 201720.

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Discussion

Vírus transmitidas por mosquitos, incluindo Zika, chikungunya e dengue ameaçam a saúde pública e destaque de surtos recente Zika a necessidade de alternativas de baixo custo deteção de point-of-care para diagnóstico do paciente, bem como para vigilância de mosquito. Métodos de amplificação isotérmica foram desenvolvidos como alternativas acessíveis para sistemas baseados em PCR. Particularmente, RT-lâmpada-based plataformas foram aplicadas para detectar uma grande variedade de agentes patogénicos. No entanto, o uso de plataformas isotérmicos tem sido limitado principalmente à detecção de alvo único. O método relatado aqui usa uma RT-lâmpada modificada para permitir a detecção simultânea de três destinos diferentes em uma mistura única de reação, que é executado em um intervalo de temperaturas moderadas (65-68 ° C), provado para ser especialmente conveniente porque temperaturas superiores 60 ° C processar Zika e outros vírus não-infecciosa30,35.

Além disso, os dados apresentados aqui mostram que RT-lâmpada é capaz de tolerar a inibição de substâncias que podem estar presentes em vários fluidos biológicos15. Isso permite que o RNA viral a ser amplificada sem uma etapa extra de purificação de RNA adicionando diretamente a amostra na mistura de reação. Dependendo do tipo de amostra, o volume máximo de amostra permitiu precisa ser determinada quanto não inibe a reação e não causar a fluorescência de fundo (falsos positivos). O estudo apresentado aqui centra-se sobre a utilização do volume final de 10% para as amostras de urina. No entanto, as amostras de saliva e soro também podem ser aplicadas para o ensaio no mesma forma20. Limites de detecção foram encontrados para ser bem acima as cargas virais relatadas em paciente urina13, bem como os mosquitos infectados por vírus20,36,37.

Vigilância de mosquito geralmente tem uma prioridade mais baixa para os recursos de saúde pública, então um barato multiplexado kit para levantamento de um agregado familiar ou uma área pública teria valor especial. Portanto, este kit foi modificado pela adição de Q-papel para permitir a detecção de vírus no mosquito carcaças. Q-papel contém altos níveis de grupos ligados covalentemente quaternário de amônio, que permite a captura de viral de ácidos nucleicos em sua superfície através de interações de coulombic. Apesar de ser uma preocupação que Q-papel pode inibir o RT-lâmpada, verificou-se que adicionando carregando carcaças de mosquito Q-papel diretamente na mistura de RT-lâmpada, detecção de vírus bem sucedido poderia ser alcançada dentro de 30 min. Para geração de sinal de sucesso, Q-papel precisa ser pequeno o suficiente (por exemplo, tamanho 3 x 4 mm para volume de reação de 100 µ l) ao ser submerso na mistura de reação de RT-lâmpada. Se for muito grande para o tubo de reação, ou começa a flutuar em vez de restantes imerso no líquido, a reação não pode ter lugar e os resultados podem aparecer como falso-negativos.

Para a detecção de sucesso e diferenciação de cada vírus, cada primer conjunto precisa seguir as diretrizes para o projeto da primeira demão de RT-lâmpada, as regras de design para deslocar sondas e incluem uma escolha de fluorophores para multiplexação. Cada primer conjunto precisa ser protegidos contra alvos diferentes para evitar reactividade cruzada. Além disso, a temperatura de incubação e a concentração de magnésio precisa ser otimizado para cada conjunto. Métodos apresentados aqui usam leituras de fluorescência visíveis a olho nu, que foi realizada através da introdução de sondas displaceable vertente para arquitetura RT-lâmpada. Três cores distintas podem ser visualizadas em um ensaio multiplexado quando diferentes fluorophores foram designados para cada vírus de alvo. Isto fornece vantagens sobre métodos de detecção isotérmicos existentes Zika, desde que a maioria dos métodos publicados depende de detecção de alvos único e a utilização de corantes intercalante ou fluorescência, que não são específicas e são propensos a gerar amplicons específico.

Um passo fundamental a considerar é a determinação da concentração final de sondas uma substituição fluorescente etiquetadas. Verificou-se que 80 a 100 nM de deslocando sondas poderia gerar sinais de fluorescência dentro de 15-20 min, Considerando que o tempo para sinalizar foi adiado quando 300 nM de concentração de sonda foi usado. Tempo de reação atrasou-se ainda mais quando os ensaios foram executados de forma multiplexada. A razão para mudar de 80 nM a 300 nM era permitir a visualização de todos os três fluorophores usando uma única fonte de LED. Blue LED com excitação a 470 nm é adequado para sondas FAM-rotulados, mas é menos adequado para sondas HEX - ou TAMRA-rotulados. Portanto, um sacrifício era feito no tempo de incubação para ser capaz de Visualizar todos os três alvos.

Um dos problemas com RT-lâmpada é contaminação para a frente. RT-lâmpada gera grandes quantidades de amplicons em um tempo de incubação curto, e amplicons poderia facilmente ser lançado como aerossóis. Para atenuar esse problema, dUTP foi incluída junto com outros dNTPs seguido por digestão UDG durante a configuração do ensaio. É importante que utilize uma versão de calor-labile do UDG, é necessário inativar UDG para evitar a digestão dos amplicons de RT-lâmpada recém-gerado.

