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Biochemistry

मल्टीप्लेक्स इज़ोटेर्माल प्रवर्धन आधारित नैदानिक मंच Zika, Chikungunya, और डेंगू का पता लगाने के लिए 1

Published: March 13, 2018 doi: 10.3791/57051
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 1,3
1Foundation for Applied Molecular Evolution (FfAME), 2Florida Medical Entomology Laboratory, University of Florida, 3Firebird Biomolecular Sciences LLC

Summary

वर्तमान मल्टीप्लेक्स निदान Zika, chikungunya, और डेंगू वायरस का पता लगाने के लिए जटिल नमूना तैयारी और महंगी इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता होती है, और कम संसाधन वातावरण में उपयोग करने के लिए कठिन है । हम एक नैदानिक कि लक्ष्य विशेष किनारा विस्थापन जांच के साथ इज़ोटेर्माल प्रवर्धन का पता लगाने और उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ इन वायरस अंतर का उपयोग करता है दिखाते हैं ।

Abstract

Zika, डेंगू, और chikungunya वायरस मच्छरों द्वारा फैलता है, इसी तरह के रोगी लक्षण के साथ रोगों के कारण । हालांकि, वे अलग बहाव रोगी के लिए रोगी संचरण क्षमता है, और बहुत अलग रोगी उपचार की आवश्यकता होती है । इस प्रकार, हाल ही में Zika प्रकोप यह उपकरण है कि तेजी से रोगियों और फंसे मच्छरों में इन वायरस भेदभाव, सही रोगी उपचार का चयन करने के लिए, और समझने और वास्तविक समय में उनके जानपदिक रोग विज्ञान का प्रबंधन करने के लिए विकसित करने के लिए अत्यावश्यक बनाते हैं ।

दुर्भाग्य से, 2016 आपातकालीन उपयोग प्राधिकरण और फास्ट ट्रैक स्थिति प्राप्त करने सहित वर्तमान नैदानिक परीक्षणों, रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर), जो इंस्ट्रूमेंटेशन, प्रशिक्षित उपयोगकर्ताओं की आवश्यकता है द्वारा वायरल आरएनए का पता लगाने, और काफी नमूना तैयारी । इस प्रकार, वे "अनुमोदित" संदर्भ प्रयोगशालाओं के लिए भेजा जाना चाहिए, समय की आवश्यकता होती है । दरअसल, अगस्त 2016 में, रोग नियंत्रण के लिए केंद्र (सीडीसी) गर्भवती महिलाओं को जो एक मच्छर ने काटा गया था पूछ रहा था और एक Zika का संकेत दाने विकसित करने के लिए सीखने से पहले एक अस्वीकार्य 2 से 4 सप्ताह इंतजार है कि वे संक्रमित थे । हम बहुत अधिक परीक्षण है कि साइट पर किया जा सकता है की जरूरत है, कुछ संसाधनों के साथ, और प्रशिक्षित लेकिन जरूरी नहीं कि लाइसेंस प्राप्त कर्मियों द्वारा ।

यह वीडियो एक परख है कि इन विनिर्देशों को पूरा करता है, मूत्र या सीरम (रोगियों के लिए) या कुचल मच्छर लावे (पर्यावरण निगरानी के लिए) के साथ काम, सब बहुत नमूना तैयारी के बिना दर्शाता है । मच्छर लावे कागज पर कब्जा कर लिया चतुर्धातुक अमोनियम समूहों (क्यू कागज) अमोनिया उपचार द्वारा पीछा करने के लिए कर रहे है के लिए खतरा । ये तो सीधे, आरएनए अलगाव के बिना कर रहे हैं, परख स्थिर युक्त एजेंट है कि प्रशीतन की कोई श्रृंखला की जरूरत है ट्यूब में डाल दिया । रिवर्स प्रतिलेखन पाश के एक संशोधित रूप-लक्ष्य के साथ मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन-विशिष्ट फ्लोरोसेंट टैग विस्थापित जांच readout पैदा करता है, 30 मिनट में, एक तीन रंग प्रतिदीप्ति संकेत के रूप में. यह एक handheld, बैटरी चालित एक नारंगी फिल्टर के साथ डिवाइस के साथ कल्पना की है । आगे संदूषण सील ट्यूबों के साथ रोका है, और प्रवर्धन मिश्रण में dUTP की उपस्थिति में thermolabile uracil डीएनए glycosylase (UDG) का उपयोग करें ।

Introduction

डेंगू, chikungunya, और Zika वायरस सहित मच्छर जनित विषाणु संक्रमण बढ़ रहे हैं और तत्काल प्रबंधन रणनीतियों की मांग कर रहे हैं । डेंगू और chikungunya वायरस पहले से ही उष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में से कई में स्थानिकमारी वाले हैं, जहां Zika अब पश्चिमी गोलार्द्ध1में फैल रहा है । Zika वायरस, डेंगू की तरह, Flaviviridae परिवार का एक सदस्य है और एक एशियाई और दो अफ्रीकी आनुवंशिक वंश2के साथ अफ्रीका के मूल निवासी है । हालांकि Zika वायरस की पहचान 1947 को वापस तिथियों, मनुष्यों में Zika संक्रमण प्रशांत और अमेरिका में उभरने से पहले एक आधा सदी के लिए छिटपुट बने रहे । Zika ज्वर की पहली रिपोर्ट प्रकोप माइक्रोनेशिया के संयुक्त राज्य अमेरिका में 2007 में याप के द्वीप पर हुई, फ्रेंच पोलिनेशिया द्वारा 2013 और 2014 में पीछा किया । अमेरिका में पहला बड़ा प्रकोप ब्राजील में 2015 में हुआ ।

Zika, chikungunya, और डेंगू वायरस मुख्यतः एडीज aegypti और एडीज albopictusसे फैलता है । हालांकि, Zika अतिरिक्त बहाव मानव के लिए मानव संचरण संभावनाओं, यौन संपर्क, मां से भ्रूण बातचीत के माध्यम से फैलता जा रहा है, और स्तनपान के माध्यम से3,4,5। Zika बुखार को पहले केवल हल्के बीमारी का कारण माना गया था. हालांकि, यह बाद में वयस्कों में Guillain-Barré सिंड्रोम, नवजात शिशुओं में microcephaly के साथ जुड़ा हुआ था, और पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस रोगों है कि साल के लिए पिछले महीने मई । Zika बीमारी के निदान चुनौतीपूर्ण हो सकता है, के बाद से एक Zika संक्रमण के लक्षण अन्य मच्छर फैले वायरस के उन लोगों के समान हैं6. आम सह इन विषाणुओं के संक्रमण में अंतर निदान भी अधिक7,8चुनौतीपूर्ण बनाते हैं । इसलिए, Zika और अंय वायरस से न्यूक्लिक एसिड का तेजी से और विश्वसनीय पता लगाने के लिए वास्तविक समय में जानपदिक रोग विज्ञान को समझने की जरूरत है, नियंत्रण और निवारक उपायों शुरू करने के लिए, और रोगी देखभाल9का प्रबंधन ।

इन वायरसों के लिए वर्तमान नैदानिक परीक्षणों में सीरम वैज्ञानिक परीक्षण, वायरस अलगाव, वायरस अनुक्रमण, और रिवर्स-प्रतिलेखन पीसीआर (RT-पीसीआर) शामिल हैं । मानक सीरम वैज्ञानिक दृष्टिकोण अक्सर अपर्याप्त संवेदनशीलता से ग्रस्त है और परिणाम जो पहले से अंय flaviviruses द्वारा संक्रमित किया गया है रोगियों में क्रॉस-जेट द्वारा जटिल हो सकता है ।

इसलिए, न्यूक्लिक एसिड परीक्षण इन वायरस का पता लगाने और अंतर करने के लिए सबसे विश्वसनीय तरीका रहता है । Zika और अन्य मच्छर जनित विषाणुओं का पता लगाने आमतौर पर आरटी-पीसीआर या वास्तविक समय आरटी-पीसीआर का उपयोग जैविक तरल पदार्थ, जैसे सीरम, मूत्र, लार, वीर्य, स्तन के दूध, और मस्तिष्क द्रव10,11के रूप में किया जाता है । मूत्र और लार के नमूने आम तौर पर खून से अधिक पसंद कर रहे हैं, क्योंकि वे कम पीसीआर प्रदर्शन, अवरोध, उच्च वायरल लोड, समय की लंबी अवधि के लिए वायरस उपस्थिति, और संग्रह में वृद्धि की आसानी और हैंडलिंग12,13. आर टी-पीसीआर आधारित नैदानिक परीक्षण, तथापि, व्यापक नमूना तैयारी कदम और महंगा थर्मल सायक्लिंग उपकरण शामिल हैं, यह बात की देखभाल के लिए कम इष्टतम बना ।

रिवर्स प्रतिलेखन पाश-मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (आरटी-लैंप) अपनी उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता14, जैविक नमूनों में निरोधात्मक पदार्थों के लिए अपनी सहनशीलता15के कारण एक शक्तिशाली आरटी-पीसीआर विकल्प के रूप में उभरा है, और एकल तापमान पर आपरेशन, जो काफी परख जटिलता और संबद्ध लागत कम करती है, यह कम संसाधन वातावरण के लिए उपयुक्त बना । RT-दीपक, के रूप में यह प्रतिष्ठित लागू किया जाता है, छह प्राइमरों कि लक्ष्य आरएनए के भीतर आठ अलग क्षेत्रों के लिए बाध्य शामिल हैं. यह 60 डिग्री सेल्सियस और 70 डिग्री सेल्सियस के बीच लगातार तापमान पर चलाता है, और एक रिवर्स transcriptase और मजबूत किनारा गतिविधि को बदलने के साथ एक डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करता है ।

