Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Мультиплексированных изотермической амплификация на основе диагностики платформы для обнаружения Зика, чикунгуньи и денге 1

Published: March 13, 2018 doi: 10.3791/57051
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 1,3
1Foundation for Applied Molecular Evolution (FfAME), 2Florida Medical Entomology Laboratory, University of Florida, 3Firebird Biomolecular Sciences LLC

Summary

Текущий мультиплексированных диагностики для обнаружения Зика, чикунгуньи и денге вирусов требуется Комплекс пробоподготовки и дорогой аппаратуры и трудно для использования в условиях ограниченных ресурсов. Мы покажем диагностики, который использует изотермической амплификация с целевыми стренги переносные датчики для обнаружения и дифференцировать эти вирусы с высокой чувствительностью и специфичностью.

Abstract

Зика, денге и чикунгунья вирусы передаются комарами, вызывая заболевания с похожими симптомами пациента. Однако они имеют различные течению пациента к пациенту передачи потенциалы и требуют весьма различные лечения пациентов. Таким образом недавние вспышки Зика делают настоятельно необходимым разрабатывать инструменты, которые быстро дискриминацию этих вирусов в больных и ловушку комаров, чтобы выбрать правильное лечение пациентов и чтобы понять и управлять их эпидемиологии в режиме реального времени.

К сожалению, текущие диагностические тесты, включая те принимающей 2016 чрезвычайной использовать разрешения и фаст трек статус, выявления вирусной РНК обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая требует инструментария, обучение пользователей, и значительные пробоподготовки. Таким образом они должны быть отправлены в «утвержденных» эталонных лабораторий, требует времени. Действительно, в августе 2016, центр по контролю за заболеваниями (CDC) спрашивал беременных женщин которые были укусил комар и разработал Зика показывая сыпь ждать неприемлемым 2 до 4 недель до обучения, ли они были инфицированы. Нам очень нужны тесты, которые можно сделать на сайте, с мало ресурсов и подготовленных, но не обязательно лицензированным персоналом.

Это видео демонстрирует assay который удовлетворяет эти спецификации, работа с мочой или сыворотки (для пациентов) или щебень комаров туши (для экологического наблюдения), все без много пробоподготовки. Комаров тушки фиксируются на бумаге, перевозящих четвертичных аммониевых групп (Q-бумага) следуют аммиака лечения для управления биологической опасности. Эти затем непосредственно, без изоляции РНК, помещаются в Пробирной пробирки, содержащие лиофилизированной реагенты, которые нужно не цепи охлаждения. Изменение формы обратной транскрипции цикла опосредованной изотермической амплификация с целевой объект специфического дневно тегами переносные датчики производит индикация, в 30 мин, как сигнал трехцветной флуоресценции. Это визуализируется с КПК, аккумуляторный устройство с фильтром оранжевый. Форвард загрязнение предотвращается с герметичных труб и использование термолабильных урацила ДНК glycosylase (ПХГ) в присутствии dUTP в смеси амплификации.

Introduction

Москиты вирусных инфекций, включая денге и чикунгунья Зика вирусы находятся на стратегии немедленного управления ростом и спросом. Денге и чикунгунья вирусы уже являются эндемичными во многих тропических регионах, где Зика сейчас распространяется в Западном полушарии1. Зика вирус, как лихорадка денге, является членом семейства Flaviviridae и родной Африке с одной азиатской и два африканских генетических линий2. Даже несмотря на то, что выявление вируса Зика восходит к 1947, Зика инфекции в организме человека оставалась спорадические за полвека до возникающих в Тихоокеанском регионе и в Америке. Первая вспышка сообщил Зика, лихорадка произошло на острове Яп Федеративных Штатов Микронезии в 2007 году, затем Французской Полинезии в 2013 и 2014. Первая крупная вспышка в Америке произошло в 2015 году в Бразилии.

Зика, чикунгуньи и денге вирусы передаются главным образом Aedes aegypti и Aedes albopictus. Однако Зика имеет возможности дополнительных течению передачи от человека, скорее всего распространяются через половой контакт, мать плод взаимодействия и через кормление грудью3,4,5. Зика лихорадка была впервые считается, вызывают только легкую форму заболевания. Однако, позже он стал связанных с синдром Гийена-Барре в взрослых, микроцефалия в новорожденных и хронических заболеваний опорно-двигательного аппарата, которые могут последних месяцев до лет. Диагноз болезни Зика может быть сложным, так как симптомы инфекции Зика, аналогичны другим комаров распространение вирусов6. Общие коинфекций этих вирусов сделать дифференциальный диагноз, даже более сложной,7,8. Таким образом быстрое и надежное обнаружение нуклеиновых кислот от Зика и других вирусов необходима для понимания эпидемиологии в режиме реального времени, начать контроля и превентивных мер, а также управлять ухода за пациентами9.

Текущий диагностические тесты для этих вирусов включают серологических тестов, изоляции вируса, вирус последовательности и реверс транскрипция ПЦР (RT-PCR). Стандартные серологические подходы часто страдают от недостаточной чувствительности и результатов может быть осложнено перекрестной реактивности у больных, которые ранее были заражены другими flaviviruses.

Таким образом тестирование нуклеиновой кислоты остается наиболее надежным способом обнаруживать и различать эти вирусы. Обнаружение Зика и других вирусов, переносимых комарами обычно выполняется с помощью ПЦР- или RT-ПЦР в реальном времени в различных биологических жидкостях, например сыворотки крови, мочи, слюны, Семен, грудное молоко и мозговой жидкости10,11. Пробы мочи и слюны предпочтительней как правило крови, так как они обладают менее ПЦР ингибирование, высоких вирусных нагрузок, присутствие вирусов на более длительные периоды времени и увеличение облегчения сбора и обработки12,13. Диагностические тесты, основанные на RT-PCR, однако, включают действия по подготовке обширной выборки и дорогих термического Велоспорт оборудования, что делает его менее оптимальных для точки обслуживания.

Обратная транскрипция, петля опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа) стала мощной альтернативой RT-PCR из-за его высокой чувствительности и специфичности14, его терпимость ингибирующих веществ в биологических образцов15, и операция на одной температуры, что значительно снижает пробирного сложность и связанные с этим расходы, что делает его пригодным для ограниченных ресурсов сред. RT-лампа, классически реализованное состоит из шести грунты, которые связывают с восьми различных регионов в рамках целевого РНК. Он запускается при постоянной температуре от 60 ° C до 70 ° C и использует обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы с сильным нити, вытесняя деятельности.

На начальных этапах RT-лампа вперед и назад внутренней грунтовки (МФП и BIP, рис. 1A) наряду с внешней вперед и назад грунтовки (F3 и B3) образуют структуру Гантель, семя структура экспоненциального Усилительная лампа. Результаты в формировании concatemers с несколькими повторяющимися циклы16, и усиления далее ускорить цикл вперед и назад грунтовки (LF и LB), которые предназначены для связывания одного мель регионах Гантель. Классическая LAMP assays зависимости мутности или индикации ДНК, интеркалирующие красители не совсем подходит для обслуживания точки обнаружения Зика, где некоторый уровень мультиплексирования является желаемой17,18,19. Мультиплексирование не получается легко в этих системах, поскольку они склонны к генерации ложных срабатываний из-за уточнениями пробить.

