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Biochemistry

Gemultiplexten isothermen Verstärkung basiert Diagnoseplattform zu erkennen, Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1

Published: March 13, 2018 doi: 10.3791/57051
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 1,3
1Foundation for Applied Molecular Evolution (FfAME), 2Florida Medical Entomology Laboratory, University of Florida, 3Firebird Biomolecular Sciences LLC

Summary

Aktuellen Multiplex Diagnostik Zika, Chikungunya und Dengue-Viren erfordern komplexe Probenvorbereitung und teure Instrumentierung, und sind in geringen Ressourcen Umgebungen geeignet zu erkennen. Wir zeigen eine Diagnose, mit denen Isotherme Verstärkung mit zielgruppenspezifischer Strang verschieblich Sonden zu erkennen und diese Viren mit hoher Sensitivität und Spezifität zu unterscheiden.

Abstract

Zika, Dengue-Fieber und Chikungunya-Fieber-Viren werden durch Mücken, übertragen Krankheiten mit ähnlichen Symptomen der Patienten verursachen. Jedoch haben andere nachgeschaltete Patient zu Patient Übertragung Potentiale, und erfordern sehr unterschiedliche Patienten Behandlungen. So Zika Ausbrüchen machen es dringend notwendig, Werkzeuge zu entwickeln, die diese Viren bei Patienten schnell zu diskriminieren und Mücken, um die richtige Behandlung von Patienten, wählen und verstehen und verwalten ihre Epidemiologie in Echtzeit gefangen.

Leider aktuellen diagnostischen Tests, einschließlich die empfangende 2016 Notfall verwenden Berechtigungen und Fast-Track-Status, virale RNA durch reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), die Instrumentierung erfordert, geschulte Benutzer, zu erkennen und beträchtliche Probenvorbereitung. So müssen sie "genehmigt" Referenzlaboratorien, die Zeit gesendet werden. In der Tat im August 2016, das Center for Disease Control (CDC) fragte schwangere Frauen gewesen, die von einer Mücke gebissen und entwickelte einen Zika-Angabe Hautausschlag, eine inakzeptable 2 bis 4 Wochen vor dem Lernen zu warten, ob sie infiziert sind. Wir brauchen sehr viel Tests, die vor Ort, mit wenigen Mitteln und durch ausgebildete, aber nicht notwendigerweise lizenzierte Personal erfolgen können.

Dieses Video zeigt einen Test, der diese Spezifikationen, arbeiten mit Urin oder Serum (für Patienten) oder zerdrückten Mücken Kadaver (für Umweltüberwachung), alles ohne viel Vorbereitung der Probe. Mosquito Schlachtkörper werden auf Papier mit quaternären Ammonium Gruppen (Q-Papier) gefolgt von Ammoniak Behandlung um Biogefährdung verwalten erfasst. Diese sind dann direkt, ohne eine RNA-Isolierung, legen in Assay-Röhrchen mit gefriergetrockneten Reagenzien, die keine Kette der Kühlung benötigen. Eine modifizierte Form der reversen Transkription Schleife-vermittelten isothermen Verstärkung mit zielgruppenspezifischer Eindringmittel tagged verschieblich Sonden produziert auslesen, in 30 min, als eine dreifarbige Fluoreszenzsignal. Dies ist mit einem handheld, batteriebetriebenes Gerät mit einen Orangefilter visualisiert. Nach vorne Kontamination wird mit versiegelten Röhren und die Verwendung von thermolabilen Uracil DNA Glycosylase (UDG) in Anwesenheit von dUTP in der Verstärkung Mischung verhindert.

Introduction

Moskitos übertragene Virus-Infektionen, einschließlich Dengue-Fieber, Chikungunya und Zika Viren sind auf den Aufstieg und Nachfrage sofortige Managementstrategien. Dengue-Fieber und Chikungunya-Fieber-Viren sind bereits in vielen tropischen Regionen denen Zika jetzt in der westlichen Hemisphäre1verbreitet ist endemisch. Zika-Virus, wie Dengue-Fieber, ist ein Mitglied der Familie Flaviviridae und stammt aus Afrika mit einem asiatischen und zwei afrikanische genetische Linien2. Obwohl die Identifizierung des Virus Zika bis 1947 zurückgeht, blieb Zika-Infektion beim Menschen sporadisch für ein halbes Jahrhundert vor der Schwellenländer in den Pazifik und Amerika. Der erste gemeldete Ausbruch der Zika-Fieber auf der Insel Yap in den Föderierten Staaten von Mikronesien im Jahr 2007 trat gefolgt von Französisch-Polynesien in 2013 und 2014. Der erste große Ausbruch auf dem amerikanischen Kontinent ereignete sich im Jahr 2015 in Brasilien.

Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber-Viren sind in erster Linie von Aedes Aegypti und Aedes Albopictusübertragen. Zika hat jedoch zusätzliche nachgeschaltete Mensch-zu-Mensch-Übertragungsmöglichkeiten, wahrscheinlich, zu verbreiten, durch sexuellen Kontakt, Mutter-Fötus-Interaktion, und über3,4,5stillen. Zika Fieber glaubte zunächst nur milde Krankheit verursachen. Jedoch wurde es später im Zusammenhang mit Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen, Mikrozephalie bei Neugeborenen und chronischen Erkrankungen des Bewegungsapparates, die letzten Monate bis Jahre. Zika Erkrankung kann schwierig sein, da die Symptome einer Zika-Infektion ähnlich denen von anderen Mücke verbreitete Viren-6 sind. Allgemeine Coinfektion dieser Viren machen Differentialdiagnose noch schwieriger7,8. Daher braucht man schnelle und zuverlässige Detektion von Nukleinsäuren von Zika und andere Viren Epidemiologie in Echtzeit, um Kontrolle und vorbeugende Maßnahmen zu initiieren und Patientenversorgung9verwalten zu verstehen.

Aktuelle diagnostische Tests für diese Viren sind serologische Tests, die Virusisolierung, Virus-Sequenzierung und Reverse Transkription PCR (RT-PCR). Serologische Standardansätze leiden oft unzureichende Sensitivität und Ergebnisse können durch Kreuzreaktivität bei Patienten, die zuvor von anderen Flaviviren infiziert wurden, erschwert werden.

Daher bleibt die Nukleinsäure-Tests der zuverlässigste Weg zu erkennen und diese Viren zu unterscheiden. Erkennung von Zika und andere Moskitos übertragene Viren erfolgt in der Regel mittels RT-PCR oder Real-Time RT-PCR in unterschiedlichsten biologischen Flüssigkeiten, wie z. B. Serum, Urin, Speichel, Sperma, Muttermilch und zerebralen Fluid10,11. Urin und Speichel Proben werden über Blut, in der Regel bevorzugt, da sie zeigen weniger PCR-Hemmung, höheren Viruslast, Virus-Präsenz für längere Zeit und erhöhte Benutzerfreundlichkeit der Sammlung und Bearbeitung von12,13. RT-PCR-basierten diagnostischen Tests, umfassen jedoch umfangreiche Stichprobe Vorbereitungsschritte und teure thermische Rad-Ausrüstung, so dass es weniger optimal für den Point-of-Care.

Reversen Transkription Schleife-vermittelten isothermen Verstärkung (RT-Lampe) als eine leistungsfähige RT-PCR-Alternative aufgrund seiner hohen Sensitivität und Spezifität14 entstanden, seine Toleranz für hemmende Stoffe in biologischen Proben15, und Betrieb auf single-Temperatur deutlich senkt die Komplexität und die damit verbundenen Kosten, eignet sich für Umgebungen mit geringen Ressourcen assay. RT-Lampe, da sie klassisch umgesetzt wird, besteht aus sechs Primer, die an acht verschiedenen Regionen innerhalb der Ziel-RNA binden. Es läuft bei konstanten Temperaturen zwischen 60 ° C und 70 ° C, und verwendet eine Reverse Transkriptase und einer DNA-Polymerase mit starken Strang Aktivität verdrängen.

