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Biochemistry

Mesure de la consommation d’oxygène mitochondriale dans les fibres perméabilisées de la drosophile à l’aide de petites quantités de tissu

Published: April 7, 2018 doi: 10.3791/57376
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Département de chimie et biochimie, Université de Moncton, 2Département de biologie, Université de Moncton
* These authors contributed equally

Summary

Dans cet article, on décrit une méthode pour mesurer la consommation d’oxygène à l’aide de respirométrie haute résolution en thoraxes perméabilisées de drosophile. Cette technique nécessite une quantité minimale de tissu par rapport à la technique d’isolement mitochondrial classique et les résultats obtenus sont plus physiologiquement pertinents.

Abstract

La drosophile, Drosophila melanogaster, représente un nouveau modèle pour l’étude du métabolisme. En effet, drosophile possèdent des structures homologues aux organes humains, de posséder des voies métaboliques hautement conservées et ont une durée de vie relativement courte qui permet l’étude des mécanismes fondamentaux différents dans un court laps de temps. Toutefois, il est surprenant que l’un des mécanismes essentiels pour le métabolisme cellulaire, la respiration mitochondriale, n’a pas été soigneusement étudié dans ce modèle. C’est probablement parce que la mesure de la respiration mitochondriale chez la drosophile nécessite généralement un très grand nombre de personnes et les résultats obtenus ne sont pas très reproductibles. Nous décrivons ici, une méthode qui permet la mesure précise de la consommation d’oxygène mitochondriale en utilisant des quantités minimales de tissus de drosophile. Dans cette méthode, les thoraxes sont disséqués et perméabilisées mécaniquement avec une pince forte tant chimiquement avec saponine, permettant à différents composés de traverser la membrane cellulaire et moduler la respiration mitochondriale. Après perméabilisation, un protocole est effectué afin d’évaluer la capacité des différents complexes du système de transport d’électrons (ETS) pour oxyder les différents substrats, ainsi que leur réponse à un découpleur et à plusieurs inhibiteurs. Cette méthode présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes utilisant des isolations mitochondriales, car il est plus physiologiquement pertinente parce que les mitochondries sont toujours en interaction avec les autres composants cellulaires et la morphologie mitochondriale est conservée. En outre, préparation de l’échantillon est plus rapides, et les résultats obtenus sont très reproductibles. En combinant les avantages de la drosophile comme modèle pour l’étude du métabolisme avec l’évaluation de la respiration mitochondriale, important de nouvelles connaissances peuvent être dévoilés, surtout quand les mouches connaissent différents environnement ou physiopathologiques conditions.

Introduction

La drosophile, Drosophila melanogaster, a servi comme un organisme modèle pour la recherche génétique pour plus d’un siècle1. L’étude de cet organisme n’a pas seulement permis d’importantes connaissances fondamentales sur la cellule sort dosage4, le développement du système nerveux et mutation taux3, hérédité liée au sexe2, mais a aussi récemment émergé comme un outil précieux pour étudier les mécanismes inhérents à plusieurs maladies comme l’Alzheimer et Parkinson5,6. En outre, c’est un modèle populaire pour étudier le processus de vieillissement, car ils peuvent être déclenchés en grand nombre sur une courte période de temps et ont une durée de vie courte. Ils possèdent également des structures homologues d’organes humains, tels que les cellules (équivalents à des cellules β pancréatiques), productrices d’insuline, des corps gras (fonctionnement de même que le tissu adipeux blanc et foie), oenocytes (cellules hépatocytes), un cœur ainsi que la hémolymphe transportant des métabolites (analogue au sang des vertébrés)7. En outre, les voies centrales du métabolisme intermédiaire (y compris la voie de signalisation comme facteur de croissance analogue à l’insuline/insuline et les voies de la cible de la rapamycine-TOR) sont également hautement conservée7. Pour ces raisons, drosophile ont récemment été exploités pour décrire les mécanismes fondamentaux qui régissent le métabolisme, en particulier dans les pathologies inhérentes aux maladies métaboliques comme le diabète8. Une composante importante du métabolisme est la mitochondrie qui intègre de multiples voies et effectue l’une des plus importantes fonctions biologiques de la vie, la production d’ATP, par l’intermédiaire du processus de la phosphorylation oxydative (OXPHOS). Compte tenu de leur rôle central dans le métabolisme de l’organisme, il n’est pas surprenant que les dysfonctions mitochondriales sont impliquées dans de nombreuses maladies comme la maladie de Parkinson9 et Alzheimer maladies10, ainsi que dans la sclérose latérale amyotrophique 11 , 12. ils sont également déterminants fondamentaux du vieillissement. En effet, ils sont les principaux producteurs de reactive oxygen species (ROS) dans la cellule, qui peut être préjudiciable à la cellule à haute concentration à travers les dommages oxydatifs11. Vieillissement a été également associée à l’accumulation d’endommagés ou muté mitochondrial DNA13, mitophagy dysfonctionnements14,15 ainsi que de déficience de la biogenèse mitochondriale,16. Les mitochondries sont également des facteurs déterminants de l’homéostasie de la cellule qu’ils peuvent utiliser différents substrats pour ajuster plusieurs fonctions cellulaires selon l’abondance ou la rareté des macronutriments17,18.

