Summary
В этой статье описан метод измерения потребления кислорода с помощью высокого разрешения respirometry в permeabilized thoraxes дрозофила. Этот метод требует минимальное количество ткани, по сравнению с классической митохондриальной изоляции технику и результаты, полученные более физиологически важны.
Abstract
Плодовой мушки Drosophila melanogaster, представляет новые модели для изучения метаболизма. Действительно дрозофилы имеют структур гомологичных органов человека, обладают весьма сохранены метаболических и относительно короткий срок, что позволяет изучение различных основных механизмов в течение короткого времени. Это, однако, удивительно, что одним из механизмов, необходимых для клеточного метаболизма, митохондриальное дыхание, имеет не было тщательно расследовано в этой модели. Вполне вероятно, потому, что мера митохондриальное дыхание у дрозофилы, как правило, требует очень большого числа людей и полученные результаты не являются весьма воспроизводимость. Здесь описан метод, позволяющий точное измерение потребления кислорода митохондриальных, используя минимальное количество ткани от дрозофилы. В этом методе thoraxes разобрал и permeabilized как механически с острыми щипцами и химически с сапонин, позволяя различных соединений пересечь клеточной мембраны и модулировать митохондриальное дыхание. После permeabilization протокол выполняется для оценки способности различных комплексов транспортная система электронов (ETS) для окисления различных субстратов, а также их реакции на uncoupler и несколько ингибиторов. Этот метод предоставляет много преимуществ по сравнению с методами с использованием митохондриальной изоляции, как это более физиологически отношение, потому что митохондрии по-прежнему взаимодействия с другими компонентами клеточных и митохондриальных морфология сохраняется. Кроме того образец препараты быстрее, и полученные результаты весьма воспроизводимость. Сочетая преимущества дрозофилы как модель для изучения метаболизма с оценкой митохондриальное дыхание, важные новые идеи могут быть раскрынным, особенно когда мух испытывают различные экологические или патофизиологические условий.
Introduction
Плодовой мушки Drosophila melanogaster, был использован как модельный организм для генетических исследований для более чем столетие1. Исследование этого организма не только привела к значительным фундаментальных знаний о сцепленный с полом наследования2, мутация ставка3, развитие нервной системы и определение судьбы клетки4, но также недавно стала ценный инструмент для изучения механизмов, присущих несколько таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера и Паркинсона5,6. Кроме того это популярная модель для изучения процесса старения, как они могут быть подняты в большом количестве за короткий период времени и имеют короткий срок. Они также обладают гомологичных структур для человеческих органов, как сердце, oenocytes (гепатоцито подобных клеток), жир тела (аналогично функции печени и белой жировой ткани), инсулин производящ клетки (эквивалент клеток поджелудочной железы β), а также Гемолимфа транспортировки метаболитов (аналогично крови позвоночных)7. Кроме того Центральный путей промежуточного метаболизма (включая инсулин/инсулин подобный фактор роста как сигнальный путь и цель Rapamycin-Тор пути), также являются весьма сохраняется7. По этим причинам дрозофила недавно использовались для описания основных механизмов, которые контролируют метаболизм, особенно в патологических условиях присущие человеческой метаболических заболеваний, таких как диабет8. Одним из основных компонентов метаболизма является митохондрий, которая интегрирует множество путей и выполняет один из наиболее важных биологических функций жизни, производства АТФ, через процесс окислительного фосфорилирования (OXPHOS). Учитывая их центральную роль в метаболизме организма это не удивительно, что митохондриальной дисфункции участвуют во многих заболеваний как9 Паркинсона и Альцгеймера заболевания10, а также в боковой амиотрофический склероз 11 , 12. они также являются фундаментальные детерминанты процесса старения. Действительно они являются основными производителями реактивнооксигенных видов (ров) в ячейке, которая может быть пагубным для ячейки при высокой концентрации через оксидативного повреждения11. Старение также было связано к накоплению поврежденных или мутировавших митохондриальной ДНК13, mitophagy дисфункции14,15 , а также ухудшение митохондриальной биогенеза16. Митохондрии являются также ключевыми факторами, определяющими гомеостаза клетки, как они могут использовать различные субстраты для настройки нескольких клеточных функций согласно изобилия или дефицит макроэлементов17,18.