In der Anfangsphase des RT-Lampe bilden vorwärts und rückwärts interne Primer (FIP und BIP, Abb. 1A) zusammen mit äußeren vorwärts und rückwärts Primer (F3 und B3) eine Hantel Struktur, die Samen der exponentiellen Amplifikation der Lampe. Verstärkung wird weiter beschleunigt durch die Schleife vorwärts und rückwärts Primer (LF und LB), die entworfen sind, um die einzelnen gestrandeten Regionen der Hantel zu binden, und führt zur Bildung von Concatemers mit mehreren sich wiederholenden Schleifen16. Klassische Lampe Tests basierend auf Trübung oder Auslesen von DNA verschuppen Farbstoffe ist nicht ganz geeignet für Point-of-Care-Erkennung von Zika, wo gewisse multiplexing ist17,18,19gewünscht. Multiplex ist nicht leicht in diesen Systemen erhalten sind anfällig für Fehlalarme durch Ziel-Vergrößerungen erzeugen.

Um diese Probleme zu verwalten, hinzugefügt die Literatur der klassischen RT-Lampe Architektur20,21,22eine zusätzliche Komponente in Form einer "Strang verdrängen Sonde". Jede Sonde verfügt über eine Sequenz-spezifische Doppel-Strang-Region und eine einsträngige Priming-Region. Die Sonde mit der einzelsträngigen Region ist mit einer 5'-Fluorophor markiert, und die ergänzenden Sonde ist mit einem 3'-Ende Quencher modifiziert. In Ermangelung eines Ziels wird keine Fluoreszenz durch Hybridisierung der ergänzenden Sonde Stränge beobachtet bringt das Fluorophor und Durstlöscher in unmittelbarer Nähe. In Anwesenheit eines Ziels der einsträngige Teil der fluoreszierenden Sonde bindet mit seinem Komplement auf das Ziel und wird dann durch einen Strang verdrängen Polymerase verlängert. Polymerase-Erweiterung durch reverse Primer bewirkt, dass die Trennung des Teilprogramms Durstlöscher aus seine komplementäre Eindringmittel beschrifteten Strang, so dass Emission von FluoreszenzAbbildung 1 b() (). Mit diesem Design wird das Signal nach der Hantel-Bildung, wodurch die Chancen von falsch-positiven Signale generiert.

Die doppelsträngige Teil des Prüfpunkts Strang verdrängen kann beliebiger Reihenfolge, und wenn Multiplexen angewendet wird, die gleiche Reihenfolge verwendet werden, mit verschiedenen Fluorophor-Quencher Paaren. Mit dieser Architektur, Virus kontaminiert Urin, Serum oder Moskito wurden Proben zerquetscht auf Papier direkt an der Assay ohne Probenvorbereitung eingeführt. Dreifarben Fluoreszenz Auslesen für menschliche Auge sichtbar waren innerhalb von 30-45 min generiert und Signale wurden durch ein 3D-gedruckten Beobachtung-Feld, das eine blaue LED und einen Orangefilter verwendet visualisiert. Gefriertrocknung die RT-Lampe Reagenzien ermöglicht Bereitstellung dieses Kits Ressourceneinstellungen ohne Kühlung zu senken.

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Protocol

Hinweis: Moskitos waren die einzigen Tiere, die direkt in dieser Studie verwendet. Die Verfahren, die Hühner, zu verwalten, deren Blut verwendet wurde, um die infizierten Mücken ernähren, wurden als IACUC Protokoll #201507682 durch die Universität von Florida institutionelle Tierpflege und Nutzung Committee.Virus Ausbreitung genehmigt und Moskito-Infektion Studien waren durchgeführt an der BSL-3-Anlage des Florida Medical Entomology Laboratory in Vero Beach, erfolgten FL. RT-Lampe Experimente im BSL-2 Labor geteilt durch FfAME und Firebird biomolekulare Wissenschaften LLC im Alachua, FL.

1. Aufbau von Primern und Strang verdrängen Sonden

  1. Extrahieren Sie virale Sequenzen für Dengue-1 aus der Broad Institute Datenbank23; Sequenzen für Zika und Chikungunya-Fieber aus dem NIAID Virendatenbank Erreger und Analyse Ressource24.
    1. Erstellen Sie mehrere Ausrichtungen Sequenz (MSAs) für Sequenzen von Interesse, die mit Software Muskel v3.8.3125. Generierten MSAs Primer Leuchtensets innerhalb einer konservierten Region des Ziels suchen, und vermeiden irrelevante oder unbeabsichtigte Ziele wie Unterscheidungen zwischen den Subtypen eines Ziels.
  2. Folgen Sie die Design-Regeln für Lampe Primer als beschriebenen Online-(http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/), und ermöglichen Sie die Verwendung von gemischten Basen in Primer zur Deckung der Virus Divergenz26. Zur Vermeidung von Kreuzreaktivität Grundierung Sätze vergleichen Sie generierte Lampe Primer an die NCBI RNA-Virus-Datenbank mit BLAST NCBI27. Jeder Satz Zündkapseln zu beseitigen, die in einem Multiplex Assay Dimere würde mithilfe von NCBI BLAST sowie zu vergleichen.
  3. Bildschirm der Doppelstrang-Teil des Prüfpunkts Strang verdrängen gegen virale Genom-Sequenz und Moskito genomischen Sequenz. Ändern Sie 5'-Enden der Ziel Bindung Sonde mit Fluorescein Amidite (FAM), HEX-Farbstoff und 5-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) Farbstoff für Zika, Chikungunya und Dengue-1, bzw..
    1. Gehören Sie eine Positivkontrolle Grundierung für Urinproben festgelegt. Design Lampe Primer auf menschliche mitochondrische DNA abzielen. Label Strang verdrängen Sonde mit TET am 5'-Ende. Label Quencher Sonden, die Eindringmittel teilweise komplementär zueinander sind beschriftet Sonde mit Quencher (z. B.Iowa schwarz-FQ) am 3'-Ende (Tabelle 1).

(2) Virus isoliert und infizierten Mücke Proben

  1. Verwendung der Zika-Virus (Puerto-Rico-Stamm), Chikungunya-Virus (La Réunion oder British Virgin Islands-Stamm) und Dengue-Virus Serotyp-1 (Key West-Stamm) isoliert. Virale Titer mit Plaque-Assay28 oder quantitative RT-PCR29zu bestimmen. Viralen RNAs mit handelsüblichen RNA-Extraktion-Kits zu extrahieren.
    Hinweis: Tabelle 2 stellt die virale Titer von jedem Virus isolieren, die in dieser Studie verwendet.
  2. Folgen Sie den Artikel von Yaren Et Al. für ein detailliertes Protokoll über die Infektion von Ae. Aegypti Weibchen mit Zika und Chikungunya Viren20veröffentlicht. Siehe Tabelle 2 für die virale Titer der Moskito-Probe mit Zika-Virus infiziert.