En effet, les différents nutriments dans l’alimentation (glucides, lipides et protéines) sont digérés, absorbés et transportés dans les cellules. Ils sont ensuite transformés dans le cytosol, et les substrats dérivées sont transportés dans la matrice mitochondriale où elles produisent des équivalents réducteurs, comme le NADH et FADH219. Ces équivalents réducteurs sont ensuite oxydés par différents complexes enzymatiques du système de transport d’électrons (ETS). Ces complexes sont incorporées dans la membrane interne mitochondriale, tels que les complexes I et II complexe. En outre, autres complexes enzymatiques tels que le glycérol-3-phosphate déshydrogénase mitochondriale et la proline déshydrogénase représentent des voies alternatives pour l’entrée des électrons dans les ETS20,21. Ces complexes « alternatives » sont particulièrement importantes chez les insectes, comme selon les espèces, ils peuvent participer activement afin d’augmenter la respiration20,22,23,21. Électrons de ces ETS systèmes d’alimentation sont transférés à l’ubiquinone et par la suite au complexe III, puis à complexe IV, jusqu'à ce que l’accepteur final, l’oxygène moléculaire. Ce transfert d’électrons génère une force proton-motrice à travers la membrane mitochondriale interne conduite la phosphorylation de l’ADP en ATP au complexe V (Figure 1). Considérant le rôle central des mitochondries dans l’homéostasie de la cellule, étudier le métabolisme mitochondrial en utilisant le modèle pertinent d. melanogaster représente un outil puissant pour délimiter les mécanismes sous-jacents de divers physiopathologiques conditions ou soumis à des contraintes environnementales et cellulaires. Curieusement cependant, seulement une poignée d’études réellement mesurées la respiration mitochondriale dans drosophile24,25,26. En effet, les expériences visant à évaluer la consommation d’oxygène mitochondriale exigent l’isolement des mitochondries. Même si c’est avantageux pour la mesure des différentes fonctions mitochondriales (telles que la production de ROS ou ratio P/O comme marqueur mitochondrial efficacité27,28), ces cas requièrent généralement assez grandes quantités des tissus provenant de plusieurs individus24,29. Cette exigence de grandes quantités de tissus et d’individus est un facteur limitant important, surtout si l'on considère que tous les individus soient du même âge et de préférence du même sexe pour les expériences, faire de la mesure de la respiration à différents temps pointe laborieux au mieux. En outre, alors que des isolations mitochondriales peuvent fournir la perspicacité significative sur les mécanismes fondamentaux qui régissent le métabolisme mitochondrial, les méthodes utilisées pour isoler les mitochondries ont plusieurs inconvénients tels que la difficulté d’obtenir des résultats reproductibles , perturbation du réseau mitochondrial et altération mitochondriale structure et la fonction29,30,31.

Le but de cette étude est de présenter un protocole robuste pour mesurer la consommation d’oxygène mitochondriale chez la drosophile en utilisant seulement une quantité minimale de tissu de très peu d’individus. Ce protocole consiste à mesurer l’oxygène mitochondriale consommation in situ utilisant des fibres musculaires perméabilisées29 de thoraxes de la drosophile en combinaison avec haute résolution respirométrie32,33, 34 , 35. cette méthode a également des avantages supplémentaires par rapport à la méthode d’isolement mitochondrial classique étant donné que les interactions avec les autres composants de la cellule aussi bien comme mitochondriale de structure et de fonction sont plus préservés dans perméabilisées fibres29,31,36, qui rend cette approche plus physiologiquement pertinents. Avec ce protocole, fonctions mitochondriales peuvent être précisément évaluées à l’aide de respirométrie haute résolution en seulement trois thoraxes de la drosophile, avec des substrats permettant la détermination de la consommation d’oxygène à plusieurs étapes différentes de l’ETS. Par conséquent, ce protocole pourrait aider à répondre à des questions clés sur les mécanismes fondamentaux qui contrôlent le métabolisme dans le cadre de nombreuses conditions environnementales ou pathophysiologiques en tirant parti du modèle drosophile.

Pour mesurer la consommation d’oxygène à plusieurs étapes différentes de l’ETS et évaluer comment différents substrats contribuent à la respiration, les différents substrats (Figure 1), les découpleur et inhibiteurs sont utilisés30 Après perméabilisation de la tissus. Plus précisément, ajouts séquentielles de différents substrats sont effectuées afin de stimuler l’entrée des électrons à travers différents complexes de l’ETS. Un découpleur, carbonyl cyanide 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP), est alors ajouté à une concentration optimale pour mesurer la respiration non couplés, c'est-à-dire la respiration non-phosphorylation stimulée à consommation maximale d’oxygène. Inhibitions séquentielles des complexes qu'i, II et III sommes ensuite effectuée afin de surveiller la consommation d’oxygène résiduel qui est due à des réactions d’oxydation non-ETS. Enfin, capacité de respiration maximale complexe IV peut être évaluée par l’injection de N, N, N «, N, - tétraméthyl - p-phénylènediamine (TMPD), un fournisseur d’électrons artificiels et l’ascorbate. Il est important de noter que les expériences sont menées à 24 °C, puisque c’est la température à laquelle les mouches sont déclenchés.

