Summary
Gjeldende multiplekset diagnostikk å oppdage Zika, chikungunya og dengue virus krever komplisert eksempel forberedelse og dyre instrumentering, og er vanskelig å bruke i lav ressurs miljøer. Vi viser en diagnose som bruker isotermiske forsterkning med mål-spesifikke strand displaceable sonder oppdage og skille disse virusene med høy sensitivitet og spesifisitet.
Abstract
Zika, dengue og chikungunya virus overføres av mygg, forårsaker sykdommer med lignende pasientens symptomer. Men de har forskjellige nedstrøms pasient til pasient overføring potensialer og krever svært forskjellige pasienter behandlinger. Dermed siste Zika utbrudd gjør det haster å utvikle verktøy som raskt skille disse virusene hos pasienter og fanget mygg, velge riktig pasient behandling, og for å forstå og administrere sine epidemiologi i sanntid.
Dessverre gjeldende diagnostiske tester, inkludert de mottar 2016 Nødsituasjonen Bruk autorisasjoner og rask status, oppdage viral RNA av omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjons (RT-PCR), som krever instrumentering, trent brukere, og betydelig eksempel forberedelse. Derfor må de bli sendt til "godkjent" referanse laboratorier, krever tid. Faktisk i August 2016, Center for Disease Control (CDC) spurte gravide kvinner som hadde blitt bitt av en mygg, og utviklet et Zika signallampe utslett vente en uakseptabel 2 til 4 uker før læring om de var smittet. Vi trenger mye tester som kan gjøres på stedet, med få ressurser, og trente men ikke nødvendigvis lisensiert personell.
Denne videoen viser en analyse som oppfyller disse spesifikasjonene, arbeider med urin eller serum (for pasienter) eller knust myggen skrotter (for miljømessige overvåking), uten mye eksempel forberedelse. Myggen skrotter er fanget på papir bærer kvartær ammonium grupper (Q-papir) etterfulgt av ammoniakk behandling for å behandle biohazards. Dette er så direkte, uten RNA isolasjon, sette i analysen rør som inneholder frysetørket reagensene som trenger ingen kjede av kjøling. En modifisert form for omvendt transkripsjon loop-mediert isotermiske forsterkning med mål-spesifikke fluorescently merket displaceable sonder produserer avlesning, i 30 min, som et tre farger fluorescens signal. Dette er visualisert med en håndholdt, batteridrevet enhet med en oransje filtrere. Fremover forurensning er forhindret med forseglet rør, og bruk av thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG) i nærvær av dUTP i forsterkning blandingen.
Introduction
Mygg-borne virusinfeksjoner, inkludert dengue og chikungunya Zika virus er på stige og etterspørsel umiddelbare ledelsen strategier. Dengue og chikungunya virus er endemisk i mange av de tropiske regionene hvor Zika nå sprer seg i den vestlige halvkule1. Zika virus, som denguefeber, er medlem av Flaviviridae -familien og er innfødt til Afrika med en asiatisk og to afrikanske genetisk linjene2. Selv om identifikasjonen av Zika viruset dateres tilbake til 1947, forble Zika infeksjon hos mennesker sporadisk i et halvt århundre før nye i Stillehavet og Amerika. Det første rapporterte utbruddet av Zika feber oppstod på øya Yap i Mikronesiaføderasjonen i 2007, etterfulgt av Fransk Polynesia i 2013 og 2014. Det første store utbruddet i Amerika oppstod i 2015 i Brasil.
Zika, chikungunya og dengue virus overføres primært Aedes aegypti og Aedes albopictus. Zika har imidlertid flere nedstrøms menneske til menneske overføringen muligheter, sannsynligvis spres gjennom seksuell kontakt, mor til fosteret interaksjon, og via amming3,4,5. Zika feber ble først antatt å forårsake bare mild sykdom. Men det ble senere tilknyttet Guillain-Barrés syndrom i voksne, microcephaly nyfødte og kroniske muskel sykdommer som kan vare måneder til år. Diagnostisering av Zika sykdom kan være utfordrende, siden symptomene på en Zika infeksjon er lik de andre mygg-spre virus6. Vanlige co infeksjoner av disse virusene gjør differensialdiagnose enda mer utfordrende7,8. Derfor er rask og pålitelig påvisning av nucleic syrer fra Zika og andre virus nødvendig å forstå epidemiologi i sanntid, initiere kontroll og forebyggende tiltak og administrere pasientomsorg9.
Gjeldende diagnosetester for disse virusene inkluderer serologisk tester, virus aisolering, virus sekvensering og omvendt-transkripsjon PCR (RT-PCR). Standard serologisk tilnærminger lider ofte av utilstrekkelig følsomhet og resultatene kan være komplisert av kryssreaktivitet hos pasienter som har tidligere blitt infisert av andre flaviviruses.
Derfor fortsatt nukleinsyre testing den sikreste måten å oppdage og skille disse virusene. Påvisning av Zika og andre mygg-borne virus er vanligvis utført RT PCR eller sanntid RT PCR i rekke biologiske væsker, som serum, urin, spytt, sæd, morsmelk og cerebral væske10,11. Urin og spytt prøver er generelt foretrukket over blod, siden de viser mindre PCR-hemming, høyere viral belastning, virus tilstedeværelse for lengre perioder og økt brukervennlighet innsamling og håndtering12,13. RT-PCR-baserte diagnostiske tester, utgjør imidlertid omfattende utvalg forberedelsene og dyre termisk sykling utstyr, slik at det blir mindre optimalt for point-of-care.
Omvendt transkripsjon loop-mediert isotermiske forsterkning (RT-lampe) har dukket opp som et kraftig RT PCR alternativ pga høy sensitivitet og spesifisitet14, sin toleranse for hemmende stoffer i biologiske prøver15, og operasjon på enkelt temperatur, som betydelig reduserer analysen kompleksitet og tilhørende kostnader, slik at det passer for lav ressurs miljøer. RT-lampe, som det implementeres klassisk, består av seks primere som binder til åtte forskjellige regioner i målet RNA. Det går ved konstant temperaturer mellom 60 ° C og 70 ° C, og bruker en revers transkriptase og en DNA polymerase med sterk tråd fortrenge aktivitet.
Under den innledende stadiet av RT-lampe danner forover og bakover interne primere (FIP og BIP, figur 1A) med ytre forover og bakover grunning (F3 og B3) en dumbbell struktur, frø strukturen eksponentiell lampe forsterkning. Forsterkningen er ytterligere akselerert ved Løkken fremover og bakover primerne (LF og LB), som er utformet for å binde enkelt strandet regionene dumbbell, og resultater i dannelsen av concatemers med flere gjentatte looper16. Klassisk lampe søk basert på turbiditet eller avlesning av DNA intercalating fargestoffer er ikke helt passer for point-of-care påvisning av Zika, der noen grad av multipleksing er ønsket17,18,19. Multipleksing er ikke lett fått i disse systemene, som de er utsatt for å generere falske positiver på grunn av off-målet amplifications.