Действительно различные питательные вещества в рационе (углеводов, липидов и белков) переваривается, поглощаются и транспортируются в клетках. Затем они превращаются в цитозоле, и производные субстратов перевозятся в митохондриальной матрицу, где они производят сокращение эквиваленты, например NADH и ГВС219. Эти сокращения эквиваленты затем окисляется в различных ферментных комплексов транспортная система электронов (ETS). Эти комплексы, внедренные в митохондриальной внутренней мембраны, например комплекс I и II сложные. Кроме того другие ферментативные комплексы, такие как митохондриальных глицерин-3-фосфат-дегидрогеназы и пролина дегидрогеназа представляют собой альтернативные маршруты для вступления электронов в ETS20,21. Эти «альтернативные» комплексы особенно важны в насекомых, как по видам, они могут активно участвовать увеличить дыхание20,,2223,21. Электроны от этих ETS, системы кормления передаются убихинон и впоследствии для сложных III и затем комплекс CIV, до окончательного акцептор, молекулярный кислород. Этот перенос электрона генерирует Протон движущей силой всей внутренней митохондриальной мембраны, вождение фосфорилированием АДФ СПС в комплекс V (рис. 1). Учитывая центральную роль митохондрий в ячейки гомеостаза, изучение митохондриального метаболизма, используя соответствующие модели D. melanogaster представляет мощный инструмент для разграничения основных механизмов различных патофизиологические условия или под сотовой и экологические стрессы. Удивительно однако, лишь небольшое число исследований фактически измеряется митохондриальное дыхание в дрозофилы24,25,26. Действительно эксперименты, стремясь оценить потребление кислорода митохондриальной требуют изоляции митохондрий. Хотя и выгодно для измерения различных митохондриальной функции (например, производство ROS или коэффициент P/O как маркер митохондриальной эффективности27,28), эти изоляции, как правило, требуют довольно больших количествах Ткани из нескольких лиц24,29. Это требование для высоких объемов ткани и лиц является важным сдерживающим фактором, особенно с учетом того, что все люди должны быть того же возраста и желательно того же пола для экспериментов, делая измерения дыхания в разное время Указывает трудоемкий в лучшем случае. Кроме того хотя митохондриальной изоляции может обеспечить значительно углубить понимание основных механизмов, регулирующих митохондриальной метаболизма, методы, используемые для изоляции митохондрии имеют ряд недостатков, таких, как трудности, чтобы получить воспроизводимые результаты , нарушение митохондриальной сети и изменения митохондриального структуры и функции29,30,31.
Цель этого исследования заключается в представлении надежный протокол для измерения потребления митохондриальной кислорода у дрозофилы, используя только минимальное количество ткани от очень мало людей. Этот протокол состоит из измерения митохондрий кислородом потребления на месте с помощью29 permeabilized мышечных волокон от дрозофилы thoraxes в сочетании с высоким разрешением respirometry32,33, 34 , 35. Этот метод также имеет дополнительные преимущества по сравнению с методом классической митохондриальной изоляции, поскольку взаимодействия с другими компонентами клетки как хорошо как митохондриальных структуры и функции более сохранились в permeabilized волокна29,,3136, что делает этот подход более физиологически соответствующих. Этот протокол митохондриальной функции можно точно оцениваться с использованием высокого разрешения respirometry в только три thoraxes дрозофилы, с субстратами, позволяя определение потребления кислорода на нескольких разных ступенях ETS. Таким образом этот протокол может помочь ответить на ключевые вопросы о основных механизмов, которые контролируют метаболизм в контексте многих условий окружающей среды или патофизиологические, воспользовавшись дрозофилы модели.
Измерение потребления кислорода в несколько различных этапов ETS и оценить как различные субстраты способствуют дыхания, разных субстратах (рис. 1), uncoupler, и ингибиторы используется30 после permeabilization из ткани. В частности последовательного добавления различных субстратов выполняются для стимулирования вступления электронов через различные комплексы ETS. Uncoupler, карбонил цианид 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), затем добавляется в оптимальной концентрации для измерения-сочетании дыхания, т.е. -phosphorylating дыхание стимулировали потребление кислорода Максимальная. Последовательного ингибитирований комплексов, которые I, II и III затем выполняются для мониторинга потребления остаточного кислорода, что обусловлено реакции окисления-ETS. Наконец, комплекс IV максимальной дыхание потенциала может оцениваться путем инъекций N, N, N', N, p - тетраметилсвинца--фенилендиамином (TMPD), поставщик искусственного электрона и аскорбата. Важно отметить, что эксперименты проводятся при 24 °C, так как это температура, при котором вызываются мух.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. реагенты подготовка
- Подготовьте следующие решения для рассечения и permeabilization ткани.