RT-लैंप, फॉरवर्ड और पिछड़े आंतरिक प्राइमरों (FIP और बिप, आंकड़ा 1a) के प्रारंभिक चरणों के दौरान बाहरी आगे और पीछे प्राइमरों के साथ (F3 और B3) एक dumbbell संरचना फार्म, घातीय लैंप प्रवर्धन की बीज संरचना । प्रवर्धन आगे पाश और पिछड़े प्राइमरों (वामो और पौंड), जो dumbbell के एकल असहाय क्षेत्रों बांध करने के लिए तैयार कर रहे हैं द्वारा त्वरित है, और एकाधिक दोहरा छोरों के साथ concatemers के गठन में परिणाम16. turbidity या डीएनए intercalating रंजक द्वारा readout के आधार पर शास्त्रीय लैंप परख पूरी तरह से Zika, जहां मल्टीप्लेक्स के कुछ स्तर वांछित है के बिंदु की देखभाल का पता लगाने के लिए अनुकूल नहीं है17,18,19। मल्टीप्लेक्स आसानी से इन प्रणालियों में प्राप्त नहीं है, क्योंकि वे झूठी-सकारात्मक बंद लक्ष्य प्रवर्धन के कारण उत्पंन करने के लिए प्रवण हैं ।

इन मुद्दों का प्रबंधन करने के लिए, साहित्य शास्त्रीय आरटी-दीपक वास्तुकला20,21,22के लिए एक "किनारा-जगह जांच" के रूप में एक अतिरिक्त घटक जोड़ता है । प्रत्येक जांच एक अनुक्रम विशिष्ट दोहरे-किनारा क्षेत्र और एक एकल असहाय भड़काना क्षेत्र है । एकल-कतरा क्षेत्र के साथ जांच एक 5 ' के साथ टैग-fluorophore है, और पूरक जांच एक 3 ' अंत शमनकर्ता के साथ संशोधित किया गया है । एक लक्ष्य के अभाव में, कोई प्रतिदीप्ति पूरक जांच किस्में, जो fluorophore और शमनकर्ता करीब निकटता में लाता है की संकरण के कारण मनाया जाता है । एक लक्ष्य की उपस्थिति में, फ्लोरोसेंट जांच के एकल-असहाय भाग के लक्ष्य पर अपने पूरक को बांधता है, और फिर एक कतरा पोलीमरेज़ जगह से बढ़ा है । इसके अलावा रिवर्स प्राइमरों द्वारा पोलीमरेज़ विस्तार इसके पूरक फ्लोरोसेंट लेबल कतरा से शमन किनारा की जुदाई का कारण बनता है, प्रतिदीप्ति के उत्सर्जन की अनुमति (आंकड़ा 1b)। इस डिजाइन के साथ, संकेत dumbbell गठन के बाद उत्पन्न होता है, झूठी सकारात्मक संकेतों की संभावना को कम करने.

किनारा-विक्रमण जांच के दोहरे कतरा भाग किसी भी अनुक्रम हो सकता है, और जब मल्टीप्लेक्स लागू किया जाता है, एक ही अनुक्रम अलग fluorophore-शमन के जोड़े के साथ प्रयोग किया जा सकता है । इस वास्तुकला के साथ, वायरस दूषित मूत्र, सीरम, या मच्छर के नमूने कागज पर squished सीधे नमूने की तैयारी के बिना परख करने के लिए पेश किया गया । तीन रंग प्रतिदीप्ति पढ़ने के बहिष्कार मानव आंख को दिखाई 30-45 मिनट के भीतर उत्पंन किया गया, और संकेत एक 3 डी-मुद्रित अवलोकन बॉक्स है कि एक नीली एलईडी और एक नारंगी फिल्टर का उपयोग करता है द्वारा visualized थे । फ्रीज-आर टी-लैंप रिएजेंट्स इस किट के परिनियोजन के लिए प्रशीतन के लिए एक की आवश्यकता के बिना कम संसाधन सेटिंग्स सक्षम है ।

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Protocol

नोट: मच्छरों के ही जानवर थे सीधे इस अध्ययन में इस्तेमाल किया । मुर्गियों, जिसका रक्त संक्रमित मच्छरों को खिलाने के लिए इस्तेमाल किया गया था का प्रबंधन करने के लिए प्रक्रियाओं, फ्लोरिडा विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा #201507682 IACUC प्रोटोकॉल के रूप में अनुमोदित किया गया. वायरस के प्रसार और मच्छर संक्रमण अध्ययन किया गया वीरो Beach, fl में फ्लोरिडा मेडिकल Entomology प्रयोगशाला के बीएसएल-3 सुविधा पर प्रदर्शन किया-लैंप प्रयोगों बीएसएल-2 FfAME और Firebird Alachua, fl में जैव आणविक विज्ञान LLC द्वारा साझा प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया गया ।

1. प्राइमर और किनारा के डिजाइन की जगह जांच

  1. डेंगू के लिए वायरल अनुक्रम निकालें 1 व्यापक संस्थान डाटाबेस से23; NIAID वायरस रोगजनक डेटाबेस और विश्लेषण संसाधन24से Zika और chikungunya के लिए अनुक्रम ।
    1. सॉफ्टवेयर मांसपेशी v 3.8.3125का उपयोग कर ब्याज के अनुक्रम के लिए एकाधिक अनुक्रम संरेखण (MSAs) बनाएँ । का प्रयोग करें उत्पंन MSAs के लिए खोज करने के लिए लैंप प्राइमरों के लक्ष्य के एक संरक्षित क्षेत्र के भीतर सेट, और गैर प्रासंगिक या अवांछित लक्ष्य से बचने के लिए, जैसे एक लक्ष्य के उपप्रकार के बीच भेद ।
  2. लैंप प्राइमरों के लिए डिजाइन नियमों का पालन के रूप में वर्णित ऑनलाइन (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/), और प्राइमरों में मिश्रित ठिकानों के उपयोग की अनुमति के लिए वायरस विचलन को कवर26। प्राइमर सेट के पार से बचने के लिए, NCBI ब्लास्ट27का उपयोग कर NCBI आरएनए वायरस डेटाबेस के लिए उत्पन्न दीपक प्राइमरों की तुलना करें । एक सेट की तुलना में प्राइमर है कि NCBI विस्फोट का उपयोग करके एक मल्टीप्लेक्स परख में dimerize होगा को खत्म करने के रूप में अच्छी तरह से ।
  3. स्क्रीन-किसी भी वायरल जीनोम अनुक्रम और मच्छर जीनोमिक अनुक्रम के खिलाफ किनारा-जगह के दोहरे फंसे हिस्से की जांच । संशोधित 5 '-fluorescein amidite (FAM), हेक्स डाई, और 5-carboxytetramethylrhodamine (तमृ) Zika, chikungunya, और डेंगू 1, क्रमशः के लिए डाई के साथ लक्ष्य बाध्यकारी जांच के समाप्त होता है ।
    1. एक सकारात्मक नियंत्रण प्राइमर मूत्र नमूनों के लिए सेट शामिल हैं । डिजाइन लैंप प्राइमरों मानव mitochondrial डीएनए को लक्षित करने के लिए । लेबल कतरा-' 5 '-अंत पर TET के साथ जांच की जगह । लेबल शमनकर्ता जांच है कि आंशिक रूप से शमन के साथ प्रत्येक फ्लोरोसेंट लेबल जांच (जैसे, आयोवा काले-FQ) पर 3 '-end (तालिका 1) के पूरक हैं ।

2. वायरस अलग और संक्रमित मच्छर के नमूने

  1. उपयोग Zika वायरस (पर्टो रीको तनाव), Chikungunya वायरस (La Réunion या ब्रिटिश वर्जिन आइलैंड्स तनाव), और डेंगू सीरोटाइप-1 वायरस (कुंजी पश्चिम तनाव) के अलग । निर्धारित वायरल titers पट्टिका परख28 या मात्रात्मक आरटी-पीसीआर29का उपयोग कर । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर वायरल RNAs निकालें ।
    नोट: तालिका 2 इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक वायरस के वायरल titers का प्रतिनिधित्व करता है ।
  2. Yaren एट अल द्वारा प्रकाशित लेख का पालन करें. Zika और chikungunya वायरस20के साथ एई. aegypti महिलाओं के संक्रमण के बारे में एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए । Zika वायरस से संक्रमित मच्छर के नमूने के वायरल titer के लिए तालिका 2 देखें ।

