Summary
الحالي متعدد التشخيص للكشف عن زيكا، الشيكونغونيا، وفيروسات حمى الضنك تتطلب إعداد نماذج معقدة ومكلفة للأجهزة، وهي صعبة الاستخدام في البيئات قليلة الموارد. علينا إظهار تشخيص التي يستخدمها التضخيم متحاور مع تحقيقات منقولة حبلا محددة الهدف لكشف والتفريق بين هذه الفيروسات مع حساسية عالية وخصوصية.
Abstract
زيكا وحمى الضنك وداء شيكونغونيا الفيروسات تنتقل عن طريق البعوض، تسبب الأمراض مع أعراض المريض مشابهة. ومع ذلك، لديها إمكانات نقل مريض للمتلقين للمعلومات المختلفة، وتتطلب علاجات المريض مختلفة جداً. وهكذا، تفشي Zika مؤخرا تجعل من الملح على تطوير الأدوات التي تميز سرعة هذه الفيروسات في المرضى والمحاصرين البعوض، لتحديد علاج المريض الصحيح، وفهم وإدارة تلك الأوبئة في الوقت الحقيقي.
للأسف، الاختبارات التشخيصية الحالية، بما في ذلك تلك الطوارئ 2016 المستقبلة استخدام أذون والسريع حالة، كشف الجيش الملكي النيبالي الفيروسية بالنسخ العكسي تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR)، الأمر الذي يتطلب أجهزة القياس، تدريب المستخدمين، و إعداد عينة كبيرة. وهكذا، يجب أن ترسل إلى مختبرات مرجعية "المعتمدة"، التي تحتاج إلى وقت. وفي الواقع، في آب/أغسطس عام 2016، المركز لمراقبة الأمراض كان يسأل النساء الحوامل الذين كان عضات البعوض ووضع طفح جلدي تشير إلى Zika الانتظار أمر غير مقبول من 2 إلى 4 أسابيع قبل التعلم ما إذا كانوا مصابين. نحن بحاجة إلى الاختبارات التي يمكن القيام به في الموقع، مع القليل من الموارد والأفراد المدربين ولكن ليس بالضرورة مرخصة كثيرا جداً.
ويوضح هذا الفيديو مقايسة يفي بتلك المواصفات، وتعمل مع البول أو المصل (بالنسبة للمرضى) أو ذبائح سحق البعوض (للمراقبة البيئية)، كل ذلك دون إعداد عينة كثيرا. يتم التقاط جثث البعوض على ورقة تحمل رباعي الأمونيوم المجموعات (س-الورق) تليها المعاملة الأمونيا لإدارة ندركها. هذه بعد ذلك مباشرة، دون عزل الحمض النووي الريبي، توضع في أنابيب المقايسة تتضمن المعصوفه الكواشف التي تحتاج إلى لا سلسلة التبريد. وتنتج صيغة معدلة من النسخ العكسي بوساطة حلقة التضخيم متحاور مع تحقيقات منقولة فلوريسسينتلي كلمات محددة الهدف قراءات، في 30 دقيقة، كإشارة fluorescence ألوان. وهذا هو تصور مع جهاز محمول باليد، والبطارية مع عامل تصفية اللون برتقالي. يتم منع التلوث إلى الأمام مع أنابيب مختومة، واستعمال اليوراسيل ثيرمولابيلي DNA glycosylase (UDG) حضور dUTP في خليط التضخيم.
Introduction
إصابات الفيروسات المنقولة بالبعوض، بما في ذلك حمى الضنك وداء شيكونغونيا وفيروسات Zika على استراتيجيات الإدارة الفورية الارتفاع والطلب. فيروسات حمى الضنك وداء شيكونغونيا بالفعل المستوطنة في كثير من المناطق المدارية حيث ينتشر الآن Zika في نصف الكرة الغربي1. فيروس زكى، مثل حمى الضنك، أحد أفراد عائلة فيروسات مصفرة والأصلية لأفريقيا مع آسيا واحد واثنين من السلالات الجينية الأفريقية2. على الرغم من أن تحديد هوية الفيروس Zika يعود تاريخها إلى عام 1947، ما زالت العدوى Zika في البشر متفرقة لنصف قرن قبل الناشئة في منطقة المحيط الهادئ والأمريكتين. أول اندلاع المبلغ عنها من Zika حمى وقع في جزيرة ياب في ولايات ميكرونيزيا الموحدة في عام 2007، تليها بولينيزيا الفرنسية في عام 2013 و 2014. حدث اندلاع الرئيسية الأولى في الأمريكتين بحلول عام 2015 في البرازيل.
فيروسات زكى وداء شيكونغونيا وحمى الضنك تنتقل أساسا Aedes albopictusو بعوض الزاعجة المصرية . ومع ذلك، قد Zika إمكانيات إضافية انتقال البشر إلى المصب، المحتمل أن ينتشر عن طريق الاتصال الجنسي، وتفاعل الأم إلى الجنين، وعن طريق الرضاعة الطبيعية3،،من45. ويعتقد حمى زيكا أولاً تسبب المرض خفيفة فقط. بيد أنه في وقت لاحق المرتبطة بمتلازمة غيلان باريه في البالغين، وصغر الرأس في المواليد الجدد، والأمراض العضلية الهيكلية المزمنة التي قد الأشهر الأخيرة لسنوات. يمكن أن يكون تحديا تشخيص المرض Zika، نظراً لأعراض عدوى Zika مماثلة لتلك التي ل انتشار البعوض فيروسات أخرى6. الالتهابات المشارك المشتركة من هذه الفيروسات تجعل تشخيص تفاضلية أكثر تحديا7،8. ولذلك، مطلوب الكشف السريع والموثوق بها من الأحماض النووية من Zika وغيره من الفيروسات لفهم وبائيات في الوقت الحقيقي، والشروع في المراقبة، والتدابير الوقائية، وإدارة رعاية المرضى9.
وتشمل الاختبارات التشخيصية الحالية لهذه الفيروسات PCR النسخ العكسي (RT-PCR) وتسلسل الفيروس، الاختبارات المصلية وعزل الفيروس. النهج المصلية القياسية غالباً ما يعانون من حساسية غير كافية والنتائج يمكن أن تكون تعقدت ه في المرضى الذين أصيبوا سابقا بأخرى فلافيفيروسيس.
ولذلك، اختبار الحمض النووي يظل الطريقة الأكثر موثوقية لكشف والتفريق بين هذه الفيروسات. عادة ما يتم إجراء الكشف عن زيكا وغيره من الفيروسات المنقولة بالبعوض باستخدام الرايت-بكر أو RT-PCR الوقت الحقيقي في مجموعة متنوعة من السوائل البيولوجية، مثل مصل الدم والبول واللعاب، السائل المنوي، وحليب الثدي و السائل الدماغي10،11. عينات البول واللعاب المفضل عموما عبر الدم، حيث أنها تظهر أقل PCR-تثبيط، أعلى الأحمال الفيروسية، وجود الفيروس لفترات أطول من الوقت، وزيادة سهولة جمع ومعالجة12،13. ومع ذلك، تشمل الرايت-بكر-تعتمد الاختبارات التشخيصية، خطوات إعداد عينة واسعة ومكلفة معدات الدراجات الحرارية، يجعلها أقل الأمثل للنقطة من الرعاية.
عكس النسخ بوساطة حلقة التضخيم متحاور (RT-مصباح) برز كبديل RT-PCR قوية نظراً لحساسية عالية وخصوصية14، التسامح للمواد المثبطة في البيولوجية عينات15، و العملية في درجة حرارة واحدة، والتي إلى حد كبير يخفض الاعتداء التعقيد والتكاليف المرتبطة بها، يجعلها مناسبة للبيئات قليلة الموارد. RT-مصباح، كما أنه ينفذ تقليديا، تضم ستة أجهزة الإشعال التي تربط إلى ثماني مناطق متميزة ضمن هدف الجيش الملكي النيبالي. أنه يعمل في درجات حرارة ثابتة بين 60 و 70 درجة مئوية، ويستخدم المنتسخة العكسية وبوليميراز الدنا مع حبلا قويا مما أدى إلى تشريد النشاط.
أثناء المراحل الأولية من مصباح RT، الإشعال الداخلية إلى الأمام والخلف (FIP والمقاضاة، الشكل 1A) جنبا إلى جنب مع الإشعال إلى الأمام والخلف الخارجي (F3 و B3) تشكيل هيكل دمبل، هيكل البذور من الأسى مصباح التضخيم. التضخيم هو كذلك عجلت بها حلقة إلى الأمام والخلف الإشعال (LF ورطل)، التي تهدف إلى ربط مناطق واحد الذين تقطعت بهم السبل الدمبل، والنتائج في تشكيل كونكاتيميرس مع تكرار متعددة الحلقات16. مصباح الكلاسيكية فحوصات التعكر على أساس أو قراءات من الحمض النووي إينتيركالاتينج الأصباغ ليست ملائمة تماما للكشف عن نقطة من الرعاية من زكى، حيث يكون مستوى معين من الإرسال المتعدد المطلوب17،18،19. الإرسال المتعدد هو عدم الحصول عليها بسهولة في هذه النظم، كما أنها عرضه لتوليد إيجابيات كاذبة بسبب إيضاحات مسهبة خارج الهدف.