For å forvalte disse utgivelsene, legger litteraturen en tilleggskomponent i form av en "strand-fortrenge probe" til den klassiske RT-lampe arkitektur20,21,22. Hver probe har en sekvens-spesifikke dobbel-strand region og en single-strandet grunning region. Sonde med enkelt-strandet regionen er merket med en 5-fluorophore, og komplementære sonden er endret med en 3-end avsluttes. I fravær av et mål, er ingen fluorescens observert på grunn av blanding av komplementære sonde trådene, som bringer fluorophore og avsluttes i nærheten. I nærvær av et mål, enkelt-strandet delen av fluorescerende sonden binder til sin supplement på målet, og deretter utvidet ved en strand fortrenge utvalg. Ytterligere polymerase utvidelse av omvendt primere forårsaker separasjon av avsluttes strand fra sin utfyllende fluorescently merket strand, slik at utslipp av fluorescens ((figur 1B)). Med dette motivet genereres signalet etter Manual dannelsen, redusere sjansene for falske positive signaler.
Double-strandet delen av strand-fortrenge proben kan være en sekvens, og når multipleksing brukes, samme sekvens kan brukes med forskjellige fluorophore-avsluttes par. Med denne arkitektur, virus forurenset urin, serum eller mygg ble prøver squished på papir direkte introdusert til analysen uten eksempel forberedelser. Tre farger fluorescens read-outs synlig for menneskets øye ble generert innen 30-45 min, og signaler var visualisert av en 3D-trykt observasjon som bruker en blå LED og en oransje filtrere. Frysetørring RT-lampe reagensene aktivert distribusjon av dette settet til lavere ressursinnstillinger uten behov for kjøling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Mygg var det eneste dyr direkte brukes i denne studien. Fremgangsmåtene å administrere kyllinger, med blod ble brukt til å mate de infiserte mygg, ble godkjent IACUC protokollen #201507682 av University of Florida institusjonelle dyr omsorg og bruk Committee.Virus spredning og mygg infeksjon studier var utført på BSL-3 anlegget for Florida medisinsk entomologi laboratorium i Vero Beach, ble FL. RT-lampe eksperimenter utført i BSL-2 laboratoriet deles av FfAME og Firebird Biomolecular Sciences LLC i Alachua, FL.
1. prosjektert av primere og Strand fortrenge sonder
- Ekstra viral sekvenser for Dengue 1 fra bred Institute databasen23; sekvenser for Zika og chikungunya fra NIAID Virus patogen Database og analyse ressurs24.
- Opprette flere sekvens justeringer (MSAs) for sekvenser av interesse ved hjelp av programvare muskel v3.8.3125. Bruk generert MSAs etter lampe primere sett i en bevart region målet og unngå ikke-relevante eller utilsiktet mål som forskjeller mellom undergrupper av et mål.
- Følg design reglene for lampe primere som beskrevet online (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/), og tillate bruk av blandet baser i primere å dekke virus divergens26. For å unngå kryssreaktivitet primer sett, kan du sammenligne genererte lampe primere for NCBI RNA virus database bruker NCBI BLAST27. Sammenligne hvert sett å eliminere grunning som ville dimerize i en multiplex analysen ved hjelp av NCBI BLAST også.
- Skjermen delen double-strandet av strand-fortrenge sonden mot noen viral genomet sekvens og mygg genomisk sekvens. Endre 5'-ender målet bindende sonde med fluorescein amidite (FAM), HEX fargestoff og 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) fargestoff for Zika, chikungunya og Dengue 1, henholdsvis.
- Inkluder en positiv kontroll primer satt for urinprøver. Utforme lampe primere mot menneskelig Mitokondrielt DNA. Etiketten strand-fortrenge sonde med TET på 5'-end. Etiketten avsluttes sonder som er delvis komplementære til hver fluorescently merket sonde med avsluttes (f.eksIowa svart-FQ) på 3-end (tabell 1).
2. virus isolerer og infisert mygg prøver
- Bruk isolerer Zika virus (Puerto Rico belastning), Chikungunya virus (La Réunion eller Jomfruøyene belastning) og Dengue serotype-1 virus (Key West belastning). Bestemme viral titers plakk analysen28 eller kvantitativ RT PCR29. Ekstra viral RNAs bruke kommersielt tilgjengelige RNA utvinning kits.
Merk: Tabell 2 representerer de viral titers av hver virus isolere brukt i denne studien. - Følg artikkelen publisert av Yaren et al. for en detaljert protokoll om infeksjonen Ae. aegypti kvinner med Zika og chikungunya virus20. Se tabell 2 for viral titer av mygg utvalget infisert med Zika virus.
3. RT-lampe kombinert med Thermolabile Uracil DNA Glycosylase
-
10 x primer blanding forberedelse.
- Forberede 100 µM lagerløsning av hver primer og sonde (se trinn 1) ved å legge nuclease gratis vann. Vortex godt og butikk på 20 ° C før bruk.
- For 10 X Primer blanding for hver Zika, Dengue 1 eller Mitokondrielt DNA mål, blanding 16 µL av FIP, 16 µL BIP, 2 µL av F3, 2 µL av B3, 5 µL av LF, 2 µL av LB, 3 µL av LB-fluorescerende merket sonde, 4 µL av avsluttes probe , og 50 µL av nuclease-fritt vann å gi totalt 100 µL volum.
- For 10 X Primer miks for Chikungunya, bland 16 µL av FIP, 16 µL BIP, 2 µL av F3, 2 µL av B3, 5 µL av LB, 2 µL av LF, merket 3 µL av LF-fluorescerende probe, 4 µL av avsluttes probe og 50 µL av nuclease-fritt vann å gi totalt 100 µL volum.
Merk: Sonde konsentrasjonen beskrevet ovenfor bruker 300 nM i siste fluorescerende sonde og 400 nM i avsluttes sonde. Alternativt, bruk 80 nM fluorescently merket probe og 200 nM i sin avsluttes sonde for sanntids analyse.
- Legge til 5 µL av 10 X primer blanding (For 3-plex, legge 5 µL av hver 10 X primer mix), 5 µL av 10 X isotermiske forsterkning buffer (1 X buffer sammensetning: 20 mM Tris-HCl buffer pH 8,8, 50 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 8 mM MgSO4 0,1% Tween-20, 1 mM DTT), 7 µL dNTP blanding (10 mM dATP, dCTP og dGTP, 5 mM dTTP og dUTP), 16 enheter av DNA Polymerase, 15 enheter revers transkriptase, 80 enheter av rekombinant ribonuclease hemmer, 2 enheter av thermolabile UDG, 1-2 µL av varierende mengder vi RAL RNAs og vann for å bringe det totale volumet til 50 µL i en 0,25 mL PCR tube (se Tabell for materiale).