3. भ-चिराग Thermolabile Uracil डीएनए Glycosylase के साथ युग्मित

  1. 10x प्राइमरी मिक्स तैयारी ।
    1. प्रत्येक प्राइमर और जांच के 100 µ मीटर स्टॉक समाधान तैयार करें (चरण 1 देखें) nuclease मुक्त पानी जोड़कर । भंवर अच्छी तरह से और दुकान पर-20 ° c उपयोग तक ।
    2. प्रत्येक Zika, डेंगू 1, या mitochondrial डीएनए लक्ष्य के लिए 10x प्राइमरी मिश्रण के लिए, मिश्रण 16 µ l के FIP, 16 µ l बिप, 2 µ l की F3, 2 µ l की B3, 5 µ l की वामो, 2 µ l की £, 3 µ l की lb-फ्लोरोसेंट लेबल जांच, 4 µ l की शमनकर्ता जांच , और nuclease-नि: शुल्क जल के 50 µ l को कुल 100 µ l की मात्रा दे ।
    3. Chikungunya के लिए 10x प्राइमरी मिक्स के लिए, FIP के 16 µ l को मिक्स करें, 16 µ l बिप, 2 µ l का F3, 2 µ l की B3, 5 µ l के पौंड, 2 µ l की वामो की, 3 µ l की वामो-फ्लोरोसेंट लेबल जांच की, 4 µ l की शमनकर्ता जांच की, और 50 µ l की nuclease-मुक्त पानी की कुल 100 µ l की मात्रा दे.
      नोट: जांच एकाग्रता ऊपर वर्णित अंतिम फ्लोरोसेंट जांच के 300 एनएम और शमनकर्ता जांच के 400 एनएम का उपयोग करता है । वैकल्पिक रूप से, उपयोग 80 से अधिक फ्लोरोसेंट लेबल की जांच और 200 एनएम के अपने शमनकर्ता जांच के लिए वास्तविक समय विश्लेषण ।
  2. 10x प्राइमरी मिश्रण के 5 µ एल जोड़ें (3 के लिए-plex, प्रत्येक 10x प्राइमरी मिश्रण के 5 µ एल जोड़ें), 5 µ एल के 10x इज़ोटेर्माल प्रवर्धन बफर (1x बफर संरचना: 20 मिमी Tris-एचसीएल बफर पीएच 8.8, 50 मिमी KCl, 10 मिमी (एनएच4)2तो4, 8 मिमी MgSO4 , 0.1% के बीच-20, 1 मिमी डीटीटी), dNTP मिक्सचर के 7 µ एल (10 एमएम के dATP, dCTP और dGTP के; 5 एमएम के dTTP और dUTP), डीएनए पोलीमरेज़ की 16 यूनिट, रिवर्स Transcriptase की 15 इकाइयां, रिकॉमबिनेंट ribonuclease अवरोधक की 80 इकाइयां, thermolabile UDG की 2 इकाइयां, छठी की अलग मात्रा की 1-2 µ l ्ल RNAs, और पानी की कुल मात्रा को 50 µ एल तक लाने के लिए 0.25 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  3. वायरल आरएनए की मात्रा को पानी के साथ बदलकर इस स्तर पर नकारात्मक नियंत्रण परख शामिल करें । 45 मिनट के लिए 1 एच के लिए 65-68 डिग्री सेल्सियस के बीच के नमूने की मशीन, तो 1x TBE बफर युक्त ethidium ब्रोमाइड में 2.5% agarose जेल पर प्रत्येक नमूने के 5 µ एल चलाने से विश्लेषण (0.4 µ जी/एमएल) । जेल पर मार्कर के रूप में एक 25 बीपी या 50 बीपी डीएनए सीढ़ी का प्रयोग करें ।
    नोट: एक गैर-लक्ष्य विशिष्ट टेम्पलेट के अतिरिक्त वैकल्पिक है ।
  4. रोगजनक आरएनए की उपस्थिति का पता लगाने के लिए, प्रत्येक प्राइमरी सेट और तापमान और/या मैग्नीशियम एकाग्रता अलग से अपनी नहीं टेंपलेट नियंत्रण परीक्षण, प्रत्येक RT-लैंप प्राइमर सेट के बाद से अलग तापमान में काम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था (65 ° c 68 डिग्री सेल्सियस) या मैग्नीशियम सांद्रता (6 से 10 मिमी अंतिम) । कमरे के तापमान पर प्रयोगों को तैयार करें ।

4. RT-लैंप वायरल आरएनए का उपयोग कर-मूत्र नुकीला

  1. टेस्ट आरटी-मूत्र की अंतिम सांद्रता बदलती में लैंप प्राइमरों (0%, 10%, 20%, और 50%) कुल प्रतिक्रिया मात्रा के 50 µ l में । 10% अंतिम मूत्र एकाग्रता के लिए, वायरल आरएनए के 1 µ एल जोड़ने के लिए मूत्र के 5 µ l. 20% अंतिम मूत्र एकाग्रता के लिए, वायरल आरएनए के 1 µ एल जोड़ने के लिए मूत्र के 10 µ l. 50% अंतिम मूत्र एकाग्रता के लिए, वायरल आरएनए के 1 µ एल जोड़ने के लिए मूत्र के 25 µ l.
  2. मूत्र के 10% में RT-दीपक की वास्तविक समय निगरानी के लिए, विभिन्न fluorophore फिल्टर के साथ एक वास्तविक समय पीसीआर साधन ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें ।
    1. Zika के लिए FAM-लेबल्ड amplicons से प्रतिदीप्ति संकेतों को पढ़ने के लिए, 483 से 533 एनएम तक एक फ़िल्टर का उपयोग करें; हेक्स-chikungunya के लिए लेबल amplicons के लिए, 523 से 568 एनएम को लेकर एक फिल्टर का उपयोग करें; डेंगू 1 के लिए तमृ-लेबल्ड amplicons के लिए, 558 से 610 एनएम को लेकर एक फिल्टर का उपयोग करें; और mitochondrial डीएनए के लिए TET-त्यसपछि amplicons के लिए 523 से लेकर 568 एनएम तक फिल्टर का इस्तेमाल करें ।
      नोट: FAM क्रमशः 495 एनएम और 520 एनएम के उत्तेजना और उत्सर्जन maxima है । हेक्स में क्रमशः 538 एनएम और 555 एनएम का उत्तेजना और उत्सर्जन maxima है । तमृ में क्रमशः 559 एनएम और 583 एनएम का उत्तेजना और उत्सर्जन maxima है । TET में क्रमशः 522 एनएम और 539 एनएम का उत्तेजना और उत्सर्जन maxima है ।
  3. का प्रयोग करें 96-अच्छी तरह से प्लेटें और एक स्पष्ट प्लास्टिक शीट के साथ प्लेट सील, तो 60-90 मिनट के लिए 65-68 डिग्री सेल्सियस पर नमूने की मशीन और प्रतिदीप्ति हर 30 प्रकाश साइकिल चालक का उपयोग एस रिकॉर्ड । शुरू में फ्लोरोसेंट लेबल जांच के 80 एनएम का उपयोग करें, और फिर फ्लोरोसेंट लेबल जांच के 300 एनएम परीक्षण ।
    1. 10% की अंतिम मूत्र एकाग्रता में प्रश्नपत्र पतला वायरल RNAs जोड़कर प्रत्येक लक्ष्य के लिए पता लगाने की सीमा निर्धारित करें ।
      नोट: इष्टतम तापमान, मैग्नीशियम एकाग्रता, फ्लोरोसेंट लेबल जांच एकाग्रता, और प्रतिक्रिया समय निर्धारित करने के लिए वास्तविक समय आरटी लैंप का उपयोग करें ।
  4. आंख से किनारा विस्थापन जांच द्वारा उत्पंन प्रतिदीप्ति कल्पना करने के लिए, उत्तेजना के साथ एक प्रकाश साइकिल चालक से 470 एनएम में एक नीली एलईडी प्रकाश स्रोत का उपयोग करें (किसी भी जेल ट्रो बॉक्स के साथ निर्मित ब्लू लाइट स्रोत काम करेंगे, सामग्री की तालिका देखें), और छवि रिकॉर्ड अंधेरे में कमरे के तापमान पर एक सेल फोन कैमरे के साथ ।
    नोट: आंखों से नीले एलईडी का उपयोग कर सभी तीन रंगों के दृश्य की जरूरत है जब फ्लोरोसेंट लेबल जांच के 300 एनएम का उपयोग करें ।

5. आरटी-Zika-संक्रमित मच्छरों का पता लगाने पर Q-कागज प्रौद्योगिकी का उपयोग कर लैंप

  1. तैयार चतुर्धातुक अमोनियम संशोधित फ़िल्टर कागज (क्यू कागज), मामूली संशोधनों के साथ पहले प्रकाशित तरीकों के अनुसार30।
    1. 1 जी फाइबर फिल्टर कागज हलकों में विसर्जित ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए 50 मिलीलीटर में 3.5 सेमी की 1.8% जलीय NaOH समाधान के लिए 15 मिनट सक्रियण के लिए.
    2. वैक्यूम निस्पंदन द्वारा सक्रिय कागज हलकों लीजिए और फिर कमरे के तापमान पर रातोंरात (2, 3-epoxypropyl) trimethylammonium क्लोराइड (०.२८ ग्राम) के जलीय समाधान की 40 मिलीलीटर में विसर्जित कर दिया ।
      नोट: (2, 3-epoxypropyl) trimethylammonium क्लोराइड के द्रव्यमान अनुपात रखने के लिए ०.२८ पर 1 के लिए कागज फिल्टर ।
    3. वैक्यूम निस्पंदन द्वारा परिणामी cationic कागज ले लीजिए, और एसिटिक एसिड की 1% की 50 मिलीलीटर के साथ बेअसर ।
    4. लगातार airflow के साथ एक हुड के नीचे इथेनॉल और हवा के साथ तीन बार कागज धो लो ।
  2. एक कागज पंच या कैंची का उपयोग कर छोटे आयतों (3 मिमी x 4 मिमी) में क्यू पेपर शीट्स काटें । क्रश एई. aegypti मादा मच्छरों संभावित एक सूक्ष्म मूसल के साथ प्रत्येक कागज पर Zika से संक्रमित ।
  3. प्रत्येक पेपर में जोड़ें 20 µ एल के 1 एम जलीय अमोनिया समाधान (पीएच ≈ 12) और 5 मिनट के लिए रुको । फिर प्रत्येक पेपर को एक बार धो कर 20 µ l के साथ 50% ेतोः और एक बार nuclease के 20 µ l के साथ मुक्त पानी. वायु-लगभग 1 एच के लिए बीएसएल-2 सुरक्षा कैबिनेट में कागज सूखी ।
    नोट: इस बिंदु पर, नमूने में संग्रहित किया जा सकता है-20 ° c रातोंरात उपयोग तक ।
  4. चिमटी का प्रयोग, आरटी के 100 µ एल में प्रत्येक पेपर प्लेस-दीपक प्रतिक्रिया मिश्रण और 65-68 ° c पर मशीन 45 मिनट के लिए । समाधान में कागज को पूरी तरह से जलमग्न करना सुनिश्चित करें; उसे खाक नहीं करना चाहिए । ब्लू एलईडी लाइट सोर्स और ऑरेंज या येलो फिल्टर का उपयोग करके Zika वायरस से उत्पन्न प्रतिदीप्ति को पढ़ें और रिकॉर्ड करें ।