Чтобы управлять этими вопросами, литературе добавляет дополнительный компонент в виде «Стрэнд вытесняя зонд» классическая RT-лампа архитектуры20,21,22. Каждый датчик имеет последовательность специфичных двухручьевой региона и региона одноцепочечной грунтовки. Зонд с регионом одноцепочечной маркирован с 5'-Флюорофор, и дополнительных зондов изменяется с 3'-конце утоления. В отсутствие целевого объекта не флуоресценции наблюдается за счет гибридизации взаимодополняющих зонд нитей, который приносит Флюорофор и утоления в непосредственной близости. При наличии цели одноцепочечной части флуоресцентного зонда связывается с его дополнением на цель и затем продлен на прядь, вытесняя полимеразы. Дальнейшее расширение полимеразы на обратный грунтовки причины разъединения утоления прядь от его взаимодополняющих дневно обозначенные strand, позволяя выбросов флуоресценцииРисунок 1B) (). С этой конструкции сигнал генерируется после формирования Гантель, уменьшая шансы ложных сигналов.

Double-stranded часть зонд прядь вытесняя может быть любой последовательностью, и когда применяется мультиплексирование, та же последовательность может использоваться с различными Флюорофор утоления парами. С этой архитектуры, загрязненных вирусом мочи, сыворотки или комаров образцы сплющенным на бумаге непосредственно были введены в assay без предварительной подготовки образца. Трехцветная флуоресценции read-outs видна человеческому глазу были получены в течение 30-45 мин, и сигналы были визуализированное окно 3D-печати наблюдения, которое использует синий светодиод и оранжевый фильтр. Паром для лиофильной сушки реагенты RT-лампа включена развертывания этого комплекта для снижения параметров ресурсов без необходимости охлаждения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Комаров были единственные животные, которые непосредственно используются в настоящем исследовании. Процедуры по управлению кур, чья кровь была использована кормить инфицированных комаров, были одобрены как протокол IACUC #201507682 университета Флориды институционального ухода за животными и использование Committee.Virus распространения и комаров инфекции исследования были выполняется на объекте BSL-3 Флорида медицинская лаборатория энтомологии в Веро-Бич, FL. RT-лампа эксперименты были проведены в лаборатории BSL-2, совместно FfAME и Firebird биомолекулярных наук ООО в Алачуа, Флорида.

1. дизайн праймеров и Strand вытесняя зонды

  1. Извлечь вирусный последовательности для денге 1 из Института широкой базы данных23; последовательности для Зика и чикунгунья NIAID патогенный вирус базы данных и анализ ресурсов24.
    1. Создание множественных выравниваний последовательности (СУУ) для последовательностей интерес с помощью программного обеспечения мышц v3.8.3125. Использовать сгенерированный СУУ для поиска лампа грунтовки наборы сохраненных региона цели и избежать не соответствующим или непредвиденных целей, таких как различия между подтипы целевого объекта.
  2. Следовать правилам дизайн для грунтовки лампа как описано онлайн (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/) и разрешить использование смешанных баз в грунтовки для покрытия вирус расхождение26. Чтобы избежать перекрестной реактивности грунтовка наборов, Сравните созданные лампа грунтовки базу данных NCBI РНК вируса, с помощью NCBI взрыва27. Сравните каждый набор для устранения грунты, которые будут dimerize в мультиплексированном assay, а также используя NCBI взрыва.
  3. Экран double-stranded часть зонд прядь вытесняя против любого вирусного генома и комаров геномные последовательности. Измените 5'-концы целевого объекта привязки зонда с флуоресцеин amidite (FAM), краситель HEX и 5-carboxytetramethylrhodamine (ТАМРА) краситель для Зика, чикунгуньи и денге 1, соответственно.
    1. Включать положительный контроль грунтовка для мочи. Дизайн лампы грунтовки целевой митохондриальной ДНК человека. Этикетка зонд прядь вытесняя с TET на 5'-конце. Зонды утоления метки, которые частично дополняют каждому дневно помечены зонд с утоления (например, Айова черно-FQ) на 3'-конце (Таблица 1).

2. вирус изолирует и инфицированных комаров образцов

  1. Использование изолирует Зика вирус (Пуэрто-Рико штамм), вирус чикунгуньи (штамм La Réunion или Британские Виргинские острова) и вирус денге серотип-1 (Ки-Уэст штамм). Определите вирусную титры с помощью налета пробирного28 или количественной ПЦР-29. Экстракт вирусной РНК, использование коммерчески доступных РНК добыча комплекты.
    Примечание: Таблица 2 представляет вирусная титры каждого изолят вируса, используемые в данном исследовании.
  2. Последующие статьи, опубликованной Yaren et al. для подробного протокола о заражении А.е. aegypti самок с Зика и чикунгунья вирусов20. Для вирусный титр образца комаров, инфицированных вирусом Зика см. таблицу 2 .

3. Наряду с термолабильных урацила ДНК Glycosylase RT-лампа

  1. 10 x приготовления раствора грунт.
    1. Подготовить раствор 100 мкм каждого праймера и зонд (см. шаг 1), добавив нуклеиназы свободной воды. Вихревой хорошо и хранить при температуре-20 ° C до использования.
    2. 10 X грунтовка смеси для каждой Зика, денге 1 или митохондриальной ДНК мишени, смесь 16 мкл МФП, 16 мкл BIP, 2 мкл F3, 2 мкл В3, 5 мкл LF, 2 мкл LB, 3 мкл LB-люминесцентные помечены зонд, 4 мкл утоления зонда и 50 мкл нуклеиназы свободной воды дать в общей сложности 100 мкл тома.
    3. Для 10 X грунтовка микс для чикунгунья, смешать 16 мкл МФП, 16 мкл BIP, 2 мкл F3, 2 мкл В3, 5 мкл LB, 2 мкл LF, 3 мкл LF-люминесцентные помечены зонд, 4 мкл утоления зонда и 50 мкл нуклеиназы свободной воды дать в общей сложности 100 мкл тома.
      Примечание: Зонд концентрация описанных выше использует 300 Нм окончательный флуоресцентного зонда и 400 Нм утоления зонда. Кроме того, использование 80 Нм дневно обозначенные зонд и 200 Нм ее утоления зонд для реального времени анализа.
  2. 5 мкл 10 X смеси праймера (для 3-plex, добавить 5 мкл каждого 10 X грунтовка микс), 5 мкл 10 X буфер изотермической амплификация (1 X буфер состав: 50 мм KCl, 10 мм (NH4)220 мм трис-HCl буфере рН 8,8, т4, 8 мм MgSO4 0.1% Tween-20, 1 мм DTT), 7 мкл dNTP смеси (10 мм dATP, дЦТФ и dGTP, 5 мм dTTP и dUTP), 16 единиц ДНК-полимераза, 15 единиц обратной транскриптазы, 80 единиц ингибитора рекомбинантных рибонуклеаза, 2 единицы термолабильных UDG, 1-2 мкл различное количество vi RAL РНК и воды, довести объем до 50 мкл в 0,25 мл ПЦР трубки (см. Таблицу материалы).
  3. Включите анализы отрицательного контроля на данном этапе, заменив вирусной РНК тома с водой. Проинкубируйте образцы между 65-68 ° C за 45 минут до 1 часа, а затем анализировать, выполнив 5 мкл каждого образца на 2,5% агарозном геле в 1 X TBE буфер, содержащий бромид ethidium (0,4 мкг/мл). Используйте 25 bp или 50 bp лестница ДНК как маркер на геле.
    Примечание: Добавление непромысловых конкретного шаблона является необязательным.
  4. Чтобы обнаружить присутствие патогенных РНК, проверьте каждого набора грунта и его нет шаблон управления, различной температуры и/или магния концентрации, так как каждый набор грунтовка RT-лампа была разработана для работы в различной температуры (65 ° C до 68 ° C) или магния концентрации (окончательный 6-10 мм). Подготовьте экспериментов при комнатной температуре.