- Inkluder negativ kontroll analyser på dette stadiet av erstatter viral RNA volum med vann. Inkuber prøver 65-68 ° c i 45 minutter til 1 h og analysere ved å kjøre 5 µL av hvert utvalg på 2,5% agarose gel 1 X TBE buffer inneholder ethidium bromide (0,4 µg/mL). Bruk en 25 bp eller 50 bp DNA stigen som markør på gel.
Merk: Tillegg av en bestemt mal for ikke-mål er tilleggsutstyr. - For å oppdage tilstedeværelsen av patogene RNA, teste hvert primer sett og ingen-mal kontrollen av varierende temperatur og/eller magnesium konsentrasjonen, siden hvert RT-lampe primer sett ble utformet for varierende temperatur (65 ° C 68 ° c) eller magnesium konsentrasjoner (6 til 10 mM endelige). Forberede eksperimenter i romtemperatur.
4. RT-lampe med Viral RNA-piggete urin
- Test RT-lampe primere i varierende siste konsentrasjoner av urin (0%, 10%, 20% og 50%) i 50 µL av totale reaksjon. For 10% siste urin konsentrasjon, legge til 1 µL av viral RNA 5 µL av urin. For 20% siste urin konsentrasjon, legge til 1 µL av viral RNA 10 µL av urin. For 50% siste urin konsentrasjon, legge til 1 µL av viral RNA 25 µL av urin.
- Real-time overvåkning av RT-lampe i 10% av urin, bruke en sanntid PCR instrument (se Tabell for materiale) med forskjellige fluorophore filtre.
- For å lese fluorescens signaler fra FAM-merket amplicons for Zika, bruk et filter mellom 483 533 nm; HEX-merket amplicons for chikungunya, bruke et filter mellom 523 568 nm; TAMRA-merket amplicons for Dengue 1, bruke et filter mellom 558 610 nm; og bruke et filter mellom 523 568 TET-merket amplicons for Mitokondrielt DNA, nm.
Merk: FAM har eksitasjon og utslipp maxima på 495 nm og 520 nm, henholdsvis. HEX har eksitasjon og utslipp maxima av 538 nm og 555 nm, henholdsvis. TAMRA har eksitasjon og utslipp maxima av 559 nm og 583 nm, henholdsvis. TET har eksitasjon og utslipp maxima av 522 nm og 539 nm, henholdsvis.
- For å lese fluorescens signaler fra FAM-merket amplicons for Zika, bruk et filter mellom 483 533 nm; HEX-merket amplicons for chikungunya, bruke et filter mellom 523 568 nm; TAMRA-merket amplicons for Dengue 1, bruke et filter mellom 558 610 nm; og bruke et filter mellom 523 568 TET-merket amplicons for Mitokondrielt DNA, nm.
- Bruk 96-brønns plater og segl platen med en klar plast ark, ruge samples ved 65-68 ° C i 60-90 min og spille fluorescensen hver 30 s med lys cycler. Først bruke 80 nM i fluorescently merket sonder, og deretter test 300 nM i fluorescently merket sonder.
- Angi grensen for påvisning hvert mål ved å legge serielt utvannet viral RNAs i siste urin konsentrasjon på 10%.
Merk: Bruk sanntid RT-lampe for å bestemme optimal temperatur, magnesium konsentrasjon, fluorescently merket probe konsentrasjon og reaksjonstid.
- Angi grensen for påvisning hvert mål ved å legge serielt utvannet viral RNAs i siste urin konsentrasjon på 10%.
- For å visualisere fluorescens generert av strand displaceable sonder av øyet, bruker en blå LED-lyskilde fra en lys cycler med eksitasjon på 470 nm (noen gel geleelektroforese boks med innebygd blå lyskilde vil arbeide, se tabell over materialer), og registrere bildet med en mobiltelefon kameraet ved romtemperatur i mørket.
Merk: Bruk 300 nM i fluorescently merket sonder, når visualisering av alle tre fargene av øye med blå LED er nødvendig.
5. RT-lampe på deteksjon av Zika-infiserte mygg med Q-papir-teknologi
- Forberede kvartær ammonium endret filter papir (Q-papir), i henhold til tidligere publiserte metoder med små modifikasjoner30.
- Legg 1 g cellulose filter papir sirkler (se Tabell for materiale) med diameter på 3,5 cm 50 mL av 1.8% av NaOH vannoppløsning i 15 min for aktivisering.
- Samle aktivert papir sirkler av vakuum filtrering og deretter dyppe dem i 40 mL vannløsning av (2,3-epoxypropyl) trimethylammonium chloride (0,28 g) over natten i romtemperatur.
Merk: Holde masse forholdet mellom (2,3-epoxypropyl) trimethylammonium klorid å filter papir på 0.28 til 1. - Samle det resulterende kationisk papiret av vakuum filtrering, og nøytralisere med 50 mL 1% av eddiksyre.
- Vask papiret tre ganger med etanol og air-dry under en hette med konstant luftstrøm.
- Enkeltark Q-papir på små rektangler (3 x 4 mm) bruker en papir slag eller saks. Knuse Ae. aegypti kvinnelige mygg potensielt infisert med Zika på hver papir med en mikro støter.
- Legge til hver papir 20 µL av 1 M vandig ammoniakk løsning (pH ≈ 12) og vent 5 min. Deretter vaskes hver papir en gang med 20 µL av 50% EtOH og en gang med 20 µL nuclease uten vann. Air-Dry papiret i BSL-2 biosikkerhet regjering i ca 1 time.
Merk: På dette punktet, prøver kan lagres på 20 ° C over natten før bruk. - Ved hjelp av pinsett, plasserer hvert papir i 100 µL av RT-lampe reaksjonsblandingen og ruge ved 65-68 ° C i 45 min. sikre dukke fullt ut papiret i løsningen; Det bør ikke være flytende. Lese og ta fluorescens som følge av Zika virus benytter blå LED-lyskilde og oransje eller gule.
6. lyophilization av RT-lampe reagensene 100 µL av reaksjon
- Forbered 10 X lampe primer blanding i sprøyte 3.1, og Forbered dNTP blanding som inneholder dUTP i henhold til kapittel 3.2. Lagre primer blanding og dNTPs ved 20 ° C før bruk.
- Forberede 10 mL av enzymet dialyse buffer fjerne glyserol, ved å blande 100 µL av 1 M Tris-HCl pH 7.5 500 µL av 1 M KCl, 2 µL av 0,5 M EDTA, 100 µL av 10% Triton X-100, 100 µL 0.1 m DTT og 9.198 mL nuclease gratis vann. Lagre dialyse bufferen på 4 ° C.