6. आर टी के Lyophilization-दीपक रिएजेंट के लिए 100 µ प्रतिक्रिया की मात्रा l

  1. धारा 3.1 के अनुसार 10x लैंप प्राइमर मिश्रण तैयार है, और धारा 3.2 के अनुसार dUTP युक्त dNTP मिश्रण तैयार करते हैं । प्राइमरी मिश्रण और dNTPs पर-20 डिग्री सेल्सियस उपयोग तक की दुकान ।
  2. एंजाइम डायलिसिस बफर के 10 मिलीलीटर ग्लिसरॉल को दूर करने के लिए तैयार, 1 मीटर Tris के 100 µ l को मिलाकर-एचसीएल नं० 7.5, 500 µ l का 1 m KCl, 2 µ l का 0.5 m EDTA, 100 µ l का 10% ट्राइटन X-100, 100 µ l का 0.1 m डीटीटी और ९.१९८ मिलीलीटर का nuclease-फ्री पानी । 4 डिग्री सेल्सियस पर डायलिसिस बफर स्टोर ।
    नोट: का उपयोग करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने से पहले (0.2-माइक्रोन फिल्टर) फिल्टर करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी बफर एजेंट समाधान ।
    1. 10 केडीए कट ऑफ लिमिट के साथ एक ultrafiltration झिल्ली का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें). डायलिसिस बफर के 350 µ एल प्लेस, डीएनए पोलीमरेज़ के 32 इकाइयों के 4 µ एल, रिवर्स Transcriptase की 30 इकाइयों के 2 µ एल, और µ झिल्ली के 80 यूनिटों के 2 RNase एल और 5 मिनट के लिए 14,000 एक्स जी में 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक ।
    2. डायलिसिस बफर के एक और 350 µ एल जोड़ें ultrafiltration झिल्ली और केंद्रापसारक के लिए (14,000 एक्स जी) एक और 5 मिनट के लिए संग्रह ट्यूब खाली है और इस कदम को दोहराने, तो (14,000 x जी) 3 मिनट के लिए ।
    3. रेफरेंस के लिए, झिल्ली को पलटना और एक नए कलेक्शन ट्यूब में जगह । 2 मिनट के लिए 1,000 x g पर स्पिन, रेफरेंस वॉल्यूम को मापने; 8 µ एल से कम है, तो डायलिसिस बफर जोड़कर मात्रा 8 µ एल तक ले आओ । 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफरेंस स्टोर, और तुरंत अगले कदम के लिए आगे बढ़ना ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल एकल ट्यूब lyophilization के लिए है, लेकिन एक ही ultrafiltration झिल्ली का उपयोग कर एक समय में कम से कम 10 प्रतिक्रिया ट्यूबों तैयार है और डायलिसिस बफर की एक ही राशि का उपयोग करें ।
  3. मिक्स 10 µ एल के 10x लैंप प्राइमर अगर singleplex (3 के लिए-plex, प्रत्येक 10x प्राइमरी मिश्रण के 10 µ एल जोड़ें), dNTP मिश्रण के 14 µ एल, dialyzed एंजाइम मिश्रण के 8 µ एल, µ thermolabile की 2 इकाइयों के 2 UDG एल, और µ मुफ्त पानी की 66 nuclease l (3-plex के लिए , एक 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 46 µ एल) का उपयोग करें और ढक्कन खुला छोड़ दें । इसके बजाय, भाप से बचने के लिए अनुमति देने के लिए एक सुई के साथ पंचर एक और ढक्कन जोड़ें ।
  4. तुरंत 2 घंटे के लिए-80 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों फ्रीज, और 4 एच के लिए ट्यूब lyophilize प्रकाश से सुरक्षा के लिए एल्यूमीनियम पंनी के साथ lyophilization चैंबर कवर । जब रिएजेंट सूख रहे हों, तो पंचर किए गए ढक्कनों को हटा दें, मूल ढक्कन बंद कर लें, और lyophilized के साथ ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें ।
    नोट: एजेंट रातोंरात lyophilized जा सकता है, यदि आवश्यक हो ।

7. परीक्षण Lyophilized RT-दीपक रिएजेंट मूत्र और मच्छर Zika युक्त नमूने पर

  1. किट से निंनलिखित मदों का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) Zika के लिए: एक 3 डी-नारंगी फिल्टर (लंबे पास फिल्टर, कट पर ~ 540 एनएम) के साथ अवलोकन बॉक्स, 2 एएए बैटरियों के लिए बॉक्स देख, lyophilized प्रतिक्रिया ट्यूबों Zika का पता लगाने के लिए ZV लेबल, और 1.1 x निर्जलीकरण बफर 1.5 मिलीलीटर पेंच शीर्ष ट्यूबों में ।
  2. तैयार 1.1 x निर्जलीकरण बफर के 5.5 मिलीलीटर 10x इज़ोटेर्माल प्रवर्धन बफर है कि डीएनए पोलीमरेज़ के साथ आता है ( सामग्री की तालिकादेखें) के मिश्रण से 50 मिलीलीटर, 3.3 मिलीलीटर के 100 मिमी MgSO4, 110 µ एल के 0.5 मीटर डीटीटी, और nuclease के ४१.०९ मिलीलीटर-मुक्त पानी । मिश्रण अच्छी तरह से, 1.5 मिलीलीटर पेंच शीर्ष ट्यूबों के लिए इस समाधान के 1 मिलीलीटर aliquot, और 4 ° c पर स्टोर जब तक उपयोग करें ।
  3. प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब (0.5 मिलीलीटर) के लिए 90 µ एल के 1.1 x निर्जलीकरण बफर जोड़ें । सुनिश्चित करें कि तरल lyophilized रिएजेंट युक्त ट्यूब के नीचे भरता है (उंहें मिलाते हुए मिश्रण के साथ भंग, तो संक्षेप में नीचे स्पिन (1,000 x जी)) । प्रतिक्रिया ट्यूबों के लिए वायरल आरएनए के साथ नुकीला मूत्र नमूना के 10 µ एल जोड़ें (विवरण के लिए अनुभाग 4.1 देखें) ।
    1. यदि मच्छरों का परीक्षण, Q-कागज पकड़े मच्छर लावे की एक आयत जोड़ें (के रूप में कदम में तैयार 5.2 और 5.3 वर्गों में वर्णित), साथ 10 µ l शुद्ध पानी के बजाय मूत्र के नमूनों की ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, मूत्र के बजाय लार या सीरम के नमूनों की 10 µ एल जोड़ें । नमूने डीएनए या आरएनए निकाले जाते हैं, तो reहाइड्रेटेड मिश्रण में नमूने के 2-5 µ एल जोड़ने और अंतिम नमूना मात्रा के 10 µ एल के लिए nuclease मुक्त पानी के साथ पूरा करें ।
  4. प्रतिक्रिया ट्यूबों के ढक्कन बंद करो । उंहें एक गर्मी ब्लॉक में प्लेस/65-68 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व निर्धारित/ 30-45 मिनट के लिए मशीन, लेकिन कोई 1 से अधिक एच । मशीन के बाद, गर्मी से ट्यूब निकालें । भविष्य की परख के संक्रमण को रोकने के लिए, सुनिश्चित करें कि इन ट्यूबों बंद रहते हैं ।
  5. अवलोकन बॉक्स में जगह प्रतिक्रिया ट्यूबों; तापमान परिवेश तापमान (अधिमानतः 25 डिग्री सेल्सियस) के लिए गिर जाएगी । अवलोकन बॉक्स के पीछे का स्विच चालू करें । नारंगी फिल्टर के माध्यम से नमूना निरीक्षण और एक सेल फोन कैमरा है जो एक दूरी पर आयोजित किया जाता है, जहां छवि को देखने के क्षेत्र के 80% भरता द्वारा छवि पर कब्जा ।
    नोट: बेहतर दृश्य कम प्रकाश वातावरण में हासिल की है.
  6. दृश्यावलोकन पूर्ण होने के बाद, स्विच बंद करें । अंधेरे में सील ट्यूबों की दुकान, अधिमानतः प्रशीतन के साथ, अगर बाद में दृश्य की जरूरत है ।

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Representative Results

शुरू में, प्रत्येक आरटी लैंप प्राइमर के प्रदर्शन (तालिका 1) इसके इसी वायरल आरएनए सब्सट्रेट के साथ ही नकारात्मक नियंत्रण के साथ जेल ट्रो द्वारा मूल्यांकन किया गया । RT-लैंप प्राइमरों Zika और डेंगू 1, और Chikungunya के लिए nsP2 क्षेत्र (गैर संरचनात्मक प्रोटीन P2) के लिए NS5 क्षेत्र (आरएनए-निर्भर आरएनए पोलीमरेज़) को लक्षित करने के लिए डिजाइन किए गए थे । टेंपलेट्स कुल वायरल अफ्रीकी ग्रीन बंदर गुर्दे (वीरो) कोशिकाओं में प्रसंस्कृत स्टॉक से निकाली गई आरएनए थे । एक मामले में, कुल न्यूक्लिक एसिड (डीएनए और आरएनए) एक Chikungunya संक्रमित महिला एई. aegypti (तालिका 2)से निकाला गया था ।