لإدارة هذه المسائل، يضيف الأدب عنصر إضافي في شكل "المسبار مما أدى إلى تشريد حبلا" إلى الكلاسيكية RT-مصباح العمارة20،،من2122. كل مسبار بمنطقة ستراند المزدوجة الخاصة بتسلسل ومنطقة فتيلة واحدة-الذين تقطعت بهم السبل. هو معلم التحقيق مع منطقة واحدة-الذين تقطعت بهم السبل مع 5 '--فلوروفوري، وهو تعديل التحقيق التكميلية مع يحتوي 3' في نهاية. نظراً لغياب الهدف، يلاحظ لا الأسفار بسبب تهجين خيوط التحقيق التكميلي، الذي يجمع فلوروفوري وتقضي إلى مقربة. حضور هدفا، جزء واحد-الذين تقطعت بهم السبل في التحقيق الفلورسنت يربط إلى مجموعتها على الهدف، ومن ثم مددت حبلا مما أدى إلى تشريد بوليميريز. تمديد بوليميريز بعكس كبسولة تفجير يسبب فصل حبلا يحتوي من به حبلا المسمى فلوريسسينتلي تكميلية، السماح لانبعاثات الأسفار (1B الشكل). مع هذا التصميم، يتم إنشاء الإشارة بعد تشكيل الدمبل، تقليل فرص إشارات إيجابية كاذبة.
يمكن جزء مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في التحقيق مما أدى إلى تشريد حبلا أي تسلسل، وعندما يتم تطبيق الإرسال المتعدد، يمكن استخدام نفس تسلسل مع أزواج يحتوي فلوروفوري مختلفة. مع هذا الهندسة المعمارية أو البول الملوث بالفيروس أو المصل أو البعوض أدخلت عينات مسحوق على الورق مباشرة للمقايسة دون تحضير العينة. Read-outs fluorescence ألوان مرئياً للعين البشرية تم إنشاؤها ضمن 30-45 دقيقة، وكانت تصور إشارات بمربع طباعة 3D مراقبة التي تستخدم الصمام أزرق وعامل تصفية اللون برتقالي. التجميد الكواشف RT-مصباح تمكين نشر هذه المجموعة على خفض إعدادات المورد دون حاجة للتبريد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: البعوض كانت الحيوانات فقط مباشرة المستخدمة في هذه الدراسة. وافق الإجراءات لإدارة الدجاج، والدم التي تستخدم لتغذية البعوض المصاب، كبروتوكول إياكوك #201507682 نشر مؤسسات الرعاية الحيوانية في جامعة فلوريدا، واستخدام Committee.Virus وكانت دراسات عدوى البعوض المنجزة في مرفق BSL-3 من "مختبر علم الحشرات الطبية في فلوريدا" في فيرو بيتش، أجريت تجارب سائلة RT-مصباح في مختبر BSL-2 المشتركة فام وفايربيرد LLC العلوم الجزيئية البيولوجية في الاتشوا، فلوريدا.
1-تصميم أجهزة الإشعال وحبلا مما أدى إلى تشريد المسابر
- استخراج تسلسل الفيروسية للضنك 1 من قاعدة بيانات معهد واسع23؛ تسلسل زكى وداء شيكونغونيا من نييد الفيروس الممرض قاعدة البيانات وتحليل الموارد24.
- قم بإنشاء عدة تسلسل التحالفات (MSAs) لمتواليات من اهتمام باستخدام برمجيات العضلات v3.8.3125. استخدام اتفاقات الخدمات الإدارية التي تم إنشاؤها للبحث عن مجموعات الإشعال المصباح داخل منطقة مصانة من الهدف، وتجنب الأهداف غير ذات صلة أو غير المقصودة، مثل التمييز بين الأنواع الفرعية لهدف.
- اتباع قواعد التصميم للإشعال المصباح كما هو موضح على الإنترنت (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/)، والسماح باستخدام القواعد المختلطة في كبسولة تفجير لتغطية اختلاف الفيروس26. لتجنب ه مجموعات التمهيدي، قارن الإشعال المصباح الذي تم إنشاؤه لقاعدة بيانات الفيروسات "رنا نكبي" استخدام "الانفجار نكبي"27. قارن بين كل مجموعة للقضاء على الإشعال التي سوف ديميريزي في مقايسة متعدد باستخدام "الانفجار نكبي" كذلك.
- الشاشة جزء مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في التحقيق مما أدى إلى تشريد حبلا ضد أي تسلسل الجينوم الفيروسي وتسلسل الجينوم البعوض. تعديل 5 '-ينتهي تحقيق ملزم الهدف مع فلوريسسين أميديتي (الاتحاد الماليزي) وصبغ HEX وصبغ 5-كاربوكسيتيتراميثيلرهوداميني (طمره) Zika والشيكونغونيا وحمى الضنك 1، على التوالي.
- وتشمل تمهيدي مراقبة إيجابية لعينات البول. تصميم الإشعال المصباح لاستهداف الحمض النووي البشري. التسمية مما أدى إلى تشريد حبلا التحقيق مع تيت في 5 '--نهاية. المسمى تسمية يحتوي المسابير التي تكمل جزئيا لكل فلوريسسينتلي التحقيق مع (مثلاً، آيوا الأسود-الرمزية) يحتوي على 3 '-نهاية (الجدول 1).
2-فيروس يعزل وإصابة عينات البعوض
- استخدام يعزل الفيروس Zika (سلالة بورتوريكو)، وفيروس الشيكونغونيا (La Réunion أو جزر فرجن البريطانية السلالة) وفيروس حمى الدنج النمط المصلي المسيطر-1 (السلالة الغربية الرئيسية). تحديد التتر الفيروسية باستخدام اللوحة المقايسة28 أو الكمية RT-PCR29. استخراج الكشف الفيروسية باستخدام معدات استخراج الحمض النووي الريبي المتاحة تجارياً.
ملاحظة: يمثل الجدول 2 التتر الفيروسية لكل عزل الفيروس المستخدمة في هذه الدراسة. - اتبع مقالة نشرتها يارن et al. لبروتوكول مفصلة حول عدوى الإناث Ae-مصرية مع فيروسات Zika وشيكونغونيا20. انظر الجدول 2 لعيار الفيروسية العينة البعوض مصابة بفيروس زكى.
3-يقترن اليوراسيل ثيرمولابيلي DNA Glycosylase RT مصباح
-
10 × إعداد ميكس التمهيدي.
- إعداد 100 ميكرومتر الأسهم حل كل التمهيدي والتحقيق (راجع الخطوة 1) عن طريق إضافة nuclease المياه مجاناً. دوامة جيدا ومخزن في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- ميكس التمهيدي X 10 لكل ميليلتر ميكس 16 Zika أو حمى الضنك 1 الميتوكوندريا الحمض النووي المستهدف، من FIP، 16 ميليلتر المقاضاة، المسمى 2 ميليلتر من F3، 2 ميليلتر من B3، 5 ميليلتر من المجلة، 2 ميليلتر من رطل، 3 ميليلتر من الفلورسنت رطل المسبار، 4 ميليلتر من مسبار يحتوي ، و 50 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس لتقديم ما مجموعة 100 ميليلتر الحجم.
- لمزيج ميكس التمهيدي X 10 لداء شيكونغونيا، 16 ميليلتر من FIP، 16 ميليلتر المقاضاة، 2 ميليلتر من F3، 2 ميليلتر من B3، 5 ميليلتر من رطل، 2 ميليلتر من المجلة، 3 ميليلتر من الفلورسنت LF المسمى مسبار و 4 ميليلتر من مسبار يحتوي 50 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس لإعطاء إجمالي حجم 100 ميليلتر.
ملاحظة: أن تركيز التحقيق المذكورة أعلاه يستخدم 300 نيوتن متر من المسبار الفلورسنت النهائي و 400 نانومتر يحتوي المسبار. وبدلاً من ذلك، استخدام 80 نيوتن متر من المسبار المسمى فلوريسسينتلي و 200 نيوتن متر تحقيقاتها تقضي للتحليل في الوقت الحقيقي.