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Protocol

1. préparation de réactifs

  1. Préparer les solutions suivantes pour la dissection et la perméabilisation du tissu.
    1. Préparer la solution de préservation : 2,77 CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, taurine, 20 mM 15 mM phosphocréatine de2Na, imidazole de 20 mM, 0,5 mM dithiothréitol et 50 mM K-MES, pH 7.1 (peut être conservée à-20 ° C).
    2. Préparer la solution de saponine : 5 mg de saponine dans 1 mL de solution de préservation (préparer les frais du jour).
  2. Préparer les solutions suivantes pour la mesure de la respiration.
    1. Préparer le milieu de la respiration : 120 mM KCl 5 mM KH2PO4, 3 mM HEPES, EGTA 1 mM, 1 mM MgCl2et BSA de 0,2 % (p/v), pH 7,2.
    2. Préparer des substrats, découpleur, inhibiteurs. Dissoudre tous les substrats en H2O et dissoudre le découpleur FCCP ainsi que les inhibiteurs dans l’éthanol absolu (sauf le malonate qui se dilue dans H2O). Neutraliser la plupart des substrats et le malonate (voir Table des matières). Toutes les concentrations indiquées dans le protocole sont les concentrations finales à l’intérieur de chambres de 2 mL.

2. préparation et étalonnage de la respiromètre haute résolution.

  1. Laver la chambres, capuchons et bouchons du respiromètre trois fois avec l’éthanol à 70 % et trois fois avec de l’eau distillée.
  2. Étalonnage à zéro de concentration en oxygène : pipette 2,3 mL de milieu de respiration dans les chambres et ajouter 10 mg de dithionite de sodium. Bien que le volume maximal de la chambre est de 2 mL, 2,3 mL sont ajoutés pour veiller à ce qu’aucune bulle d’air ne reste sous le bouchon lors de la fermeture des chambres. Fermer les chambres avec les bouchons et mesurer la concentration en oxygène pour 10-20 min. étalonner les électrodes à zéro de concentration en oxygène avec le taux de consommation d’oxygène qui en résulte.
  3. Laver les chambres avec de l’eau distillée et incuber en éthanol absolu pendant 10 min puis rincez à l’eau distillée.
  4. Calibrez à saturation de l’air : pipette 2,3 mL de milieu de respiration dans les chambres, insérez les bouchons, aspirer l’excès du milieu sur le dessus les bouchons et puis retirez les bouchons avec l’entretoise. Milieu de respiration excessive est reversé dans les chambres (volume total de 2 ml) afin d’éviter la présence de bulles d’air après la fermeture des chambres.
  5. Surveiller la consommation d’oxygène pendant 45 min à une heure, jusqu'à ce que la concentration en oxygène (trace bleue) est stable autour de 250 nM à 24 ° C.

3. dissection de mouches et de perméabilisation de tissu

  1. Assurez-vous que toutes les mesures sont effectuées sur la glace.
  2. Anesthésier six mouches mâles de la même souche, même âge et a grandi sur le même régime alimentaire sur la glace pour faciliter la dissection des mouches (type sauvage w1118, 15 jours, nourris sur le milieu de la semoule de maïs).
  3. À l’aide d’un scalpel et pinces à pointe fine, disséquer les mouches (enlever les têtes et l’abdomen) pour garder uniquement les thoraxes contenant les muscles du vol. Cette étape peut être faite à le œil nu. Gérer les thoraxes qui en résulte avec une pince à pointe fine.
  4. Le transfert de trois thoraxes découpées dans une boîte de Pétri contenant 2 mL de solution de préservation glacée à l’aide de la pince de 25 mm.
  5. Avec la pince à pointe fine, mécaniquement permeabilize les thoraxes en insérant l’extrémité de la pince dans les thoraxes et à plusieurs reprises déchirer le tissu pour obtenir un réseau vaguement lié.
  6. Dans un plat de 24 puits, remplir deux puits avec 12,5 µL de la solution de saponine et 1 mL de solution de conservation pour obtenir une concentration finale de 62,5 µg/mL de saponine. Remplir les deux puits adjacents avec 1 mL de milieu de respiration.
  7. Avec la pince à pointe fine, transférer trois perméabilisées thoraxes dans la solution diluée de saponine et incuber en agitant le mélange doux dans un agitateur orbital, sur la glace, pendant 20 min.
  8. Après l’incubation de ce dernier, transférer les fibres dans les puits adjacents remplis d’agitation légère, sur la glace, pendant 5 min à rincer la saponine, au milieu de la respiration.

4. détermination de la masse sèche

  1. Sécher les perméabilisées thoraxes sur une surface absorbante et flip 3 - 4 fois à l’aide de la pince à pointe fine pour s’assurer que toute l’humidité est enlevée.
  2. Peser les trois thoraxes ensemble sur une microbalance. Notez le poids obtenu car il sera utilisé pour normaliser les taux de consommation d’oxygène mitochondriale.
  3. Transférer les tissus immédiatement dans une goutte de milieu de respiration sur la glace.