- Приготовляют раствор сохранение: 2,77 мм CaK2EGTA, EGTA, 5.77 мм Na2СПС, 6.56 мм MgCl2, 20 мм таурина, 15 Na2фосфокреатина, имидазола 20 мм, 0,5 мм Дитиотреитол, 7.23 мм K2и 50 мм K-МЧС, рН 7,1 (могут быть сохранены при-20 ° C).
- Подготовить сапонин раствор: 5 мг сапонин в 1 мл раствора для сохранения (приготовить свежий ежедневно).
- Подготовьте следующие решения для измерения дыхания.
- Подготовка среднего дыхания: 120 мм KCl, 5 мм х2PO4, 3 мм HEPES, 1 мм EGTA, MgCl 1 мм2и 0,2% BSA (w/v), рН 7,2.
- Подготовка поверхностей, uncoupler, ингибиторы. Распустить все субстраты H2O и распустить uncoupler FCCP, а также ингибиторы в этиловом спирте, абсолютного (за исключением Дендримерные, который растворяется в H2O). Нейтрализовать большинство субстратов, а также Дендримерные (см. Таблицу материалы). Все концентрации уступаны протокол являются окончательные концентрации внутри камеры 2 мл.
2. Подготовка и калибровка с высоким разрешением респирометра.
- Вымойте палат, колпачки и пробки респирометра три раза с 70% этиловом спирте и в три раза с дистиллированной водой.
- Калибровка нулевой концентрации кислорода: Пипетки 2.3 мл среды дыхания в камерах и добавить 10 мг Дитионит натрия. Хотя максимальный объем камеры-2 мл, 2.3 мл добавляются к гарантировать что нет пузырьков воздуха под пробку при закрытии камер. Закройте камер с пробками и измерить концентрацию кислорода на 10-20 мин калибровки электродов на нулевой концентрации кислорода с результирующей скорости потребления кислорода.
- Мыть камер с дистиллированной водой, инкубировать в абсолютного этанола, в течение 10 минут и затем смойте дистиллированной водой.
- Калибровки на насыщение воздуха: Пипетки 2.3 мл среды дыхания в камерах, вставьте заглушки, аспирационная превышение средней верхней пробки, а затем поднимите пробки с распоркой. Избыток дыхания среднего накапаны в камерах (объем всего 2 мл) чтобы избежать наличия пузырьков воздуха после закрытия камер.
- Контролировать потребление кислорода за 45 минут до часа, до тех пор, пока концентрация кислорода (синий след) является стабильным около 250 Нм при 24 ° C.
3. рассечение мух и Permeabilization ткани
- Убедитесь, что все действия выполняются на льду.
- Обезболивают шесть мужчин мух же штамма, же возраст и поднял на ту же диету на льду для облегчения рассечение мух (одичал тип w1118, 15 дней, кормили кукурузной муки среднего).
- С помощью скальпеля и штраф наконечником щипцы, вскрыть мух (удалить головы и животы) держать только thoraxes, содержащие полет мышцы. Этот шаг может быть сделано с невооруженным глазом. Обрабатывать полученный thoraxes с острым концом щипцами.
- Перевести три расчлененных thoraxes в 25 мм Петри, содержащий 2 мл раствора ледяной сохранения с помощью щипцов.
- С острым концом щипцами механически разрушения thoraxes, вставив наконечник щипцы в thoraxes и неоднократно разорвать ткань для получения слабо связанной сети.
- В 24-ну плита заполните две скважины с 12,5 мкл раствора сапонина и 1 мл раствора сохранения для получения конечной концентрации 62,5 мкг/мл сапонины. Заполните два соседних скважин с 1 мл среды дыхания.
- С острым концом щипцами передача три permeabilized thoraxes в разреженных сапонин раствор и инкубировать с мягким перемешиванием на орбитальный шейкер, на льду, за 20 мин.
- После последней инкубации передача волокон в соседних скважин, наполненный среднего дыхания с мягким перемешиванием, на льду, на 5 минут, чтобы смыть сапонин.
4. Определение сухого веса
- Сухой permeabilized thoraxes на абсорбирующие поверхности и флип, 3 - 4 раза с помощью щипцов острым концом чтобы убедиться, что вся влага удаляется.
- Весят три thoraxes вместе на микровзвешивания. Обратите внимание на полученный вес, как он будет использоваться для нормализации показателей потребления митохондрий кислородом.
- Передача ткани сразу в капле среднего дыхания на льду.
5. кислорода определение цены потребления
- Откройте камеры респирометра (удалить пробки) и добавить 10 мм из пирувата и 2 мм малат в каждой камере.
- Добавьте permeabilized ткани непосредственно в камеры заполнены среднего дыхания.