चित्र 2a RT-लैंप के साथ कुछ प्रतिनिधि परिणाम इन नमूनों के साथ प्रदर्शन से पता चलता है. दोनों singleplex और मल्टीप्लेक्स (3-plexed) मामलों में, आरटी-लैंप उत्पादों concatemers की एक सीढ़ी के रूप में दिखाई देते हैं जब agarose जेल पर चलाते हैं । नकारात्मक नियंत्रण नमूने के रूप में पानी युक्त नमूना केवल प्राइमरों के लिए बैंड खुद को दिया, गैर सहित विशिष्ट लक्ष्य नियंत्रण जहां कुल न्यूक्लिक एसिड एक गैर संक्रमित एई से निकाली गई । aegypti मादा मच्छर को खाके के रूप में इस्तेमाल किया गया ।

इष्टतम RT-लैंप की स्थिति खोजने के लिए, विभिन्न मैग्नीशियम सांद्रता और मशीन तापमान का परीक्षण किया गया । यह पाया गया कि उच्च मैग्नीशियम सांद्रता और कम तापमान गैर विशिष्ट amplicons उत्पंन, झूठी सकारात्मक को जंम दे सकता है । इसलिए, 65 डिग्री सेल्सियस पर मैग्नीशियम और मशीन के 8 मिमी (चित्रा 2 बी) पर तब से सभी प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया ।

जेल ट्रो प्रतिक्रिया ट्यूब के उद्घाटन की आवश्यकता है, जो पहले से उत्पंन amplicons द्वारा प्रयोगों के अगले सेट के संदूषण को जंम दे सकता है, झूठी सकारात्मक करने के लिए अग्रणी । आगे संदूषण को रोकने के लिए, dTTP dTTP और dUTP के बराबर अनुपात द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था, ताकि dUTP RT-लैंप amplicons में शामिल किया जाएगा. यह uracil के लिए एक सब्सट्रेट में संभव दूषित amplicon-डीएनए glycosylase (UDG) के किसी भी बाद आरटी-दीपक31,32प्रतिक्रियाओं की तैयारी के दौरान बदल जाता है । जब UDG के एक thermolabile संस्करण का उपयोग किया जाता है, ड्यू-युक्त amplicons कमरे के तापमान पर पचा जा सकता है के रूप में आरटी लैंप के नमूनों की स्थापना की जा रही है, और UDG इज़ोटेर्माल प्रवर्धन के दौरान निष्क्रिय हो जाएगा । इसके अलावा, प्रतिक्रिया ट्यूब एक बहाव विश्लेषण, जब जरूरत के लिए खोला जा सकता है । UDG पाचन के उपयोग के अलावा, एक वास्तुकला विस्थापन जांच का उपयोग कर प्रतिदीप्ति कि प्रतिक्रिया ट्यूब खोलने की आवश्यकता के बिना पढ़ा जा सकता है उत्पंन करता है ।

चित्रा 3 ए Zika आरएनए लक्ष्यीकरण फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग Zika के लिए पता लगाने (लोद) की सीमा का परिणाम बचाता है । धारावाहिक कमजोर पड़ने अध्ययनों से पता चला है कि के रूप में कम 1.42 pfu एक singleplex परख या एक 3-plexed परख में 30 मिनट के भीतर पता लगाया जा सकता है । जब नमूने आगे ०.७१ pfu को पतला किया गया, एक फ्लोरोसेंट संकेत एक singleplex परख के लिए 40 मिनट के बाद मनाया गया था, और 3 के लिए 50 मिनट के बाद-plexed मिश्रण । वास्तविक समय RT-दीपक के अलावा, प्रतिदीप्ति एक नारंगी फिल्टर के माध्यम से 35 मिनट के बाद कल्पना की थी, नमूनों के बाद नीले एलईडी प्रकाश में दिखाया गया 470 एनएम का एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (चित्र बी) । इसी तरह, पता लगाने की सीमा ३७.८ प्रतियां और Chikungunya और डेंगू 1 के लिए 1.22 pfu पर मापा गया, क्रमशः (चित्रा 3सी-डी) ।

इष्टतम मूत्र एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, Zika वायरल आरएनए (२.८५ pfu) एक प्रामाणिक मानव मूत्र नमूना (0%, 10%, 20% और 50%) की सांद्रता बदलती करने के लिए जोड़ा गया था । संभवतः इसकी इलेक्ट्रोलाइट्स की वजह से, आरटी-दीपक संकेत 15 से 35 मिनट में देरी जब 50% मूत्र परख में इस्तेमाल किया गया था । 10% मूत्र एक कम पृष्ठभूमि पेश करने के कारण इष्टतम होना निर्धारित किया गया था । Zika लक्ष्य के अभाव में, कोई प्रवर्धन किसी भी एकाग्रता में मनाया गया था, लेकिन उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति उच्च मूत्र एकाग्रता (चित्रा 3E) के साथ नमूनों में मनाया गया था ।

अलग प्रतिदीप्ति रंग के पढ़ने के बहिष्कार के साथ मल्टीप्लेक्स की अनुमति देने के लिए, किनारा विस्थापन जांच के 80 एनएम अलग fluorophores के साथ लेबल (Zika के लिए FAM, Chikungunya के लिए हेक्स, और तमृ के लिए डेंगू 1) थे, लेकिन एक ही शमनकर्ता के साथ (आयोवा काले-FQ) 200 एनएम की एकाग्रता के साथ । सेल कल्चर से निकाली वायरल RNAs (२.८५ के लिए pfu Zika, 242 वायरल आरएनए Chikungunya के लिए प्रतियां, और डेंगू के लिए 1.22 pfu 1) लक्ष्य के रूप में इस्तेमाल किया गया, 10% मूत्र में पतला । प्रतिदीप्ति डेटा के वास्तविक समय विश्लेषण संकेत पीढ़ी में देरी (के बारे में 10 मिनट) 3 के लिए-plexed परख जहां सभी लक्ष्यों के लिए प्राइमरों मौजूद थे दिखाया । singleplex मामलों में, दूसरी ओर, प्रतिक्रिया 10-15 मिनट (चित्रा 4a-सी) के भीतर पूरा किया गया था । जब प्रतिदीप्ति एक नीली एलईडी और नारंगी फिल्टर का उपयोग करके कल्पना की थी, संकेत शक्ति में अंतर अलग fluorophores के लिए मनाया गया, जहां FAM-लेबल amplicons सबसे अधिक दिखाई दे रहे थे । यह उंमीद है, के बाद से उत्तेजना पर 470 एनएम FAM उत्तेजना स्पेक्ट्रम (चित्रा 4d) की अधिकतम करने के लिए निकटतम है ।

एक एकल एलईडी उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (470 एनएम) के साथ सभी तीन रंगों के दृश्य को सक्षम करने के लिए, विस्थापित जांच की सांद्रता 300 एनएम के लिए बढ़ गया और पूरक शमनकर्ता जांच 400 एनएम के लिए । singleplex मामलों में, Zika, Chikungunya के लिए 20 मिनट, और डेंगू के लिए 40 मिनट के लिए 10 मिनट के भीतर सिग्नल जनरेशन पूरा किया गया था 1 । 3-plexed परख में, तथापि, यह आगे सभी परख में 20 मिनट की देरी थी (आंकड़ा धारा 5-सी)। फिर भी, समय में बलिदान के लिए संकेत पीढ़ी नारंगी फिल्टर के साथ नीले एलईडी प्रकाश का उपयोग कर सभी तीन रंगों के दृश्य सक्षम होना चाहिए । ग्रीन प्रतिदीप्ति जांच का उपयोग कर Zika के लिए मनाया जाता है 5 '-FAM के साथ लेबल अंत, हल्के हरे-पीले प्रतिदीप्ति Chikungunya को सौंपा जहां जांच है 5 '-अंत हेक्स के साथ लेबल, और नारंगी-लाल प्रतिदीप्ति डेंगू के लिए प्रयोग किया जाता है 1, जहां इसकी जांच है 5 '-end लेबल तमृ (चित्र 5d) के साथ ।

संभव Zika संक्रमण के साथ मच्छर के नमूनों के परीक्षण के लिए, प्रयोगशाला संक्रमित एई. aegypti मादा मच्छरों (तालिका 2) Q-कागज की एक आयत पर कुचल दिया गया, अमोनिया उपचार के बाद वायरस को निष्फल करने के लिए और उजागर करने के लिए बांध वायरल पर आरएनए सकारात्मक आरोप क्यू पेपर । कागज इथेनॉल के साथ धोया गया था pterin मच्छर लावे कि प्रतिदीप्ति readout के साथ हस्तक्षेप हो सकता है में मौजूद यौगिकों को दूर करने के लिए33,34। क्यू-मच्छरों युक्त कागज तो सीधे आर टी-लैंप मिश्रण में डूबे थे, और 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के बाद, चमकीले हरे प्रतिदीप्ति Zika वायरस की उपस्थिति में मनाया गया था (चित्रा 6) ।