(3) RT-Lampe gepaart mit thermolabilen Uracil DNA Glycosylase

  1. 10 x Grundierung Eismixherstellung.
    1. 100 µM-Stammlösung jede Grundierung vorzubereiten und Sonde (siehe Schritt 1) durch Zugabe von Nuklease kostenlos Wasser. Vortex gut und Speicher bei-20 ° C bis zur Verwendung.
    2. Für 10 X Primer-Mix für jeden Zika, Dengue-Fieber 1 oder mitochondriale DNA Ziel Mix 16 µL FIP, 16 µL BIP, beschriftet 2 µL F3, 2 µL B3, 5 µL LF, 2 µL LB, 3 µL LB-fluoreszierende Sonde, 4 µL Quencher Sonde , und 50 µL Nuklease-freies Wasser, insgesamt 100 µL Volumen zu geben.
    3. Für 10 X Primer-Mix für Chikungunya-Fieber, mix 16 µL der FIP, 16 µL BIP, 2 µL F3, 2 µL B3, 5 µL LB, LF 2 µL, beschriftet 3 µL von LF-fluoreszierend Sonde, 4 µL Quencher Sonde und 50 µL Nuklease-freies Wasser, insgesamt 100 µL Volumen zu geben.
      Hinweis: Die Sonde Konzentration beschriebenen Verwendungen 300 nM endgültige fluoreszierende Sonde und 400 nM Quencher Sonde. Alternativ Nutzung 80 nM Eindringmittel markierte Sonde und 200 nM seine Quencher-Sonde für die Echtzeit-Analyse.
  2. Fügen Sie 5 µL 10 X Grundierung Mix (3-Plex, fügen Sie 5 µL jedes 10 X Grundierung Mischung), 5 µL 10-fach Puffer isothermen Verstärkung (1 X Puffer Zusammensetzung: 20 mM Tris-HCl-Puffer pH 8,8, 50 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 8 mM MgSO4 0,1 % Tween-20, 1 mM DVB-t), 7 µL dNTP-Gemisch (10 mM dATP, dCTP, dGTP; 5 mM dTTP und dUTP), 16 Einheiten der DNA-Polymerase, 15 Einheiten von Reverse Transkriptase, 80 Einheiten des rekombinanten Ribonuklease-Inhibitor, 2 Einheiten von thermolabilen UDG, 1-2 µL unterschiedliche Mengen an vi RAL RNAs und Wasser bringen das Gesamtvolumen bis zu 50 µL in einem 0,25 mL PCR Rohr (siehe Tabelle der Materialien).
  3. Enthalten Sie Negativkontrolle Assays in diesem Stadium virale RNA Volumen durch Wasser ersetzen. Inkubieren Sie Proben zwischen 65-68 ° C für 45 min bis 1 h, dann analysieren Sie, indem Sie 5 µL jeder Probe auf 2,5 % Agarosegel auf 1 X TBE-Puffer mit Interkalation Bromid (0,4 µg/mL) ausgeführt. Verwenden Sie einen 25 bp oder 50 bp DNA-Leiter als Marker auf das Gel.
    Hinweis: Zusatz einer Nichtziel-spezifische Vorlage ist optional.
  4. Um das Vorhandensein von pathogenen RNA zu erkennen, testen Sie jede Grundierung-Gruppe und ihre keine-Template-Kontrolle durch Variation der Temperatur und/oder Magnesium-Konzentration, da jedes RT-Lampe-Grundierung-Set entwickelt wurde, um Arbeit in unterschiedlichen Temperaturen (65 ° C bis 68 ° C) oder magnesium Konzentrationen (letzte 6 bis 10 mM). Bereiten Sie die Experimente bei Raumtemperatur.

(4) RT-Lampe mit viralen RNA versetzt Urin

  1. RT-Lampe Primer in unterschiedlichen Endkonzentrationen von Urin (0 %, 10 %, 20 % und 50 %) in 50 µL der gesamte Reaktionsvolumen zu testen. Fügen Sie für 10 % final Urinkonzentration 1 µL der viralen RNA 5 µL des Urins hinzu. Fügen Sie für 20 % final Urinkonzentration 1 µL der viralen RNA 10 µL des Urins hinzu. Fügen Sie für 50 % final Urinkonzentration 1 µL der viralen RNA 25 µL Urin hinzu.
  2. Zur Echtzeit-Überwachung von RT-Lampe in 10 % der Urin, verwenden Sie ein Real-Time PCR-Instrument (siehe Tabelle der Materialien) mit verschiedenen Fluorophor filtern.
    1. Fluoreszenz-Signale von FAM-markierten Amplifikate für Zika zu lesen, verwenden Sie einen Filter von 483 bis 533 nm; für HEX-markierten Amplifikate für Chikungunya-Fieber, verwenden Sie einen Filter von 523 bis 568 nm; für TAMRA-markierten Amplifikate für Dengue-1, verwenden Sie einen Filter von 558 bis 610 nm; und für TET-markierten Amplifikate für mitochondriale DNA, verwenden Sie einen Filter von 523 bis 568 nm.
      Hinweis: FAM hat Anregung und Emission Maxima von 495 nm und 520 nm, beziehungsweise. HEX ist Anregung und Emission Maxima 538 nm und 555 nm, beziehungsweise. TAMRA ist Anregung und Emission Maxima von 559 nm und 583 nm, beziehungsweise. TET hat Anregung und Emission Maxima von 522 nm und 539 nm, beziehungsweise.
  3. Verwendung 96-Well Platten und Dichtung der Platte mit einer klaren Plastikfolie, dann Proben bei 65-68 ° C 60-90 min inkubieren und notieren der Fluoreszenz alle 30 s mit der light Cycler. Verwenden Sie zunächst 80 nM Fluoreszent markierten Sonden und dann Test der 300 nM Fluoreszent markierten Sonden.
    1. Bestimmen Sie die Nachweisgrenze für jedes Ziel durch Zugabe von seriell virale RNA im endgültigen Urinkonzentration von 10 % verdünnt.
      Hinweis: Verwenden Sie Real-Time RT-Lampe, um optimale Temperatur, Magnesiumkonzentration, Eindringmittel markierte Sonde Konzentration und Reaktionszeit zu bestimmen.
  4. Um die Fluoreszenz erzeugt durch Strang verschieblich Sonden mit dem Auge sichtbar zu machen, verwenden Sie eine blaue LED-Lichtquelle aus einem leichten Cycler mit Erregung bei 470 nm (Gel-Elektrophorese-Box mit eingebauten blaue Lichtquelle arbeiten, siehe Tabelle der Materialien), und notieren Sie das Bild mit einer Handy-Kamera bei Raumtemperatur im Dunkeln.
    Hinweis: Verwendung 300 nM Fluoreszent markierten Sonden, wenn Visualisierung aller drei Farben vom Auge mit blauer LED benötigt wird.

(5) RT-Lampe auf Erkennung von Zika-infizierten Mücken mit Q-Papiertechnik

  1. Quartäre Ammonium-modifizierte Filterpapier (Q-Papier), nach zuvor veröffentlichten Methoden mit leichten Modifikationen30vorzubereiten.
    1. Tauchen Sie 1 g Zellulose Filterpapier Kreise (siehe Tabelle der Materialien) mit einem Durchmesser von 3,5 cm in 50 mL von 1,8 % des wässriger NaOH Lösung für 15 min für die Aktivierung.
    2. Sammeln Sie aktivierte Papier Kreise durch Vakuumfiltration und dann tauchen sie in 40 mL wässrige Lösung von (2,3-Epoxypropyl) Trimethylammonium Chlorid (0,28 g) über Nacht bei Raumtemperatur.
      Hinweis: Halten Sie das Massenverhältnis von (2,3-Epoxypropyl) Trimethylammonium-Chlorid auf Filterpapier auf 0,28 bis 1.
    3. Sammeln Sie die daraus resultierenden kationische Papier durch Vakuumfiltration, und mit 50 mL von 1 % Essigsäure neutralisieren.
    4. Das Papier dreimal mit Ethanol zu waschen und Trocknen unter eine Haube mit konstanter Luftstrom.
  2. Q-Papierbögen in kleine Rechtecke (3 x 4 mm) mit einem Schlag Papier oder Schere zu schneiden. Zerdrücken Sie Ae. Aegypti weibliche Stechmücken potenziell infizierte Zika auf jedem Papier mit einem Mikro Stößel.
  3. Jedes Papier 20 µL 1 M wässrigen Ammoniak-Lösung (pH ≈ 12) hinzufügen und 5 min warten. Dann waschen Sie jedes Papier einmal mit 20 µL 50 % EtOH und einmal mit 20 µL Nuklease-freies Wasser. Trocknen Sie das Papier in BSL-2 Biosafety Schrank für ca. 1 h an der Luft.
    Hinweis: An dieser Stelle können Proben bei-20 ° C über Nacht bis zum Gebrauch gespeichert werden.
  4. Mit einer Pinzette, jedes Papier in 100 µL RT-Lampe Reaktionsgemisch und 45 min. Stellen Sie sicher, vollständig das Papier in die Lösung tauchen bei 65-68 ° C inkubieren; Es sollte nicht zu schweben. Ablesen und Aufzeichnen der Fluoreszenz aus Zika-Virus mit blauen LED-Lichtquelle und orange oder gelb-Filter.