Merk: Sørg for å filtrere (0,2-mikron filterene) alle buffer reagens løsninger tidligere bruk og lagre dem på 4 ° C.- Bruke en ultrafiltrasjon membran med 10 kDa cut-off grense (se Tabell for materiale). Plass 350 µL dialyse bufferen, 4 µL av 32 enheter av DNA Polymerase, 2 µL 30 enheter i revers transkriptase og 2 µL av 80 enheter av RNase hemmer i ultrafiltrasjon membran og sentrifuge 14.000 x g for 5 min på 4 ° C.
- Legg til en annen 350 µL dialyse bufferen ultrafiltrasjon membran og sentrifuge (14.000 x g) for en annen 5 min. tom samling røret Gjenta dette trinnet, og sentrifuge (14.000 x g) i 3 minutter.
- Inverter membranen elueringsrør, og plasser i en ny samling rør. Spinn på 1000 x g i 2 min. mål elueringsrør lydstyrken Hvis mindre enn 8 µL, bringe volumet til 8 µL ved å legge dialyse buffer. Lagre tilsettes på 4 ° C, og umiddelbart videre til neste trinn.
Merk: Denne protokollen gjelder enkeltrør lyophilization, men forberede minst 10 reaksjon rør samtidig ved hjelp av samme ultrafiltrasjon membranen og bruke samme mengde dialyse buffer.
- Bland 10 µL av 10 X lampe primer hvis singleplex (for 3-plex, legge 10 µL av hver 10 X primer mix), 14 µL dNTP blanding, 8 µL dialyzed enzym mix, 2 µL av 2 enheter av thermolabile UDG og 66 µL av nuclease gratis vann (for 3-plex bruke 46 µL) i en 0,5 mL microcentrifuge rør og la lokket åpne. I stedet legge til et annet lokket punktert med en nål slik at damp å rømme.
- Umiddelbart fryse rør ved-80 ° C for 2t og lyophilize røret for 4 h. Cover lyophilization kammeret med aluminiumsfolie for beskyttelse mot lyset. Når reagenser er tørket, fjerne punktert lokkene, stenger opprinnelige lokket og lagre rør med lyofilisert reagenser på 4 ° C i mørket.
Merk: Reagenser kan være lyofiliserte over natten, om nødvendig.
7. testing lyofiliserte RT-lampe reagenser urin og mygg prøver som inneholder Zika
- Bruk følgende fra kit (se Tabell for materiale) for Zika: en 3D-trykt observere boks med oransje filtrere (long pass filter, kutt på ~ 540 nm), 2 AAA-batterier for å observere boksen lyofiliserte reaksjon rør merket ZV for Zika oppdagelsen, og 1.1 X rehydrering Buffer i 1,5 mL skrukork rør.
- Forberede 50 mL av 1,1 X rehydrering bufferen ved å blande 5,5 mL 10 X isotermiske forsterkning bufferen som følger med DNA Polymerase (se Tabell for materiale), 3,3 mL 100 mM MgSO4, 110 µL 0,5 m DTT og 41.09 mL nuclease gratis vann. Bland godt, aliquot 1 mL av denne løsningen til 1,5 mL skrukork rør og lagre på 4 ° C før bruk.
- Legge til 90 µL 1,1 X rehydrering bufferen til hver reaksjon tube (0,5 mL). Sikre at væsken fyller bunnen av røret med lyofilisert reagenser (oppløse dem med blanding av risting, deretter kort Nedspinning (1000 x g)). Legge til 10 µL av urinprøve spiked med viral RNA til reaksjon rør (se avsnitt 4.1 for detaljer).
- Hvis du tester mygg, legge til et rektangel med Q-papir holder myggen skrotter (som utarbeidet i fremgangsmåten beskrevet i delene 5.2 og 5.3), sammen med 10 µL renset vann i stedet for urinprøver.
Merk: Alternativt, legge 10 µL av spytt eller serum-prøver i stedet for urin. Hvis utvalgene er utdraget DNA eller RNA, legge til 2-5 µL av utvalget i utvannet blanding og komplett med nuclease-fritt vann til 10 µL av siste eksempel volum.
- Hvis du tester mygg, legge til et rektangel med Q-papir holder myggen skrotter (som utarbeidet i fremgangsmåten beskrevet i delene 5.2 og 5.3), sammen med 10 µL renset vann i stedet for urinprøver.
- Lukk lokket av reaksjon rørene. Plass dem i en varme blokk/bad (eller inkubator) ved 65-68 ° C. Inkuber i 30-45 min, men ikke mer enn 1 time. Etter inkubasjon fjerne røret fra varmen. For å hindre forurensning av fremtidige analyser, kan du sikre at disse rørene forblir lukket.
- Plasser reaksjon rør i boksen observere. temperaturen vil falle til omgivelsestemperaturen (fortrinnsvis 25 ° C). Slå på bryteren på baksiden av boksen observere. Observere eksempel gjennom oransje filteret og fange bildet av en mobiltelefon kamera som holdes på avstand der bildet fyller 80% av synsfeltet.
Merk: Bedre visualisering oppnås i lite lys miljøer. - Når visualisering er ferdig, slå av bryteren. Lagre forseglet rør i mørket, fortrinnsvis med kjøling, hvis senere visualisering er nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utgangspunktet ble for hver RT-lampe primer (tabell 1) med sine tilsvarende viral RNA substrat samt negative kontroller vurdert av gel geleelektroforese. RT-lampe primere ble utformet til NS5 målregion (RNA-avhengig RNA polymerase) for Zika og Dengue 1 og nsP2 område (ikke-strukturell protein P2) for Chikungunya. Maler var totalt RNA utvunnet fra viral aksjer kulturperler i afrikanske grønn ape-nyreceller (Vero). I ett tilfelle, total nukleinsyre (DNA og RNA) var Hentet fra en Chikungunya-infiserte kvinner Ae. aegypti (tabell 2).
Figur 2A viser noen representant resultater med RT-lampe utført med disse prøvene. Både singleplex og multiplex (3-plexed) tilfeller vises RT-lampe produkter som en stige i concatemers når kjører på agarose gel. Negativ kontroll prøver som inneholder vann som eksempel ga bare bandene for primere selv, inkludert ikke-spesifikk målkontrollen der total nukleinsyre trukket ut fra en ikke-infisert Ae. aegypti kvinnelige ble mosquito brukt som mal.
For å finne optimale RT-lampe forhold, ble ulike magnesium konsentrasjoner og inkubasjon temperaturer testet. Det ble funnet at høyere konsentrasjoner av magnesium og lavere temperaturer kan generere uspesifisert amplicons, gir opphav til falske positiver. 8 mM av magnesium og inkubasjon på 65 ° C ble derfor brukt alle eksperimentene fra da av (figur 2B).