- Замените пробки с помощью разделителя.
- С 60 мл шприц собирать кислорода непосредственно из цистерны кислорода и вставляют 2-5 мл кислорода через пробку капилляра каждой палаты убеждаться диффузии кислорода через ткань не будет ограничивать потребление кислорода.
- Вставьте шприц Гамильтон капилляров каждого пробку, чтобы убедиться, что thoraxes остаются в камере.
- Полностью закрыть камер, когда концентрация кислорода составляет около 400 Нм, достижение уровней кислорода выше насыщенность воздуха (около 160% воздуха насыщения) внутри камеры.
- Остановите и перезапустите мешалки для проверки пузырьков воздуха в камерах.
- Введите массы ткани, весил ранее для нормализации дыхания ставки по массе ткани (мг), Отображение потребления кислорода масса конкретных (пмоль O2 consumed.s-1.mg-1 ткани).
- После того, как потребление кислорода стабилизируется (красный след), добавьте 5 мм ADP с помощью шприца Гамильтон.
- После каждой инъекции, промойте шприцы с дистиллированной водой, этанол 70% и снова дистиллированной воды.
- Как только снова потребление кислорода является стабильной, придать 5 мкл 4 мм c тситохрома.
- Перейти к последовательным инъекции следующие субстраты для оценки потребления митохондриальной кислорода на разных этапах ETS:
- 5 мкл Proline 2 М.
- 10 мкл сукцината 1 М.
- 30 мкл 1 M глицерин-3-фосфат.
- Придать uncoupler FCCP образом титрования с шагом 0,5-1 мкм (2 мкл раствора 1 мм) до оптимальной концентрации является достиг, т.е. концентрация для достижения высокого потребления кислорода возможно без торможения (осторожно: увидеть таблицы из материалов).
- Внедрить следующие ингибиторы последовательно для того, чтобы полностью подавляют потока электронов в ETS для измерения потребления остаточного кислорода (ROX) т.е.-дыхательной реакции, такие как циклооксигеназы реакции среди прочего:
- 1 мкл ротенон 1 мм (осторожно: Смотрите Таблицу материалы).
- 5 мкл Дендримерные 2м (осторожно: Смотрите Таблицу материалы).
- 1 мкл 5 мм antimycin A (осторожно: Смотрите Таблицу материалы).
- Добавление аскорбиновая кислота 0,2 мм и 0,5 мм TMPD последовательно в камеры, начиная с аскорбат для измерения потребления кислорода на сложном IV.
- Добавить 20 мм азид натрия для ингибирования комплекс CIV (осторожно: Смотрите Таблицу материалы).
- После сигнала стабильна, откройте камер с распоркой, повторно кислородом палат путем инъекций 2 мл чистого кислорода и закрыть камер, когда концентрация составляет около 250-300 nmol.mL-1.
- Измерить сигнал на 10-15 мин и расчет химических фон, то есть потребление кислорода из-за autoxidation TMPD.
6. Очистка респирометра
- После измерения раз ополосните камер с дистиллированной водой и промойте камер три раза в 70% этиловом спирте.
- Инкубируйте в абсолютного этанола за 10 минут, чтобы инактивировать ингибиторы.
- Три раза промыть дистиллированной водой, заполнить камеры с 70% этанола и заменить пробки и колпачки до следующего использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель след потребления митохондриальной кислорода с помощью протокола, описанные выше приводится на рисунке 2. Пируват и малат, вводят в камерах вместе с permeabilized мышечных волокон упоминаются в CI-утечки дыхания, т.е., когда комплекс я ETS стимулируется NADH производится через окисление пирувата и малат через Цикл трикарбоновых кислот (CI). Во время этой частоты дыхания митохондриальных кислорода поддерживается главным образом компенсировать Протон утечки, то есть, протонов, пересекая из межмембранное пространства в митохондриальной матрицу, когда АТФ-синтазы является не активный (утечки)30. Когда добавляется ADP, АТФ-синтазы активируется и электроны переходят от комплекса I комплекс CIV с параллельных фосфорилированием АДФ в СПС (CI-OXPHOS), что приводит к увеличение потребления митохондрий кислородом. Коэффициент сцепления OXPHOS рассчитывается как CI-OXPHOS/CI-утечки и обычно берется как хороший показатель митохондриальной качества и митохондриальной муфта30. У дрозофилы это соотношение по крайней мере должен превышать 6.0 (рис. 3). Если он ниже этого значения, это может указывать на проблему с Подготовка тканей или митохондриальной дисфункции. Добавление c тситохрома позволяет определение целостности внешней мембраны митохондрий и поэтому используется как контроль качества подготовки (рис. 4). Действительно цитохром с слабо привязана к внутренней митохондриальной мембраны и это обычно смыты во время процесса permeabilization при повреждении внешней митохондриальной мембраны. В результате Добавление экзогенных цитохром с будет значительно увеличить потребление кислорода при повреждении внешней митохондриальной мембраны и эндогенных цитохром с теряется. Увеличение менее чем 10-15% в потребления кислорода (рис. 4) обычно показывает соответствующие целостности внешней митохондриальной мембраны29. На рисунке 3 и 4, были получены зеленый следы от номера адекватная permeabilization и обработки образцов (чрезмерное разрывая ткани на рисунке 3и весил после длительного времени на абсорбирующие поверхности на рис. 4), в то время как красные следы представляют образцы адекватно permeabilized и обрабатываются. Эти результаты подчеркивают, что соответствующие permeabilization условия имеют решающее значение для надежной оценки потребления митохондриальной кислорода.