4. RT-лампа с использованием вирусной РНК шипами мочи

  1. Теста RT-лампа грунтовки в различных окончательный концентрации мочи (0%, 10%, 20% и 50%) по 50 мкл объема общей реакции. Для 10% концентрации окончательной мочи добавьте 1 мкл вирусной РНК 5 мкл мочи. Для 20% концентрации окончательной мочи добавьте 1 мкл вирусной РНК в 10 мкл мочи. Для концентрации 50% окончательной мочи добавьте 1 мкл вирусной РНК в 25 мкл мочи.
  2. Для реального времени наблюдения за RT-лампа в 10% мочи, используйте инструмент ПЦР в реальном времени (см. Таблицу материалы) с различными Флюорофор фильтрами.
    1. Для чтения флуоресценции сигналы от FAM-меченых ампликонов для Зика, используйте фильтр от 483 до 533 Нм; для HEX-меченых ампликонов для чикунгунья, используйте фильтр от 523 до 568 Нм; для ТАМРА меченых ампликонов денге 1, используйте фильтр от 558 до 610 Нм; и для тет меченых ампликонов митохондриальной ДНК, используйте фильтр от 523 до 568 Нм.
      Примечание: FAM имеет возбуждения и выбросов Максима 495 нм и 520 Нм, соответственно. HEX имеет возбуждения и выбросов Максима 538 Нм и 555 Нм, соответственно. ТАМРА имеет возбуждения и выбросов Максима 559 Нм и 583 Нм, соответственно. Тэт имеет возбуждения и выбросов Максима 522 Нм и 539 Нм, соответственно.
  3. Использование 96-луночных пластины и уплотнение пластину с прозрачной пластиковой листа, затем Проинкубируйте образцы на 65-68 ° C 60-90 мин и записывать флюоресценция каждые 30 сек с использованием света cycler. Первоначально используйте 80 Нм дневно обозначенные зондов, а затем испытания 300 Нм дневно обозначенные зондов.
    1. Определите, что предел обнаружения для каждого целевого компьютера, добавляя серийно разбавленный вирусной РНК в окончательной мочи 10% концентрации.
      Примечание: Используйте реального времени RT-лампа для определения оптимальной температуры, концентрации магния, дневно обозначенные зонд концентрация и время реакции.
  4. Чтобы визуализировать флуоресценции, порожденных стренги переносные датчики на глаз, используйте голубой светодиодный источник света от света циклователь с возбуждением в 470 Нм (любое поле электрофореза геля с встроенным синий источник света будет работать, см. таблицу материалов) и записать образ с камерой мобильного телефона при комнатной температуре в темноте.
    Примечание: Использование 300 Нм дневно обозначенные зондов, когда требуется визуализация всех трех цветов от глаз, используя синий светодиод.

5. RT-лампа на обнаружение Зика инфицированных комаров с помощью Q-бумажной технологии

  1. Подготовьте четвертичного аммония изменение фильтра бумаги (Q-), согласно опубликованной ранее методы с незначительными изменениями30.
    1. Погружайте 1 g целлюлозы Бумага фильтровальная кругов (см. Таблицу материалы) диаметром 3,5 см в 50 мл 1,8% водного раствора NaOH 15 мин для активации.
    2. Собрать активированные бумаге круги путем вакуумной фильтрации и затем погрузить их в 40 мл водного раствора хлорида (2,3-epoxypropyl) триметиламмония (0,28 g) на ночь при комнатной температуре.
      Примечание: Держите массе хлористого триметиламмония (2,3-epoxypropyl) фильтр-бумаги на 0.28 до 1.
    3. Собирать результате Катионный бумаги, вакуумной фильтрации и нейтрализовать с 50 мл 1% уксусной кислоты.
    4. Вымойте бумаги три раза с этанолом и просушите под капотом с постоянным потоком воздуха.
  2. Вырежьте Q-бумажные листы в небольшие прямоугольники (3 x 4 мм) с использованием бумаги удар или ножницы. Раздавить А.е. aegypti женского комаров, потенциально инфицированных Зика на каждом бумаге с микро пестиком.
  3. Добавить каждой бумаги 20 мкл раствора 1 М Водный аммиак (≈ 12 рН) и подождать 5 мин. Затем промывайте каждый документ раз с 20 мкл 50% EtOH и один раз с 20 мкл воды, свободной от нуклеиназы. Воздушно-сухой бумаги в области биобезопасности BSL-2 кабинета для около 1 ч.
    Примечание: В этой точке, образцы могут храниться при температуре-20 ° C ночь до использования.
  4. С помощью пинцета, каждый документ в 100 мкл реакционной смеси RT-лампа и Инкубируйте на 65-68 ° C на 45 мин убедитесь, что полностью погрузите бумаги в решении; она не должна плавающей. Чтение и запись флуоресценции, вытекающих из Зика вирус, используя синий светодиодный источник света и оранжевый или желтый фильтр.