Gel geleelektroforese krever åpningen av reaksjon-røret, som kan gi opphav til forurensning av neste sett av eksperimenter av tidligere genererte amplicons, fører til falske positiver. For å hindre videre smitte, ble dTTP erstattet av lik prosenter av dTTP og dUTP, slik at dUTP vil bli innarbeidet i RT-lampe amplicons. Dette viser mulige forurensende amplicon i et substrat for uracil-DNA glycosylase (UDG) under utarbeidelsen av alle etterfølgende RT-lampe reaksjoner31,32. Når en thermolabile versjon av UDG, kan dU inneholder amplicons bli fordøyd ved romtemperatur RT-lampe prøvene blir satt opp, og UDG vil bli deaktivert under isotermiske forsterkning. Videre kan reaksjon røret åpnes for en nedstrøms analyse, ved behov. I tillegg til UDG fordøyelsen genererer en arkitektur med displaceable sonder fluorescens som kan leses uten å måtte åpne reaksjon røret.
Figur 3A leverer resultatet av grensen for påvisning (LOD) for Zika med fluorescerende sonder målretting Zika RNA. Seriell fortynning studier viste at så lavt som 1,42 pfu ble oppdaget i 30 minutter i en singleplex analysen eller en 3-plexed søk. Når prøvene var mer utvannet til 0.71 pfu, ble et lysstoffrør signal observert etter 40 min for en singleplex analysen, og etter 50 min for 3-plexed blandinger. I tillegg til sanntids RT-lampe, fluorescens var visualisert etter 35 min gjennom en oransje filtrere, etter prøver ble utsatt til blå LED-lampe med en eksitasjon bølgelengden til 470 nm (figur 3B). På samme måte begrenser av oppdagelsen ble målt på 37.8 eksemplarer og 1,22 pfu Chikungunya og Dengue 1, henholdsvis (Figur 3 c-D).
Å bestemme optimal urin konsentrasjonen, Zika viral RNA (2,85 pfu) ble lagt til ulike konsentrasjoner av en ekte menneskelig urinprøve (0%, 10%, 20% og 50%). Antagelig på grunn av sin elektrolytter, var RT-lampe signalet forsinket 15 35 min når 50% urin ble brukt i analysen. 10% urin ble bestemt å være optimalt på grunn av presenterer en lavere bakgrunn. I fravær av Zika mål, ingen forsterkning ble observert noen konsentrasjon, men høyere bakgrunn fluorescens ble observert i prøver med høyere urin konsentrasjon (figur 3E).
For å tillate multipleksing med read-outs av forskjellige fluorescens farger, 80 nM i strand displaceable sonder var merket med forskjellige fluorophores (FAM for Zika, HEX for Chikungunya og TAMRA for Dengue 1), men ledsaget av den samme avsluttes (Iowa svart-FQ) med en konsentrasjon av 200 nM. Celle kultur-utpakkede viral RNAs (2,85 pfu for Zika, 242 viral RNA eksemplarer Chikungunya og 1,22 pfu for Dengue 1) ble brukt som mål, fortynnet i 10% urin. Sanntid analyse av fluorescens data viste en forsinkelse i signal generasjon (ca 10 min) for 3-plexed analyser der primere for alle mål var til stede. I singleplex tilfeller, derimot, ble reaksjonen fullført innen 10-15 min (figur 4A-C). Når fluorescens var visualisert ved hjelp av en blå LED og oransje filtrere, ble forskjeller i signalstyrke observert for forskjellige fluorophores, hvor FAM-merket amplicons var den mest synlige. Dette er som forventet siden eksitasjon på 470 nm er nærmest for maksimal FAM eksitasjon spekteret (Figur 4 d).
Aktivere visualisering av alle tre fargene med en enkelt LED eksitasjon bølgelengde (470 nm), konsentrasjonen av displaceable sonder økte til 300 nM og komplementære avsluttes sonde til 400 nM. I singleplex tilfeller ble signal generasjon fullført i 10 min for Zika, 20 min for Chikungunya og 40 min for Dengue 1. I 3-plexed analyser, men det ble ytterligere forsinket med 20 min i alle analyser ((figur 5A)- C). Likevel aktivert offer i tid til signalet generasjon visualisering av alle tre fargene blå LED lys med oransje filtrere. Grønne fluorescens er observert i Zika bruker sonder 5'-end merket med FAM, lys grønn-gul fluorescens tilordnes Chikungunya der sonden er 5'-end merket med HEX, og orange-rød fluorescens brukes for Dengue 1, der dens sonde er 5'-end merket med TAMRA (figur 5 d).
For å teste mosquito prøver med mulig Zika infeksjon, laboratorium-infiserte Ae. aegypti kvinnelige mygg (tabell 2) ble knust på et rektangel Q-papir, etterfulgt av ammoniakk behandling å sterilisere viruset og binde den utsatte viral RNA på positivt ladede Q-papir. Papiret var kort vasket med etanol fjerne pterin forbindelser i myggen skrotter som kan forstyrre fluorescens avlesning33,34. Q-dokumenter som inneholder mygg ble deretter direkte neddykket i RT-lampe blandingen, og etter inkubasjon på 65 ° C i 30 min, lyse grønne fluorescens ble observert i nærvær av Zika virus (figur 6).
Å levere oppdagelsen utstyr uten en kjede av kjøling, og å gjøre analysen enkelt for å bruke, var RT-lampe reagenser lyofiliserte og ledsaget av en utvanning buffer og en 3D-trykt observasjon boks som bruker en 470 nm emitting LED og en oransje filtrere (figur 7a). bruker 9 mengder rehydrering buffer og 1 mengden urinprøve, synlige grønne fluorescens kan genereres innen 30 min og bildet kan bli slått av noen mobiltelefon kameraet (figur 7B). Mygg prøver på Q-papir kan også brukes av samme analysen ved å legge til 1 volum av vann i stedet for urinprøve.