Следующие субстратов, используемых в ходе экспериментов обеспечивают электронов убихинон и позволило увеличить потока электронов в ETS. ПроЛайн это аминокислота, которая может использоваться в качестве субстрата энергии особенно насекомых23, но и у млекопитающих во время острого голода или патологических состояний37. Добавление пролина в камерах позволяет оценить вклад пролина дегидрогеназа (ПРОДХ) потока электронов в ETS, когда электроны текут от оба комплекса I и ПРОДХ и участвуют в процессе OXPHOS (CI + ПРОДХ-OXPHOS). С добавлением сукцината вклад комплекс II (сукцинатдегидрогеназы) для ETS может наблюдаться (CI + ПРОДХ + CII-OXPHOS). Инъекции глицерин-3-фосфат (G3P), еще больше увеличивает потребление кислорода митохондриальной как этот субстрат стимулирует митохондриальной глицерин-3-фосфат-дегидрогеназы (G3PDH), который является частью Глицерофосфат Трансфер и передачи электроны в ETS (CI + ПРОДХ + CII + G3PDH-OXPHOS). ПРОДХ и G3PDH было показано, быть особенно активное участие в нескольких видов насекомых, и поэтому имеет важное значение в этом протоколе с дрозофилы20,21,,2223,32 .
Когда получается uncoupler, который добавляется FCCP,-сочетании дыхания (ETS состояние), т.е., потребление максимальное кислорода, представляющий максимальную способность ETS (CI + ПРОДХ + CII + G3P-ETS). FCCP является protonophore, который перевозит протоны из межмембранное пространства в митохондриальной матрицу без прохождения через комплекс V. FCCP должен быть тщательно титруют, как концентрации ниже оптимального результата потребления кислорода-максимальные и нестабильным дыхания ставки при концентрации выше оптимального результата в торможении потребления митохондриальной кислорода (рис. 5). После добавления субстрата и uncoupler, ингибирование комплексов, I, II и III может быть последовательно выполняются ротенон, Дендримерные и antimycin A, соответственно. С каждым ингибитора используется наблюдается снижение потребления митохондриальной кислорода, до достижения низкого потребления кислорода после добавления antimycin а. Скорость достигла после добавления всех ингибиторов является потребление остаточного кислорода30. Он представляет собой потребление кислорода вследствие не митохондриальных окислительных реакций таких реакций циклооксигеназы и реактивных видов производства, например, и поэтому должен быть вычитанным от всех других курсов измеряется.
TMPD-искусственные электрона перевозчик, предоставляющий электронов непосредственно в сложном IV, минуя все комплексы вверх по течению, позволяя измерения комплекс IV максимальной дыхание мощности. Этот субстрат, однако склонны к autoxidation, поэтому аскорбат должен быть добавлен предварительного TMPD ограничения, но не полностью избежать этой autoxidation. Чтобы исправить для оставшихся autoxidation TMPD, азид натрия ингибитор комплекс IV добавляется камер и потребление кислорода затем записывается на 10-15 минут. Это потребление кислорода поэтому представляет химического фона, или, другими словами, autoxidation TMPD, которые должны приниматься во внимание для расчета сложных IV максимальной дыхание потенциала.