प्रशीतन की एक श्रृंखला के बिना पता लगाने किट देने के लिए, और परख का उपयोग करने के लिए आसान बनाने के लिए, आर टी-लैंप रिएजेंट थे lyophilized और एक निर्जलीकरण बफर और एक 3 डी-मुद्रित अवलोकन बॉक्स है कि एक 470 एनएम का उपयोग करता है एलईडी और एक नारंगी फिल्टर के साथ (चित्रा 7A). निर्जलीकरण बफर और मूत्र नमूना के 1 मात्रा के 9 संस्करणों का उपयोग करना, दिखाई हरी प्रतिदीप्ति 30 मिनट के भीतर उत्पन्न किया जा सकता है और छवि किसी भी सेल फोन कैमरा (चित्रा 7B) द्वारा कब्जा किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, क्यू-पेपर पर मच्छर के नमूनों को मूत्र के नमूने के बजाय पानी की 1 मात्रा जोड़कर उसी परख द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: लैंप परख डिजाइन (a) RT-लैंप प्राइमरों और एक dumbbell संरचना के गठन एक कतरा द्वारा डीएनए पोलीमरेज़ की जगह । (ख) किनारा-जगह जांच का परिचय मल्टीप्लेक्स और प्रतिदीप्ति readout की अनुमति देने के लिए, और वास्तविक समय में आरटी-लैंप प्रगति की निगरानी के लिए । Yaren एट अल. 201720से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: amplicons के ट्रो विश्लेषण जेल । (क) उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साथ singleplex या मल्टीप्लेक्स (३-plex) प्रारूप में दीपक प्राइमरोंकापरीक्षण करना. सकारात्मक नियंत्रण निम्नलिखित titers के साथ शुद्ध वायरल आरएनए शामिल हैं: २.८५ pfu के लिए Zika (ZV), 242 जीनोमिक के लिए प्रतियां (CH), और डेंगू के लिए 1.22 Chikungunya 1 (D1) । एनटीसी-जेड, एनटीसी-सी और एनटीसी-डी Zika, Chikungunya, और डेंगू 1 प्राइमरों के लिए कोई टेंपलेट नियंत्रण के लिए खड़े singleplex प्रारूप में, क्रमशः । एनएससी गैर विशिष्ट लक्ष्य नियंत्रण के लिए खड़ा है, जहां कुल xNA (डीएनए और आरएनए) संक्रमण से मुक्त एई. aegyptiनिकाला जाता है । एम मार्कर के लिए खड़ा है (50 आधार जोड़ी डीएनए सीढ़ी) । (ख) RT-लैंप मशीन तापमान की एक सीमा का परीक्षण करके परख शर्तों का अनुकूलन (55 डिग्री सेल्सियस से 70 डिग्री सेल्सियस) और MgSO4 सांद्रता (4 मिमी से 10 मिमी) के लिए मल्टीप्लेक्स प्रारूप में लक्ष्य आरएनए के अभाव में । Yaren एट अल. 201720से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: आरटी-वास्तविक समय में चिराग । (क) Singleplex और मल्टीप्लेक्स की सीमा का पता लगाने के लिए (लोद) Zika (ZV) के लिए 80 एनएम FAM का उपयोग कर-लेबल कतरा-अचल समय पीसीआर साधन (चैनल 483-533 एनएम) का उपयोग कर रीयल-टाइम में जांच । नमूने के बारे में 50 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर मशीन थे (ख) प्रतिदीप्ति हालांकि एक नारंगी फिल्टर नीले प्रकाश के साथ 470 एनएम पर नमूनों की उत्तेजना के बाद मनाया गया था । एक से नमूने दृश्य के लिए इस्तेमाल किया गया । (ग) Chikungunya पर लोद के लिए वास्तविक समय विश्लेषण (CH) लक्ष्य एक वास्तविक समय पीसीआर उपकरण पर 523-568 एनएम के प्रतिदीप्ति चैनल का उपयोग singleplex प्रारूप में असर लैंप जांच हेक्स के 80 एनएम का उपयोग कर । (घ) डेंगू पर लोद के लिए वास्तविक समय विश्लेषण 1 (D1) एक वास्तविक समय पीसीआर साधन पर 558-610 एनएम के प्रतिदीप्ति चैनल का उपयोग singleplex प्रारूप में तमृ असर लैंप जांच के 80 एनएम का उपयोग कर लक्ष्य । (ङ) RT-लैंप अभिक्रिया में अधिकतम मूत्र सामग्री का निर्धारण. अंतिम मूत्र सांद्रता की एक श्रेणी (0%-50%) Zika vRNA. एनटीसी के २.८५ pfu की उपस्थिति में 80 एनएम FAM-लेबल जांच का उपयोग कर परीक्षण किया गया सभी पैनलों पर कोई टेंपलेट नियंत्रण = । Yaren एट अल. 201720से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: मूत्र में Singleplex और मल्टीप्लेक्स वायरस का पता लगाने के 80 एनएम जांच का उपयोग । (क) singleplex और मल्टीप्लेक्स प्रारूप में 10% मूत्र में Zika का पता लगाने के लिए ZV-लेबल जांच (80 एनएम) के साथ Zika (FAM) वायरल आरएनए के २.८५ pfu का उपयोग करना । (ख) singleplex और मल्टीप्लेक्स प्रारूप में 10% मूत्र में Chikungunya डिटेक्शन हेक्स-लेबल जांच (80 एनएम) के साथ Chikungunya (CH) वायरल आरएनए की 242 प्रतियां का उपयोग करना । (ग) singleplex में 10% मूत्र में डेंगू 1 डिटेक्शन और मल्टीप्लेक्स प्रारूप में डेंगू का 1.22 pfu 1 (D1) वायरल आरएनए का उपयोग तमृ-लेबल की जांच (80 एनएम) के साथ । (D) नारंगी फ़िल्टर के माध्यम से RT-लैंप प्रतिक्रियाओं का विज़ुअलाइज़ेशन नीले LED लाइट के साथ 470 एनएम पर उत्तेजना के बाद । Yaren एट अल. 201720से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । एनटीसी = सभी पैनलों पर कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: Singleplex और मल्टीप्लेक्स वायरस का पता लगाने में मूत्र का उपयोग कर 300 एनएम जांच । (क) ZV-त्यसपछि जांच (३०० एनएम) के साथ २.८५ pfu Zika (FAM) वायरल आरएनए का उपयोग करते हुए singleplex और मल्टीप्लेक्स फार्मेट में 10% मूत्र में Zika डिटेक्शन. (ख) singleplex और मल्टीप्लेक्स प्रारूप में 10% मूत्र में Chikungunya डिटेक्शन हेक्स-लेबल जांच (300 एनएम) के साथ Chikungunya (CH) वायरल आरएनए की 242 प्रतियां का उपयोग करना । (ग) singleplex में 10% मूत्र में डेंगू 1 का पता लगाने और मल्टीप्लेक्स प्रारूप में तमृ-लेबल जांच (300 एनएम) के साथ 1.22 pfu of Dengue1 (D1) वायरल आरएनए का उपयोग करना । (D) नारंगी फ़िल्टर के माध्यम से RT-लैंप प्रतिक्रियाओं का विज़ुअलाइज़ेशन नीले LED लाइट के साथ 470 एनएम पर उत्तेजना के बाद । मूत्र प्रयोगों में एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एक दीपक प्राइमर मानव mitochondrial डीएनए लक्ष्यीकरण सेट (mtDNA) TET-लेबल जांच (300 एनएम) के साथ प्रयोग किया जाता था । एनटीसी = सभी पैनलों पर कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं है । Yaren एट अल. 201720से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: स्वस्थ और Zika-संक्रमित Ae. aegypti (ZV 9, तालिका 2) के साथ Q-पेपर प्रौद्योगिकी का उपयोग कर संक्रमित मच्छर के नमूनों का Zika डिटेक्शन के लिए कार्यप्रवाह । Yaren एट अल. 201720से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: अवलोकन बॉक्स. (क) मेटाबॉलिज्म बॉक्स बेस में दो एएए बैटरी का उपयोग करता है । ये बैटरी बिजली चार नीले एलईडी रोशनी है कि 0.5 मिलीलीटर चार छेद में रखा ट्यूबों में आयोजित नमूनों को रोशन । एलईडी लाइट्स एक स्विच के साथ चालू हैं । नमूनों नारंगी फिल्टर के माध्यम से कल्पना कर रहे हैं । (B) प्रेक्षण बॉक्स में प्रतिदीप्ति । बाएं से दाएं: नकारात्मक, Zika के लिए सकारात्मक, नकारात्मक, और Zika के लिए सकारात्मक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

लक्ष्य वायरस नाम अनुक्रम (5 '-3 ') लंबाई स्थिति प्रारंभ करें अंत स्थिति
zika ZV-F3 GAGACTGCTTGCCTAG 16 ९९०५ ९९२०
ZV-B3 CTGGGGTCTTGTCTTC 16 १०१४५ १०१३०
ZV-पगली CAGTTGGAACCCAGTCAAC 19 १००२८ १००१०
ZV-LB GTGGAACAGAGTGTGGATTG 20 १००९३ १०११२
ZV-FIP CCATGGATTGACCAGGTAGTTTTTTCGACTGATGGCCAATG 41 ९९७४ १००५३
ZV-बिप ACCACTGARGACATGCTTGTTTTTCATGTGGTCGTTYTCC 40 १००७० १०१२९
ZV-LB_NatTail FAM-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
GTGGAACAGAGTGTGGATTG		 60 १००९३ १०११२
chikungunya CH-F3 CGTCAACGTACTCCTAAC 18 २८९१ २९०८
CH-B3 ACGTTGGCTTTRTTTTGG 18 ३०९४ ३०७७
CH-पगली AGCGTCTTTATCCACGGG 18 २९६८ २९५१
CH-LB AYGCATCRATAATGGCGGG 19 ३०२५ ३०४३
CH-FIP GAAGTTTCCTTTCGGTGGGTTTTTGGAAGACACTYTCYGG 40 २९३२ २९९३
CH-बिप AAGGAGTGGGAGGTGGATTTTTTCAYTTGGTGACTGCAG 39 ३००६ ३०६३
CH-LF_NatTail हेक्स-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
AGCGTCTTTATCCACGGG		 58 २९६८ २९५१
डेंगू-1 D1-F3 ACAGCYCTGAATGAYATGG 19 ९५८३ ९६०१
D1-B3 GCAGTTTCTCTCAGGC 16 ९८०३ ९७८८
D1-पगली CACTTGYTGCCARTCATTCC 20 ९६६६ ९६४७
D1-LB CCATGCCGYAACCAAG 16 ९७२७ ९७४२
D1-FIP CTGGTGGAARTGGTGTGATTTTTTGGGAACCTTCAAAAGG 40 ९६२८ ९६९३
D1-बिप GAAGGAYGGGAGGGAAATAGTTTTTTTAGCCCTRCCCA
CAAG		 42 ९७०२ ९७६३
D1-LB_NatTail तमृ-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
CCATGCCGYAACCAAG		 56 ९७२७ ९७४२
Mitochondrial डीएनए MtDNA-F3 AGCCTACGTTTTCACAC 17 ९१८३ ९१९९
MtDNA-B3 GCGCCATCATTGGTAT 16 ९४१० ९३९५
MtDNA-LB GCCTAGCCATGTGATTTCAC 20 ९३२२ ९३४१
MtDNA-पगली GGCATGTGATTGGTGGGT 18 ९२५४ ९२३७
MtDNA-FIP GTCATGGGCTGGGTTTTACTTTTTCTACCTGCACGACAAC 40 ९२१३ ९२२८
MtDNA-बिप CTCAGCCCTCCTAATGACCTTTTTGAGCGTTATGGAGTGG 40 ९३५९ ९३४४
MtDNA-LB_NatTail TET-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
GCCTAGCCATGTGATTTCAC		 60 ९३२२ ९३४१
आम शमनकर्ता CTGACCTGACGGACTGAACGGATGGCTGAGCGCA
AACCCG-आयोवा काले FQ		 40