5. détermination de taux consommation d’oxygène

  1. Ouvrez les chambres du respiromètre (enlever les bouchons) et ajouter 10 mM du pyruvate et de 2 millimètres de malate dans chaque chambre.
  2. Ajouter les tissus perméabilisées directement dans les salles remplies avec le milieu de la respiration.
  3. Remplacer les bouchons à l’aide de l’entretoise.
  4. Avec une seringue de 60 mL, recueillir de l’oxygène directement depuis un réservoir d’oxygène et injecter 2 à 5 mL de l’oxygène à travers le capillaire bouchon de chaque chambre pour s’assurer que la diffusion de l’oxygène à travers le tissu ne limitera pas la consommation d’oxygène.
  5. Insérer une seringue de Hamilton dans le capillaire de chaque bouchon pour s’assurer que les thoraxes restent dans la salle.
  6. Fermer les chambres complètement lorsque la concentration en oxygène est environ de 400 nM, atteindre des niveaux d’oxygène au-dessus de saturation de l’air (environ 160 % saturation d’air) à l’intérieur des chambres.
  7. Arrêtez et redémarrez les agitateurs pour vérifier les bulles d’air dans les chambres.
  8. Indiquer la masse de tissu pesé auparavant pour normaliser les taux de respiration par la masse de tissu (mg), affichage de consommation d’oxygène spécifique à la masse (pmol O2 consumed.s-1.mg-1 du tissu).
  9. Une fois que la consommation d’oxygène est stabilisée (trace rouge), ajouter 5 mM ADP avec une seringue de Hamilton.
  10. Après chaque injection, rincer la seringue avec de l’eau distillée, éthanol à 70 % et à nouveau de l’eau distillée.
  11. Une fois que la consommation d’oxygène est à nouveau stable, injecter 5 µL de 4 mM du cytochrome c.
  12. Aller de l’avant pour les injections séquentielles des substrats suivants pour évaluer la consommation d’oxygène mitochondriale à différentes étapes de l’ETS :
    1. Ajouter 5 µL d’une Proline 2 M.
    2. Ajouter 10 µL d’un succinate de 1 M.
    3. Ajouter 30 µL d’un 1 M glycérol-3-phosphate.
  13. Injecter le découpleur, FCCP, d’une manière de titrage par pas de 0,5 à 1 µM (2 µL d’une solution de 1 mM) jusqu'à ce que la concentration optimale est atteinte, c'est-à-dire la concentration pour atteindre la plus haut possible sans inhibition de consommation d’oxygène (attention : voir Table des matériaux).
  14. Injecter les inhibiteurs suivants dans l’ordre pour empêcher entièrement le flux d’électrons dans le SCEQE afin de mesurer la consommation d’oxygène résiduel (ROX) c'est-à-dire non respiratoires réactions comme réactions oxygénase entre autres :
    1. Ajouter 1 µL d’une roténone 1 mM (attention : voir Table des matières).
    2. Ajouter 5 µL d’un malonate de 2 M (attention : voir Table des matières).
    3. Ajouter 1 µL d’une 5 mM l’antimycine A (attention : voir Table des matières).
  15. Ajouter ascorbate de 0,2 mM et 0,5 mM TMPD séquentiellement dans les chambres, à partir de l’ascorbate pour mesurer la consommation d’oxygène par le complexe IV.
  16. Ajouter 20 mM de l’azide de sodium inhibe le complexe IV (attention : voir Table des matières).
  17. Dès que le signal est stable, ouvrir des chambres avec l’entretoise, ré-oxygéner les chambres par l’injection de 2 mL de l’oxygène pur et fermer les chambres lorsque la concentration est autour de 250-300 nmol.mL-1.
  18. Mesurer le signal pendant 10-15 min et calculer le fond chimique, c'est-à-dire la consommation d’oxygène en raison de l’autoxydation TMPD.

6. nettoyage de la respiromètre

  1. Après les mesures, rincez les chambres avec de l’eau distillée une fois et rincer les chambres trois fois dans l’éthanol à 70 %.
  2. Incuber dans l’éthanol absolu pendant 10 min inactiver les inhibiteurs.
  3. Rincer trois fois avec de l’eau distillée, remplissez les compartiments 70 % d’éthanol et remplacer les bouchons et les bouchons jusqu'à la prochaine utilisation.