Рисунок 1 . Схематическое представление митохондриальной переноса электронов, транспортная система электронов и окислительного фосфорилирования в внутреннюю мембрану митохондрий. I: комплекс я; II: комплекс II; III: комплекс III; IV: комплекс IV; V: АТФ-синтазы; Ацетил-КоА: ацетил коэнзима A; CYT c: c тситохрома; e–: электрон; G3P: глицерин-3-фосфат; G3PDH: митохондриальной глицерин-3-фосфат дегидрогеназа; H+: Протон; ПРОДХ: пролина дегидрогеназа; TCA: Цикл трикарбоновых кислот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Представитель следы митохондриальной кислорода концентрация (синий след) и потребления (красный след) на permeabilized thoraxes дрозофила. Каждой инъекции представлена со стрелкой, указывающей вводят соединения (Pyr: пируват; мал: малата; АДАПТАЦИЯ; CYT c: c тситохрома; Pro: пролина; SUCC: сукцината; G3P: глицерин-3-фосфат; FCCP: карбонильных цианида 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone; Гниль: ротенон; Мало: Дендримерные; Муравей A: antimycin A; TMPD: N, N, N', N, p - тетраметилсвинца--фенилендиамином; ASC: аскорбиновая кислота; САЗ: азид натрия). Каждый митохондрий кислородом расхода обозначается на графике, когда стабилизировать потребление кислорода (красный след). C тситохрома эффект означает целостность внешней мембраны митохондрий (см. текст для подробной информации). Остаточного кислорода потребление представляет собой потребление кислорода из-за окислительного побочных реакций в клетках и должен быть вычитанным на другие измерения ставки. Химический фон обозначает потребление кислорода только благодаря autoxidation TMPD и должно приниматься во внимание для расчета сложных IV максимальной дыхание потенциала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Представитель следы действительный (красный след, камеры A) и неадекватной (зеленый след, палата B) ответы с добавлением ADP. Красный след соответствует камеры A а зеленый след в палату B, во время же эксперимента. Красный след был получен из thoraxes, адекватно permeabilized, тогда как зеленый след был получен после чрезмерно разрывов тканей во время permeabilization. При добавлении ADP, ожидается увеличение потребления кислорода, как красный след. OXPHOS муфта коэффициенты рассчитываются как CI-OXPHOS/CI-утечки и представлены на графике. Соотношение меньше чем 6.0 в дрозофилы предполагает проблему в митохондриальной муфту и характерно образца деградации или митохондриальной дисфункции, представленный зеленый след. Pyr: пируват; мал: малат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Представитель следы действительный (красный след, камеры A) и неадекватной (зеленый след, палата B) ответ на добавление цитохрома c. Красный след соответствует камеры A а зеленый след в палату B, во время же эксперимента. Красный след был получен от thoraxes адекватно permeabilized и обрабатываются, в то время как зеленый след был получен после thoraxes были намеренно сушат на более длительное время на абсорбирующие поверхности до взвешивания. Цитохром с обычно не увеличить потребление митохондриальной кислорода, как видно на красный след, обозначающий, что внешней митохондриальной мембраны неповрежденными. Если, однако, добавление экзогенных цитохром с значительно увеличивает митохондрий кислородом потребления более чем на 15%, как видно на зеленый след, он предполагает, что повреждена внешней мембраны митохондрий и следовательно что образец разлагается и должно быть отбрасываются. Pyr: пируват; мал: малата; CYT c: цитохрома c. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Представитель следы митохондриальной кислорода концентрация (синий след) и потребления (красный след) после титрования FCCP. Различные инъекции FCCP на нескольких концентрации должны быть тщательно выполнены определить потребление максимальное кислорода, вызванные этой uncoupler. Недостаточной концентрации не позволяют оценку потребления кислорода Максимальная и характеризуются нестабильным дыхания ставки, тогда как FCCP избыток подавляет потребления митохондриальной кислорода. Стрелки обозначают различные инъекции FCCP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Воспроизводимость потребления кислорода митохондриальной ставок во время типичного эксперимент, полученных с помощью двух различных камер (красный след, камеры A; зеленый след, палата B) респирометра. Красный след соответствует камеры A а зеленый след в палату B, в тот же эксперимент с использованием дрозофилы из того же возраста, секс, деформации и вырос на ту же диету, а также протокол, в описанный. Оба образца были нормализованы с массы сухой ткани, весил, как описано в протоколе (0,53 и 0,66 мг для камер A и B, соответственно). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании описан метод для подготовки проб до измерения потребления митохондриальной кислорода у дрозофилы. Этот метод был разработан для преодоления различных проблем, связанных с протоколы, используя митохондриальной изоляции, особенно в том, что касается продолжительности и числа лиц, требуется. Вместо работы с митохондриальных изоляции, обычно требующих большое количество тканей, полученных из нескольких лиц, этот эксперимент выполняется на permeabilized мышечные волокна из thoraxes несколько дрозофилы. В этом протоколе только три лица необходимы для отображения оптимальные результаты. Таким образом измерение потребления кислорода митохондрий в различные моменты времени возможен, как это более достижимой для синхронизации меньшие группы мух того же возраста и одного пола.