Figur 1: lampe analysen Design (A) RT-lampe primere og dannelsen av en dumbbell struktur av en strand fortrenge DNA polymerase. (B) innføring av strand-fortrenge sonder å tillate multipleksing og fluorescens avlesning og overvåke RT-lampe fremgang i sanntid. Gjengitt med tillatelse fra Yaren et al. 201720. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Gel geleelektroforese analyse av amplicons. (A) Testing lampe primere i singleplex eller multipleksen (3-plex) format med riktig positive og negative kontroller. Positiv omfatter renset viral RNA med følgende titers: 2,85 pfu for Zika (ZV), 242 genomisk kopier for Chikungunya (CH) og 1,22 pfu for Dengue 1 (D1). NTC-z, NTC-c og NTC d står for ingen mal kontroll for Zika, Chikungunya og Dengue 1 primere i singleplex format, henholdsvis. NSC står for ikke-spesifikk målkontrollen der totale xNA (DNA og RNA) er Hentet fra smitte-fri Ae. aegypti. M står for markør (50 base par DNA stiger). (B) optimalisering av analysen betingelser ved å teste en utvalg av RT-lampe inkubasjon temperaturer (fra 55 ° C til 70 ° C) og MgSO4 konsentrasjoner (fra 4 mM 10 mm) i multipleks format i fravær av målrette RNA. Gjengitt med tillatelse fra Yaren et al. 201720. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: RT-lampe i sanntid. (A) Singleplex og multiplex grensen for påvisning (LOD) for Zika (ZV) bruker 80 nM FAM-merket strand-fortrenge sonde i sanntid ved hjelp av sanntids PCR instrument (kanal 483-533 nm). Prøvene ble inkubert på 65° C for ca 50 min. (B) fluorescens ble observert skjønt en oransje filtrere etterfulgt av magnetisering av prøvene på 470 nm med blått lys. Eksempler fra A ble brukt for visualisering. (C) sanntid analyse LOD på Chikungunya (CH) målet bruker 80 nM i HEX-bærende lampe sonder i singleplex-format med fluorescens kanalen 523-568 nm på en sanntid PCR-instrument. (D) sanntid analyse LOD på Dengue 1 (D1) mål bruker 80 nM i TAMRA rentebærende lampe sonder i singleplex-format med fluorescens kanalen 558-610 nm på en sanntid PCR-instrument. (E) fastsettelse av maksimal urin innhold RT-lampe reaksjon. En rekke siste urin konsentrasjoner (0%-50%) ble testet med 80 nM FAM-merket sonde i nærvær av 2,85 pfu av Zika vRNA.NTC = ingen mal kontroll på alle paneler. Gjengitt med tillatelse fra Yaren et al. 201720. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Singleplex og multipleks virusoppdaging i urinen bruker 80 nM sonde. (A) Zika gjenkjenning i 10% urin i singleplex og multipleks 2,85 pfu av Zika (ZV) viral RNA med FAM-merket probe (80 nM). (B) Chikungunya gjenkjenning i 10% urin i singleplex og multipleks 242 kopier av Chikungunya (CH) viral RNA med HEX-merket probe (80 nM). (C) Dengue 1 gjenkjenning i 10% urin i singleplex og multipleks 1,22 pfu av Dengue 1 (D1) viral RNA med TAMRA-merket probe (80 nM). (D) effekt av RT-lampe reaksjoner gjennom oransje filtrere etter eksitasjon på 470 nm med blå LED-lyset. Gjengitt med tillatelse fra Yaren et al. 201720. NTC = ingen mal kontroll på alle paneler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Singleplex og multipleks virusoppdaging i urinen med 300 nM sonde. (A) Zika gjenkjenning i 10% urin i singleplex og multipleks 2,85 pfu av Zika (ZV) viral RNA med FAM-merket probe (300 nM). (B) Chikungunya gjenkjenning i 10% urin i singleplex og multipleks 242 kopier av Chikungunya (CH) viral RNA med HEX-merket probe (300 nM). ()C) Dengue 1 gjenkjenning i 10% urin i singleplex og multipleks Formatbruker 1,22 pfu for Dengue1 (D1) viral RNA med TAMRA-merket probe (300 nM). (D) effekt av RT-lampe reaksjoner gjennom oransje filtrere etter eksitasjon på 470 nm med blå LED-lyset. Som en positiv urin eksperimenter, en lampe primer sett målretting menneskelig Mitokondrielt DNA (mtDNA) ble brukt med TET-merket probe (300 nM). NTC = ingen mal kontroll på alle paneler. Gjengitt med tillatelse fra Yaren et al. 201720. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Arbeidsflyt Zika deteksjon av infiserte mygg prøver ved Q-papir-teknologi med sunn og Zika-infiserte Ae. aegypti (ZV 9, tabell 2). Gjengitt med tillatelse fra Yaren et al. 201720. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: boksen observere. (A) den observere boksen bruker to AAA-batterier i basen. Disse batteriene makt fire blå LED-lys som lyser opp prøvene i 0,5 mL rør i de fire hullene. LED-lysene er aktivert med bryter. Prøvene er visualisert gjennom oransje filteret. (B) fluorescens i observasjon-boksen. Fra venstre til høyre: negative, positivt for Zika, negative og positive for Zika. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Målet virus | navn | Sekvens (5 - 3') | Lengde | Startposisjon | Endestilling | |||
| Zika | ZV-F3 | GAGACTGCTTGCCTAG | 16 | 9905 | 9920 | |||
| ZV-B3 | CTGGGGTCTTGTCTTC | 16 | 10145 | 10130 | ||||
| ZV-LF | CAGTTGGAACCCAGTCAAC | 19 | 10028 | 10010 | ||||
| ZV-LB | GTGGAACAGAGTGTGGATTG | 20 | 10093 | 10112 | ||||
| ZV-FIP | CCATGGATTGACCAGGTAGTTTTTTCGACTGATGGCCAATG | 41 | 9974 | 10053 | ||||
| ZV-BIP | ACCACTGARGACATGCTTGTTTTTCATGTGGTCGTTYTCC | 40 | 10070 | 10129 | ||||
| ZV-LB_NatTail |
FAM-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG GTGGAACAGAGTGTGGATTG |
60 | 10093 | 10112 | ||||
| Chikungunya | CH-F3 | CGTCAACGTACTCCTAAC | 18 | 2891 | 2908 | |||
| CH-B3 | ACGTTGGCTTTRTTTTGG | 18 | 3094 | 3077 | ||||
| CH-LF | AGCGTCTTTATCCACGGG | 18 | 2968 | 2951 | ||||
| CH-LB | AYGCATCRATAATGGCGGG | 19 | 3025 | 3043 | ||||
| CH-FIP | GAAGTTTCCTTTCGGTGGGTTTTTGGAAGACACTYTCYGG | 40 | 2932 | 2993 | ||||
| CH-BIP | AAGGAGTGGGAGGTGGATTTTTTCAYTTGGTGACTGCAG | 39 | 3006 | 3063 | ||||
| CH-LF_NatTail |
HEX-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG AGCGTCTTTATCCACGGG |