- إضافة 5 ميليلتر من 10 X ميكس التمهيدي (3-من نوع plex، لإضافة 5 ميليلتر من كل 10 X ميكس التمهيدي)، 5 ميليلتر من 10 × التضخيم متحاور المخزن المؤقت (1 X تكوين المخزن المؤقت: 20 مم تريس-HCl المخزن المؤقت الأس الهيدروجيني 8.8، 50 مم بوكل، 10 مم (NH4)2هكذا4، 8 مم MgSO4 ، 0.1% توين-20، 1 مم DTT)، ميليلتر 7 من خليط دنتب (10 مم داتب ودكتب ودجتب؛ 5 مم دتتب و dUTP)، 16 وحدة من دنا بوليميريز، 15 وحدة المنتسخة العكسية، 80 وحدة من مثبط ribonuclease المؤتلف، ووحدتين من ثيرمولابيلي UDG، 1-2 ميليلتر من كميات مختلفة من السادس راؤول الكشف، والماء لجلب إجمالي حجم ما يصل إلى 50 ميليلتر 0.25 مل PCR أنبوب (انظر الجدول للمواد).
- وتشمل فحوصات المراقبة السلبية في هذه المرحلة بالاستعاضة عن حجم الجيش الملكي النيبالي الفيروسية بالمياه. احتضان عينات بين 65-68 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة إلى ح 1، ثم تحليل عن طريق تشغيل 5 ميليلتر لكل عينة على 2.5% [اغروس] هلام في مخزن X TBE 1 يحتوي على اثيديوم بروميد (0.4 ميكروغرام/مل). استخدام 25 bp أو سلم الحمض النووي bp 50 كعلامة على الجل.
ملاحظة: إضافة قالب معين غير المستهدفة اختيارية. - للكشف عن وجود الحمض النووي الريبي المسببة للأمراض، اختبار كل مجموعة التمهيدي وسيطرتها لا-قالب باختلاف تركيز درجة الحرارة و/أو المغنيسيوم، حيث كل مجموعة التمهيدي RT-مصباح تم تصميمه للعمل في درجات حرارة متفاوتة (65 درجة مئوية، إلى 68 درجة مئوية) أو المغنسيوم تركيزات (6 إلى 10 مم النهائي). إعداد التجارب في درجة حرارة الغرفة.
4-استخدام البول ارتفعت الرنا الفيروسي RT مصباح
- اختبار الإشعال RT-مصباح في مختلف التركيزات النهائية للبول (0% و 10%، 20% و 50%) في 50 ميليلتر من رد فعل مجموع حجم. لتركيز البول النهائي 10 ٪، إضافة 1 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي الفيروسية إلى 5 ميليلتر من البول. لتركيز البول النهائي 20%، إضافة 1 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي الفيروسية إلى 10 ميليلتر من البول. لتركيز البول النهائي 50%، إضافة 1 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي الفيروسية إلى 25 ميليلتر من البول.
- للرصد في الوقت الحقيقي RT-مصباح في 10% بول، استخدم أداة PCR الوقت الحقيقي (انظر الجدول للمواد) مع مرشحات فلوروفوري مختلفة.
- قراءة إشارات الأسفار من أمبليكونس المسمى الاتحاد الماليزي زيكا، استخدم عامل تصفية بدءاً من 483 إلى 533 نانومتر؛ لعرافة المسمى أمبليكونس لداء شيكونغونيا، استخدم عامل تصفية بدءاً من 523 إلى 568 نانومتر؛ لطمره المسمى أمبليكونس للضنك 1، استخدم عامل تصفية تتراوح بين 558 610 نانومتر؛ وبالنسبة للمسمى تيت أمبليكونس للحمض النووي، استخدام عامل تصفية بدءاً من 523 إلى 568 شمال البحر الأبيض المتوسط.
ملاحظة: الاتحاد الماليزي على ماكسيما الإثارة والانبعاثات من 495 نانومتر و 520 نانومتر، على التوالي. عرافة قد ماكسيما الإثارة والانبعاثات من 538 نانومتر و 555 نانومتر، على التوالي. طمره قد ماكسيما الإثارة والانبعاثات من 559 نانومتر و 583 شمال البحر الأبيض المتوسط، على التوالي. تيت، ماكسيما الإثارة والانبعاثات من 522 نانومتر و 539 شمال البحر الأبيض المتوسط، على التوالي.
- قراءة إشارات الأسفار من أمبليكونس المسمى الاتحاد الماليزي زيكا، استخدم عامل تصفية بدءاً من 483 إلى 533 نانومتر؛ لعرافة المسمى أمبليكونس لداء شيكونغونيا، استخدم عامل تصفية بدءاً من 523 إلى 568 نانومتر؛ لطمره المسمى أمبليكونس للضنك 1، استخدم عامل تصفية تتراوح بين 558 610 نانومتر؛ وبالنسبة للمسمى تيت أمبليكونس للحمض النووي، استخدام عامل تصفية بدءاً من 523 إلى 568 شمال البحر الأبيض المتوسط.
- لوحات استخدام 96-جيدا وختم اللوحة مع ورقة بلاستيك الشفاف، ثم احتضان عينات في 65-68 درجة مئوية لمدة 60-90 دقيقة وسجل الأسفار كل 30 ثانية باستخدام cycler الخفيفة. في البداية استخدم 80 نيوتن متر المسابر المسمى فلوريسسينتلي، ومن ثم اختبار 300 نانومتر من المسابر المسمى فلوريسسينتلي.
- تحديد الحد الأقصى للكشف عن كل هدف بإضافة متسلسل المخفف الكشف الفيروسية في تركيز البول النهائي بنسبة 10%.
ملاحظة: استخدام مصباح RT في الوقت الحقيقي لتحديد تركيز المغنيسيوم وتركيز التحقيق المسمى فلوريسسينتلي، ودرجة الحرارة المثلى ووقت رد الفعل.
- تحديد الحد الأقصى للكشف عن كل هدف بإضافة متسلسل المخفف الكشف الفيروسية في تركيز البول النهائي بنسبة 10%.
- تصور الأسفار التي تولدها حبلا المسابير منقولة بالعين، استخدام مصدر ضوء LED زرقاء من cycler خفيفة مع الإثارة في 470 نانومتر (أي مربع التفريد هلام مع مصدر الضوء الأزرق المدمج سوف العمل، انظر الجدول للمواد)، وسجل في الصورة مع كاميرا هاتف الخليوي في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
ملاحظة: استخدام 300 نانومتر من المسابر المسمى فلوريسسينتلي، عند الحاجة إلى التصور من كافة الألوان الثلاثة بالعين باستخدام الصمام الأزرق.
5-RT-مصباح على الكشف عن البعوض المصابة Zika استخدام التكنولوجيا ف ورقة
- إعداد رباعي الأمونيوم تعديل عامل تصفية ورقة (س-الورق)، وفقا لأساليب نشرها مسبقاً مع تعديلات طفيفة30.
- تزج ز 1 السليولوز دوائر ورق الترشيح (انظر الجدول للمواد) مع أقطار 3.5 سم في 50 مل من 1.8 في المائة محلول مائي من هيدروكسيد الصوديوم لمدة 15 دقيقة للتنشيط.
- جمع الدوائر ورقة المنشط عن طريق الترشيح الفراغ وثم تزج لهم في 40 مل محلول مائي من كلوريد تريميثيلامونيوم (2، 3-ابوكسيبروبيل) (0.28 ز) بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: الحفاظ على نسبة كتلة من كلوريد تريميثيلامونيوم (2، 3-ابوكسيبروبيل) لتصفية الورق في 0.28 إلى 1. - جمع الورقة الموجبة الناتجة عن طريق الترشيح فراغ، وتحييد مع 50 مل من 1% حمض الخليك.
- يغسل الورق ثلاث مرات مع الإيثانول وأيردري تحت غطاء محرك السيارة مع استمرار تدفق الهواء.
- قص أوراق Q-الورقة إلى مستطيلات صغيرة (3 مم × 4 مم) استخدام لكمه ورقة أو المقص. سحق البعوض Ae. مصرية الإناث يحتمل أن المصابين مع Zika على كل ورقة مدقة الصغرى.
- إضافة إلى كل ميليلتر 20 ورقة من محلول الأمونيا المائية 1 م (الرقم الهيدروجيني ≈ 12) وانتظر لمدة 5 دقائق. ثم تغسل كل ورقة مرة واحدة مع 20 ميليلتر من 50% EtOH ومرة مع 20 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس. أيردري الورقة في مجال السلامة الأحيائية BSL-2 مجلس الوزراء لحوالي 1 ساعة.
ملاحظة: عند هذه النقطة، عينات يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها حتى الاستخدام. - استخدام الملقط، وضع كل ورقة في 100 ميليلتر من خليط رد فعل RT-مصباح واحتضان في 65-68 درجة مئوية عن 45 دقيقة تجعل بالتأكيد إلى غمر كامل الورقة في الحل؛ وينبغي أن لا تكون عائمة. قراءة وتسجيل الأسفار الناجمة عن الفيروس Zika باستخدام مصدر ضوء LED زرقاء وتصفية اللون البرتقالي أو الأصفر.