Во-первых это важно использовать дрозофилы же возраста, пола, деформации и поднял в тех же условиях для получения низкой изменчивости в результатах (рис. 6), как дыхание может измениться с возраста, пола, генотипа и диетические мух. Наиболее важным этапом в осуществлении настоящего Протокола является permeabilization процедурой thoraxes. Очень важно действовать быстро, чтобы избежать деградации ткани, и это также важно, чтобы убедиться, что thoraxes хорошо permeabilized иметь максимальные показатели потребления кислорода. Для обеспечения что permeabilization была выполнена правильно и что структурной и функциональной целостности митохондрии сохраняются после permeabilization, OXPHOS, муфты соотношение (CI-OXPHOS/CI-утечки, рис. 3), а также ответ на цитохром с (рис. 4) используются в качестве контроля качества. Существует компромисс принимать во внимание между работает быстро и убедившись, что permeabilization хорошо выполняется. Это также важно всегда работает на льду, когда манипулирования расчлененных thoraxes. Для получения наиболее воспроизводимость результатов (рис. 6), необходима однородная permeabilization и практикующих технику для permeabilization помогает убедиться, что повторяются те же движения. Другим важным шагом является определение сухого веса образца. Действительно после thoraxes инкубируют, они являются очень чувствительными, хрупка и подвержена деградации. Поэтому подобно к permeabilization, быстро приступить к определению сухого веса имеет важное значение. С другой стороны важно определить вес с точностью, как результаты нормализуются массы ткани. Количество thoraxes используется также может быть оптимизирован. Протокол может быть адаптирована для использования единого грудной клетки на камере35, но определенный уровень резолюции могут быть потеряны в измерение потребления кислорода как при определении сухого веса. Количество thoraxes может быть увеличен при необходимости, но важно отметить, что больше митохондрий в образце, тем выше потребления кислорода и камеры должны поэтому быть reoxygenated. Этот реоксигенацию может быть сделано путем открытия камеры и придать кислорода, но это увеличит вероятность вставки пузырьков воздуха в камере. Поэтому если возможно, старайтесь избегать необходимости reoxygenate палат (за исключением тех случаев, когда комплекс IV максимальной дыхание потенциала должен быть определен). Перед запуском эксперименты, оптимизация концентрации субстрата необходимо также достичь высокого потребления митохондриальной кислорода без соблюдения тормозящее действие из-за чрезмерной концентрации. Камеры респирометра также должны быть тщательно очищены для того, чтобы избежать возможных загрязнений. Важно начать очистку с дистиллированной водой, а затем избавиться от потенциальных биологических загрязнений на 70% спирте. После этого, инкубации в абсолютного этанола, в течение 10 минут рекомендуется избегать загрязнения гидрофобные ингибиторов. Наконец камеры с дистиллированной водой для ополаскивания и заполнения их с 70% этанол будет избежать потенциальных загрязнений до следующего использования.
Протокол могут быть легко изменены для изучения влияния других субстратов, или разных ингибиторов. Например интересный белок для изучения является носителем митохондриальной пирувата (ПДК). Роль этого белка — для перевозки пируват, сгенерированные в цитозоле митохондриальной матрицы. Недавно было предложено играть важную роль в модуляции метаболизма при патологических состояний, таких как во время тип 2 диабет38. Изучение влияния белка ПДК на митохондриальной метаболизма, полезно начать инъекции с пируваткиназой только вместо пируват и малат в то же время. Таким образом пируват изучено влияние независимо от влияния малата, как последний вводится только поддержать цикла трикарбоновых кислот и обеспечить что интермедиатов не истощены. Это также можно использовать ингибиторы MPC39 для оценки, если ограничение этого перевозчика, вместо окисление пирувата наблюдается. Затем можно было бы наблюдать потенциального сдвига в источнике предпочтительным топлива для дыхания40. Это также можно опустить некоторые субстратов для упрощения протокола, если это не актуально для исследования. Например изучение дисфункции комплекса я только, не стоит использовать все субстраты, представленные в настоящем Протоколе.