6. die Gefriertrocknung von RT-Lampe Reagenzien für 100 µL Reaktionsvolumen

  1. Bereiten Sie 10 X Lampe Grundierung Mischung gemäß Abschnitt 3.1 vor, und bereiten Sie dNTP-Gemisch mit dUTP gemäß Abschnitt 3.2. Primer-Mischung und dNTPs bei-20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
  2. Vorbereitung 10 mL der Enzym-Dialyse-Puffer, Glycerin, zu entfernen, durch das Mischen von 100 µL 1 M Tris-HCl pH 7.5, 500 µL 1 m KCl, 2 µL 0,5 M EDTA, 100 µL 10 % Triton x-100, 100 µL 0.1 M DTT und 9,198 mL Nuklease-freies Wasser. Speichern des Dialyse-Puffers bei 4 ° C.
    Hinweis: Achten Sie darauf, (0,2 µm-Filter) filtern alle Puffer Reagenzlösungen vor verwenden und bei 4 ° c lagern
    1. Verwenden Sie eine Ultrafiltration Membran mit 10 kDa-Grenzwert (siehe Tabelle der Materialien). Setzen Sie 350 µL Dialyse-Puffer, 4 µL 32 Einheiten der DNA-Polymerase, 2 µL von 30 Einheiten der reversen Transkriptase und 2 µL von 80 Einheiten der RNase-Inhibitor Ultrafiltration Membran und Zentrifuge bei 14.000 x g für 5 min bei 4 ° C.
    2. Eine weitere 350 µL Dialyse-Puffer auf die Ultrafiltration Membran und Zentrifuge (14.000 x g) für eine weitere 5 min. leer das Sammelröhrchen hinzufügen und wiederholen Sie diesen Schritt, dann (14.000 x g) für 3 min zentrifugieren.
    3. Zur Elution invertieren Sie die Membran und in eine neue Kollektion-Röhre. Mit 1.000 x g für 2 min. Maßnahme die Elution Lautstärke Drehen; Wenn weniger als 8 µL, das Volumen bis zu 8 µL bringen durch Zugabe von Dialyse-Puffer. Speichern der Elution bei 4 ° C, und sofort weiter zum nächsten Schritt.
      Hinweis: Dieses Protokoll ist für einzelne Rohr Lyophilisierung, aber mindestens 10 Reaktionsgefäßen zu einem Zeitpunkt mit der gleichen Ultrafiltration Membran vorbereiten und verwenden die gleiche Menge an Dialyse-Puffer.
  3. 10 µL 10 X Lampe Grundierung mischen, wenn Singleplex (3-Plex, fügen Sie 10 µL jedes 10 X Grundierung Mischung), 14 µL dNTP-Gemisch, 8 µL dialysierten Enzym-Mix und 2 µL 2 Einheiten von thermolabilen UDG 66 µL Nuklease Wasser (für 3-Plex frei Verwenden Sie 46 µL) 0,5 mL Microcentrifuge Schlauch und lassen den Deckel zu öffnen. Stattdessen fügen Sie ein weiteres Deckel punktiert mit einer Nadel zu Dampf entweichen zu lassen.
  4. Sofort Einfrieren der Rohre bei-80 ° C 2 h, und lyophilize dem Rohr für 4 Std. Abdeckung der Lyophilisation Kammer mit Alu-Folie zum Schutz vor Licht. Wenn Reagenzien getrocknet sind, entfernen Sie den durchlöcherten Deckel, schließen Sie original Deckel und speichern Sie die Rohre mit lyophilisierter Reagenzien bei 4 ° C im Dunkeln.
    Hinweis: Reagenzien können über Nacht, ggf. lyophilisiert werden.

7. testen lyophilisiert RT-Lampe Reagenzien auf Urin und Moskito-Proben mit Zika

  1. Verwenden Sie die folgenden Elemente aus dem Kit (siehe die Tabelle der Materialien) für Zika: eine 3D-gedruckten Beobachtung Box mit Orangefilter (langen Pass Filter, Schnitt auf ~ 540 nm), 2 AAA-Batterien für die Beobachtung im Feld lyophilisiert Reaktionsgefäßen ZV für Zika-Erkennung, beschriftet und 1.1 X Rehydratation Puffer in 1,5 mL Schraubverschluss Röhren.
  2. 50 mL von 1,1 X Rehydratation Puffer durch das Mischen von 5,5 mL 10 X isothermen Verstärkung Puffer, die zusammen mit DNA-Polymerase vorbereiten (siehe die Tabelle der Materialien), 3,3 mL 100 mm MgSO4, 110 µL 0,5 M DTT und 41,09 mL Nuklease-freies Wasser. Vermischen Sie, aliquoten 1 mL dieser Lösung auf 1,5 mL Schraubverschluss Rohre, und bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
  3. Jedes Reaktionsgefäß (0,5 mL) 90 µL 1,1 X Rehydratation Puffer hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit den Boden des Röhrchens mit lyophilisierten Reagenzien (lösen sie füllt mit dem Mischen durch Schütteln, dann kurz nach unten (1.000 x g) drehen). Fügen Sie 10 µL der Urinprobe gespickt mit viralen RNA in die Reaktionsgefäße (siehe Abschnitt 4.1).
    1. Wenn Mücken zu testen, fügen Sie ein Rechteck von Q-Papier hält Mücken Kadaver (wie in den Schritten beschriebene in Abschnitten 5.2 und 5.3 vorbereitet), zusammen mit 10 µL gereinigtes Wasser anstelle von Urinproben.
      Hinweis: Alternativ fügen Sie 10 µL der Speichel oder Serum Proben statt Urin hinzu. Wenn die Proben extrahierte DNA oder RNA sind, fügen Sie 2 bis 5 µL der Probe in eingeweichtes Mischung und komplett mit Nuklease-freies Wasser zu 10 µL des endgültigen Probenvolumen.
  4. Schließen Sie den Deckel von der Reaktionsgefäße. Legen Sie sie in eine Wärme Block/Bad (oder Inkubator) voreingestellt bei 65-68 ° C. Inkubieren Sie für 30-45 min, aber nicht mehr als 1 h. Nehmen Sie nach der Inkubation den Schlauch vom Herd. Um zukünftige Tests zu vermeiden, sicherstellen Sie, dass diese Rohre geschlossen bleiben.
  5. Legen Sie im Feld beobachten Reaktionsgefäßen; die Temperatur fällt auf die Umgebungstemperatur (vorzugsweise 25 ° C). Schalten Sie den Schalter auf der Rückseite des Feldes beobachten. Beobachten Sie Probe durch den orange Filter und erfassen Sie das Abbild von einer Handy-Kamera, die in einem Abstand gehalten wird, wo das Bild 80 % des Sichtfeldes füllt.
    Hinweis: Bessere Visualisierung wird bei geringen Lichtverhältnissen erzielt.
  6. Nach Abschluss der Visualisierung ausschalten. Speichern Sie die versiegelten Röhren in der Dunkelheit, vorzugsweise mit Kältetechnik, ggf. später Visualisierung.

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Representative Results

Zunächst wurden die Leistungen der einzelnen RT-Lampe Grundierung (Tabelle 1) mit ihren entsprechenden viralen RNA-Substrat sowie Negativkontrollen durch Gelelektrophorese bewertet. RT-Lampe Primer wurden entwickelt, um NS5 Zielregion (RNA-abhängige RNA-Polymerase) für Zika und Dengue-1 und nsP2 Region (nichttragenden Protein P2) für Chikungunya-Fieber. Vorlagen waren total RNA aus kultivierten virale Bestände in African Green Monkey Nierenzellen (Vero) extrahiert. In einem Fall wurde insgesamt Nukleinsäure (DNA und RNA) von einer Frau Chikungunya-Fieber infiziert extrahiert Ae. Aegypti (Tabelle 2).

Abbildung 2A zeigt, dass einige repräsentative Ergebnisse mit RT-Lampe mit diesen Proben durchgeführt. RT-Lampe Produkte scheinen in Singleplex und Multiplex (3-Plexed) Fällen als Leiter der Concatemers bei der Ausführung auf Agarosegel. Negativen Kontrollproben wasserhaltige als Probe nur die Bänder für Grundierungen selbst gab, einschließlich das unspezifische Zielsteuerelement wo total Nukleinsäure aus einer nicht infizierten Ae. Aegypti weibliche extrahiert Mücke als Vorlage diente.