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Representative Results

Une trace représentative de la consommation d’oxygène mitochondriale en utilisant le protocole décrit ci-dessus est fournie à la Figure 2. Le pyruvate et le malate injecté dans les chambres ainsi que les fibres musculaires perméabilisées sont désignés à la respiration CI-fuite, c'est-à-direlorsque le complexe I de l’ETS est stimulée par le NADH produit par oxydation du pyruvate et le malate via le cycle des acides tricarboxyliques (CI). Au cours de ce rythme de la respiration, l’oxygène mitochondriale est principalement maintenue pour compenser la fuite de protons, c.-à-d., protons traversant de l’espace intermembranaire à la matrice mitochondriale, lorsque l ' ATP synthase n’est pas actif (fuite)30. Lorsqu’il est ajouté, l’ADP, l’ATP synthase est activée et les électrons sont transférés du complexe I le complexe IV avec simultanées phosphorylation de l’ADP en ATP (CI-OXPHOS), ayant pour résultat a augmenté la consommation d’oxygène mitochondriale. Le rapport de couplage OXPHOS est calculé comme CI-OXPHOS/CI-fuite et est habituellement pris comme un bon indicateur de qualité mitochondriale et de couplage mitochondrial30. Chez la drosophile, ce ratio devrait au moins dépasser 6.0 (Figure 3). Si elle est inférieure à cette valeur, il pourrait indiquer un problème avec la préparation de tissu ou d’un dysfonctionnement mitochondrial. L’ajout du cytochrome c permet la détermination de l’intégrité de la membrane mitochondriale externe et est donc utilisé par un contrôle de la qualité de la préparation (Figure 4). En effet, le cytochrome c est faiblement lié à la membrane mitochondriale interne et est éliminé en général si la membrane mitochondriale externe est endommagée au cours du processus de la perméabilisation. En conséquence, ajout exogène cytochrome c augmentera sensiblement la consommation d’oxygène si la membrane mitochondriale externe est endommagée et endogène cytochrome c est perdu. Une augmentation de moins de 10 à 15 % la consommation d’oxygène (Figure 4) illustre généralement appropriée intégrité de la membrane mitochondriale externe29. Figures 3 et 4, les traces vertes ont été obtenues de la perméabilisation non adéquates et la manipulation des échantillons (excessives déchirure du tissu pour la Figure 3et pesait après un temps plus long sur la surface absorbante de la Figure 4), considérant que les traces rouges représentent des échantillons suffisamment perméabilisées et manipulés. Ces résultats mettent en évidence que des conditions appropriées perméabilisation sont déterminantes pour une évaluation fiable de la consommation d’oxygène mitochondriale.

Les substrats suivants utilisés au cours des expériences fournissent des électrons à l’ubiquinone et a permis d’augmenter le flux d’électrons dans le SCEQE. Proline est un acide aminé qui peut être utilisé comme substrat énergétique notamment dans les insectes23, mais aussi chez les mammifères durant le jeûne aiguë ou lors de certaines pathologies,37. L’ajout de proline dans les chambres permet d’évaluer la contribution de la proline déshydrogénase (ProDH) le flux d’électrons dans le SCEQE, lorsque les électrons sont découlant de ces deux complexes I et ProDH et participent au processus OXPHOS (CI + ProDH-OXPHOS). Avec l’addition du succinate, la contribution du complexe II (succinate déshydrogénase) de l’ETS peut être observée (ProDH + CI + CII-OXPHOS). Injection de glycérol-3-phosphate (G3P), augmente encore la consommation d’oxygène mitochondriale car ce substrat stimule la mitochondriale glycérol-3-phosphate déshydrogénase (G3PDH) qui fait partie de la navette glycérophosphate et transfert électrons à l’ETS (CI + ProDH + CII + G3PDH-OXPHOS). ProDH et G3PDH auraient dû être divulgués à travailler activement dans plusieurs espèces d’insectes et sont donc importantes dans le présent protocole avec la drosophile20,21,22,23,32 .

Lorsque le découpleur que FCCP est ajouté, la respiration non couplés (État ETS) est obtenu, c'est-à-dire, la consommation maximale d’oxygène, ce qui représente la capacité maximale de l’ETS (CI + ProDH + CII + G3P-ETS). Le FCCP est un protonophore qui transporte les protons de l’espace intermembranaire à la matrice mitochondriale sans passer par V complexe. Le FCCP doit être titré avec soin, comme les concentrations inférieures à un résultat optimal dans la consommation d’oxygène maximale non et les taux de respiration non stable tandis que des concentrations supérieures à un résultat optimal dans l’inhibition de mitochondrial d’oxygéne (Figure 5). Une fois ajoutés les substrats et le découpleur, inhibition des complexes qu'i, II et III peut être dans l’ordre effectuées en utilisant la roténone, malonate et l’antimycine A, respectivement. Avec chaque inhibiteur utilisé, on observe une diminution de la consommation d’oxygène mitochondriale, jusqu'à arriver à la plus faible consommation d’oxygène après l’addition de l’antimycine A. Le taux a atteint après que l’ajout de tous les inhibiteurs de l’est de la consommation de l’oxygène résiduel30. Il représente la consommation d’oxygène due à des réactions d’oxydation non-mitochondriale comme réactions oxygénase et de la production d’espèces réactives, par exemple, et a par conséquent à soustraire de tous les autres taux mesuré.

TMPD est un transporteur d’électrons artificiels qui fournit des électrons directement au complexe IV, contournant tous les complexes en amont, permettant la mesure de la capacité de respiration maximale complexe IV. Ce substrat est cependant sujette à l’autoxydation, donc ascorbate doit être ajouté avant à TMPD à limiter, mais pas complètement éviter cette autoxydation. Pour corriger l’autoxydation restante de TMPD, l’azoture de sodium IV complexe inhibiteur est ajouté aux chambres et la consommation d’oxygène est alors enregistrée pendant 10-15 minutes. Cette consommation d’oxygène représente donc l’arrière-plan chimique, ou en d’autres termes l’autoxydation de TMPD qui devrait être pris en compte pour le calcul de la capacité de respiration maximale complexe IV.