Этот протокол представляет некоторые ограничения, которые отвлекают от условий в естественных условиях . Измерение потребления кислорода митохондриальной записаны когда дыхание средний выше воздуха насыщенность, как чистый кислород вводится, чтобы не допустить ограничения диффузии кислорода внутри ткани30. Кроме того концентрации субстрата впрыснуты в избытке, которые не отражают условия в естественных условиях . Важно также отметить, что возраст, пол, деформации и диета дрозофилы может повлиять на результаты. Эти параметры являются таким образом приниматься во внимание при интерпретации результатов. Этот метод является однако ближе к физиологических условиях, чем методы с использованием митохондриальной изоляции для измерения потребления митохондриальной кислорода, как взаимодействие с других клеточных компонентов и структурной целостности митохондрий и Морфология являются сохранение31. Важно отметить, что митохондриальной изоляции более выгодным, когда дополнительные параметры, такие как производство ROS или митохондриальной эффективность (отношение P/O) должны быть измеренной27.
Этот метод может использоваться для достижения различных целей, начиная от понимания митохондриальной дисфункции и основные механизмы метаболических заболеваний, для тестирования воздействия различных соединений на митохондриальной функции при патологических условий. Кроме того она может использоваться для наблюдения за последствия нескольких экологических напряжений на митохондриальной метаболизм, например, изменения в диете или температуры. Например это возможно для изучения эффективности биологически синтетическим молекулам митохондриальной функции и в лечении митохондриальной дисфункции. Этот метод также является хорошим инструментом для изучения митохондриальной функции в разное время точек, что делает его весьма актуальной для изучения основных механизмов, связанных с процессом старения. Оценки митохондриальной метаболизма через потребление кислорода с помощью permeabilized thoraxes, безусловно, поможет улучшить наши знания о роли митохондриальной метаболизма когда клетка подвергается в сложных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было профинансировано грантов от национальной науки и инженерных исследований Совета (Сенти, открытие Грант) и Université de Moncton NP. LHB хотел бы отметить финансовую поддержку от Канадского института медицинских исследований (КНИИЗ), Нью-Брансуик инновационный фонд (NBIF) и Université de Moncton. Работа EHC поддерживается Alzheimer общества Канады, Канада мозга, Сенти, Канадский Фонд рака молочной железы, Нью-Брансуик инновационного фонда, Нью-Брансуик Фонд исследований в области здравоохранения и Université de Moncton.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Fine-tipped antimagnetic forceps | VWR | 82027-400 | |
| Secura225D-1S-DQE | Sartorius AG, Goettingen, Germany | Semi-micro balance (distributed by several companies) |
|
| Drosophila melanogaster wild-type w1118 | Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA | Storage Condition: 24 °C |
|
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA Storage Condition: RT |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | Storage Condition: RT |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Storage Condition: -20 °C |
| MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | Storage Condition: RT |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Storage Condition: RT |
| Na2Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | Storage Condition: -20 °C |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | Storage Condition: RT |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Storage Condition: 2-8 °C |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | Storage Condition: RT |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 | Saponin Storage Condition: RT Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily. |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | Storage Condition: RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | Storage Condition: RT |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Storage Condition: RT |
| BSA | Sigma-Aldrich | 05470 | Storage Condition: 2-8 °C |
| Na2S2O4 | Sigma-Aldrich | 157953 | Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Pyruvate Storage Condition: 2-8 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily. |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Malate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C. |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A5285 | ADP Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C. |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | Cytochrome c Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Proline Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | Succinate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C. |
| sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt | Sigma-Aldrich | G7886 | Glycerol-3-phosphate Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C. |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C. |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C. |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily. |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C. |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | TMPD Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Ascorbate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
References
- Stephenson, R., Metcalfe, N. H. Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use. The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).
- Morgan, T. H. An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila. Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).
- Dobzhansky, T., Wright, S. Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura. Genetics. 26 (1), 23-51 (1941).
- Zipursky, S. L., Rubin, G. M. Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).
- Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease. The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).
- Blandini, F., Armentero, M. T. Animal models of Parkinson's disease. FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).
- Baker, K. D., Thummel, C. S. Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila. Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).
- Morris, S. N. S., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).
- Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).
- Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T.
- Szibor, M., Holtz, J.
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- López-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. Mitochondrial biogenesis and healthy aging. Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).
- Muoio, D. M. Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock. Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).
- Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M.
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).
- McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. "Alternative" fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).
- Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production. PLOS ONE. 10 (3), e0120600 (2015).
- Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor. Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).
- Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333 (2016).
- Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster. The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).
- Miwa, S., Brand, M. D. The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).
- Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).
- Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria. Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).
- Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males. Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).
- Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., Côté, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies. Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways. Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).
- Bender, T., Martinou, J. C. The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- McCommis, K., et al. An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion. Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).