Um optimale Bedingungen für RT-Lampe zu finden, wurden verschiedene Magnesium-Konzentrationen und Inkubation Temperaturen getestet. Es wurde festgestellt, dass höhere Konzentrationen von Magnesium und niedrigeren Temperaturen unspezifische Amplifikate, wodurch Fehlalarme generieren konnte. Daher wurden 8 mM Magnesium und Inkubation bei 65 ° C in allen Versuchen von da an (Abb. 2 b) verwendet.

Gelelektrophorese erfordert die Eröffnung das Reaktionsgefäß, das zur Kontamination von der nächsten Reihe von Experimenten von zuvor generierten Amplifikate, führt zu Fehlalarmen führen kann. Um die vorderen Kontamination zu verhindern, wurde dTTP von gleichen Verhältnissen von dTTP und dUTP, ersetzt, so dass dUTP in RT-Lampe Amplifikate einfließen würden. Dadurch wird die mögliche Kontamination Amplifikate in ein Substrat für Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) bei der Vorbereitung von jeder nachfolgenden RT-Lampe Reaktionen31,32. Wenn eine thermolabile UDG-Version verwendet wird, kann dU-haltigen Amplifikate bei Raumtemperatur verdaut werden, da die RT-Lampe-Proben aufgebaut sind und die UDG während der isothermen Verstärkung inaktiviert werden wird. Darüber hinaus kann das Reaktionsgefäß für eine nachgeschaltete Analyse geöffnet werden, wenn nötig. Neben dem Einsatz von UDG Verdauung erzeugt eine Architektur mit verschieblich Sonden Fluoreszenz, die ohne die Notwendigkeit, das Reaktionsgefäß öffnen gelesen werden kann.

Abbildung 3A liefert das Ergebnis der Nachweisgrenze (LOD) für Zika mit fluoreszierenden Sonden targeting Zika RNA. Serielle Verdünnung Studien zeigten, dass Tests, die so niedrig wie 1.42 Pfu innerhalb von 30 min in einen Singleplex-Assay oder ein 3-Plexed nachgewiesen werden konnte. Wenn Proben zu 0,71 Pfu weiter verdünnt wurden, wurde ein Fluoreszenzsignal nach 40 min für einen Singleplex-Assay und nach 50 min für 3-Plexed-Gemischen beobachtet. Neben Real-Time RT-Lampe, Fluoreszenz visualisiert wurde nach 35 min durch einen Orangefilter, nachdem Proben ausgesetzt waren, um blaue mit einer Erregung Wellenlänge von 470 LED nm (Abb. 3 b). In ähnlicher Weise Nachweisgrenzen wurden gemessen bei 37,8 Kopien und 1,22 Pfu für Chikungunya und Dengue-1 bzw. (Abbildung 3-D).

Um die optimale Urinkonzentration Zika virale RNA bestimmen (2,85 Pfu) wurde hinzugefügt, um unterschiedlichen Konzentrationen einer authentischen menschlichen Urin-Probe (0 %, 10 %, 20 % und 50 %). Vermutlich wurde wegen seiner Elektrolyte, das RT-Lampe Signal verzögert von 15 bis 35 min bei 50 % Urin im Test verwendet wurde. 10 % Urin war entschlossen, optimale aufgrund niedrigeren Hintergrund präsentiert werden. In Ermangelung der Zika-Ziele keine Verstärkung in jeder Konzentration beobachtet wurde, aber höhere Hintergrundfluoreszenz wurde in Proben mit höheren Urinkonzentration (Abbildung 3E) beobachtet.

Damit kann Multiplexen mit Auslesen von verschiedenen Fluoreszenz Farben, 80 nM Strang verschieblich Sonden mit verschiedenen Fluorophore (FAM für Zika, HEX für Chikungunya-Fieber und TAMRA für Dengue-1) gekennzeichnet waren, aber begleitet von der gleichen Quencher (Iowa schwarz-FQ) mit einer Konzentration von 200 nM. Zelle Kultur extrahiert viralen RNAs (2,85 Pfu für Zika, 242 virale RNA-Kopien für Chikungunya-Fieber und 1,22 Pfu für Dengue-1) dienten als Ziele, in 10 % Urin verdünnt. Echtzeit-Analyse der Fluoreszenz-Daten zeigten eine Verzögerung in Signalerzeugung (ca. 10 min) für 3-Plexed-Assays, wo Primer für alle Ziele vorhanden waren. In Singleplex Fällen auf der anderen Seite war die Reaktion innerhalb von 10-15 min (Abbildung 4A-C) abgeschlossen. Bei der Fluoreszenz visualisiert wurde durch eine blaue LED und Orangefilter, wurden Unterschiede in der Signalstärke für verschiedene Fluorophore, beobachtet wo FAM-markierten Amplifikate am deutlichsten sichtbar. Dies dürfte seit Erregung bei 470 nm liegt das Maximum der FAM Anregungsspektrums (Abbildung 4).

Ermöglichen die Visualisierung aller drei Farben mit einer einzigen LED Erregung Wellenlänge (470 nm), verschieblich Sonden wurden Konzentrationen bis 300 nM und die ergänzenden Quencher Sonde bis 400 nM. In Singleplex Fällen wurde Signalerzeugung innerhalb 10 min für Zika, 20 min für Chikungunya-Fieber und 40 min für Dengue-1 abgeschlossen. In 3-Plexed-Assays, jedoch weiter verzögert wurde von 20 min in alle Tests ()Abbildung 5A- C). Dennoch ermöglichte Opfer rechtzeitig zur Signalerzeugung die Visualisierung aller drei Farben mit blauem LED-Licht mit Orangefilter. Grüne Fluoreszenz wird für Zika Sonden 5'-Ende mit FAM, Licht, grün-gelbe Fluoreszenz, Chikungunya zugewiesen ist, wo die Sonde ist 5'-Ende mit HEX beschriftet, und Orange-rote Fluoreszenz dient für Dengue-1, wo die Sonde 5'-Ende mit der Bezeichnung ist, beschriftet mit beobachtet mit TAMRA (Abbildung 5).

Zu Testzwecken Moskito Proben mit möglichen Zika Infektion, Labor-infizierten Ae. Aegypti weibliche Mücken (Tabelle 2) wurden auf einem Rechteck von Q-Papier, gefolgt von Ammoniak-Behandlung, um das Virus zu sterilisieren und exponierten binden zerkleinert virale RNA auf positiv geladenen Q-Papier. Das Papier wurde kurz gewaschen, mit Ethanol, Pterin-Verbindungen, die in Mücke Kadaver zu entfernen die Fluoreszenz Anzeige33,34beeinträchtigen könnten. Q-Papiere mit Mücken dann direkt in der RT-Lampe-Mischung, und nach der Inkubation bei 65 ° C für 30 min überflutet waren, wurde in Anwesenheit von Zika-Virus (Abbildung 6) helle grüne Fluoreszenz beobachtet.

Die Detection Kit ohne eine Kette der Kühlung und den Test einfach um zu bedienen, RT-Lampe Reagenzien wurden lyophilisiert und begleitet von einer Rehydratation Puffer und ein 3D-gedruckten Beobachtung-Feld, das verwendet ein 470 nm emittieren geführt zu machen und einen Orangefilter (Abbildung liefern 7a). Verwendung von 9 Bände der Rehydratation Puffer und 1 Volumen der Urinprobe, sichtbare grüne Fluoreszenz kann innerhalb von 30 min erzeugt werden und das Bild kann von jedem Handy-Kamera (Abb. 7 b) erfasst werden. Alternativ können Moskito Proben auf Q-Papier durch den gleichen Test verwendet werden, durch Hinzufügen von 1 Volumen von Wasser anstelle von Urinprobe.