Figure 1
Figure 1 . Représentation schématique du mitochondriale de transport d’électrons par le système de transport d’électrons et la phosphorylation oxydative dans la membrane interne mitochondriale. I : le complexe I ; II : le complexe II ; III : le complexe III ; IV : complexe IV ; V : ATP synthase ; Acétyl-CoA : acétyl coenzyme A ; Cyt c : cytochrome c ; e–: électron ; G3P : glycérol-3-phosphate ; G3PDH : mitochondrial glycérol-3-phosphate déshydrogénase ; H+: proton ; PRODH : déshydrogénase proline ; TCA : cycle des acides tricarboxyliques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Traces représentatives de la concentration en oxygène mitochondriale (trace bleue) et de la consommation (trace rouge) sur thoraxes perméabilisées de Drosophila. Chaque injection est représentée par une flèche indiquant le composé injecté (Pyr : pyruvate ; mal : malate ; ADP ; Cyt c : cytochrome c ; Pro : proline ; Succ : succinate ; G3P : glycérol-3-phosphate ; FCCP : cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone ; Pourriture : roténone ; Malo : malonate ; Fourmi A: l’antimycine A ; TMPD : N, N, N «, N, - tétraméthyl - p-phénylènediamine ; ASC : ascorbate ; SAZ : azoture de sodium). Chaque taux de consommation d’oxygène mitochondriale est représentée sur le graphique, lorsque la consommation d’oxygène (trace rouge) a été stabilisée. Effet c cytochrome dénote l’intégrité de la membrane mitochondriale externe (voir le texte pour plus de détails). La consommation d’oxygène résiduel représente la consommation d’oxygène due à des réactions côté oxydatif dans les cellules et à soustraire à tous les autres taux mesurés. Contexte chimique indique la consommation d’oxygène uniquement en raison de l’autoxydation TMPD et doit être pris en compte pour le calcul de la capacité de respiration maximale complexe IV. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Traces représentatives d’une valide (trace rouge, Chambre A) et inadéquate (trace verte, chambre B) réponses à l’ajout d’ADP. La trace rouge correspond à la Chambre A et la trace verte à la chambre B, au cours de la même expérience. La trace rouge provient de thoraxes perméabilisées adéquatement tandis que la trace verte a été obtenue après déchirement excessivement les tissus au cours de la perméabilisation. Lors de l’ajout ADP, une augmentation de la consommation d’oxygène est prévue, comme la trace rouge. OXPHOS rapports de couplage sont calculés comme CI-OXPHOS/CI-fuite et sont présentés dans le graphique. Un ratio inférieur à 6,0 chez la drosophile suggère un problème dans l’accouplement mitochondriale et est caractéristique de la dégradation de l’échantillon ou de dysfonctionnement mitochondrial, représentée par la trace de verte. PYR : pyruvate ; mal : malate. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Traces représentatives d’une valide (trace rouge, Chambre A) et inadéquate (trace verte, chambre B) réponse à l’ajout de cytochrome c. La trace rouge correspond à la Chambre A et la trace verte à la chambre B, au cours de la même expérience. Trace rouge provient de thoraxes adéquatement perméabilisées et manipulés, alors que la trace verte a été obtenue après que le thoraxes ont été délibérément séchés plus longtemps sur la surface absorbante avant la pesée. Le cytochrome c n’augmente pas habituellement d’oxygéne mitochondriale, comme on le voit sur la trace rouge, indiquant que la membrane mitochondriale externe est intacte. Si, toutefois, ajout du exogène cytochrome c augmente significativement consommation d’oxygène mitochondriale de plus de 15 %, comme on le voit sur la trace de verte, il suggère que la membrane mitochondriale externe est endommagée et donc que l’échantillon est dégradé et qu’il devrait être mis au rebut. PYR : pyruvate ; mal : malate ; Cyt c : cytochrome c. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Traces représentatives de la concentration en oxygène mitochondriale (trace bleue) et de la consommation (trace rouge) après titration du FCCP. Différentes injections de FCCP à plusieurs concentrations doivent être réalisées avec soin pour déterminer la consommation maximale d’oxygène déclenchée par ce découpleur. Des concentrations insuffisantes ne permettent pas l’évaluation de la consommation maximale d’oxygène et sont caractérisées par des taux de respiration non stable, alors que FCCP excès inhibe la consommation d’oxygène mitochondriale. Flèches indiquent les différentes injections de FCCP. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Reproductibilité de consommation d’oxygène mitochondriale des taux pendant une expérience typique obtenue à l’aide de deux chambres différentes (trace rouge, Chambre A ; trace verte, chambre B) d’un respiromètre. La trace rouge correspond à la Chambre A et la trace verte à la chambre B, au cours de la même expérimenter à l’aide de drosophile de même âge, le sexe, la souche et déclenché sur le même régime alimentaire, ainsi que le protocole décrit. Les deux échantillons ont été normalisées avec la masse de tissu sec pesée comme décrit dans le protocole (0,53 et 0,66 mg pour chambres de A et B, respectivement). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans cette étude, on décrit une méthode pour la préparation de l’échantillon avant la mesure de la consommation d’oxygène mitochondriale chez la drosophile. Cette méthode a été développée pour résoudre les différents problèmes liés aux protocoles utilisant des isolations mitochondriales, notamment en termes de durée et nombre de personnes requis. Au lieu de travailler avec des isolations mitochondriales habituellement nécessitant une grande quantité de tissus obtenus à partir de plusieurs individus, cette expérience est réalisée sur des fibres musculaires perméabilisées de thoraxes de Drosophila quelques. Dans le présent protocole, seules trois personnes sont nécessaires pour afficher des résultats optimaux. Par conséquent, la mesure de la consommation d’oxygène mitochondriale à divers moments est possible car il est plus réalisable pour synchroniser un groupe plus restreint de mouches ayant le même âge et du même sexe.