6. лиофилизация реагентов RT-лампа для 100 мкл реакции тома

  1. Подготовка 10 X лампа грунтовка смеси согласно разделу 3.1 и подготовить dNTP смесь, содержащую dUTP согласно статье 3.2. Хранить смесь грунт и дНТФ при-20 ° C до использования.
  2. Подготовка 10 мл фермента диализа буфера для удаления глицерина, смешивая 100 мкл 1 М трис-HCl рН 7,5, 500 мкл 1 м KCl, 2 мкл 0,5 М ЭДТА, 100 мкл 10% Тритон X-100, 100 мкл 0,1 М DTT и 9.198 мл воды, свободной от нуклеиназы. Магазин в буфер диализа при 4 ° C.
    Примечание: Убедитесь, что фильтр (фильтры 0,2 микрон) всех буферных растворов реагентов до использовать и хранить их на 4 ° C.
    1. Используйте ультрафильтрационные мембраны с 10 кДа пороговое предельное (см. Таблицу материалы). Место 350 мкл буфера диализа, 4 мкл 32 единиц ДНК-полимеразы, 2 мкл 30 единиц обратной транскриптазы и 2 мкл 80 единиц АБС битор РНКазы ультрафильтрационные мембраны и центрифуги в 14.000 x g 5 мин при 4 ° C.
    2. Добавьте еще 350 мкл буфера диализа ультрафильтрационные мембраны и центрифуги (14.000 x g) для еще 5 мин пустой коллекции трубки и повторите этот шаг, затем центрифуги (14.000 x g) 3 мин.
    3. Для элюции инвертировать мембраны и место в новой коллекции трубки. Спина на 1000 x g на 2 мин мера элюции тома; Если меньше, чем 8 мкл, доводят объем до 8 мкл, добавив диализа буфера. Хранить элюции при температуре 4 ° C и сразу же переходите к следующему шагу.
      Примечание: Этот протокол для однотрубных лиофилизации, но подготовить по крайней мере 10 реакции трубы одновременно с помощью же ультрафильтрационные мембраны и использовать то же количество диализа буфера.
  3. Смешайте 10 мкл 10 X лампа грунт, если singleplex (для 3-plex, добавить 10 мкл каждого 10 X грунтовка микс), 14 мкл dNTP смеси, 8 мкл dialyzed фермента смеси, 2 мкл 2 единиц термолабильных UDG и 66 мкл нуклеиназы свободной воды (для 3-plex Используйте 46 мкл) в пробки microcentrifuge 0,5 мл и оставьте крышку открытым. Вместо этого добавьте другой крышкой прокола иглой, чтобы позволить паров бежать.
  4. Немедленно заморозить трубы на-80 ° C 2 h и lyophilize трубки для 4 ч. Обложка лиофилизации камеры с алюминиевой фольги для защиты от света. Когда сушеные реагентов, удалите прокалываться крышки, закройте крышку оригинальный и хранить трубы с лиофилизованным реагентов при температуре 4 ° C в темноте.
    Примечание: Реагентов может быть лиофилизованный препарат на ночь, при необходимости.

7. Тестирование лиофилизированный RT-лампа реагентов на мочу и комаров образцы, содержащие Зика

  1. Используйте следующие элементы из комплекта (см. Таблицу материалов) для Зика: окно наблюдения 3D-печати с оранжевый фильтр (длинный пас, вырезать на ~ 540 Нм), 2 батареи AAA для наблюдения за окно, лиофилизированный реакции трубки помечены ZV для обнаружения Зика, и 1.1 X регидратации буфера в завинчивающейся крышкой 1,5 мл пробирок.
  2. Подготовка 50 мл 1.1 X регидратации буфера путем смешивания 5,5 мл 10 X буфер изотермической амплификация, который поставляется вместе с ДНК-полимеразы (см. Таблицу материалы), 3,3 мл 100 мм MgSO4, 110 мкл 0.5 м DTT и 41.09 мл воды, свободной от нуклеиназы. Перемешать, аликвота 1 мл этого раствора для 1.5 мл пробирок завинчивающейся крышкой и хранить при 4 ° C до использования.
  3. Мкл 90 1.1 X регидратации буфера к каждой пробке реакции (0,5 мл). Убедитесь, что жидкость заполняет в нижней части трубки, содержащую лиофилизированные реагентов (растворить их с смешивания путем встряхивания, затем кратко вращаться вниз (1000 x g)). 10 мкл мочи шипами с вирусной РНК в реакции труб (см. раздел 4.1 для подробной информации).
    1. Если тестирование комаров, добавить прямоугольник Q-бумаги Холдинг комаров туши (как подготовленные в шаги описаны в разделах, 5.2 и 5.3), наряду с 10 мкл очищенной воды вместо мочи.
      Примечание: в качестве альтернативы, 10 мкл образцов слюны или сыворотки вместо мочи. Если образцы имеют извлечения ДНК или РНК, 2-5 мкл пример в регидратированных смесь и в комплекте с свободной от нуклеиназы водой до 10 мкл объема окончательного образца.
  4. Закройте крышку трубки реакции. Поместите их в тепла блок/ванна (или инкубатор) предварительно установить на 65-68 ° C. Инкубируйте 30-45 мин, но не более чем 1 час. После инкубации извлеките трубку от жары. Чтобы предотвратить загрязнение будущих анализов, убедитесь, что эти трубы остаются закрытыми.
  5. Место труб реакции в поле наблюдения; температура упадет до температуры окружающей среды (предпочтительно 25 ° C). Включите переключатель на задней части поле наблюдения. Наблюдать за образец через оранжевый фильтр и захватить изображение на камеру мобильного телефона, которая проходит на расстоянии, где изображение заполняет 80% поле зрения.
    Примечание: Лучше визуализация достигается в средах с низкой света.
  6. После завершения визуализации, выключите выключатель. Храните герметичные трубы в темноте, предпочтительно с охлаждением, если позднее визуализации требуется.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Первоначально выступления каждого праймера RT-лампа (таблица 1) с его соответствующего вирусной РНК субстрата, а также негативный контроль были оценены электрофорезом геля. RT-лампа грунтовки были разработаны для целевого региона NS5 (РНК зависимой РНК-полимеразы) для Зика и денге 1 и nsP2 региона (структурно-белка P2) для чикунгунья. Шаблоны были всего РНК, извлеченные из вирусного запасов культивировали в африканских зеленых мартышек почек (Vero) клеток. В одном случае, Общая нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) было извлечено от чикунгуньи инфицированных женщин А.е. aegypti (таблица 2).

Рисунок 2A показывает, что некоторые представитель результаты с RT-лампа выполнена с этими образцами. В singleplex и случаях мультиплексированных (3-plexed) RT-лампа продукты появляются как лестница concatemers при запуске на геле агарозы. Отрицательный контроль образцов, содержащих воду, как образец дал только полосы для грунтовки, сами, в том числе неспецифический целевого элемента управления, где всего нуклеиновые кислоты извлечено от неинфицированных А.е. aegypti женский комара использовался как шаблон.

Чтобы найти оптимальные условия RT-лампа, были протестированы различные магния концентрации и температуры инкубации. Было установлено, что более высокие концентрации магния и более низких температурах может генерировать неспецифической ампликонами, рождая ложных срабатываний. Таким образом 8 мм магния и инкубации при температуре 65 ° C были использованы в всех экспериментов с этого момента (рис. 2B).