Figure 1
Abbildung 1: Lampendesign Assay (A) RT-Lampe Primern und Bildung einer Hantel-Struktur durch einen Strang DNA-Polymerase zu verdrängen. (B) Einführung der Strang verdrängen Sonden multiplexing und Fluoreszenz auslesen lassen und RT-Lampe Fortschritte in Echtzeit zu überwachen. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Yaren Et Al. 201720. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Gel-Elektrophorese Analyse der Amplifikate. (A) Prüfung Lampe Grundierungen in Singleplex oder Multiplex (3-Plex) formatieren Sie mit richtigen positive und negative Kontrollen. Positive Kontrollen umfassen gereinigten virale RNA mit folgenden Titer: 2,85 Pfu Zika (ZV), 242 genomische Kopien für Chikungunya-Fieber (CH) und 1.22 Pfu für Dengue-1 (D1). NTC-Z, NTC-c und NTC-d stehen bzw. für keine Vorlage-Steuerung für Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1 Primer im Singleplex-Format. NSC steht für unspezifische Zielsteuerelement wo total xNA (DNA und RNA) aus infektionsfreien Ae. Aegyptiextrahiert. M steht für Marker (50 Basenpaare DNA-Leiter). (B) Optimierung der Assay Bedingungen durch die Prüfung einer Reihe von RT-Lampe Inkubation Temperaturen (von 55 ° C bis 70 ° C) und MgSO4 Konzentrationen (ab 4 mM bis 10 mM) in multiplex-Format in der Abwesenheit der Ziel-RNA. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Yaren Et Al. 201720. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: RT-Lampe in Echtzeit. (A) Singleplex und Multiplex Limit der Nachweisgrenze (LOD) für Zika (ZV) mit 80 nM FAM-markierten Strang verdrängen Sonde in Echtzeit mit Echtzeit-PCR Instrument (Kanal 483-533 nm). Proben wurden bei 65° C inkubiert, für ca. 50 min. (B) Fluoreszenz aber einen Orangefilter beobachtet wurde, gefolgt von der Anregung der Proben bei 470 nm mit blauem Licht. Proben von A wurden zur Visualisierung verwendet. (C) Echtzeit-Analyse für LOD Chikungunya-Fieber (CH) Zielgruppe mit 80 nM HEX-tragenden Lampe Sonden in Singleplex Format mit Fluoreszenz-Kanal von 523-568 nm auf einem Echtzeit-PCR-Instrument. (D) Echtzeit-Analyse für LOD auf Dengue-1 (D1) Ziele mit 80 nM TAMRA tragenden Lampe Sonden in Singleplex Format mit Fluoreszenz-Kanal von 558-610 nm auf einem Echtzeit-PCR-Instrument. (E) Bestimmung der maximalen Urin-Gehalt in RT-LAMP-Reaktion. Eine Auswahl der letzten Urin Konzentrationen (0 %-50 %) wurden getestet mit 80 nM FAM-markierten Sonde im Beisein von 2,85 Pfu Zika vRNA.NTC = keine Vorlage Kontrolle auf allen Tafeln. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Yaren Et Al. 201720. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Singleplex und multiplex-Virenerkennung im Urin mit 80 nM Sonde. (A) Zika-Nachweis im Urin von 10 % im Singleplex und Multiplex-Format mit 2,85 Pfu Zika (ZV) virale RNA mit FAM-markierten Sonde (80 nM). (B) Chikungunya-Erkennung in 10 % Urin im Singleplex und Multiplex-Format mit 242 Kopien der viralen RNA Chikungunya-Fieber (CH) mit HEX-markierten Sonde (80 nM). (C) Dengue-1 Nachweis im Urin von 10 % im Singleplex und Multiplex-Format mit 1,22 Pfu Dengue-1 (D1) virale RNA mit TAMRA-markierten Sonde (80 nM). (D) Visualisierung der RT-Lampe Reaktionen durch orange-Filter nach Anregung bei 470 nm mit blauem LED-Licht. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Yaren Et Al. 201720. NTC = keine Vorlage Kontrolle auf allen Tafeln. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Singleplex und multiplex-Virenerkennung im Urin mit 300 nM Sonde. (A) Zika-Nachweis im Urin von 10 % im Singleplex und Multiplex-Format mit 2,85 Pfu Zika (ZV) virale RNA mit FAM-markierten Sonde (300 nM). (B) Chikungunya-Erkennung in 10 % Urin in HEX-markierten Sonde 242 Kopien der viralen RNA Chikungunya-Fieber (CH) mit Singleplex und Multiplex-Format (300 nM). ()C) Dengue-1 Nachweis im Urin von 10 % im Singleplex und Multiplex-Format mit 1,22 Pfu Dengue1 (D1) virale RNA mit TAMRA-markierten Sonde (300 nM). (D) Visualisierung der RT-Lampe Reaktionen durch orange-Filter nach Anregung bei 470 nm mit blauem LED-Licht. Als Positivkontrolle im Urin Experimente, eine Lampe Grundierung setzen auf menschliche mitochondrische DNA (MtDNA) mit TET-markierten Sonde verwendet wurde (300 nM). NTC = keine Vorlage Kontrolle auf allen Tafeln. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Yaren Et Al. 201720. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Workflow für Zika Erkennung von infizierten Mücke Proben mit Q-Papiertechnik mit gesunden und Zika-infizierten Ae. Aegypti (ZV 9, Tabelle 2). Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Yaren Et Al. 201720. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Feld beobachten. (A) die Beobachtung Box verwendet zwei AAA-Batterien in der Basis. Diese Batterien vier blauer LED-Leuchten, die die Proben statt in 0,5 mL Röhrchen gelegt in die vier Löcher zu beleuchten. Die LED-Leuchten sind mit einem Schalter eingeschaltet. Die Proben werden durch die orange-Filter visualisiert. (B) Fluoreszenz im Feld der Beobachtung. Von links nach rechts: negativ, positiv für Zika, negative und positive für Zika. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ziel-virus Name Sequenz (5' - 3') Länge Startposition Endposition
Zika ZV-F3 GAGACTGCTTGCCTAG 16 9905 9920
ZV-B3 CTGGGGTCTTGTCTTC 16 10145 10130
ZV-LF CAGTTGGAACCCAGTCAAC 19 10028 10010
ZV-LB GTGGAACAGAGTGTGGATTG 20 10093 10112
ZV-FIP CCATGGATTGACCAGGTAGTTTTTTCGACTGATGGCCAATG 41 9974 10053
ZV-BIP ACCACTGARGACATGCTTGTTTTTCATGTGGTCGTTYTCC 40 10070 10129
ZV-LB_NatTail FAM-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
GTGGAACAGAGTGTGGATTG		 60 10093 10112
Chikungunya-Fieber CH-F3 CGTCAACGTACTCCTAAC 18 2891 2908
CH-B3 ACGTTGGCTTTRTTTTGG 18 3094 3077
CH-LF AGCGTCTTTATCCACGGG 18 2968 2951
CH-LB AYGCATCRATAATGGCGGG 19 3025 3043
CH-FIP GAAGTTTCCTTTCGGTGGGTTTTTGGAAGACACTYTCYGG 40 2932 2993
CH-BIP AAGGAGTGGGAGGTGGATTTTTTCAYTTGGTGACTGCAG 39 3006 3063
CH-LF_NatTail HEX-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
AGCGTCTTTATCCACGGG		 58 2968 2951
Dengue-Fieber-1 D1-F3 ACAGCYCTGAATGAYATGG 19 9583 9601
D1-B3 GCAGTTTCTCTCAGGC 16 9803 9788
D1-LF CACTTGYTGCCARTCATTCC 20 9666 9647
D1-LB CCATGCCGYAACCAAG 16 9727 9742
D1-FIP CTGGTGGAARTGGTGTGATTTTTTGGGAACCTTCAAAAGG 40 9628 9693
D1-BIP GAAGGAYGGGAGGGAAATAGTTTTTTTAGCCCTRCCCA
CAAG		 42 9702 9763
D1-LB_NatTail TAMRA-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
CCATGCCGYAACCAAG		 56 9727 9742
Mitochondriale DNA MtDNA-F3 AGCCTACGTTTTCACAC 17 9183 9199
MtDNA-B3 GCGCCATCATTGGTAT 16 9410 9395
MtDNA-LB GCCTAGCCATGTGATTTCAC 20 9322 9341
MtDNA-LF GGCATGTGATTGGTGGGT 18 9254 9237
MtDNA-FIP GTCATGGGCTGGGTTTTACTTTTTCTACCTGCACGACAAC 40 9213 9228
MtDNA-BIP CTCAGCCCTCCTAATGACCTTTTTGAGCGTTATGGAGTGG 40 9359 9344
MtDNA-LB_NatTail TET-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
GCCTAGCCATGTGATTTCAC		 60 9322 9341
Gemeinsamen quencher CTGACCTGACGGACTGAACGGATGGCTGAGCGCA
AACCCG-Iowa schwarz FQ		 40