Tout d’abord, il est important d’utiliser la drosophile du même âge, sexe, souche et a grandi dans les mêmes conditions pour obtenir la faible variabilité dans les résultats (Figure 6), comme la respiration peut changer avec l’âge, le sexe, le génotype et le régime alimentaire des mouches. L’étape la plus critique dans l’exécution du présent protocole est la procédure de la perméabilisation des thoraxes. Il est très important de procéder rapidement pour éviter la dégradation du tissu, et il est également important de s’assurer que les thoraxes sont bien perméabilisées pour avoir le taux maximal de consommation d’oxygène. Pour s’assurer que la perméabilisation a été effectuée correctement et que l’intégrité structurale et fonctionnelle des mitochondries sont conservées après perméabilisation, la OXPHOS couplage ratio (CI-OXPHOS/CI-fuite, Figure 3), ainsi que la réponse à cytochrome c (Figure 4) sont utilisés comme contrôles de qualité. Il existe un compromis à prendre en considération entre le travail rapidement et en vous assurant que la perméabilisation est bien exécutée. Il est aussi essentiel de toujours travailler sur la glace lors de la manipulation des thoraxes disséqués. Pour obtenir des résultats plus reproductibles (Figure 6), la perméabilisation homogène est nécessaire et la pratique de la technique pour la perméabilisation contribue à s’assurer que les mêmes mouvements sont répétés. Une autre étape critique est la détermination de la masse sèche de l’échantillon. En effet, après que les thoraxes sont incubés, ils sont très sensibles, fragiles et sujettes à la dégradation. Par conséquent, de même pour la perméabilisation, rapidement procéder à la détermination du poids sec est important. En revanche, il est important de déterminer le poids avec précision, car les résultats sont normalisés par la masse du tissu. La quantité de thoraxes utilisé peut également être optimisée. Le protocole peut être adapté pour utiliser un thorax unique par chambre35, mais un certain niveau de résolution pourrait être perdu dans la mesure de la consommation d’oxygène autant que dans la détermination de la masse sèche. La quantité de thoraxes peut être augmentée, si nécessaire, mais il est important de noter que les mitochondries plus dans l’échantillon, plus la consommation d’oxygène et les chambres devront donc être réoxygénées. Cette réoxygénation peut se faire en ouvrant les chambres et injecter de l’oxygène, mais cela augmentera la probabilité pour insérer des bulles d’air dans la chambre. Donc, si possible, essayez d’éviter d’avoir à reoxygenate les chambres (sauf quand la capacité de respiration maximale complexe IV doit être déterminée). Avant d’exécuter les expériences, optimisation de la concentration du substrat est également nécessaire pour atteindre la plus forte consommation d’oxygène mitochondriale sans avoir observé les effets inhibiteurs dus à une concentration excessive. Les chambres du respiromètre doivent également être nettoyés à fond afin d’éviter des contaminations potentielles. Il est important de commencer le nettoyage avec l’eau distillée, puis 70 % éthanol pour se débarrasser d’éventuelles contaminations biologiques. Suite à cela, une incubation dans l’éthanol absolu pendant 10 min est recommandée pour éviter la contamination des inhibiteurs hydrophobes. Enfin, rincer les chambres avec de l’eau distillée et remplir avec de l’éthanol 70 % permettra d’éviter des contaminations potentielles jusqu'à la prochaine utilisation.

Le protocole peut être facilement modifié pour étudier l’effet des autres substrats ou inhibiteurs différents. Par exemple, une protéine intéressante à étudier est le transporteur de pyruvate mitochondrial (MPC). Le rôle de cette protéine est de transporter le pyruvate généré dans le cytosol dans la matrice mitochondriale. Récemment, il a été suggéré à jouer un rôle important dans la modulation du métabolisme au cours de certaines pathologies telles que pendant le type 2 diabète38. Pour étudier l’effet de la protéine MPC sur le métabolisme mitochondrial, il est utile de commencer les injections avec pyruvate seulement au lieu de pyruvate et le malate en même temps. Ainsi, l’effet de la pyruvate est étudié indépendamment de l’effet de malate, comme ce dernier est injecté pour seulement soutenir le cycle des acides tricarboxyliques et veiller à ce que les intermédiaires ne sont pas épuisés. Il est également possible d’utiliser des inhibiteurs de MPC39 pour évaluer si une limitation de ce transporteur, plutôt que l’oxydation du pyruvate est observée. Ensuite, il serait possible d’observer un changement potentiel dans la source de carburant préféré pour la respiration,40. Il est également possible d’omettre certains substrats pour simplifier le protocole si elle n’est pas pertinente pour l’étude. Par exemple, pour étudier un dysfonctionnement du complexe j’ai seulement, il n’est pas nécessaire d’utiliser tous les substrats présentés dans le présent protocole.