58 | 2968 | 2951 | ||||
| Dengue-1 | D1-F3 | ACAGCYCTGAATGAYATGG | 19 | 9583 | 9601 | |||
| D1-B3 | GCAGTTTCTCTCAGGC | 16 | 9803 | 9788 | ||||
| D1-LF | CACTTGYTGCCARTCATTCC | 20 | 9666 | 9647 | ||||
| D1-LB | CCATGCCGYAACCAAG | 16 | 9727 | 9742 | ||||
| D1-FIP | CTGGTGGAARTGGTGTGATTTTTTGGGAACCTTCAAAAGG | 40 | 9628 | 9693 | ||||
| D1-BIP | GAAGGAYGGGAGGGAAATAGTTTTTTTAGCCCTRCCCA CAAG |
42 | 9702 | 9763 | ||||
| D1-LB_NatTail |
TAMRA-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG CCATGCCGYAACCAAG |
56 | 9727 | 9742 | ||||
| Mitokondrielt DNA | MtDNA-F3 | AGCCTACGTTTTCACAC | 17 | 9183 | 9199 | |||
| MtDNA-B3 | GCGCCATCATTGGTAT | 16 | 9410 | 9395 | ||||
| MtDNA-LB | GCCTAGCCATGTGATTTCAC | 20 | 9322 | 9341 | ||||
| MtDNA-LF | GGCATGTGATTGGTGGGT | 18 | 9254 | 9237 | ||||
| MtDNA-FIP | GTCATGGGCTGGGTTTTACTTTTTCTACCTGCACGACAAC | 40 | 9213 | 9228 | ||||
| MtDNA-BIP | CTCAGCCCTCCTAATGACCTTTTTGAGCGTTATGGAGTGG | 40 | 9359 | 9344 | ||||
| MtDNA-LB_NatTail |
TET-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG GCCTAGCCATGTGATTTCAC |
60 | 9322 | 9341 | ||||
| Vanlige avsluttes | CTGACCTGACGGACTGAACGGATGGCTGAGCGCA AACCCG-Iowa svart FQ |
40 | ||||||
Tabell 1: primere og strand displaceable sonder. Gjengitt med tillatelse fra Yaren et al. 201720. Sekvenser i fet representerer regionen double-strandet strand fortrenge sonder. FAM-merket (sett som grønne fluorescens), HEX-merket (sett lys grønn-gul fluorescens), TAMRA-merket (sett som orange-rød fluorescens), og TET-merket (sett som gule fluorescens) sonder ble tilordnet oppdage Zika, Chikungunya, Dengue 1, og Mitokondrielt DNA i urin, henholdsvis. FAM har eksitasjon og utslipp maxima 495 nm og 520 nm, henholdsvis. HEX har eksitasjon og utslipp maxima 538 nm og 555 nm, henholdsvis. TAMRA har eksitasjon og utslipp maxima 559 nm og 583 nm, henholdsvis. TET har eksitasjon og utslipp maxima 522 nm og 539 nm, henholdsvis. Hvis du vil aktivere bruken av en enkelt avsluttes for alle fluorophores, ble Iowa svart-FQ brukt på grunn av sitt brede absorpsjon utvalg (420-620 nm).
| Virus, belastning (GenBank tiltredelse tall) | Familie/slekt | Viral titers |
| Zika virus (ZV), Puerto Rico (PRVABC59, KU501215.1) | Flaviviridae/Flavivirus gruppe IV, positiv, ssRNA | 2,85 x 108 pfu/mL |
| Chikungunya virus (CH), Jomfruøyene (asiatisk herkomst, KJ451624) | Togaviridae/Alphavirus gruppe IV, positiv, ssRNA | 2,42 x 108 genomer/mL |
| Chikungunya virus (CH), La Reunion (Indiahavet avstamning, LR2006-OPY1, KT449801) | Togaviridae/Alphavirus gruppe IV, positiv, ssRNA | 1.89 x 108 genomer/mL |
| Chikungunya virus (CH), La Reunion utdraget totale NA fra Aedes aegypti kvinnelige (Indiahavet avstamning, LR2006-OPY1, KT449801) | Togaviridae/Alphavirus gruppe IV, positiv, ssRNA | 3,85 x 105 genomer/mL |
| Dengue serotype 1 (D-1), Key West (FL) (JQ675358) | Flaviviridae/Flavivirus gruppe IV, positiv, ssRNA | 1,22 x 106 pfu/mL |
| Zika (ZV) mygg identitet, belastning | Ben titer pfu/mL | |
| ZV 9, Puerto Rico | 4,76 x 103 |
Tabell 2: Viral titers i cellekulturer og infiserte mygg. PFU: plakk-forming enhet. Gjengitt med tillatelse fra Yaren et al. 201720.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mygg-borne virus inkludert Zika chikungunya og dengue True folkehelsen og siste Zika utbrudd høydepunkt behovet for rimelige point-of-care oppdagelsen alternativer for pasienten diagnostikk og mygg overvåking. Isotermiske forsterkning metoder ble utviklet som rimelige alternativer til PCR-baserte systemer. RT-lampe-baserte plattformer er spesielt brukt for å oppdage en rekke patogener. Men er bruk av isotermiske plattformer hovedsakelig begrenset til én målgjenkjenning. Metoden rapporterte her bruker en modifisert RT-lampe tillate samtidig påvisning av tre ulike mål i en enkelt reaksjonsblandingen, som kjører på en rekke moderate temperaturer (65-68 ° C), vist seg for å være spesielt praktisk fordi minst 60 ° C gjengi Zika og andre virus ikke-smittsomme30,35.
Videre viser dataene som presenteres her at RT-lampen er i stand til å tolerere hemme stoffer som kan finnes i ulike biologiske væsker15. Dette gjør viral RNAs mikrofonfunksjon uten et ekstra trinn for RNA rensing ved direkte å legge til utvalget i reaksjonsblandingen. Avhengig av prøven, det maksimale volumet av prøve lov må man ikke hemme reaksjon og forårsake bakgrunnen fluorescens (feil). Studien presenteres her fokuserer på bruk av 10% siste volum for urinprøver. Spytt og serum kan imidlertid også brukes til analysen i samme måte20. Begrenser av oppdagelsen ble funnet for å være godt over rapporterte viral laster i pasienten urin13, samt virusinfiserte mygg20,36,37.
Mygg overvåking har vanligvis lavere prioritet for folkehelsen ressurser, slik at en rimelig multiplekset kit å kartlegge en husholdning eller et offentlig område ville ha spesiell verdi. Derfor, dette settet ble endret ved tilsetning av Q-papir slik at påvisning av virus i myggen skrotter. Q-papir inneholder høye nivåer av covalently vedlagt kvartær ammonium grupper, som lar erobringen av viral nukleinsyrer på overflaten gjennom coulombic vekselsvirkningene. Selv om det var en bekymring at Q-papir kan hemme RT-lampe, ble det funnet at legger Q-papir bærer myggen skrotter direkte inn RT-lampe blanding, kan vellykket virusoppdaging oppnås innen 30 min. For vellykket signal generasjon, Q-papir må være små nok (f.eksstørrelse som 3 x 4 mm for 100 µL reaksjon volum) dyppes i reaksjonsblandingen RT-lampe. Hvis det er for stor for reaksjon røret, eller starter flytende stedet for gjenværende midt i væsken, reaksjonen kan ikke skje, og resultatene kan vises som feilaktige negativer.