तालिका 1: प्राइमर और किनारा विस्थापन जांच । Yaren एट अल. 201720से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । बोल्ड में जुगाड़ कतरा के दोहरे-असहाय क्षेत्र का प्रतिनिधित्व जांचता है । FAM-लेबल (हरी प्रतिदीप्ति के रूप में देखा), हेक्स-लेबल (हल्के हरे-पीले प्रतिदीप्ति के रूप में देखा), तमृ-लेबल (नारंगी के रूप में देखा लाल प्रतिदीप्ति), और TET-लेबल (पीले प्रतिदीप्ति के रूप में देखा) जांच के लिए सौंपा गया था का पता लगाने Zika, Chikungunya, डेंगू 1, और क्रमशः मूत्र में mitochondrial डीएनए । FAM क्रमशः 495 एनएम और 520 एनएम में उत्तेजना और उत्सर्जन maxima है । हेक्स 538 एनएम और 555 एनएम, क्रमशः उत्तेजना और उत्सर्जन maxima है । तमृ ने क्रमशः 559 एनएम और 583 एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन maxima है । TET क्रमश: 522 एनएम और 539 एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन maxima है । सभी fluorophores के लिए एक शमनकर्ता के उपयोग को सक्षम करने के लिए, आयोवा काले-FQ इसकी व्यापक अवशोषण रेंज (420-620 एनएम) के कारण इस्तेमाल किया गया था ।

वायरस, तनाव (GenBank पहुंच संख्या) परिवार/ वायरल titers
Zika वायरस (ZV), पर्टो रीको (PRVABC59, कू 501215.1) Flaviviridae/Flavivirus गट IV, positive, ssRNA २.८५ x 108 pfu/एमएल
Chikungunya वायरस (CH), ब्रिटिश वर्जिन आइलैंड्स (एशियाई वंश, KJ451624) Togaviridae/Alphavirus गट IV, positive, ssRNA २.४२ एक्स 108 जीनोम/
Chikungunya वायरस (CH), ला रीयूनियन (हिंद महासागर वंश, LR2006-OPY1, KT449801) Togaviridae/Alphavirus गट IV, positive, ssRNA १.८९ एक्स 108 जीनोम/
Chikungunya वायरस (CH), ला रीयूनियन निकाली गई कुल ना से एडीज aegypti मादा (हिंद महासागर वंश, LR2006-OPY1, KT449801) Togaviridae/Alphavirus गट IV, positive, ssRNA 3.85 x 105 जीनोम/
डेंगू सीरोटाइप 1 (डी-1), कुंजी वेस्ट (FL) (JQ675358) Flaviviridae/Flavivirus गट IV, positive, ssRNA 1.22 x 106 pfu/एमएल
Zika (ZV) मच्छर की पहचान, तनाव लेग titer pfu/
9 ZV, पर्टो रीको ४.७६ एक्स 103

तालिका 2: सेल संस्कृतियों और संक्रमित मच्छर में वायरल titers । pfu: पट्टिका बनाने इकाई । Yaren एट अल. 201720से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित ।

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Discussion

Zika, chikungunya, और डेंगू सहित मच्छर जनित वायरस सार्वजनिक स्वास्थ्य और हाल ही में Zika फैलने की धमकी रोगी निदान के लिए कम लागत बिंदु की देखभाल का पता लगाने के विकल्प, साथ ही मच्छर निगरानी के लिए की जरूरत पर प्रकाश डाला । इज़ोटेर्माल प्रवर्धन तरीकों पीसीआर आधारित सिस्टम के लिए सस्ती विकल्प के रूप में विकसित किया गया । विशेष रूप से, आरटी-लैंप आधारित प्लेटफार्मों रोगजनकों की एक विस्तृत श्रृंखला का पता लगाने के लिए लागू किया गया है । हालांकि, इज़ोटेर्माल प्लेटफार्मों का उपयोग मुख्य रूप से एकल लक्ष्य का पता लगाने के लिए सीमित किया गया है । विधि यहां रिपोर्ट एक संशोधित आरटी-लैंप का उपयोग करता है एक प्रतिक्रिया मिश्रण है, जो मध्यम तापमान (65-68 डिग्री सेल्सियस) की एक सीमा पर रन में तीन अलग लक्ष्य का एक साथ पता लगाने की अनुमति, विशेष रूप से सुविधाजनक साबित हो क्योंकि तापमान से अधिक 60 डिग्री सेल्सियस प्रदान Zika और अंय वायरस गैर संक्रामक30,35।

इसके अलावा, यहां प्रस्तुत आंकड़ों से पता चलता है कि आरटी-लैंप बाधा पदार्थों है कि विभिंन जैविक तरल पदार्थ में मौजूद हो सकता है बर्दाश्त करने में सक्षम है15। यह वायरल RNAs सीधे प्रतिक्रिया मिश्रण में नमूना जोड़ने के द्वारा आरएनए शुद्धि के एक अतिरिक्त कदम के बिना परिलक्षित किया जा करने के लिए अनुमति देता है । नमूना के प्रकार पर निर्भर करते हुए, नमूना की अनुमति की अधिकतम मात्रा की प्रतिक्रिया को बाधित नहीं करने के लिए के रूप में निर्धारित करने की आवश्यकता है और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (false धनात्मक) का कारण नहीं है । यहां प्रस्तुत अध्ययन मूत्र नमूनों के लिए 10% अंतिम मात्रा के उपयोग पर केंद्रित है । हालांकि, लार और सीरम के नमूनों को भी एक ही तरीके से20में परख के लिए लागू किया जा सकता है । पता लगाने की सीमा रोगी मूत्र13में रिपोर्ट वायरल लोड ऊपर अच्छी तरह से पाए गए थे, साथ ही वायरस संक्रमित मच्छरों20,36,37.

मच्छर निगरानी आम तौर पर सार्वजनिक स्वास्थ्य संसाधनों के लिए एक कम प्राथमिकता है, तो एक सस्ती मल्टीप्लेक्स किट एक घर या एक सार्वजनिक क्षेत्र के सर्वेक्षण के लिए विशेष मूल्य होगा । इसलिए, यह किट Q-पेपर के अलावा मच्छर लावे में वायरस का पता लगाने की अनुमति के द्वारा संशोधित किया गया था । क्यू-पेपर में covalently संलग्न चतुर्धातुक अमोनियम समूहों के उच्च स्तर होते हैं, जो coulombic इंटरैक्शन के माध्यम से इसकी सतह पर वायरल न्यूक्लिक एसिड के कैप्चर की अनुमति देते हैं । हालांकि यह एक चिंता का विषय है कि क्यू कागज आरटी-लैंप बाधित हो सकता था, यह पाया गया कि q-सीधे आरटी-लैंप मिश्रण में मच्छर लावे ले कागज, सफल वायरस का पता लगाने के 30 मिनट के भीतर प्राप्त किया जा सकता है । सफल संकेत पीढ़ी के लिए, क्यू कागज के लिए काफी छोटा होना चाहिए (उदा, के रूप में आकार 3 x 4 मिमी के लिए 100 µ एल प्रतिक्रिया मात्रा) RT-लैंप प्रतिक्रिया मिश्रण में जलमग्न हो । यह प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए बहुत बड़ा है, या तरल में डूबे शेष के बजाय तैर शुरू होता है, प्रतिक्रिया जगह नहीं ले सकता है और परिणाम झूठी नकारात्मक के रूप में प्रकट हो सकता है ।

सफल पता लगाने और प्रत्येक वायरस के भेदभाव के लिए, प्रत्येक प्राइमर सेट के लिए RT-लैंप प्राइमरी डिजाइन के लिए दिशा निर्देशों का पालन करने की जरूरत है, को बदलने के लिए डिजाइन नियम जांच, और मल्टीप्लेक्स के लिए fluorophores का एक विकल्प शामिल हैं । प्रत्येक प्राइमर सेट के लिए विभिंन लक्ष्यों के खिलाफ जांच के लिए पार से बचने की जेट की जरूरत है । इसके अतिरिक्त, मैग्नीशियम एकाग्रता और मशीन तापमान प्रत्येक सेट के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है । तरीकों यहां प्रस्तुत नेत्र, जो आर टी-दीपक वास्तुकला के लिए किनारा विस्थापन जांच शुरू करने से पूरा किया गया द्वारा प्रतिदीप्ति readouts दिखाई देते हैं । तीन अलग रंग एक मल्टीप्लेक्स परख में visualized किया जा सकता है जब विभिंन fluorophores प्रत्येक लक्ष्य वायरस को सौंपा गया । यह मौजूदा इज़ोटेर्माल Zika का पता लगाने के तरीकों पर लाभ प्रदान करता है, क्योंकि प्रकाशित विधियों में से अधिकांश एकल लक्ष्य का पता लगाने और intercalating या प्रतिदीप्ति रंजक है, जो अनुक्रम विशेष नहीं कर रहे है और पैदा करने के लिए प्रवण है के उपयोग पर भरोसा करते है गैर विशिष्ट amplicons ।