Ce protocole présente quelques limitations que détourner des conditions in vivo . La mesure de la consommation d’oxygène mitochondriale est enregistrée lorsque le support de la respiration est au-dessus de saturation de l’air, comme l’oxygène pur est injecté pour éviter la limitation de la diffusion de l’oxygène à l’intérieur du tissu30. Par ailleurs, les concentrations des substrats sont injectées en excès, qui ne reflètent pas les conditions in vivo . Il est également important de noter que l’âge, le sexe, le souche et le régime alimentaire de la drosophile peuvent affecter les résultats. Ces paramètres sont donc à prendre en compte lors de l’interprétation des résultats. Cette méthode est cependant plus proche de physiologique conditions que les méthodes utilisant des isolations mitochondriales pour mesurer la consommation d’oxygène mitochondriale, que les interactions avec les autres composants cellulaires et de l’intégrité structurale des mitochondries et la morphologie sont conservées31. Il est important de noter que des isolations mitochondriales sont des paramètres plus avantageuses lorsque supplémentaires tels que la production de ROS ou efficacité mitochondriale (rapport P/O) doivent être mesurées27.

Cette méthode peut être utilisée pour atteindre des buts divers, allant de la compréhension des dysfonctions mitochondriales et les mécanismes sous-jacents des maladies métaboliques, à tester les effets des différents composés sur des fonctions mitochondriales sous pathologique conditions. En outre, il peut être utilisé pour observer les effets de plusieurs contraintes environnementales sur le métabolisme mitochondrial, tels que les changements de régime ou de la température. Par exemple, il est possible d’étudier l’efficacité de molécules bioactives de synthèse sur les fonctions mitochondriales et dans le traitement des dysfonctions mitochondriales. Cette méthode est également un bon outil pour étudier les fonctions mitochondriales à différents moments, ce qui le rend très pertinentes pour l’étude des mécanismes fondamentaux liés au processus du vieillissement. L’évaluation du métabolisme mitochondrial via la consommation d’oxygène à l’aide de thoraxes perméabilisées va certainement aider à améliorer nos connaissances sur le rôle du métabolisme mitochondrial lorsque la cellule est exposée à des conditions difficiles.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par des subventions de la National Sciences et l’Engineering Research Council (CRSNG, subvention à la découverte) et l’Université de Moncton au NP. LHB aimerait remercier le soutien financier de l’Institut canadien de recherche en santé (IRSC), la Fondation Innovation du Nouveau-Brunswick (FINB) et l’Université de Moncton. Les travaux de l’EHC sont pris en charge par la société Alzheimer du Canada, Canada de cerveau, CRSNG, Canadian Breast Cancer Foundation, New Brunswick Innovation Foundation, New Brunswick Health Research Foundation et l’Université de Moncton.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High-resolution respirometer Oxygraph O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 10022-02 Startup O2K respirometer kit
 
O2K-Titration Set  Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20820-03 Hamilton syringes with different volumes
 
Datlab software Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20700 Software for data acquisition and analysis
 
Fine-tipped antimagnetic forceps VWR 82027-400
 
Secura225D-1S-DQE Sartorius AG, Goettingen, Germany Semi-micro balance (distributed by several companies) 
 
Drosophila melanogaster wild-type w1118 Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA
Storage Condition: 24 °C
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378 EGTA
Storage Condition: RT
KOH Sigma-Aldrich P1767 CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity.
Storage Condition: RT
CaCO3 Sigma-Aldrich C4830
Storage Condition: RT
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383
Storage Condition: -20 °C
MgCl2.6H2O Sigma-Aldrich M9272
Storage Condition: RT
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Storage Condition: RT
Na2Phosphocreatine Sigma-Aldrich P7936
Storage Condition: -20 °C
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Storage Condition: RT
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Storage Condition: 2-8 °C
MES hydrate Sigma-Aldrich M8250
Storage Condition: RT
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S7900 Saponin
Storage Condition: RT
Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily.
KCl Sigma-Aldrich P9541
Storage Condition: RT
KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791
Storage Condition: RT
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Storage Condition: RT
BSA Sigma-Aldrich 05470
Storage Condition: 2-8 °C
Na2S2O4 Sigma-Aldrich 157953 Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity.
Storage Condition: RT
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Pyruvate
Storage Condition: 2-8 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily.
L-(-)-Malic acid Sigma-Aldrich M1000 Malate
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C.
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A5285 ADP
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C.
Cytochrome c from equine heart Sigma-Aldrich C7752 Cytochrome c
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.
L-Proline Sigma-Aldrich P0380 Proline
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma-Aldrich S2378 Succinate
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C.
sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt Sigma-Aldrich G7886 Glycerol-3-phosphate
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C.
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920 FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity.
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C.
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.
Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C.
Malonic acid Sigma-Aldrich M1296 Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage.
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily.
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674 Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C.
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine Sigma-Aldrich T7394 TMPD
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at  -20 °C.
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Ascorbate
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at  -20 °C.
NaN3 Sigma-Aldrich S2002 Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. 
Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.

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