6-ليوفيليزيشن كواشف RT-مصباح ل 100 ميليلتر من حجم رد الفعل
- إعداد الخليط التمهيدي مصباح X 10 وفقا للقسم 3.1، وإعداد خليط دنتب المحتوية على dUTP وفقا للمادة 3، 2. تخزين خليط التمهيدي ودنتبس في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إعداد 10 مل من إنزيم الغسيل الكلوي العازلة لإزالة الجلسرين، بخلط 100 ميليلتر من 1 م تريس-HCl درجة الحموضة 7.5، ميليلتر 500 1 م بوكل، 2 ميليلتر يدتا 0.5 متر، 100 ميليلتر من 10% X-100 تريتون، 100 ميليلتر من 0.1 م DTT ومل 9.198 المياه خالية من نوكلاس. تخزين في المخزن المؤقت للغسيل الكلوي في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: تأكد من لتصفية (0.2 ميكرون المرشحات) جميع الحلول كاشف المخزن المؤقت قبل استخدامها وتخزينها في 4 درجات مئوية.- استخدام غشاء أولترافيلتريشن مع حد الوقف كاتشين 10 (انظر الجدول للمواد). ضع 350 ميليلتر من المخزن المؤقت للغسيل الكلوي وميليلتر 4 وحدات 32 من بوليميريز الحمض النووي، 2 ميليلتر من 30 وحدة من المنتسخة العكسية و 2 ميليلتر من 80 وحدة من مثبط رناسي في غشاء أولترافيلتريشن وأجهزة الطرد المركزي في 14,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إضافة آخر ميليلتر 350 من المخزن المؤقت للغسيل الكلوي لغشاء أولترافيلتريشن وجهاز الطرد المركزي (14,000 س ز) لإفراغ أنبوب جمع آخر 5 دقيقة وكرر هذه الخطوة ثم الطرد المركزي (14,000 س ز) لمدة 3 دقائق.
- شطف، عكس الغشاء ووضعه في أنبوب مجموعة جديدة. تدور في 1,000 س ز 2 دقيقة قياس حجم شطف؛ إذا كان أقل من 8 ميليلتر، إحضار وحدة التخزين حتى 8 ميليلتر بإضافة المخزن المؤقت للغسيل الكلوي. تخزين شطف في 4 درجات مئوية، وتشرع فورا في الخطوة التالية.
ملاحظة: هذا البروتوكول lyophilization أنبوب واحد، ولكن إعداد 10 على الأقل رد فعل أنابيب في وقت باستخدام نفس الغشاء أولترافيلتراتيون واستخدام نفس الكمية من المخزن المؤقت للغسيل الكلوي.
- مزيج ميليلتر 10 من 10 X مصباح التمهيدي إذا سينجليبليكس (3-من نوع plex، لإضافة 10 ميليلتر من كل 10 X ميكس التمهيدي)، 14 ميليلتر من خليط دنتب ميليلتر 8 من مزيج الإنزيم دياليزيد، 2 ميليلتر من وحدتين من UDG ثيرمولابيلي وميليلتر 66 من نوكلاس مجانية المياه (3-من نوع plex ، استخدم ميليلتر 46) في أنبوب ميكروسينتريفوجي 0.5 مل وإجازة فتح الغطاء. بدلاً من ذلك، قم بإضافة غطاء آخر ثقب بإبرة للسماح للبخار للهروب.
- فورا تجميد هذه الأنابيب في-80 درجة مئوية ح 2، وليوفيليزي الأنبوبة ل h. 4 تغطية قاعة lyophilization مع رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء. عندما يتم المجففة الكواشف، إزالة الأغطية ثقب وإغلاق الغطاء الأصلي وتخزين الأنابيب مع الكواشف المجففة بالتبريد عند 4 درجة مئوية في الظلام.
ملاحظة: الكواشف يمكن أن ليوفيليزيد بين ليلة وضحاها، إذا لزم الأمر.
7-اختبار المجففة بالتبريد الكواشف RT-مصباح في البول وعينات البعوض التي تحتوي على زكى
- استخدام العناصر التالية من المجموعة (انظر الجدول للمواد) ل Zika: المجففة بالتبريد مربع مراقبة طباعة 3D مع البرتقال (عامل تصفية تمرير طويل، قص على ~ 540 نانومتر)، 2 أأأ البطاريات لمراقبة مربع أنابيب رد فعل يسمى ZV للكشف عن زكى، و 1.1 X الإماهة المخزن المؤقت في أنابيب 1.5 مل رأس المسمار.
- إعداد 50 مل 1.1 X العازلة الإماهة عن طريق خلط مل 5.5 من 10 × التضخيم متحاور العازلة التي تأتي جنبا إلى جنب مع بوليميريز الحمض النووي (انظر الجدول للمواد)، 3.3 مل من 100 مم MgSO4، 110 ميليلتر من 0.5 م DTT، ومل 41.09 المياه خالية من نوكلاس. مزيج جيد، الكوة 1 مل هذا الحل إلى 1.5 مل المسمار أعلى الأنابيب، وتخزين في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
- إضافة ميليلتر 90 X 1.1 الإماهة المخزن المؤقت لكل أنبوبة رد فعل (0.5 مل). التأكد من أن السائل يملأ الجزء السفلي من الأنبوب الذي يحتوي على الكواشف المجففة بالتبريد (حل لهم بالاختلاط بالهز، ثم بإيجاز تدور إلى أسفل (س 1,000 ز)). إضافة 10 ميكروليتر من عينة البول ارتفعت مع الجيش الملكي النيبالي الفيروسية لأنابيب رد فعل (انظر الفرع 4-1 لمزيد من التفاصيل).
- إذا كان اختبار البعوض، إضافة مستطيل Q-ورقة عقد البعوض الذبائح (كما أعدت في الخطوات الموصوفة في المقاطع 5.2 و 5.3)، جنبا إلى جنب مع 10 ميليلتر تنقية المياه بدلاً من عينات البول.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، أضف 10 ميليلتر من عينات اللعاب أو المصل بدلاً من البول. إذا كانت العينات المستخرجة من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي، إضافة 2-5 ميليلتر من العينة في خليط امهاء وكاملة مع المياه خالية من نوكلاس إلى 10 ميليلتر من حجم العينة النهائي.
- إذا كان اختبار البعوض، إضافة مستطيل Q-ورقة عقد البعوض الذبائح (كما أعدت في الخطوات الموصوفة في المقاطع 5.2 و 5.3)، جنبا إلى جنب مع 10 ميليلتر تنقية المياه بدلاً من عينات البول.
- أغلق غطاء الأنابيب رد فعل. مكان لهم في كتلة/حمام الحرارة (أو حاضنة) المحددة مسبقاً في 65-68 درجة مئوية. احتضان لمدة 30-45 دقيقة، ولكن لا يزيد عن 1 ح. بعد الحضانة، إزالة الأنبوب من الحرارة. لمنع التلوث لفحوصات المقبلة، ضمان أن هذه الأنابيب لا تزال مغلقة.
- وضع أنابيب رد فعل في مربع الرصد؛ درجة الحرارة ستنخفض إلى درجة الحرارة المحيطة (يفضل أن تكون 25 درجة مئوية). تشغيل التبديل على الجزء الخلفي مربع الرصد. ملاحظة عينة من خلال تصفية البرتقال والتقاط الصورة بواسطة كاميرا هاتف الخليوي الذي يقام على مسافة حيث يملأ الصورة 80% من مجال الرؤية.
ملاحظة: يتحقق التصور أفضل في بيئات منخفضة الضوء. - بعد اكتمال التصور، إيقاف تشغيل التبديل. تخزين أنابيب مختومة في الظلام، ويفضل أن يكون ذلك بالنسبة للتبريد إذا لزم التصور لاحقاً.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في البداية، تم تقييم أداء كل مصباح RT التمهيدي (الجدول 1) مع الركازة الرنا الفيروسي المقابلة، فضلا عن عناصر سلبية قبل التفريد هلام. صممت الإشعال RT-مصباح NS5 المنطقة المستهدفة (المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الرنا) Zika وحمى الضنك 1، ومنطقة nsP2 (بروتين غير الهيكلية P2) لداء شيكونغونيا. كانت قوالب مجموع الحمض النووي الريبي المستخرج من الفيروسية المخزونات المستزرعة في خلايا الكلي (فيرو) القرد الأخضر الأفريقي. وفي إحدى الحالات، تم استخراج مجموع الحمض النووي (DNA والحمض النووي الريبي) من الإناث المصابات بداء شيكونغونيا عبد اللطيف-مصرية (الجدول 2).