Tabelle 1: Primer und Strang verschieblich Sonden. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Yaren Et Al. 201720. Sequenzen in Fettdruck vertrete die Doppelstrang-Region des Stranges Sonden zu verdrängen. FAM-Label (gesehen als grüne Fluoreszenz), HEX-Label (gesehen so leicht grün-gelbe Fluoreszenz), TAMRA beschriftet (gesehen als Orange-rote Fluoreszenz), und TET beschriftet (gesehen als gelbe Fluoreszenz) Sonden wurden beauftragt, Zika, Chikungunya-Fieber, Dengue-Fieber-1, zu erkennen und mitochondriale DNA im Urin, beziehungsweise. FAM ist Anregung und Emission Maxima bei 495 nm und 520 nm, beziehungsweise. HEX ist Anregung und Emission Maxima bei 538 nm und 555 nm, beziehungsweise. TAMRA ist Anregung und Emission Maxima bei 559 nm und 583 nm, beziehungsweise. TET hat die Anregung und Emission Maxima bei 522 nm und 539 nm, beziehungsweise. Um die Verwendung einer einzigen Durstlöscher für alle Fluorophore zu ermöglichen, wurde Iowa schwarz-FQ aufgrund seiner Breite Absorption (420-620 nm) verwendet.

Virus, Stamm (GenBank Zbl-Nummer) Familie/Gattung Viral-Titer
Zika-Virus (ZV), Puerto Rico (PRVABC59, KU501215.1) Flaviviridae/Flavivirus Gruppe IV, positive, ssRNA 2,85 x 108 Pfu/mL
Chikungunya-Virus (CH), British Virgin Islands (asiatischer Abstammung, KJ451624) Togaviridae/Alphavirus Gruppe IV, positive, ssRNA 2,42 x 108 Genome/mL
Chikungunya-Virus (CH), La Réunion (Indischer Ozean-Linie LR2006-OPY1, KT449801) Togaviridae/Alphavirus Gruppe IV, positive, ssRNA 1,89 x 108 Genome/mL
Chikungunya-Virus (CH), La Reunion extrahiert insgesamt NA von Aedes Aegypti weibliche (indischer Abstammung, LR2006-OPY1, KT449801) Togaviridae/Alphavirus Gruppe IV, positive, ssRNA 3,85 x 105 Genome/mL
Dengue-Fieber Serotyp 1 (D1), Key West (Florida) (JQ675358) Flaviviridae/Flavivirus Gruppe IV, positive, ssRNA 1,22 x 106 Pfu/mL
Zika (ZV) Moskito Identität, Belastung Bein-Titer Pfu/mL
ZV 9, Puerto Rico 4,76 x 103

Tabelle 2: virale Titer in Zellkulturen und infizierten Mücke. PFU: Plaque-bildende Einheit. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Yaren Et Al. 201720.

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Discussion

Moskitos übertragene Viren einschließlich Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber bedrohen die Gesundheit und den letzten Höhepunkt der Zika-Ausbrüche den Bedarf an kostengünstigen Point-of-Care-Erkennung Alternativen für Patienten Diagnostik sowie für Moskito-Überwachung. Isothermen Amplifikationsverfahren wurden als erschwingliche Alternativen zu PCR-basierten Systemen entwickelt. Insbesondere wurden RT-Lampe-basierten Plattformen angewendet, um eine Vielzahl von Krankheitserregern zu erkennen. Die Verwendung von isothermen Plattformen wurde jedoch hauptsächlich auf Einzelziel-Erkennung beschränkt. Die Methode berichtet hier verwendet eine modifizierte RT-Lampe, simultane Detektion von drei verschiedene Ziele in einer einzigen Reaktionsmischung zuzulassen, auf eine Reihe von gemäßigten Temperaturen (65-68 ° C) läuft, als besonders geeignet erwiesen weil Temperaturen höher als 60 ° C machen Zika und andere Viren nichtinfektiöse30,35.

Die hier vorgestellte Daten zufolge weiter, RT-Lampe ist in der Lage ist, tolerieren, hemmende Stoffe, die in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten15vorhanden sein könnte. Dies ermöglicht viralen RNAs, ohne einen zusätzlichen Schritt der RNA Reinigung verstärkt werden, indem man direkt die Probe in das Reaktionsgemisch. Je nach Art der Probe erlaubt das maximale Volumen der Probe muss, nicht die Reaktion hemmen und nicht dazu führen, dass Hintergrundfluoreszenz (falsch positiv) bestimmt werden. Die Studie präsentiert hier konzentriert sich auf die Verwendung von 10 % Endvolumen für Urinproben. Speichel und Serumproben können jedoch auch auf die Probe in der gleichen Weise20angewendet werden. Nachweisgrenzen erwiesen sich weit über die gemeldeten Viruslast bei Patienten Urin13sowie infizierte Mücken20,36,37.

Moskito-Überwachung hat in der Regel eine niedrigere Priorität für Volksgesundheit Ressourcen, also eine preiswerte gemultiplext Umfrage ein Haushalts-Kit oder ein öffentlicher Bereich besonderen Wert hätten. Dieses Kit wurde daher durch die Zugabe von Q-Papier ermöglicht die Erkennung von Viren in Mücke Schlachtkörper geändert. Q-Papier enthält hohe Mengen an kovalent verbunden quartäre Ammonium-Gruppen, ermöglicht die Erfassung von viralen Nukleinsäuren auf seiner Oberfläche durch Coulomb-Wechselwirkungen. Obwohl es ein Anliegen war, dass Q-Papier RT-Lampe hemmen konnte, ergab, dass durch Zugabe von Q-Papier Tragetasche Moskito Schlachtkörper direkt in RT-Lampe-Mischung, erfolgreichen Virenerkennung innerhalb von 30 Minuten erreicht werden konnte. Für erfolgreiche Signalerzeugung, Q-Papier muss klein genug (z.B., Größe 3 x 4 mm für 100 µL Reaktionsvolumen) in der RT-Lampe Reaktionsgemisch getaucht werden. Wenn es zu groß für das Reaktionsgefäß ist oder beginnt, schwimmende statt noch in die Flüssigkeit eingetaucht, die Reaktion kann nicht stattfinden und als falsche negative Ergebnisse angezeigt.

Für erfolgreiche Erkennung und Differenzierung von jedem Virus setzen jede Grundierung muss befolgen die Richtlinien für RT-Lampe besser gekleideteres Design, den Design-Regeln für Sonden, verdrängen und beinhalten eine Auswahl an Fluorophore für multiplexing. Jede Grundierung setzen muss untersucht werden, gegen verschiedene Ziele Kreuzreaktivität zu vermeiden. Zusätzlich Magnesium Konzentration und Inkubation Temperatur für jeden Satz optimiert werden müssen. Hier vorgestellte Methoden verwenden Fluoreszenz-Anzeigen sichtbar vom Auge, was erreicht wurde, durch die Einführung von Strang verschieblich Sonden auf RT-LAMP-Architektur. Drei unterschiedliche Farben können in einem Multiplex Assay visualisiert werden, wenn andere Fluorophore, jedes Ziel-Virus zugeordnet wurden. Dies bietet Vorteile gegenüber bestehenden isothermen Zika Nachweisverfahren, da die meisten veröffentlichten Methoden auf Einzelziel-Erkennung und die Verwendung von verschuppen oder Fluoreszenz-Farbstoffen, die nicht Sequenz-spezifische und sind anfällig setzen für die Erzeugung von unspezifische Amplifikate.