Электрофорез геля требует открытия трубки реакции, которые могут привести к загрязнению следующий набор экспериментов по ранее сгенерированный ампликонами, приводит к ложным положительным результатам. Чтобы предотвратить загрязнение вперед, dTTP был заменен равного соотношения dTTP и dUTP, так что dUTP будут включены в RT-лампа ампликонами. Это превращает возможного загрязнения ампликон в субстрат для урацил ДНК glycosylase (ПХГ) в ходе подготовки любых последующих RT-лампа реакции31,32. Когда используется термолабильных версии UDG, dU содержащих ампликонов можно переваривается при комнатной температуре как образцы RT-лампы установлены вверх, и UDG будет отключена во время изотермической амплификация. Кроме того реакция трубки может быть открыт для вниз по течению анализа, при необходимости. Помимо использования UDG пищеварение архитектуры, с использованием переносные датчики генерирует флуоресценции, которая может быть прочитана без необходимости открывать реакции трубки.

На рисунке 3A обеспечивает результат предел обнаружения (LOD) для Зика с использованием флуоресцентных зондов, ориентация Зика РНК. Последовательного растворения исследования показали, что, как низко как 1,42 pfu могут быть обнаружены в течение 30 мин в singleplex assay или 3-plexed assays. Когда образцы были далее разбавляют до 0,71 pfu, флуоресцентный сигнал наблюдалась после 40 мин для singleplex assay и после 50 мин для 3-plexed смеси. В дополнение к постоянной RT-лампа, флуоресценции был визуализирован после 35 мин через оранжевый фильтр, после того, как образцы были подвергнуты воздействию синий светодиодный свет с длиной волны возбуждения 470 Нм (рис. 3B). Аналогичным образом, пределы обнаружения были измерены в 37,8 копий и 1.22 pfu чикунгуньи и денге 1, соответственно (рис. 3 c-D).

Чтобы определить оптимальный моче концентрации, Зика вирусной РНК (2.85 ОРП) был добавлен в различной концентрации подлинной человеческой мочи (0%, 10%, 20% и 50%). Предположительно из-за его электролитов, RT-лампа сигнала было перенесено с 15 до 35 мин при 50% мочи был использован в assay. 10% мочи преисполнена решимости быть оптимальной из-за представления более низкая предпосылка. В отсутствие целей Зика без усиления наблюдалось в любой концентрации, но выше фона флуоресценции наблюдалось в образцах с большей концентрацией мочи (Рисунок 3E).

Чтобы разрешить мультиплексирование с read-outs различных флуоресценции цветов, 80 Нм стренги переносные датчики были помечены разными флуорофоров (FAM для Зика, HEX для чикунгуньи и ТАМРА денге 1), но сопровождается же утоления (Айова черно-FQ) с концентрацией 200 Нм. Клетки культуры извлечены вирусной РНК (2.85 ОРП для Зика, 242 вирусных копий РНК для чикунгуньи и 1.22 ОРП за денге 1) были использованы в качестве целевых объектов, разбавленной мочой 10%. Реальном времени анализ данных флуоресценции показал задержку в генерации сигнала (около 10 минут) для 3-plexed анализов, где присутствовали Праймеры для всех целей. С другой стороны, в singleplex случаях, реакция была завершена в течение 10-15 мин (рис. 4A-C). Когда флуоресценции был визуализирован с использованием синий светодиод и оранжевый фильтр, различия в силу сигнала были замечены для различных флуорофоров, где FAM-меченых ампликонов были наиболее видимым. Это как ожидается, с момента возбуждения в 470 Нм ближе к максимуму спектра возбуждения FAM (рис. 4 d).

Чтобы включить визуализацию всех трех цветов с одной длины волны возбуждения LED (470 Нм), концентрации переносные датчики были увеличены до 300 Нм и взаимодополняющих утоления зонд до 400 Нм. В singleplex случаях генерации сигнала была завершена в течение 10 мин для Зика, 20 мин для чикунгуньи и 40 мин для денге 1. В 3-plexed анализов, однако, он был вновь отложено по 20 мин в всех анализов ()Рисунок 5A- C). Тем не менее жертвы в время генерации сигнала включена визуализация всех трех цветов, используя синий светодиод с оранжевый фильтр. Зеленая Флуоресценция наблюдается на Зика, с использованием зондов 5'-конец, помечены FAM, свет, зелено желтые флуоресценции назначается чикунгунья где зонд является 5'-конец обозначено с HEX, и оранжево красной флуоресценцией используется для денге 1, где его зонд является 5'-конце помечены с ТАМРА (рис. 5 d).

Для тестирования образцы комаров с возможной инфекцией Зика, Лаборатория инфицированных А.е. aegypti женского комаров (таблица 2) были разгромлены на прямоугольник Q-бумаги, следуют аммиака лечения для стерилизации вирус и привязки подвергаются вирусный RNA на положительно заряженный Q-бумагу. Этот документ был кратко промывают этанол, чтобы удалить pterin соединений, присутствующих в туши комаров, которые могут помешать Индикация флуоресцирования33,34. Q-документы, содержащие комаров затем непосредственно были погружены в RT-лампа смеси и после инкубации при 65 ° C для 30 мин, яркие зеленые флуоресценции было отмечено присутствии Зика вирус (рис. 6).

Доставить обнаружения комплект без цепи охлаждения и сделать assay легко использовать, RT-лампа реагенты были лиофилизированные и сопровождается регидратации буфера и окно 3D-печати наблюдения, использующий 470 Нм испуская привели и оранжевый фильтр (Рисунок 7A). использование 9 томов регидратации буфера и 1 объем мочи, видимый зеленый флуоресценции могут быть созданы в течение 30 мин и изображение может быть захвачен любой сотовый телефон камеры (рис. 7B). Кроме того образцы комаров на Q-бумага может использоваться же assay, добавив 1 объем воды вместо мочи.