يبين الشكل 2 ألف يؤديها بعض النتائج الممثل مع RT-مصباح مع هذه العينات. وفي سينجليبليكس والحالات متعدد (3-بليكسيد)، تظهر المنتجات RT-مصباح كسلم كونكاتيميرس عند تشغيلها على [اغروس] هلام. عينات المراقبة السلبية التي تحتوي على المياه كما أعطى عينة فقط العصابات لكبسولة تفجير أنفسهم، بما في ذلك عنصر التحكم الهدف غير محددة حيث مجموع الحمض النووي المستخرج من غير المصابين عبد اللطيف-مصرية الإناث البعوض كقالب.
لإيجاد الظروف المثلى RT-مصباح، اختبرت تركيزات المغنيسيوم مختلفة ودرجات حرارة الحضانة. ووجد أن أعلى تركيزات المغنيسيوم ودرجات الحرارة المنخفضة يمكن أن تولد أمبليكونس غير محددة، مما يؤدي إلى إيجابيات كاذبة. ولذلك، استخدمت 8 مم من المغنيسيوم والحضانة عند 65 درجة مئوية في جميع التجارب من الآن فصاعدا (الشكل 2).
ويتطلب التفريد جل افتتاح أنبوب رد الفعل، التي يمكن أن تؤدي إلى تلوث المجموعة التالية من التجارب قبل أمبليكونس الذي تم إنشاؤه مسبقاً، مما يؤدي إلى إيجابيات كاذبة. لمنع التلوث، إلى الأمام، استعيض دتتب بنسب متساوية دتتب و dUTP، حيث أن dUTP ستدرج في أمبليكونس RT-مصباح. يؤدي ذلك إلى احتمال تلويث amplicon إلى ركيزة للحمض النووي اليوراسيل glycosylase (UDG) أثناء إعداد أي اللاحقة RT-مصباح31،ردود فعل32. عند استخدام إصدار ثيرمولابيلي من UDG، يمكن هضمها المحتوية على دو أمبليكونس في درجة حرارة الغرفة كما يجري إنشاء العينات RT-مصباح، وسوف يتم إلغاء تنشيط UDG خلال التضخيم متحاور. وعلاوة على ذلك، يمكن فتح الأنبوب رد فعل لتحليل المتلقين للمعلومات، عند الحاجة. بالإضافة إلى استخدام UDG الهضم، ينشئ بنية استخدام المسابير منقولة الأسفار التي يمكن قراءتها بدون الحاجة إلى فتح الأنبوب رد فعل.
يسلم 3A الشكل نتيجة للحد من الكشف عن (اللد) ل Zika استخدام المسابير الفلورسنت استهداف رنا Zika. وأظهرت الدراسات تمييع المسلسل أن فحوصات منخفضة كما يمكن الكشف عن بفو 1.42 في غضون 30 دقيقة في الإنزيم سينجليبليكس أو 3-بليكسيد. عندما كانت المخفف عينات أخرى إلى بفو 0.71، لوحظ إشارة فلورسنت بعد 40 دقيقة للانزيم سينجليبليكس، وبعد 50 دقيقة بالنسبة لمخاليط 3-بليكسيد. بالإضافة إلى مصباح RT في الوقت الحقيقي، وكان تصور الأسفار بعد 35 دقيقة من خلال عامل تصفية برتقال، بعد تعرض عينات للأزرق LED مع الطول موجي إثارة من 470 شمال البحر الأبيض المتوسط (الشكل 3B). وبالمثل، حدود الكشف قيست في نسخ 37.8 و 1.22 بفو الشيكونغونيا وحمى الضنك 1، على التوالي (الشكل 3-D).
لتحديد تركيز البول الأمثل، Zika الفيروسي الحمض النووي الريبي (2.85 بفو) أضيفت إلى تركيزات متفاوتة عينة البول البشري أصيلة (0%، 10%، 20% و 50%). يفترض بسبب الشوارد، الرايت-مصباح إشارة تأخر من 15 إلى 35 دقيقة عندما استخدمت البول 50% في المقايسة. البول 10% مصممة ليكون الحل الأمثل بسبب تقديم خلفية أقل. نظراً لغياب الأهداف Zika، لوحظ لا التضخيم بأي تركيز، ولكن لوحظ أعلى الخلفية الفلورية في عينات مع تركيز البول أعلى (رقم 3E).
للسماح بالإرسال المتعدد مع read-outs الأسفار المختلفة الألوان، 80 نيوتن متر المسابر منقولة حبلا المسمى مع فلوروفوريس مختلفة (الاتحاد الماليزي ل Zika, HEX لداء شيكونغونيا، وتآمرا للضنك 1)، ولكن يرافقه يحتوي نفس (آيوا الأسود-الرمزية) مع تركيز 200 نانومتر. الخلية المستخرجة من ثقافة الفيروسية الكشف (2.85 بفو ل Zika ونسخ الرنا الفيروسي 242 الشيكونغونيا بفو 1.22 للضنك 1) استخدمت كأهداف، وتضعف في البول نسبة 10 في المائة. أظهر تحليل الوقت الحقيقي للبيانات الأسفار تأخير في توليد إشارة (حوالي 10 دقائق) لفحوصات 3-بليكسيد حيث حضر كبسولة تفجير لجميع الأهداف. وفي حالات سينجليبليكس، من ناحية أخرى، اكتمل رد فعل خلال 10-15 دقيقة (الشكل 4 أ-ج). عندما كانت تصور الأسفار باستخدام الصمام الأزرق وتصفية البرتقال، لوحظت الاختلافات في قوة الإشارة ل fluorophores مختلفة، حيث كانت الأكثر وضوحاً أمبليكونس المسمى الاتحاد الماليزي. ومن المتوقع، منذ الإثارة في 470 شمال البحر الأبيض المتوسط الأقرب إلى الحد أقصى الطيف الإثارة الاتحاد الماليزي (الشكل 4).
لتمكين التصور من كافة الألوان الثلاثة مع موجه إثارة الصمام واحدة (470 nm)، زادت تركيزات المسابير منقولة إلى 300 نانومتر ويحتوي يكمل التحقيق إلى 400 نانومتر. وفي حالات سينجليبليكس، اكتمل توليد إشارة داخل 10 دقيقة زيكا و 20 دقيقة لداء شيكونغونيا و 40 دقيقة للضنك 1. في فحوصات 3-بليكسيد، بيد أنها كذلك تأخر 20 دقيقة في جميع فحوصات (الشكل 5A-ج). ومع ذلك، تمكين التضحية في الوقت المناسب لتوليد إشارة التصور من كافة الألوان الثلاثة باستخدام الضوء الأزرق LED مع تصفية البرتقال. ويلاحظ الفلورية الخضراء لاستخدام المسابير 5 '-نهاية المسمى مع الاتحاد الماليزي، الضوء الأخضر والأصفر الأسفار يتم تعيينه إلى الشيكونغونيا المسبار 5'-نهاية المسمى مع ست عشري، حيث يستخدم fluorescence الأحمر البرتقالي 1 حمى الضنك، تحقيقاتها فيها 5 '-نهاية المسمى زيكا مع تمارا (الشكل 5).
لاختبار عينات البعوض مع إمكانية الإصابة Zika، المختبر المصابة Ae. مصرية سحقوا أنثى البعوض (الجدول 2) على مستطيل Q-ورقة، تليها المعاملة الأمونيا لتعقيم الفيروس وربط يتعرض الفيروسية الجيش الملكي النيبالي على الورق Q مشحونة بشكل إيجابي. كان يغسل الورقة بإيجاز مع الإيثانول لإزالة مركبات ترين موجودة في جثث البعوض التي قد تتداخل مع الأسفار قراءات33،34. Q-ورقات ثم كانت مغمورة البعوض التي تحتوي على مباشرة في خليط RT-مصباح، وبعد الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ومضان أخضر مشرق لوحظ وجود فيروس زيكا (الشكل 6).
لتقديم أدوات الكشف دون سلسلة التبريد، وجعل المقايسة سهلة لاستخدام، والكواشف RT-مصباح المجففة بالتبريد ومصحوبة بالمخزن مؤقت الإماهة ومربع طباعة 3D مراقبة التي يستخدمها نانومتر 470 تنبعث منها قيادة وعامل تصفية برتقالي (الشكل 7 ألف)-9 استخدام وحدات تخزين المخزن المؤقت الإماهة وحجم 1 من عينة البول، يمكن أن تتولد الفلورية الخضراء مرئية داخل 30 دقيقة ويمكن التقاط الصورة من أي كاميرا الهاتف الخليوي (الشكل 7). بدلاً من ذلك، أن عينات البعوض في س-ورقة يمكن أن يستخدمها الإنزيم نفسه بإضافة 1 حجم المياه بدلاً من عينة البول.