For vellykket gjenkjenning og differensiering av hver virus angi hver primer må følge retningslinjene for RT-lampe primer design, design reglene for fortrenge sonder, og inkluderer et utvalg av fluorophores for multiplexing. Hver primer sett må bli vist mot ulike mål å unngå kryssreaktivitet. I tillegg, magnesium konsentrasjon og inkubasjon temperaturen må være optimalisert for hvert sett. Metoder som presenteres her bruker fluorescens readouts synlig av øyet, som ble oppnådd ved å innføre strand displaceable sonder RT-lampe arkitektur. Tre farger kan visualiseres i en multiplex analysen når ulike fluorophores ble tilordnet hvert mål virus. Dette gir fordelene over eksisterende isotermiske Zika oppdagingsmetoder, siden de fleste publiserte metodene stole på enkelt målgjenkjenning og bruk av intercalating eller fluorescens fargestoffer, som ikke sekvens-spesifikke og er tilbøyelige til å generere Uspesifisert amplicons.
En kritisk skritt å vurdere er fastsettelse av siste konsentrasjonen av fluorescently merket fortrenger sonder. Det ble funnet at 80 til 100 nM i fortrenge sonder kunne generere fluorescens signaler i 15-20 minutter, mens tid å signalisere ble forsinket når 300 nM sonde konsentrasjon ble brukt. Reaksjonstid ble ytterligere forsinket når analyser ble kjørt på en multiplex måte. Grunnen for å bytte fra 80 nM til 300 nM var å aktivere visualisering av alle tre fluorophores ved hjelp av en enkelt LED-kilde. Blå LED med eksitasjon på 470 nm er egnet for FAM-merket sonder, men er mindre egnet til HEX - eller TAMRA-merket sonder. Derfor ble et offer gjort inkubasjonstiden å visualisere alle tre mål.
Et av problemene med RT-lampe er fremover forurensning. RT lamper genererer store mengder amplicon i en kort inkubasjon tid, og amplicons lett kan frigis som aerosoler. For å løse dette problemet, var dUTP inkludert sammen med andre dNTPs etterfulgt av UDG fordøyelsen under analysen oppsett. Det er viktig å bruke en varme-labil versjon av UDG, siden det er nødvendig å deaktivere UDG for å hindre at fordøyelsen av nygenererte RT-lampe amplicons.
For at fordelingen av settet uten kjøling, alle komponentene i analysen måtte være lyofiliserte og kit supplert med en utvanning buffer. Derfor ble noen glyserol i kommersielt tilgjengelig enzymer fjernet av ultrafiltrasjon fordi glycerol ikke kan fjernes ved lyophilization. På høy konsentrasjon i en blanding, kan glyserol forstyrre enzym aktivitet. Bare enzymet ikke inkludert i fjerningen glyserol var den thermolabile UDG. UDG er et lite enzym med molekylvekt av 24,6 kDa, noe som gjør det uegnet for ultrafiltrasjon eksperimenter. Derfor ble det lagt til lyophilization blandingen som kjøpt. Gjenværende glycerol påvirke ikke negativt analysens utfallet.
En av begrensningene for denne fluorescerende RT-lampe teknikken er bruk av enkelt LED kilden. Når analyser kjøres i singleplex eller multiplex format, var høyere konsentrasjoner av fortrenge sonder nødvendig for signalet visualisering av alle mål. Men forårsaker endringen forsinkelser i tidssignalet-generasjon. En mulig måte å overvinne dette kan være bruk av to LED kilder til å bedre betjene den andre fluorophores (HEX og TAMRA). På denne måten kan lavere sonde konsentrasjon brukes til å generere et signal med kortere inkubasjon tid.
En annen begrensning som må vurdering dømmer fluorescens fargen av øyet i et svakt opplyst miljø. Det er enklere hvis et enkelt mål finnes i et singleplex eller multiplex format, siden primere ble designet ikke å samhandle med hverandre. Analysen er vanskeligere å tolke hvis flere mål var tilstede i en singel-analysen tube, som en pool av mygg eller en pasient med flere viral infeksjon. Dette vil kreve en endring av lese-out arkitekturen som et digitalt display i stedet for å dømme av øyet.
En mulig fremtidig tilnærming vil være å øke nivået av multipleksing ved å opprette et større panel av mygg-borne arboviruses. Dette krever forsiktig primer design for å unngå primer-primer interaksjoner, og kan kreve bruk av modifisert nukleinsyre analogs som selv unngå molekylær anerkjennelse systemer (SAMRS) og kunstig utvidet genetisk informasjonssystem (AEGIS) bedre plass høy multipleksing38. Derfor ville løsningen for signalet skrivebeskyttet ut i et høyere multiplex system være å bruke en enkelt fluorophore for hver fortrenger sonde, og for å tilordne en unik fordrevne sekvens for hvert mål og fange fordrevne sonder på en solid overflate av DNA hybridisering. Dette vil skape en matrise-formatert plattform med en enkelt fluorophore og LED å opphisse, men bedømme tilstedeværelsen av hvert mål ville være basert på sin posisjon i matrisen39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Flere av forfatterne og deres institusjoner egne åndsverk tilknyttet denne analysen.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet i en del av FDOH-7ZK15 og NIAID 1R21AI128188-01. Forskningen i denne publikasjonen ble støttes delvis av National Institutes of Allergy og smittsomme sykdommer, og delvis av biomedisinsk forskning Program av Florida Department of Health. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet av NIH eller Florida Department of Health. Dynamisk kombinasjon kjemi LLC er anerkjent for deres støtte og bidrag til dette prosjektet.
Dengue 1 virus (belastning BOL-KW010) ble vennlig levert av Florida Department for Health Bureau of laboratorier. Zika virus og asiatiske slektslinje chikungunya virus ble allernådigst levert av Centers for Disease Control og Prevention. Indiahavet slektslinje chikungunya virus ble vennlig levert av Robert Tesh (verden referanse senter for Emerging virus og Arboviruses, gjennom University of Texas Medical Branch i Galveston, Texas) til den UF-FMEL. Vi takker S. Bellamy, B. Eastmond, S. Ortiz, D. Velez, K. Wiggins, R. ZimLer og K. Zirbel for hjelp med infeksjon studiene. Vi takker også M. S. Kim for å gi Q-papir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
References
- Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
- Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636 (2014).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
- Musso, D., Gubler, D. J.
- Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
- Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
- Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
- Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
- Shukla, S., Hong, S. -Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685 (2016).
- Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295 (2016).
- Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
- Musso, D., et al.
- Gourinat, A. C., O'Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M.
- Notomi, T.
- Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
- Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
- Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
- Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
- Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
- Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
- Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
- Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
- Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605 (2016).
- Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
- Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
- Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
- Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22 (2010).
- Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226 (2015).
- Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
- Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , 62,381,759 (2016).