Para permitir a distribuição do kit sem refrigeração, todos os componentes do ensaio precisavam ser liofilizado e o kit suplementado com um buffer de reidratação. Portanto, qualquer presente em enzimas comercialmente disponíveis de glicerol foi removido por ultrafiltração, porque o glicerol não pode ser removido por liofilização. Em uma concentração elevada em uma mistura, glicerol pode interferir com a atividade da enzima. A única enzima não incluída no processo de remoção de glicerol foi o UDG termolábil. UDG é uma pequena enzima com peso molecular de 24,6 kDa, tornando-o inadequado para experimentos de ultrafiltração. Portanto, ele foi adicionado à mistura de liofilização como adquirido. O glicerol residual não afectou negativamente o resultado do ensaio.

Uma das limitações desta técnica de RT-lâmpada fluorescente é o uso da única fonte de LED. Quando os ensaios foram executados no formato multiplex ou singleplex, concentrações mais altas de deslocando sondas foram necessárias para visualização do sinal de todos os alvos. No entanto, esta mudança provoca atrasos na geração de tempo-para-sinal. Uma maneira de superar este poderia ser o uso de duas fontes de LED para melhor acomodar os outros fluorophores (HEX e TAMRA). Desta forma, menor concentração de sonda poderia ser usada para gerar um sinal com os tempos de incubação mais curtos.

Outra limitação que precisa de consideração está a julgar a cor de fluorescência pelo olho em um ambiente mal iluminado. É mais fácil se um único alvo está presente em um singleplex ou formato multiplex, desde que os iniciadores foram projetados para não interagir uns com os outros. O ensaio seria mais difícil de interpretar se múltiplos alvos estavam presentes em um tubo de ensaio único, como uma piscina de mosquitos ou um paciente com mais de uma infecção viral. Isso exigiria uma mudança de arquitetura de leitura, como um display digital, ao invés de julgar pelo olho.

Uma abordagem possível futura seria aumentar o nível de multiplexação, criando um painel maior de arbovírus transmitidas por mosquitos. Isto requer cuidado primer design para evitar interações primer-primer e pode exigir a utilização de análogos de modificado de ácidos nucleicos tais como self evitar sistemas de reconhecimento molecular (SAMRS) e artificialmente expandido o sistema de informação genética (AEGIS) para melhor acomodar o elevado nível de multiplexação38. Nesse sentido, a solução para leitura de sinal em um sistema multiplex maior seria usar um fluoróforo único para cada sonda uma substituição e atribuir uma sequência única de deslocados para cada destino e capturar as sondas deslocadas em uma superfície sólida por DNA hibridização. Isto criaria uma plataforma matriz formatada com um fluoróforo único e LED para excitar, mas julgando a presença de cada destino seria baseado em sua posição na matriz39.

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Disclosures

Vários dos autores e suas instituições possuem propriedade intelectual associada com este ensaio.

Acknowledgments

O trabalho foi financiado em parte por 1R21AI128188-01 FDOH-7ZK15 e NIAID. Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada em parte pelos institutos nacionais de alergia e doenças infecciosas e em parte pelo biomédico pesquisa programa de Florida Department of Health. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do NIH ou Florida Department of Health. LLC de química combinatória dinâmico é reconhecido por seu apoio e contribuição para este projeto.

Vírus dengue 1 (estirpe BOL-KW010) foi gentilmente fornecida pela Florida departamento de saúde Secretariado dos laboratórios. Vírus Zika e estirpe asiática do vírus chikungunya foram graciosamente fornecidos pelos centros de controle e prevenção de doenças. A Oceano Índico a linhagem do vírus chikungunya foi gentilmente cedida por Robert Tesh (centro de referência mundial para vírus emergentes e arbovírus, através da Universidade do Texas Medical Branch em Galveston, Texas) para o UF-FMEL. Agradecemos a S. Bellamy, B. Eiko, S. Ortiz, D. Velez, K. Wiggins, r. ZimLer e Zirbel K. para obter assistência com os estudos de infecção. Agradecemos também o M. S. Kim para fornecer Q-papel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS Major Science MBE-150 Gel electrophoresis
G:BOX F3 Syngene G:BOX F3 Gel imaging
LightCycler 480 Instrument II, 96-well Roche Applied Science 05 015 278 001 Real-time PCR
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane Millipore Sigma UFC501096 ultrafiltraton membrane for dialysis
Eppendorf 5417C Centrifuge Marshall Scientific EP-5417C centrifuge
Myblock Mini Drybath Benchmark Scientific BSH200 drybath
FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System Labconco 7934020 lyophilizer
all priers and probes IDT custom RT-LAMP primers and probes
dNTP set Bioline BIO-39049
Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) Promega U1191
Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase New England Biolabs M0538L enzyme
WarmStart RTx Reverse Transcriptase New England Biolabs M0380L enzyme
RNase Inhibitor, Murine New England Biolabs M0314L enzyme
Antarctic Thermolabile UDG New England Biolabs M0372L enzyme
50bp DNA Step Ladder Promega G4521 marker
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Roche Applied Science 4729692001 real-time RT-LAMP analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Multiplexado amplificação isotérmica com base em plataforma de diagnóstica para detectar Dengue 1, Chikungunya e Zika
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Yaren, O., Alto, B. W., Bradley, K. M., Moussatche, P., Glushakova, L., Benner, S. A. Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1. J. Vis. Exp. (133), e57051, doi:10.3791/57051 (2018).

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