رقم 1: تصميم المقايسة مصباح (أ) الإشعال RT-مصباح وتشكيل هيكل الدمبل حبلا مما أدى إلى تشريد بوليميريز الحمض النووي. (ب) الأخذ بتشريد حبلا المسابير للسماح لقراءات الإرسال المتعدد، والأسفار، ورصد التقدم المحرز RT-مصباح في الوقت الحقيقي. طبع بإذن من يارن et al. عام 201720. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: جل التحليل الكهربي من أمبليكونس- (أ) الإشعال "مصباح الاختبار" في سينجليبليكس أو متعدد (3-من نوع plex) تنسيق مع الضوابط الصحيحة الموجبة والسالبة. إيجابية تشمل عناصر الجيش الملكي النيبالي الفيروسية المنقاة مع التتر التالية: 2.85 بفو Zika (ZV) ونسخ الجينوم 242 "داء شيكونغونيا" (CH) بفو 1.22 للضنك 1 (D1). زي المجلس الوطني الانتقالي, المجلس الوطني الانتقالي-ج والمجلس الوطني الانتقالي-د الوقوف للتحكم في لا قالب للإشعال Zika وداء شيكونغونيا وحمى الضنك 1 في شكل سينجليبليكس، على التوالي. يقف مجلس الأمن القومي لعنصر التحكم الهدف غير محددة حيث يتم استخراج xNA المجموع (الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي) من خالية من العدوى الزاعجة المصرية عبد اللطيف.. م تقف على علامة (50 زوج قاعدي سلم الحمض النووي). الشروط (ب) الاستغلال الأمثل للفحص قبل الاختبار درجات حرارة حضانة مجموعة RT-مصباح (من 55 درجة مئوية إلى 70 درجة مئوية) واستهداف مجسو متعدد تركيزات4 (من 4 ملم إلى 10 ملم) في تنسيق في الغياب الجيش الملكي النيبالي. طبع بإذن من يارن et al. عام 201720. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: RT-مصباح في الوقت الحقيقي- (أ) سينجليبليكس ومتعدد الحدود للكشف عن (اللد) زيكا (ZV) باستخدام مسبار شمال البحر الأبيض المتوسط المسمى الاتحاد الماليزي حبلا-مما أدى إلى تشريد 80 في الوقت الحقيقي باستخدام أداة PCR الوقت الحقيقي (قناة 483-533 nm). كانت المحتضنة العينات عند 65 درجة مئوية لحوالي 50 دقيقة (ب) الأسفار لوحظ على الرغم من عامل تصفية برتقال متبوعاً بإثارة العينات في 470 شمال البحر الأبيض المتوسط مع الضوء الأزرق. واستخدمت عينات من أ للتصور. (ج) تحليل في الوقت الحقيقي اللد في الهدف الشيكونغونيا (CH) باستخدام 80 نيوتن متر مصباح HEX الحاملة تحقيقات في تنسيق سينجليبليكس باستخدام قناة fluorescence 523-568 نيوتن متر على صك PCR الوقت الحقيقي. (د) تحليل في الوقت الحقيقي اللد على حمى الضنك 1 (D1) أهداف استخدام 80 نيوتن متر مصباح تؤثر طمره تحقيقات في تنسيق سينجليبليكس باستخدام قناة fluorescence 558-610 نيوتن متر على صك PCR الوقت الحقيقي. (ه) تحديد محتوى البول كحد أقصى في رد فعل RT-مصباح. تم اختبار مجموعة من تركيزات البول النهائي (0%-50%) باستخدام مسبار المسمى الاتحاد الماليزي 80 نانومتر حضور بفو 2.85 من Zika vRNA.NTC = لا قالب التحكم في كل اللوحات. طبع بإذن من يارن et al. عام 201720. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: سينجليبليكس ومتعدد الكشف عن الفيروس في البول باستخدام مسبار شمال البحر الأبيض المتوسط 80- (أ) الكشف عن زكى في البول 10% في تنسيق سينجليبليكس ومتعدد باستخدام بفو 2.85 من الجيش الملكي النيبالي الفيروسية Zika (ZV) مع مسبار المسمى الاتحاد الماليزي (80 نانومتر). (ب) الكشف عن داء شيكونغونيا في البول 10% في تنسيق سينجليبليكس ومتعدد باستخدام نسخ 242 من الجيش الملكي النيبالي الفيروسية الشيكونغونيا (CH) مع مسبار المسمى HEX (80 نانومتر). (ج) الكشف عن حمى الضنك 1 في البول 10% في تنسيق سينجليبليكس ومتعدد باستخدام بفو 1.22 من حمى الضنك 1 (D1) الرنا الفيروسي مع مسبار المسمى تمارا (80 نانومتر). (د) ردود فعل التصور RT-مصباح عن طريق تصفية البرتقال بعد الإثارة في 470 شمال البحر الأبيض المتوسط مع ضوء LED أزرق. طبع بإذن من يارن et al. عام 201720. المجلس الوطني الانتقالي = لا قالب التحكم في كل اللوحات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: سينجليبليكس ومتعدد الكشف عن الفيروس في البول باستخدام 300 نانومتر مسبار. (أ) الكشف عن زيكا في البول 10% في تنسيق سينجليبليكس ومتعدد باستخدام بفو 2.85 من الجيش الملكي النيبالي الفيروسية زيكا (ZV) مع مسبار المسمى الاتحاد الماليزي (300 نانومتر). (ب) الكشف عن داء شيكونغونيا في البول 10% في تنسيق سينجليبليكس ومتعدد باستخدام نسخ 242 من الجيش الملكي النيبالي الفيروسية الشيكونغونيا (CH) مع مسبار المسمى HEX (300 نانومتر). (C) الكشف عن حمى الضنك 1 في البول 10% في تنسيق سينجليبليكس ومتعدد باستخدام بفو 1.22 من Dengue1 الرنا الفيروسي (D1) مع مسبار المسمى تمارا (300 نانومتر). (د) ردود فعل التصور RT-مصباح عن طريق تصفية البرتقال بعد الإثارة في 470 شمال البحر الأبيض المتوسط مع ضوء LED أزرق. كعنصر إيجابي في تجارب البول، استخدمت تمهيدي مصباح تعيين استهداف الحمض النووي البشري (متدنا) مع مسبار المسمى تيت (300 نانومتر). المجلس الوطني الانتقالي = لا قالب التحكم في كل اللوحات. طبع بإذن من يارن et al. عام 201720. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: سير العمل للكشف عن زكى لعينات البعوض المصاب باستخدام تكنولوجيا Q-ورقة مع صحية والمصابين Zika عبد اللطيف-مصرية (ZV 9، الجدول 2). طبع بإذن من يارن et al. عام 201720. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: مربع مراقبة- (أ) المراقبة مربع يستخدم اثنين بطاريات AAA في القاعدة. هذه البطاريات الطاقة أربعة مصابيح LED الزرقاء التي تضيء هذه العينات في أنابيب 0.5 مل وضعها في الثقوب الأربعة. يتم تشغيل أضواء LED مع رمز تبديل. هي تصور العينات من خلال مرشح اللون البرتقالي. (ب) الأسفار في مربع الملاحظة. من اليسار إلى اليمين: سلبية وإيجابية ل Zika، السلبية والإيجابية ل Zika. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الفيروسات المستهدفة | الاسم | تسلسل (5 '-3') | طول | موضع البدء | نهاية الموقف | |||
| زيكا | ZV-F3 | جاجاكتجكتجككتاج | 16 | 9905 | 9920 | |||
| ZV B3 | كتجججتكتجتكتك | 16 | 10145 | 10130 | ||||
| ZV LF | كاجتجاكككاجتكاك | 19 | 10028 | 10010 | ||||
| ZV رطل | جتجاكاجاجتجتجاتج | 20 | 10093 | 10112 | ||||
| فيب ZV | ككاتجاتجاككاجتاجتتتتتكجاكتجاتغككاتج | 41 | 9974 | 10053 | ||||
| ZV-المقاضاة | أككاكتجارجاكاتجكتجتتتتكاتجتجتكجتيتكك | 40 | 10070 | 10129 | ||||
| ZV-LB_NatTail |
الاتحاد الماليزي-كججتتجكجكتكاجككاتككجتكاجتككجتكاجتكاج جتجاكاجاجتجتجاتج |
60 | 10093 | 10112 | ||||
| داء شيكونغونيا | CH-F3 | كجتكاكجتاكتككتاك | 18 | 2891 | 2908 | |||
| CH B3 | أكجتجكتترتتتج | 18 | 3094 | 3077 | ||||
| CH LF | أجكجتكتتاتككاكجج | 18 | 2968 | 2951 | ||||
| CH-رطل | أيجكاتكراتاتجكجج | 19 | 3025 | 3043 | ||||