Figure 1
Рисунок 1: Assay дизайн лампы (A) RT-лампа грунты и формирования структуры гантели на прядь, вытесняя ДНК-полимеразы. (B) введение зондов, вытесняя нити позволяет мультиплексирование и флуоресценции индикации и RT-лампа следить в режиме реального времени. Перепечатано с разрешения Yaren et al. 201720. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: гель электрофореза анализе ампликонов. (A) тестирования лампа грунтовки в singleplex или Мультиплекс (3-plex) формат с надлежащей положительной и отрицательной контроля. Позитивные элементы управления включают очищенный вирусной РНК с следующих титры: 2.85 pfu Зика (ZV), 242 геномной копий Чикунгунья (CH), и 1,22 ОРП за денге 1 (D1). NTC-z, NTC-c и NTC-d постоять для Зика, чикунгуньи и денге 1 грунтовки в singleplex формате, нет шаблона элемента управления соответственно. НСК выступает за неспецифической целевого элемента управления, где всего xNA (ДНК и РНК) добывается из свободных инфекции А.е. aegypti. M стоит для маркера (50 пар ДНК лестница). (B) оптимизации анализа условий испытания температуры инкубации диапазон RT-лампа (от 55 ° C до 70 ° C) и MgSO,4 концентрации (от 4 мм до 10 мм) в мультиплекс формат в отсутствие целевых РНК. Перепечатано с разрешения Yaren et al. 201720. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: RT-лампа в режиме реального времени. (A) Singleplex и мультиплексных предел обнаружения (LOD) для Зика (ZV), используя 80 Нм FAM-меченых стренги вытесняя зонд в реальном времени с помощью реального времени PCR инструмент (канал 483-533 Нм). Образцы инкубировали при 65° C для около 50 мин флуоресценции (B) было отмечено, хотя фильтр оранжевый последовали возбуждения образцов 470 нм с синим светом. Образцы из A были использованы для визуализации. (C) анализ в реальном времени для Лод створ Чикунгунья (CH), используя 80 Нм HEX-подшипник лампа зонды в singleplex формате, с использованием канала флуоресценции 523-568 Нм на инструмент ПЦР в реальном времени. (D) анализ в реальном времени для Лод на цели денге 1 (D1), используя 80 Нм ТАМРА подшипник лампа зонды в singleplex формате, с использованием канала флуоресценции 558-610 Нм на инструмент ПЦР в реальном времени. (E) определение содержания максимальной мочи в реакции RT-лампа. Диапазон концентраций окончательной мочи (0%-50%) были протестированы с использованием 80 Нм FAM-меченых зонд присутствии 2,85 pfu Зика vRNA.NTC = нет элемента управления шаблона на всех панелях. Перепечатано с разрешения Yaren et al. 201720. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Singleplex и мультиплекс обнаружения вируса в моче с помощью зонда 80 Нм. (A) Зика обнаружения в моче 10% в singleplex и мультиплекс формате, с использованием 2,85 pfu Зика (ZV) вирусной РНК с FAM-меченых зонд (80 Нм). (B) обнаружения чикунгунья в моче 10% в формате singleplex и мультиплексирования с использованием 242 копий Чикунгунья (CH) вирусной РНК с HEX-меченых зонд (80 Нм). (C) обнаружения денге 1 в 10% мочи в singleplex и мультиплекс формате, с использованием 1.22 pfu денге 1 (D1) вирусной РНК с надписью ТАМРА зонд (80 Нм). (D) визуализация RT-лампа реакции через оранжевый фильтр после возбуждения в 470 нм с голубой Подсветкой. Перепечатано с разрешения Yaren et al. 201720. NTC = нет элемента управления шаблона на всех панелях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Singleplex и мультиплекс обнаружения вируса в моче с помощью 300 Нм зонда. (A) Зика обнаружения в моче 10% в singleplex и мультиплекс формате, с использованием 2,85 pfu Зика (ZV) вирусной РНК с FAM-меченых зонд (300 Нм). (B) обнаружения чикунгунья в моче 10% в формате singleplex и мультиплексирования с использованием 242 копий Чикунгунья (CH) вирусной РНК с HEX-меченых зонд (300 Нм). (C) обнаружения денге 1 в 10% мочи в формате singleplex и мультиплексирования с использованием 1.22 ОРП Dengue1 вирусной РНК (D1) с надписью ТАМРА зонд (300 Нм). (D) визуализация RT-лампа реакции через оранжевый фильтр после возбуждения в 470 нм с голубой Подсветкой. Как позитивный элемент управления в моче экспериментов, лампа грунт, набор ориентации человека митохондриальной ДНК (мтДНК) был использован с тет меченых зонд (300 Нм). NTC = нет элемента управления шаблона на всех панелях. Перепечатано с разрешения Yaren et al. 201720. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Рабочий процесс для обнаружения Зика проб инфицированных комаров с помощью Q-бумажной технологии с здоровых и пораженных Зика А.е. aegypti (ZV 9, таблица 2). Перепечатано с разрешения Yaren et al. 201720. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: поле наблюдения. (A) наблюдения поле использует две батареи типа AAA в базе. Эти батареи мощностью четыре голубой светодиод, которые освещают образцы, провел в 0.5 мл трубки помещены в четыре отверстия. Светодиодные огни включены с переключателем. Образцы визуализируются через оранжевый фильтр. (B) флуоресценции в окне наблюдения. Слева направо: отрицательные, положительные для Зика, негативные и позитивные для Зика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Целевом вируса Имя Последовательность (5' - 3') Длина Стартовая позиция Конечное положение
Зика ZV-F3 GAGACTGCTTGCCTAG 16 9905 9920
ZV-B3 CTGGGGTCTTGTCTTC 16 10145 10130
ZV-LF CAGTTGGAACCCAGTCAAC 19 10028 10010
ZV-LB GTGGAACAGAGTGTGGATTG 20 10093 10112
ZV-FIP CCATGGATTGACCAGGTAGTTTTTTCGACTGATGGCCAATG 41 9974 10053
ZV-BIP ACCACTGARGACATGCTTGTTTTTCATGTGGTCGTTYTCC 40 10070 10129
ZV-LB_NatTail FAM-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
GTGGAACAGAGTGTGGATTG		 60 10093 10112
Чикунгунья CH-F3 CGTCAACGTACTCCTAAC 18 2891 2908
CH-B3 ACGTTGGCTTTRTTTTGG 18 3094 3077
CH-LF AGCGTCTTTATCCACGGG 18 2968 2951
CH-LB AYGCATCRATAATGGCGGG 19 3025 3043
CH-FIP GAAGTTTCCTTTCGGTGGGTTTTTGGAAGACACTYTCYGG 40 2932 2993
CH-BIP AAGGAGTGGGAGGTGGATTTTTTCAYTTGGTGACTGCAG 39 3006 3063
CH-LF_NatTail HEX-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
AGCGTCTTTATCCACGGG		 58 2968 2951
Лихорадка денге-1 D1-F3 ACAGCYCTGAATGAYATGG 19 9583 9601
D1-B3 GCAGTTTCTCTCAGGC 16 9803 9788
D1-LF CACTTGYTGCCARTCATTCC 20 9666 9647
D1-LB CCATGCCGYAACCAAG 16 9727 9742
D1-FIP CTGGTGGAARTGGTGTGATTTTTTGGGAACCTTCAAAAGG 40 9628 9693
D1-BIP GAAGGAYGGGAGGGAAATAGTTTTTTTAGCCCTRCCCA
CAAG		 42 9702 9763
D1-LB_NatTail ТАМРА CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
CCATGCCGYAACCAAG		 56 9727 9742
Митохондриальная ДНК Митохондриальной ДНК F3 AGCCTACGTTTTCACAC 17 9183 9199
Митохондриальной ДНК B3 GCGCCATCATTGGTAT 16 9410 9395
Митохондриальной ДНК LB GCCTAGCCATGTGATTTCAC 20 9322 9341
Митохондриальной ДНК LF GGCATGTGATTGGTGGGT 18 9254 9237
Митохондриальной ДНК FIP GTCATGGGCTGGGTTTTACTTTTTCTACCTGCACGACAAC 40 9213 9228
Митохондриальной ДНК BIP CTCAGCCCTCCTAATGACCTTTTTGAGCGTTATGGAGTGG 40 9359 9344
Митохондриальной ДНК LB_NatTail ТЕТ CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
GCCTAGCCATGTGATTTCAC		 60 9322 9341
Общие утоления CTGACCTGACGGACTGAACGGATGGCTGAGCGCA
AACCCG-Айова черный FQ		 40