Ein entscheidender Schritt zu prüfen, ist die Bestimmung der Endkonzentration von Eindringmittel beschrifteten verdrängenden Sonden. Es wurde festgestellt, dass 80 bis 100 nM verdrängen Sonden Fluoreszenz Signale innerhalb von 15-20 min erzeugen könnte, während Zeit signalisieren wenn 300 verzögerte nM der Sonde Konzentration verwendet wurde. Reaktionszeit wurde weiter verzögert, wenn die Assays in einem Multiplex Mode ausgeführt wurden. Der Grund für den Wechsel von 80 nM bis 300 nM war, Visualisierung von allen drei Fluorophore, die über eine einzelne LED-Lichtquelle zu ermöglichen. Blaue LED mit Erregung bei 470 nm eignet sich für FAM-markierten Sonden, sondern eignet sich weniger für HEX - oder TAMRA-markierten Sonden. Deshalb wurde ein Opfer auf Inkubationszeit unternommen, um in der Lage sein, alle drei Ziele zu visualisieren.

Eines der Probleme mit RT-Lampe ist vorwärts Kontamination. RT-Lampe erzeugt große Mengen an Amplifikate in eine kurze Inkubationszeit und Amplifikate leicht als Aerosole freigesetzt werden könnten. Um dieses Problem zu umgehen, wurde dUTP zusammen mit anderen dNTPs gefolgt von UDG Verdauung während der Assay Einrichtung enthalten. Es ist wichtig, eine Hitze-labile Version der UDG, zu verwenden, da es erforderlich ist, UDG um zu verhindern, dass die Verdauung der neu generierten RT-Lampe Amplifikate zu inaktivieren.

Um die Verteilung des Kit ohne Kühlung zu ermöglichen, alle Komponenten des Assays lyophilisiert werden musste und das Kit ergänzt mit einem Rehydratation Puffer. Daher war Glycerin in kommerziell erhältlichen Enzyme vorhanden durch Ultrafiltration entfernt, weil Glycerin durch Gefriertrocknung entfernt werden kann. Bei einer hohen Konzentration in einem Gemisch kann Glycerin Enzymaktivität beeinträchtigen. Das einzige Enzym nicht in den Vorgang des Entfernens Glycerin enthalten war die thermolabilen UDG. UDG ist ein kleines Enzym mit einem Molekulargewicht von 24,6 kDa, wodurch es ungeeignet für die Ultrafiltration Experimente. Daher wurde die Lyophilisation Mischung hinzugefügt als gekauft. Die restliche Glycerin der Test Ergebnis nicht negativ beeinflussen.

Eine Einschränkung dieser fluoreszierende RT-Lampe-Technik ist die Verwendung von LED-Hand. Bei Tests in Singleplex oder Multiplex-Format ausgeführt wurden, waren höhere Konzentrationen von verdrängen Sonden für Signal Visualisierung aller Ziele benötigt. Diese Änderung bewirkt jedoch Verzögerungen Zeitsignal-Generation. Eine Möglichkeit, dies zu überwinden wäre die Verwendung von zwei LED-Lichtquellen, die andere Fluorophore (HEX und TAMRA) besser unterzubringen. Auf diese Weise könnten niedriger Konzentration der Sonde zur Erzeugung eines Signals mit kürzeren Inkubationszeiten verwendet werden.

Eine weitere Einschränkung, die Überlegung ist die Fluoreszenz-Farbe vom Auge in einer schwach beleuchteten Umgebung beurteilen. Es ist einfacher, wenn ein einzelnes Ziel in ein Singleplex oder Multiplex-Format vorhanden ist, da Primer entwickelt wurden, nicht miteinander interagieren. Der Test wäre schwieriger zu interpretieren, wenn mehrere Ziele in einem einzigen Assay-Rohr, wie z. B. einen Pool von Mücken oder einem Patienten mit mehr als eine Virusinfektion anwesend waren. Dies erfordert eine Änderung der Auslesen Architektur, z. B. eine Digitalanzeige, anstatt Auge nach zu urteilen.

Ein möglicher zukünftiger Ansatz wäre die Erhöhung der durch die Schaffung einer größeren Gruppe von Stechmücken übertragenen Arboviren Multiplexen. Dies erfordert sorgfältige Grundierung Primer-Grundierung Interaktionen zu vermeiden entwerfen und erfordern die Verwendung von modifizierten Nukleinsäure-Analoga wie molekulare Erkennung-Systeme (SAMRS) selbst zu vermeiden und künstlich erweitert genetische Informationssystem (Federführung) hohes Maß an Multiplexen38besser zu empfangen. Dementsprechend wäre die Lösung für Signal-Auslesen in einer höheren multiplex-System zu verwenden, ein einzelnes Fluorophore für jede verdrängenden Sonde und weisen eine einzigartige Vertriebenen Sequenz für jedes Ziel und erfassen die Vertriebenen Sonden auf festen Oberflächen durch DNA Hybridisierung. Dadurch würde eine Array-formatierte Plattform geschaffen, mit einem einzigen Fluorophor und LED zu begeistern, aber urteilen die Anwesenheit der einzelnen Ziele würde auf seine Position im Array39beruhen.

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Disclosures

Einige der Autoren und ihrer Institutionen besitzen geistigen Eigentums dieser Assay zugeordnet.

Acknowledgments

Die Arbeit wurde zum Teil durch FDOH-7ZK15 und NIAID 1R21AI128188-01 unterstützt. Forschung, die in dieser Publikation berichtet wurde zum Teil durch das National Institute of Allergy and Infectious Diseases, und andererseits durch biomedizinische Forschung Programm des Florida Department of Health unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der NIH oder Florida Department of Health. Dynamische Kombinatorische Chemie GmbH ist bekannt für ihre Unterstützung und ihren Beitrag zu diesem Projekt anerkannt.

1 Denguevirus (Stamm BOL-KW010) wurde uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Florida Abteilung des Health Bureau des Labors. Zika-Virus und die asiatischen Linie des Chikungunya-Virus wurden gnädig von den Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention zur Verfügung gestellt. Die indischen Ozean-Linie des Chikungunya-Virus wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Robert Tesh (Welt Referenzzentrum für auftauchende Viren und Arboviren, durch die University of Texas Medical Branch in Galveston, Texas), die UF-FMEL. Wir danken S. Bellamy, B. Eastmond, S. Ortiz, D. Velez, K. Wiggins, R. ZimLer und K. Zirbel für die Unterstützung bei der Infektion-Studien. Wir danken auch M. S. Kim für die Bereitstellung von Q-Papier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS Major Science MBE-150 Gel electrophoresis
G:BOX F3 Syngene G:BOX F3 Gel imaging
LightCycler 480 Instrument II, 96-well Roche Applied Science 05 015 278 001 Real-time PCR
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane Millipore Sigma UFC501096 ultrafiltraton membrane for dialysis
Eppendorf 5417C Centrifuge Marshall Scientific EP-5417C centrifuge
Myblock Mini Drybath Benchmark Scientific BSH200 drybath
FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System Labconco 7934020 lyophilizer
all priers and probes IDT custom RT-LAMP primers and probes
dNTP set Bioline BIO-39049
Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) Promega U1191
Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase New England Biolabs M0538L enzyme
WarmStart RTx Reverse Transcriptase New England Biolabs M0380L enzyme
RNase Inhibitor, Murine New England Biolabs M0314L enzyme
Antarctic Thermolabile UDG New England Biolabs M0372L enzyme
50bp DNA Step Ladder Promega G4521 marker
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Roche Applied Science 4729692001 real-time RT-LAMP analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biochemie Ausgabe 133 Point-of-Care Diagnostik gemultiplext isothermen Verstärkung Loop-vermittelten isothermen Verstärkung Zika-Erkennung Fluoreszenz auslesen keine RNA-Extraktion Moskito-Überwachung Virenerkennung
Gemultiplexten isothermen Verstärkung basiert Diagnoseplattform zu erkennen, Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1
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Yaren, O., Alto, B. W., Bradley, K. M., Moussatche, P., Glushakova, L., Benner, S. A. Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1. J. Vis. Exp. (133), e57051, doi:10.3791/57051 (2018).

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