| CH-FIP | جاجتتتككتتكجتججتتتتجاجاكاكتيتسيج | 40 | 2932 | 2993 | ||||
| CH-المقاضاة | آجاجتججاجتجاتتتتتكايتجتجاكتجكاج | 39 | 3006 | 3063 | ||||
| CH-LF_NatTail |
عرافة-كججتتجكجكتكاجككاتككجتكاجتككجتكاجتكاج أجكجتكتتاتككاكجج |
58 | 2968 | 2951 | ||||
| حمى الضنك-1 | دال-1-F3 | أكاجسيكتجاتجاياتج | 19 | 9583 | 9601 | |||
| D1 B3 | جكاجتتكتكتكاجك | 16 | 9803 | 9788 | ||||
| D1 LF | كاكتجيتجككارتكاتكك | 20 | 9666 | 9647 | ||||
| دال-1 رطل | ككاتجككجياككاج | 16 | 9727 | 9742 | ||||
| D1 FIP | كتجتجارتجتجتجاتتتتتججاككتكاااج | 40 | 9628 | 9693 | ||||
| دال-1-المقاضاة | جاجايججاججااتاجتتتتتتاجكككتركككا كاج |
42 | 9702 | 9763 | ||||
| دال-1-LB_NatTail |
طمره-كججتتجكجكتكاجككاتككجتكاجتككجتكاجتكاج ككاتجككجياككاج |
56 | 9727 | 9742 | ||||
| الحمض النووي | متدنا-F3 | أجككتاكجتتتكاكاك | 17 | 9183 | 9199 | |||
| متدنا-B3 | جكجككاتكاتجتات | 16 | 9410 | 9395 | ||||
| متدنا رطل | جككتاجككاتجتجاتتكاك | 20 | 9322 | 9341 | ||||
| LF متدنا | غكاتجتجاتتجتغغت | 18 | 9254 | 9237 | ||||
| فيب متدنا | جتكاتججكتججتتتاكتتتتكتاككتجكاكجاكاك | 40 | 9213 | 9228 | ||||
| متدنا-المقاضاة | كتكاجكككتككتاتجاككتتتتجاجكجتاتجاجتج | 40 | 9359 | 9344 | ||||
| متدنا-LB_NatTail |
تيت كججتتجكجكتكاجككاتككجتكاجتككجتكاجتكاج جككتاجككاتجتجاتتكاك |
60 | 9322 | 9341 | ||||
| يحتوي المشتركة | كتجاككتجاكجاكتجاكجاتجكتجاجكجكا آيوا آكككج الرمزية أسود |
40 | ||||||
الجدول 1: الإشعال والمسابير منقولة حبلا. طبع بإذن من يارن et al. عام 201720. تسلسل في جريئة تمثل منطقة ستراند مما أدى إلى تشريد المسابير مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل. المسمى الاتحاد الماليزي (اعتبار الفلورية الخضراء)، المسمى HEX (ينظر إليه الضوء الأخضر والأصفر الأسفار)، المسمى طمره (اعتبار الأسفار الأحمر البرتقالي)، والمسمى تيت (اعتبار الأسفار الصفراء) تم تعيين تحقيقات للكشف عن Zika والشيكونغونيا وحمى الضنك 1، و الحمض في البول، على التوالي. الاتحاد الماليزي قد ماكسيما الإثارة والانبعاثات في 495 نانومتر و 520 نانومتر، على التوالي. عرافة قد ماكسيما الإثارة والانبعاثات في 538 نانومتر و 555 نانومتر، على التوالي. لقد طمره ماكسيما الإثارة والانبعاثات في 559 نانومتر و 583 شمال البحر الأبيض المتوسط، على التوالي. تيت، ماكسيما الإثارة والانبعاثات في 522 نانومتر و 539 شمال البحر الأبيض المتوسط، على التوالي. لتمكين استخدام يحتوي واحد لجميع فلوروفوريس، استخدمت آيوا الأسود-الرمزية بسبب نطاق واسع الاستيعاب (420-620 نانومتر).
| الفيروس والسلالة (رقم الانضمام إلى بنك الجينات) | الأسرة/جنس | التتر الفيروسية |
| فيروس زكى (ZV)، بورتوريكو (PRVABC59، KU501215.1) | فيروسات مصفرة/مصفر "المجموعة الرابعة"، سرنا إيجابية، | 2.85 × 108 بفو/mL |
| فيروس الشيكونغونيا (CH)، جزر فرجن البريطانية (الآسيوية النسب، KJ451624) | توجافيريداي/الفافيروس "المجموعة الرابعة"، سرنا إيجابية، | 2.42 × 108 مورثات/mL |
| فيروس الشيكونغونيا (CH)، ريونيون (النسب المحيط الهندي، LR2006-OPY1، KT449801) | توجافيريداي/الفافيروس "المجموعة الرابعة"، سرنا إيجابية، | 1.89 × 108 مورثات/mL |
| فيروس الشيكونغونيا (CH)، ريونيون استخراج غ مجموع من بعوض الزاعجة المصرية الإناث (النسب المحيط الهندي، LR2006-OPY1، KT449801) | توجافيريداي/الفافيروس "المجموعة الرابعة"، سرنا إيجابية، | 3.85 × 105 مليلتر الجينوم |
| حمى الضنك النمط المصلي المسيطر 1 (D-1)، "كي ويست" (فلوريدا) (JQ675358) | فيروسات مصفرة/مصفر "المجموعة الرابعة"، سرنا إيجابية، | 1.22 × 106 بفو/mL |
| Zika (ZV) البعوض الهوية، سلالة | المحطة عيار بفو/mL | |
| ZV 9، بورتوريكو | 4.76 × 103 |
الجدول 2: التتر الفيروسية في الثقافات الخلية والبعوض المصاب. [بفو]: وحدة تشكيل اللوحة. طبع بإذن من يارن et al. عام 201720.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الفيروسات المنقولة بالبعوض، بما في ذلك زكى وداء شيكونغونيا وحمى الضنك تهدد الصحة العامة وتسليط الضوء على حالات تفشي Zika الأخيرة الحاجة إلى بدائل منخفضة التكلفة نقطة العناية بالكشف لتشخيص المريض، فضلا عن مراقبة البعوض. وقد وضعت أساليب التضخيم متحاور كبدائل ميسورة للأنظمة المستندة إلى PCR. وبخاصة، طبقت الأنظمة الأساسية المستندة إلى مصباح RT للكشف عن مجموعة واسعة من العوامل الممرضة. ومع ذلك، كان استخدام منصات متحاور تقتصر أساسا على الكشف عن هدف واحد. يستخدم الأسلوب ذكرت هنا مصباح RT معدلة للسماح بالكشف عن واحد من ثلاثة أهداف مختلفة في خليط رد فعل واحد، التي يتم تشغيلها في مجموعة من درجات الحرارة المعتدلة (65-68 درجة مئوية)، ثبت أن تكون مريحة خاصة لدرجات حرارة أعلى من تقديم 60 درجة مئوية Zika وأخرى غير المعدية30،الفيروسات35.
علاوة على ذلك، تظهر البيانات المقدمة هنا أن RT-مصباح قادرة على التغاضي عن تثبيط المواد التي قد تكون موجودة في مختلف السوائل البيولوجية15. يسمح هذا الكشف الفيروسية تضخيم دون خطوة إضافية لتنقية الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة العينة مباشرة إلى الخليط رد فعل. تبعاً لنوع العينة، يسمح الحد الأقصى لحجم العينة يجب أن يكون العزم لا تحول دون رد فعل ولا تسبب الخلفية الفلورية (إيجابية كاذبة). قدمت الدراسة هنا يركز على استخدام 10% من الحجم النهائي لعينات البول. ومع ذلك، يمكن تطبيقها عينات اللعاب والمصل أيضا للفحص في نفس طريقة20. تم العثور على الحدود للكشف عن أن يكون جيدا فوق الأحمال الفيروسية المبلغ عنها في البول المريض13، فضلا عن البعوض المصابة بالفيروس20،،من3637.
مراقبة البعوض عادة ما يكون له أولوية أدنى لموارد الصحة العامة، حتى غير مكلفة متعدد طقم الدراسات الاستقصائية الأسر معيشية أو منطقة عامة ستكون لها قيمة خاصة. لذلك، تعديل هذه المجموعة بإضافة Q-ورقة للسماح بالكشف عن الفيروسات في البعوض جثث. فاء-ورقة تتضمن مستويات عالية من المجموعات المرفقة تساهمي رباعي الأمونيوم، الذي يسمح القبض على الأحماض النووية الفيروسية على سطحه من خلال التفاعلات كولومبيك. حتى ولو كان مصدر قلق أن الورقة ف قد تمنع RT-مصباح، وجد أن بإضافة Q-ورقة تحمل البعوض الذبائح مباشرة في خليط RT-مصباح، يمكن أن يتحقق الكشف عن الفيروسات ناجحة خلال 30 دقيقة. لتوليد إشارة ناجحة، يحتاج Q-ورقة صغيرة كافية (مثلاً، الحجم ك 3 x 4 مم لحجم رد فعل ميليلتر 100) تكون مغمورة في خليط رد فعل RT-مصباح. إذا كان كبير جداً للأنبوب رد فعل، أو يبدأ العائمة بدلاً من البقاء مغمورة في السائل، لا يجوز رد فعل للمكان وقد تظهر النتائج كسلبيات كاذبة.