Таблица 1: Грунты и переносные датчики Стрэнд. Перепечатано с разрешения Yaren et al. 201720. Последовательности жирным шрифтом представляют регионе двунитевая стренги, вытесняя зондов. FAM-меченых (рассматривать как зеленой флуоресценцией), HEX-меченых (видел как свет Флуоресцирование зелено желтый), ТАМРА меченых (рассматривать как оранжево красной флуоресценцией) и тет меченых (рассматривать как желтый флуоресценции) датчики были назначены для обнаружения Зика, чикунгуньи и денге 1, и Митохондриальная ДНК в моче, соответственно. FAM имеет возбуждения и выбросов Максима на 495 нм и 520 Нм, соответственно. HEX имеет возбуждения и выбросов Максима на 538 Нм и 555 Нм, соответственно. ТАМРА имеет возбуждения и выбросов Максима на 559 Нм и 583 Нм, соответственно. Тэт имеет возбуждения и выбросов Максима в 522 Нм и 539 Нм, соответственно. Чтобы включить использование единого утоления для всех флуорофоров, Айова черно-FQ был использован из-за его поглощения широкий диапазон (420-620 Нм).

Вирус, штамм (GenBank присоединения номер) Семья/род Вирусные титры
Зика вирус (ZV), Пуэрто-Рико (PRVABC59, KU501215.1) Флавивирусы/Flavivirus группы IV, позитивные, ssRNA 2,85 x 108 ОРП/мл
Вирус чикунгуньи (CH), Британские Виргинские острова (Азиатские линии, KJ451624) Togaviridae/альфавирус группы IV, позитивные, ssRNA 2.42 x 108 геномов/мл
Вирус чикунгуньи (CH), отель La Reunion (Индийского океана линии, LR2006-OPY1, KT449801) Togaviridae/альфавирус группы IV, позитивные, ssRNA 1.89 x 108 геномов/мл
Вирус чикунгуньи (CH), отель La Reunion извлечены всего NA от Aedes aegypti женский (Индийского океана линии, LR2006-OPY1, KT449801) Togaviridae/альфавирус группы IV, позитивные, ssRNA 3,85 x 105 геномов/мл
Денге серотип 1 (D-1), Ки-Уэст (штат Флорида) (JQ675358) Флавивирусы/Flavivirus группы IV, позитивные, ssRNA 1.22 x 106 ОРП/мл
Зика (ZV) комаров личности, штамм Нога титр ОРП/мл
ZV 9, Пуэрто-Рико 4,76 x 103

Таблица 2: вирусный титры в клеточных культурах и инфицированных комаров. ОРП: металлическ формируя подразделение. Перепечатано с разрешения Yaren et al. 201720.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Москиты вирусов, включая Зика, чикунгуньи и денге угрожают общественного здравоохранения и недавние вспышки голы Зика потребность в лоу кост обслуживания точки обнаружения альтернатив для диагностики пациентов, а также для наблюдения комаров. Изотермическая амплификация методы были разработаны доступные альтернативы для систем на базе ПЦР. В частности RT-лампа-платформ были применены к обнаружить широкий спектр патогенных микроорганизмов. Однако использование изотермический платформ был главным образом ограничивается одной цели обнаружения. Метод сообщили здесь использует изменение RT-лампа позволяет одновременное обнаружение трех различных целей в одном реакция смеси, которая работает в диапазоне умеренных температур (65-68 ° C), оказалась особенно удобно потому что температура выше, чем 60 ° C оказывают Зика и другие вирусы неинфекционных30,35.

Кроме того данные, представленные здесь показывает, что RT-лампа способна терпимо, ингибирующих веществ, которые могут присутствовать в различных биологических жидкостях15. Это позволяет вирусной РНК быть усилена без дополнительный шаг РНК непосредственно добавив образец в реакционной смеси. В зависимости от образца максимальный объем выборки позволил должна определяться не ингибируют реакции и не вызывают фон флуоресцирования (ложный положительный). Представлено здесь исследование фокусируется на использование 10% окончательный объем мочи. Однако образцы слюны и сыворотки может также применяться к assay в том же порядке20. Пределы обнаружения оказались значительно выше о вирусной нагрузки в моче пациента13, а также вирусом комаров20,,3637.

Комаров наблюдения обычно имеет более низкий приоритет для ресурсов общественного здравоохранения, поэтому недорогой мультиплексированных комплект для обследования домашних хозяйств или общественной зоне будет иметь особое значение. Таким образом этот комплект был изменен путем добавления Q-бумаги, чтобы разрешить обнаружение вирусов в Москито туши. Q-документ содержит высокий уровень ковалентно прилагаемый четвертичных аммониевых групп, который позволяет захвата вирусных нуклеиновых кислот на поверхности через кулоновских взаимодействий. Несмотря на то, что это было проблемой, что Q-бумага может препятствовать RT-лампа, было установлено, что, добавляя Q-бумага, перевозящих комаров туши прямо в смесь RT-лампа, обнаружение успешного вирусов могут быть достигнуты в течение 30 мин. Для успешного сигнал поколения, Q-бумага должна быть небольшой достаточно (например, размером 3 x 4 мм для 100 мкл реакции тома) чтобы быть погружен в RT-лампа реакционной смеси. Если он слишком велик для реакции трубки, или начинается плавающей вместо остается погруженным в жидкость, реакция не может иметь место, и результаты могут появиться как ложные негативов.

Для успешного обнаружения и дифференциации каждого вируса каждый грунт набор необходимо следовать руководящим принципам для конструкции праймера RT-лампа, правила разработки для перемещения зонда и включают в себя выбор флуорофоров для мультиплексирования. Каждый грунт набор должен проверяться против различных целей, чтобы избежать перекрестной реактивности. Кроме того магния концентрации и инкубации температуры должны быть оптимизированы для каждого набора. Представленные здесь методы использовать отсчетов флуоресценции видимых глазом, который было достигнуто путем введения стренги переносные датчики для RT-лампа архитектуры. Три различных цветов могут быть визуализированы в мультиплексированном assay, когда различные флуорофоров были назначены в каждом целевом вируса. Это дает преимущества над методами обнаружения существующих изотермический Зика, поскольку большинство опубликованных методов полагаются на одну цель обнаружения и использования вставочный или флуоресцентной краски, которые не зависят от последовательности и склонны к генерации неспецифические ампликонами.

Важным шагом для рассмотрения является определение окончательного концентрации дневно обозначенные вытесняя зондов. Было установлено, что 80-100 Нм вытесняя зондов может генерировать сигналы флуоресценции в течение 15-20 мин, тогда как время сигнала было отложено когда 300 Нм концентрации зонд был использован. Время реакции было отложено дальнейшего выполнения анализов в мультиплексированном моды. Причина для перехода от 80 Нм до 300 Нм – дать визуализация всех трех флуорофоров, используя один светодиодный источник. Синий светодиод с возбуждением в 470 нм подходит для FAM-меченых зондов, но менее подходит для HEX или ТАМРА меченных зонды. Таким образом чтобы иметь возможность визуализировать все три цели на время инкубации было сделано жертву.