एक महत्वपूर्ण कदम पर विचार करने के लिए फ्लोरोसेंट के अंतिम एकाग्रता का निर्धारण है जगह जांच के लेबल । यह पाया गया कि 80 से 100 के एनएम के लिए जगह जांच 15-20 मिनट के भीतर प्रतिदीप्ति संकेत उत्पंन कर सकता है, जबकि संकेत करने के लिए समय देरी थी जब जांच एकाग्रता के 300 एनएम इस्तेमाल किया गया था । रिएक्शन टाइम तब और देरी हो गया जब एक मल्टीप्लेक्स में परख कर फैशन चलाया गया । 80 एनएम से 300 एनएम के लिए स्विचन के लिए कारण सभी तीन fluorophores के दृश्य एक एकल एलईडी स्रोत का उपयोग कर सक्षम था । ब्लू उत्तेजना के साथ 470 एनएम पर एलईडी FAM के लिए उपयुक्त है-जांच लेबल, लेकिन हेक्स के लिए कम उपयुक्त है-या तमृ-लेबल जांच । इसलिए, एक बलिदान के लिए सभी तीन लक्ष्यों की कल्पना करने में सक्षम होने के लिए मशीन समय पर किया गया था ।

RT-लैंप के साथ समस्याओं में से एक आगे संदूषण है । RT-लैंप एक छोटी मशीन समय में amplicon की बड़ी मात्रा में उत्पंन करता है, और amplicons आसानी से एयरोसोल के रूप में जारी किया जा सकता है । इस समस्या को कम करने के लिए, dUTP अंय dNTPs के साथ साथ शामिल किया गया था UDG पाचन के दौरान परख सेट अप के बाद । यह UDG के एक गर्मी-labile संस्करण का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह UDG नव उत्पन्न RT-दीपक amplicons के पाचन को रोकने के लिए निष्क्रिय करने के लिए आवश्यक है.

प्रशीतन के बिना किट के वितरण की अनुमति, परख के सभी घटकों को lyophilized और एक जलयोजन बफर के साथ पूरक किट की जरूरत है । इसलिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइमों में मौजूद किसी भी ग्लिसरॉल को ultrafiltration द्वारा निकाल दिया गया था क्योंकि ग्लिसरॉल को lyophilization द्वारा हटाया नहीं जा सकता । एक मिश्रण में एक उच्च एकाग्रता में, ग्लिसरॉल एंजाइम गतिविधि के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । केवल एंजाइम ग्लिसरॉल हटाने की प्रक्रिया में शामिल नहीं किया गया था thermolabile UDG. UDG २४.६ केडीए के आणविक भार के साथ एक छोटा सा एंजाइम है, यह ultrafiltration प्रयोगों के लिए अनुपयुक्त बना. इसलिए, इसे खरीदा के रूप में lyophilization मिश्रण करने के लिए जोड़ा गया था । अवशिष्ट ग्लिसरॉल नकारात्मक परख के परिणाम को प्रभावित नहीं किया ।

इस फ्लोरोसेंट आरटी-लैंप तकनीक की सीमाओं में से एक एक एलईडी स्रोत का उपयोग है । जब परख singleplex या मल्टीप्लेक्स प्रारूप में चला रहे थे, जगह जांच के उच्च सांद्रता सभी लक्ष्यों के संकेत दृश्य के लिए आवश्यक थे । हालांकि, यह परिवर्तन समय के लिए संकेत जनरेशन में विलंब का कारण है । एक संभव तरीका है इस पर काबू पाने के दो एलईडी स्रोतों का उपयोग करने के लिए बेहतर अंय fluorophores (हेक्स और तमृ) समायोजित हो सकता है । इस तरह, कम जांच एकाग्रता के लिए कम गर्मी के समय के साथ एक संकेत उत्पंन किया जा सकता है ।

एक और सीमा है कि विचार की जरूरत है एक dimly जलाया वातावरण में आंख से प्रतिदीप्ति रंग पहचानने । यह आसान है अगर एक भी लक्ष्य एक singleplex या मल्टीप्लेक्स प्रारूप में मौजूद है, क्योंकि प्राइमरों के लिए एक दूसरे के साथ बातचीत नहीं डिजाइन किए गए थे । परख अगर कई लक्ष्यों को एक एकल परख ट्यूब में मौजूद थे, जैसे मच्छरों के एक पूल या एक से अधिक वायरल संक्रमण के साथ एक मरीज की व्याख्या कठिन होगा । इस तरह के एक डिजिटल प्रदर्शन के रूप में के रूप में नजर से पहचानने से पढ़ने के बाहर वास्तुकला, के एक परिवर्तन की आवश्यकता होगी ।

एक संभावित भविष्य का दृष्टिकोण मच्छर जनित arboviruses का एक बड़ा पैनल बनाकर मल्टीप्लेक्स के स्तर को बढ़ाने के लिए होगा. यह सावधान प्राइमर डिजाइन की आवश्यकता है प्राइमरी बातचीत से बचने के लिए, और इस तरह स्वयं के रूप में संशोधित न्यूक्लिक एसिड अनुरूप के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है आणविक मान्यता प्रणालियों से परहेज (SAMRS) और कृत्रिम रूप से विस्तारित आनुवंशिक सूचना प्रणाली (तत्वावधान) मल्टीप्लेक्सिंग३८के उच्च स्तर को बेहतर रूप से समायोजित करना. तदनुसार, एक उच्च मल्टीप्लेक्स प्रणाली में संकेत पढ़ें बाहर के लिए समाधान के लिए प्रत्येक के लिए एक जगह की जांच के लिए एक एकल fluorophore का उपयोग करें, और प्रत्येक लक्ष्य के लिए एक अद्वितीय विस्थापित अनुक्रम निर्दिष्ट और डीएनए द्वारा एक ठोस सतह पर विस्थापित जांच पर कब्जा होगा संकरण. यह एक एकल fluorophore के साथ एक सरणी स्वरूपित मंच बनाने के लिए और उत्तेजित करने के लिए नेतृत्व करेंगे, लेकिन प्रत्येक लक्ष्य की उपस्थिति को पहचानने सरणी39में अपनी स्थिति के आधार पर होगा ।

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Disclosures

लेखकों और उनके संस्थानों के कई बौद्धिक संपदा इस परख के साथ जुड़े ।

Acknowledgments

कार्य FDOH-7ZK15 और NIAID 1R21AI128188-01 द्वारा भाग में समर्थित किया गया था । अनुसंधान इस प्रकाशन में रिपोर्ट एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, और भाग में जैव चिकित्सा अनुसंधान स्वास्थ्य विभाग के फ्लोरिडा के द्वारा कार्यक्रम । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि NIH या फ्लोरिडा स्वास्थ्य विभाग के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं । गतिशील मिश्रित रसायन LLC उनके समर्थन और इस परियोजना के लिए योगदान के लिए स्वीकार किया है ।

डेंगू 1 वायरस (तनाव BOL-KW010) कृपया फ्लोरिडा स्वास्थ्य ब्यूरो की प्रयोगशालाओं के विभाग द्वारा प्रदान की गई थी । Zika वायरस और chikungunya वायरस के एशियाई वंश विनय रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र द्वारा प्रदान की गई । हिंद महासागर chikungunya वायरस के वंश कृपया रॉबर्ट तेश्वर द्वारा प्रदान की गई थी (विश्व संदर्भ उभरते वायरस और Arboviruses के लिए केंद्र, Galveston में टेक्सास चिकित्सा शाखा के विश्वविद्यालय के माध्यम से, टेक्सास) के लिए-FMEL । हम संक्रमण अध्ययन के साथ सहायता के लिए एस. Bellamy, बी. Eastmond, एस. Ortiz, डी. वेलेज़, के. Wiggins, आर. ZimLer, और के. Zirbel का धन्यवाद करते हैं । क्यू-पेपर प्रदान करने के लिए हम एम. एस. किम का भी धन्यवाद करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS Major Science MBE-150 Gel electrophoresis
G:BOX F3 Syngene G:BOX F3 Gel imaging
LightCycler 480 Instrument II, 96-well Roche Applied Science 05 015 278 001 Real-time PCR
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane Millipore Sigma UFC501096 ultrafiltraton membrane for dialysis
Eppendorf 5417C Centrifuge Marshall Scientific EP-5417C centrifuge
Myblock Mini Drybath Benchmark Scientific BSH200 drybath
FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System Labconco 7934020 lyophilizer
all priers and probes IDT custom RT-LAMP primers and probes
dNTP set Bioline BIO-39049
Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) Promega U1191
Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase New England Biolabs M0538L enzyme
WarmStart RTx Reverse Transcriptase New England Biolabs M0380L enzyme
RNase Inhibitor, Murine New England Biolabs M0314L enzyme
Antarctic Thermolabile UDG New England Biolabs M0372L enzyme
50bp DNA Step Ladder Promega G4521 marker
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Roche Applied Science 4729692001 real-time RT-LAMP analysis

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References

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