تعيين كل التمهيدي للكشف الناجح والتفريق بين كل الفيروسات، يحتاج إلى اتباع المبادئ التوجيهية للتصميم التمهيدي RT-مصباح، قواعد التصميم مما أدى إلى تشريد تحقيقات، وتشمل اختيار فلوروفوريس للإرسال المتعدد. تعيين كل التمهيدي يحتاج إلى فحص ضد أهداف مختلفة لتجنب ه. بالإضافة إلى ذلك، يلزم المغنيسيوم تركيز وحضانة درجة الحرارة الأمثل لكل مجموعة. استخدام الأساليب المعروضة هنا قراءات الأسفار مرئية بالعين المجردة، التي أنجزت بإدخال المجسات حبلا منقولة إلى العمارة RT-مصباح. يمكن تصور ثلاثة ألوان مميزة في مقايسة متعدد عندما تم تعيين فلوروفوريس مختلفة لكل الفيروسات المستهدفة. وهذا يوفر مزايا أكثر من أساليب الكشف عن Zika القائمة متحاور، حيث تعتمد معظم الطرق المنشورة على الكشف عن هدف واحد واستخدام الأصباغ إينتيركالاتينج أو الأسفار التي ليست خاصة بالتسلسل وهي عرضه لتوليد أمبليكونس غير محددة.
خطوة حاسمة للنظر هو تحديد تركيز النهائي من المسابر إلى تشريد المسمى فلوريسسينتلي. وقد وجد أن 80 إلى 100 نانومتر لتحل محل تحقيقات يمكن أن تولد إشارات الأسفار داخل 15-20 دقيقة، وحين تأخر الوقت للإشارة إلى عند 300 نانومتر تركيز التحقيق تم استخدامه. كذلك تأخر وقت رد الفعل عندما تم تشغيلها فحوصات بشكل متعدد. والسبب في التحول من 80 نانومتر إلى 300 نانومتر وكان تمكين التصور من جميع fluorophores الثلاثة باستخدام مصدر LED واحد. الأزرق LED مع الإثارة في 470 نانومتر وهي مناسبة لتحقيقات المسمى الاتحاد الماليزي، ولكن أقل ملاءمة لتحقيقات ست عشري أو طمره المسمى. ولذلك، قدم تضحية في وقت الحضانة ليتمكن من تصور جميع الأهداف الثلاثة.
واحدة من المشاكل مع RT-مصباح هو التلوث إلى الأمام. RT-مصباح يولد كميات كبيرة من أمبليكون في فترة حضانة قصيرة، ويمكن أن يفرج أمبليكونس بسهولة كالهباء الجوي. للتخفيف من حدة هذه المشكلة، أدرج dUTP جنبا إلى جنب مع دنتبس الأخرى تليها UDG الهضم أثناء إعداد المقايسة. من المهم استخدام إصدار حرارة مجا من UDG، حيث أنها ضرورية لإلغاء تنشيط UDG منع هضم أمبليكونس RT-مصباح الذي تم إنشاؤه حديثا.
للسماح بتوزيع عدة دون التبريد، وجميع مكونات المقايسة اللازمة المجففة بالتبريد تكون وطقم تستكمل مع المخزن مؤقت الإماهة. ولذلك، تمت إزالة أي والغليسيرول موجودة في الإنزيمات المتوافرة تجارياً قبل أولترافيلتريشن لأنه لا يمكن إزالة الجلسرين من ليوفيليزيشن. بتركيز عال في خليط، والغليسيرول قد تتداخل مع نشاط إنزيم. وكان الإنزيم فقط لم تدرج في عملية إزالة الجلسرين UDG ثيرمولابيلي. UDG إنزيم صغيرة مع الوزن الجزيئي من 24.6 كاتشين، يجعلها غير صالحة للتجارب أولترافيلتريشن. ولذلك، أضيف إلى الخليط ليوفيليزيشن كما تم شراؤها. والغليسيرول المتبقية لم يؤثر سلبا على نتائج الفحص.
أحد أوجه القصور في هذا الأسلوب RT-مصباح فلورسنت يتم استخدام مصدر الصمام وحيد. عندما تم تشغيل الاختبارات في سينجليبليكس أو في تنسيق متعدد، هناك حاجة إلى تركيزات أعلى مما أدى إلى تشريد المسابير للتصور إشارة لجميع الأهداف. ومع ذلك، يؤدي هذا التغيير التأخير في الوقت إلى إشارة الجيل. يمكن أن يكون أحد السبل الممكنة للتغلب على هذه استخدام مصدرين الصمام لاستيعاب أفضل في فلوروفوريس أخرى (ست عشري وطمره). بهذه الطريقة، يمكن استخدام أقل تركيز التحقيق لتوليد إشارة بأوقات حضانة أقصر.
هو الحكم قيد آخر يحتاج إلى النظر في الألوان الفلورية بالعين في بيئة الخافتة. فمن الأسهل إذا كان هدف واحد موجود في سينجليبليكس أو تنسيق متعدد، حيث صممت أجهزة الإشعال لا بالتفاعل مع بعضها البعض. المقايسة سيكون أصعب لتفسير إذا كانت أهداف متعددة موجودة في أنبوب مقايسة واحدة، مثل مجموعة من البعوض أو مريض مع واحد أو أكثر من العدوى الفيروسية. وهذا سيتطلب تغييرا في بنية القراءة، مثل شاشة رقمية بدلاً من الحكم بالعين المجردة.
نهج محتمل في مستقبل سيكون لزيادة مستوى الإرسال المتعدد عن طريق إنشاء فريق أكبر من سيتناقش التي ينقلها البعوض. وهذا يتطلب عناية التمهيدي تصميم لتجنب التفاعلات التمهيدي-التمهيدي، وقد تحتاج إلى استخدام النظير تعديل الحمض النووي مثل تجنب الذاتية أنظمة التعرف الجزيئي (سامرس) ومصطنع توسيع نظام المعلومات الوراثية (رعاية) إلى أفضل احتواء ارتفاع مستوى الإرسال المتعدد38. تبعاً لذلك، سيكون الحل لقراءة الإشارات في نظام متعدد أعلى لاستخدام فلوروفوري واحد لكل مسبار إلى تشريد، ولتعيين تسلسل المشردين فريدة من نوعها لكل هدف والتقاط المسابير المشردين على سطح صلب بالحمض النووي التهجين. هذا يؤدي إلى إنشاء منصة تهيئة الصفيف مع فلوروفوري واحد والصمام لإثارة، ولكن الحكم على وجود كل هدف على أساس موقفها في صفيف39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
العديد من المؤلفين ومؤسساتها الخاصة الملكية الفكرية المرتبطة بهذا الفحص.
Acknowledgments
وأيد العمل في جزء 7ZK15 فدوة ونييد 1R21AI128188-01. كان يؤيد البحث عنها في هذا المنشور في الجزء "المعاهد الوطنية للحساسية" و "الأمراض المعدية"، وجزئياً "الطب الحيوي البحث البرنامج من فلوريدا وزارة الصحة". المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة أو وزارة الصحة ولاية فلوريدا. شركة الكيمياء التوافيقيه دينامية المسلم لدعمها ومساهمتها في هذا المشروع.
وكان فيروس حمى الضنك 1 (سلالة BOL-KW010) يرجى المقدمة "إدارة ولاية فلوريدا من مكتب الصحة" المختبرات. فيروس Zika وسلالته الآسيوية من فيروس الشيكونغونيا قدمت مشكورا المراكز للسيطرة على الأمراض والوقاية. يرجى قدم النسب المحيط الهندي من فيروس الشيكونغونيا روبرت تيش (مركز الإحالة العالم بحثاً عن الفيروسات الناشئة وسيتناقش، من خلال فرع جامعة تكساس الطبية في غالفيستون، تكساس) إلى الجبهة المتحدة-فميل. ونشكر س. بيلامي، ابستموند ب، س. أورتيز، فيليز دال، يغينز ك.، زيملير ر. وزيربيل ك. للمساعدة في دراسات عدوى. ونشكر أيضا م. س. كيم لتقديم الورقة Q.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
References
- Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
- Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636 (2014).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
- Musso, D., Gubler, D. J.
- Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
- Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
- Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
- Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
- Shukla, S., Hong, S. -Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685 (2016).
- Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295 (2016).
- Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
- Musso, D., et al.
- Gourinat, A. C., O'Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M.
- Notomi, T.
- Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
- Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
- Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
- Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
- Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
- Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
- Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
- Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
- Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605 (2016).
- Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
- Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
- Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
- Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22 (2010).
- Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226 (2015).
- Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
- Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , 62,381,759 (2016).