Одна из проблем с RT-лампа — вперед загрязнения. RT-лампа генерирует большое количество ампликон в короткий инкубационный период, и ампликонов может быть легко выпущен как аэрозоли. Чтобы смягчить эту проблему, dUTP был включен вместе с другими дНТФ следуют UDG пищеварение во время анализа настройки. Важно использовать тепло лабильного версию UDG, поскольку это необходимо для инактивации UDG для предотвращения переваривания созданный RT-лампа ампликонов.

Чтобы разрешить распространение комплекта без охлаждения, все компоненты анализа необходимо быть лиофилизированные и комплект дополняется с буфером регидратации. Таким образом любой глицерина в коммерчески доступных ферментов был снят ультрафильтрации, потому что глицерин нельзя удалить с помощью лиофилизации. В высокой концентрации в смеси глицерина могут конфликтовать с ферментативной активности. Единственный фермент, не включены в процесс удаления глицерин был термолабильных UDG. UDG — небольшой фермент с молекулярным весом 24,6 кДа, что делает его непригодным для ультрафильтрации экспериментов. Таким образом было добавлено в смесь лиофилизации как купил. Остаточные глицерин не негативно пробирного результат.

Один из недостатков этой флуоресцентные RT-лампа техники является использование одного источника LED. Когда анализы были запущены в singleplex или мультиплекс формат, более высокие концентрации вытесняя зонды были необходимы для визуализации сигнала всех целевых объектов. Однако это изменение вызывает задержки сигнала времени поколения. Один из возможных способов преодоления этой может быть использование двух Светодиодных источников для лучшего размещения других флуорофоров (HEX и ТАМРА). Таким образом, низкой концентрации зонд может использоваться для формирования сигнала с короче инкубационного раз.

Еще одно ограничение, которое требует рассмотрения судя флуоресценции цвет глаз в тускло освещенной среде. Это проще, если одну цель присутствует в формате singleplex или мультиплекс, поскольку грунтовки были призваны не взаимодействуют друг с другом. Assay будет труднее интерпретировать, если несколько целей были представлены в одном пробирного трубку, например пул комаров или у пациентов с более чем одной вирусной инфекции. Это потребует изменения считывания архитектуры, такие как цифровой дисплей, вместо того, чтобы судить на глаз.

Возможный будущий подход было бы увеличить уровень мультиплексирование, создавая большие группы арбовирусов комарами. Это требует тщательной грунтовка дизайн чтобы избежать грунт грунтовка взаимодействия и могут потребовать использование модифицированных нуклеиновых кислот аналогов как самостоятельной избегая молекулярного распознавания систем (SAMRS) и искусственно расширена система генетической информации (ЭГИДОЙ) лучше установить высокий уровень мультиплексирования38. Соответственно решение для считывания сигнала в системе высшего мультиплекс бы использовать один Флюорофор для каждого перемещения зонда и назначить уникальный перемещенных последовательность для каждого целевого компьютера и захватить перемещенных зонды на твердой поверхности, ДНК гибридизации. Это создаст платформу массив формате с одного Флюорофор и светодиодные для возбуждения, но судя присутствие каждой цели будет основываться на его позицию в массиве39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Несколько авторов и их институтов владеть интеллектуальной собственности, связанные с этот assay.

Acknowledgments

Работа частично поддержали FDOH-7ZK15 и NIAID 1R21AI128188-01. Исследования в этой публикации было поддержано в части национальных институтов аллергии и инфекционных заболеваний и в части биомедицинских исследований программы из Флорида Департамента здравоохранения. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения низ или Флорида Департамента здравоохранения. Динамический Комбинаториальная химия ООО признается за их поддержку и вклад в этот проект.

Вирус денге 1 (штамм Бол-KW010) был любезно представил Флорида Департамент здравоохранения бюро лабораторий. Зика вирус и азиатских lineage вирус чикунгуньи любезно предоставил центрами по контролю и профилактике заболеваний. Индийского океана lineage вирус чикунгуньи была любезно предоставленных Роберт Теш (Всемирный консультационный центр для новых вирусов и арбовирусов, через университет Техаса Медицинское отделение в Галвестон, штат Техас) для UF-FMEL. Мы благодарим S. Беллами, B. Истмонд, S. Ортис, D. Велес, K. Уиггинс, р. ZimLer и K. Zirbel за помощь с исследованиями инфекции. Мы также благодарим м. S. Ким за предоставление Q-бумаги.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS Major Science MBE-150 Gel electrophoresis
G:BOX F3 Syngene G:BOX F3 Gel imaging
LightCycler 480 Instrument II, 96-well Roche Applied Science 05 015 278 001 Real-time PCR
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane Millipore Sigma UFC501096 ultrafiltraton membrane for dialysis
Eppendorf 5417C Centrifuge Marshall Scientific EP-5417C centrifuge
Myblock Mini Drybath Benchmark Scientific BSH200 drybath
FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System Labconco 7934020 lyophilizer
all priers and probes IDT custom RT-LAMP primers and probes
dNTP set Bioline BIO-39049
Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) Promega U1191
Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase New England Biolabs M0538L enzyme
WarmStart RTx Reverse Transcriptase New England Biolabs M0380L enzyme
RNase Inhibitor, Murine New England Biolabs M0314L enzyme
Antarctic Thermolabile UDG New England Biolabs M0372L enzyme
50bp DNA Step Ladder Promega G4521 marker
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Roche Applied Science 4729692001 real-time RT-LAMP analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
  2. Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636 (2014).
  3. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
  4. Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clin Microbiol Rev. 29, (2016).
  5. Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
  6. Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
  7. Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
  8. Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
  9. Shukla, S., Hong, S. -Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685 (2016).
  10. Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295 (2016).
  11. Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
  12. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. Journal of Clinical Virology. 68, 53-55 (2015).
  13. Gourinat, A. C., O'Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M. Detection of zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 21, (2015).
  14. Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28, (2000).
  15. Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
  16. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
  17. Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
  18. Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
  19. Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
  20. Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
  21. Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
  22. Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
  23. Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
  24. Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
  25. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
  26. Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
  27. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
  29. Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
  30. Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
  31. Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
  32. Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605 (2016).
  33. Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
  34. Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
  35. Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
  36. Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22 (2010).
  37. Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226 (2015).
  38. Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
  39. Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , 62,381,759 (2016).

Tags

Биохимия выпуск 133 диагностика точка обслуживания мультиплексируются изотермической амплификация петля опосредованной изотермической амплификация Зика обнаружения флуоресценции считывания не извлечение RNA комаров наблюдения обнаружения вирусов
Мультиплексированных изотермической амплификация на основе диагностики платформы для обнаружения Зика, чикунгуньи и денге 1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yaren, O., Alto, B. W., Bradley, K.… More

Yaren, O., Alto, B. W., Bradley, K. M., Moussatche, P., Glushakova, L., Benner, S. A. Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1. J. Vis. Exp. (133), e57051, doi:10.3791/57051 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter