Summary
Neste trabalho, é descrito um método para medir o consumo de oxigênio usando respirometria de alta resolução em permeabilized avermelhado da drosófila. Esta técnica requer uma quantidade mínima de tecido, em comparação com a técnica de isolamento mitocondrial clássico e os resultados obtidos são fisiologicamente mais relevantes.
Abstract
Mosca da fruta, Drosophila melanogaster, representa um modelo emergente para o estudo do metabolismo. Com efeito, drosófila têm estruturas homólogas de órgãos humanos, possuem vias metabólicas altamente conservadas e têm uma duração relativamente curta que permite o estudo de diferentes mecanismos fundamentais em um curto período de tempo. No entanto, é surpreendente que um dos mecanismos essenciais para o metabolismo celular, a respiração mitocondrial, não tenha sido cuidadosamente investigado neste modelo. É provável, porque a medida da respiração mitocondrial em Drosophila geralmente requer um grande número de indivíduos e os resultados obtidos não são altamente reprodutíveis. Aqui, um método que permite a medição precisa do consumo de oxigênio mitocondrial usando quantidades mínimas de tecido da drosófila é descrito. Neste método, o avermelhado é dissecados e permeabilizado mecanicamente com Pinças afiadas e quimicamente com saponina, permitindo que diferentes compostos atravessar a membrana celular e modulam a respiração mitocondrial. Após a permeabilização, um protocolo é realizado para avaliar a capacidade dos diferentes complexos do sistema de transporte de elétrons (ETS) para oxidar substratos diferentes, bem como a sua resposta para um desacoplador e vários inibidores. Esse método apresenta muitas vantagens em comparação com métodos usando isolamentos mitocondriais, como é mais fisiologicamente relevante porque as mitocôndrias são ainda interagir com os outros componentes celulares e a morfologia mitocondrial é conservada. Além disso, os preparativos de amostra são mais rápidos, e os resultados obtidos são altamente reprodutíveis. Combinando as vantagens da drosófila como um modelo para o estudo do metabolismo com a avaliação da respiração mitocondrial, importante novas percepções podem ser reveladas, especialmente quando as moscas estão experimentando diferentes ambientais ou fisiopatológicos condições.
Introduction
Mosca da fruta, Drosophila melanogaster, tem sido usada como um organismo modelo para pesquisa genética para mais de um século1. O estudo deste organismo não deu origem apenas significativo conhecimento fundamental sobre herança ligada ao sexo2, taxa de mutação3, o desenvolvimento do sistema neural e o celular destino determinação4, mas também recentemente emergiu como um ferramenta valiosa para estudar os mecanismos inerentes à várias doenças como Alzheimer e Parkinson5,6. Além disso, é um modelo popular para estudar o processo de envelhecimento, como eles podem ser levantados em grande número durante um curto período de tempo e têm vida curta. Eles também possuem estruturas homólogas de órgãos humanos, tais como um coração, oenocytes (hepatócitos células), corpos de gordura (funcionando da mesma forma como o tecido adiposo branco e fígado), células (equivalentes a células β-pancreáticas), produtoras de insulina, bem como a hemolinfa transporta metabólitos (análogo ao sangue de vertebrados)7. Além disso, as vias centrais do metabolismo intermediário (incluindo o fator de crescimento insulina/insulin-like, como via de sinalização e vias de alvo de rapamicina-TOR) também são altamente conservadas7. Por estas razões, a drosófila recentemente têm sido explorados para descrever os mecanismos fundamentais que controlam o metabolismo, especialmente em condições patológicas inerentes ao humanas doenças metabólicas tais como diabetes,8. Um componente importante do metabolismo é a mitocôndria que integra múltiplos caminhos e executa uma das mais importantes funções biológicas de vida, produção de ATP, através do processo de fosforilação oxidativa (OXPHOS). Considerando seu papel central no metabolismo do organismo, não é de estranhar que disfunções mitocondriais estão envolvidas em muitas doenças como9 a doença de Parkinson e doenças de Alzheimer10, bem como na esclerose lateral amiotrófica 11 , 12. eles também são determinantes fundamentais do processo de envelhecimento. Na verdade, eles são os principais produtores de espécies reativas de oxigênio (ROS) na célula, que pode ser prejudicial para a célula em alta concentração através de de danos oxidativos11. Envelhecimento também tem sido associado à acumulação de danificado ou mutado DNA mitocondrial13, mitophagy disfunções14,15 , bem como o comprometimento da biogênese mitocondrial16. As mitocôndrias são também determinantes da homeostase da célula como eles podem utilizar diferentes substratos para ajustar várias funções celulares, de acordo com a abundância ou escassez de macronutrientes17,18.
Com efeito, os diferentes nutrientes na dieta (carboidratos, lipídios e proteínas) são digeridos, absorvidos e transportados nas células. Eles são então transformados no citosol, e os substratos derivados são transportados para a matriz mitocondrial, onde produzem equivalentes redutores, tais como NADH e DANIII219. Estes redutores equivalentes são então oxidados por complexos enzimáticos diferentes do sistema de transporte de elétrons (ETS). Estes complexos são incorporados na membrana mitocondrial interna, tais como complexo I e II do complexo. Além disso, outros complexos enzimáticos, tais como o glicerol-3-fosfato desidrogenase mitocondrial e a desidrogenase de prolina representam rotas alternativas para a entrada de elétrons para o ETS20,21. Estes complexos 'alternativos' são particularmente importantes em insetos, como de acordo com a espécie, eles podem participar activamente para aumentar a respiração20,22,23,21. Elétrons destes ETS sistemas de alimentação são transferidos para a ubiquinona e posteriormente ao complexo III e depois para o complexo IV, até o aceitador final, oxigênio molecular. Esta transferência de elétrons gera uma força motriz protónica através da membrana mitocondrial interna, dirigindo a fosforilação do ADP a ATP a complexo V (Figura 1). Considerando o papel central da mitocôndria na homeostase da célula, estudar o metabolismo mitocondrial, usando o modelo relevantes d. melanogaster representa uma ferramenta poderosa para delinear os mecanismos subjacentes de vário fisiopatológicos condições ou sob tensões ambientais e celulares. Surpreendentemente, no entanto, apenas um punhado de estudos efectivamente medidos respiração mitocondrial em Drosophila24,25,26. De fato, experimentos com o objetivo de avaliar o consumo de oxigênio mitocondrial exigem o isolamento da mitocôndria. Apesar de vantajoso para a medição de diferentes funções mitocondriais (tais como a produção de ROS ou P/O rácio como marcador de eficiência mitocondrial27,28), estes isolamentos geralmente requerem quantidades bastante grandes de tecido de vários indivíduos24,29. Este requisito para grandes quantidades de tecido e indivíduos é um importante fator limitante, especialmente considerando que todos os indivíduos devem ter a mesma idade e de preferência do mesmo sexo para os experimentos, tornando a medida da respiração em horário diferente na melhor das hipóteses, aponta laborioso. Além disso, enquanto os isolamentos mitocondriais podem fornecer insights significativos sobre os mecanismos fundamentais que regulam o metabolismo mitocondrial, os métodos usados para isolar as mitocôndrias têm várias desvantagens como a dificuldade de obter resultados replicáveis , interrupção da rede mitocondrial e alteração da mitocondrial estrutura e função de29,30,31.
O objetivo deste estudo é apresentar um protocolo robusto para medir o consumo de oxigênio mitocondrial em drosófila usando apenas uma quantidade mínima de tecido de muito poucos indivíduos. Esse protocolo consiste em medir o oxigênio mitocondrial consumo em situ usando permeabilized fibras musculares29 de avermelhado de Drosophila em combinação com alta resolução respirometria32,33, 34 , 35. este método também tem vantagens adicionais em comparação com o método clássico de isolamento mitocondrial desde as interações com os outros componentes da célula, como bem como mitocondrial estrutura e função são mais preservadas em permeabilizado fibras29,31,36, que faz com que esta abordagem mais fisiologicamente relevantes. Com este protocolo, funções mitocondriais podem ser exatamente avaliadas usando respirometria de alta resolução em apenas três avermelhado de Drosophila, com substratos, permitindo a determinação do consumo de oxigênio em várias etapas diferentes do RCE. Portanto, este protocolo poderia ajudar a responder questões chave sobre os mecanismos fundamentais que controlam o metabolismo no contexto de muitas condições ambientais ou fisiopatológicos, aproveitando o modelo de Drosophila.
Para medir o consumo de oxigênio em várias etapas diferentes do RCE e avaliar como diferentes substratos contribuem para a respiração, diferentes substratos (Figura 1), desacoplador e inibidores são usados30 após a permeabilização do tecido. Especificamente, adições sequenciais de diferentes substratos são realizadas para estimular a entrada de elétrons através dos complexos diferentes do RCE. Um desacoplador, cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi) phenylhydrazone (FCCP), então é adicionado na concentração ideal para medir a respiração não acoplados, ou seja, a respiração não-pressões estimuladas ao consumo máximo de oxigênio. Inibições sequenciais dos complexos que i, II e III são, em seguida, executada para monitorar o consumo de oxigênio residual que é devido a reações de oxidação não-ETS. Finalmente, a capacidade de respiração máxima complexa IV pode ser avaliada através da injeção de N, N, N', N, - tetrametil - p-fenilenodiamina (TMPD), um provedor de elétron artificial e ascorbato. É importante notar que as experiências são conduzidas a 24 °C, desde que é a temperatura em que as moscas são geradas.
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Protocol
1. preparação de reagentes
- Prepare as seguintes soluções para dissecção e permeabilização do tecido.
- Preparar a solução de preservação: 2,77 mM CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, 20mm taurina, 15mm fosfocreatina de2nd, imidazol 20 mM, 0.5 mM ditiotreitol e 50 mM K-MES, pH 7.1 (podem ser armazenados a-20 ° C).
- Preparar a solução de saponina: 5 mg de saponina em 1 mL de solução de preservação (preparar fresco diariamente).
- Prepare as seguintes soluções para a medição da respiração.
- Prepare o suporte de respiração: 120 mM KCl, 5mm KH2PO4, 3mm HEPES, EGTA de 1 mM, 1 mM MgCl2e BSA de 0,2% (p/v), pH 7,2.
- Prepare substratos, desacoplador, inibidores. Dissolver todos os substratos em H2O e dissolver o desacoplador Compararia as well os inibidores em etanol absoluto (exceto malonato que é diluído em H2O). Neutralize a maioria dos substratos os malonato (ver Tabela de materiais). Todas as concentrações que constam do protocolo são concentrações finais no interior de câmaras de 2 mL.
2. preparação e calibração do Respirometer de alta resolução.
- Lave as câmaras, tampas e rolhas do respirometer três vezes com etanol 70% e três vezes com água destilada.
- Calibrar em zero concentração de oxigênio: Pipetar 2,3 mL de meio de respiração nas câmaras e adicionar 10 mg de ditionito de sódio. Embora o volume máximo da câmara é 2 mL, 2,3 mL são adicionados para garantir que nenhuma bolha de ar permaneça sob a rolha quando fechar as câmaras. Fechar as câmaras com as rolhas e medir a concentração de oxigênio de 10-20 min.. calibrar os eléctrodos em zero concentração de oxigênio com a taxa de consumo de oxigênio resultante.
- Lave as câmaras com água destilada, incubar em etanol absoluto por 10 min e depois enxaguar com água destilada.
- Calibrar a saturação do ar: Pipetar 2,3 mL de meio de respiração nas câmaras, inserir as rolhas, Aspire o excesso de meio em cima as rolhas e em seguida, retire as rolhas com o espaçador. Médio de excesso de respiração é pipetado nas câmaras (volume de 2 mL total) para evitar a presença de bolhas de ar após fechar as câmaras.
- Monitorar o consumo de oxigênio por 45 min a uma hora, até que a concentração de oxigênio (traço azul) é estável em torno de 250 nM a 24 ° C.
3. dissecação de moscas e permeabilização do tecido
- Certifique-se de todas as etapas são executadas no gelo.
- Anaesthetize seis moscas masculinas da mesma estirpe, mesma idade e erguido sobre a mesma dieta no gelo para facilitar a dissecação das moscas (selvagem-tipo w1118, 15 dias de idade, alimentados com médias de farinha de milho).
- Usando um bisturi e uma pinça de ponta fina, disse as moscas (retire as cabeças e os abdomes) para manter apenas o avermelhado contendo os músculos de voo. Este passo pode ser feito a olho nu. Lidar com o resultante avermelhado com pinça de ponta fina.
- Transferi três avermelhado dissecado em uma placa de Petri contendo 2 mL de solução de preservação gelada, usando a pinça de 25 mm.
- Com a pinça de ponta fina, permeabilize mecanicamente o avermelhado por inserir a ponta da pinça o avermelhado e repetidamente rasgar o tecido para obter uma rede frouxamente conectada.
- Em uma placa de 24, encha dois poços com 12,5 µ l da solução de saponina e 1 mL de solução de preservação para obter uma concentração final de 62,5 µ g/mL de saponina. Encha os dois poços adjacentes com 1 mL de meio de respiração.
- Com a pinça de ponta fina, transferir três permeabilized avermelhado para a solução de saponina diluídos e incubar com agitação suave em um agitador orbital, no gelo, por 20 min.
- Após a incubação este último, transferi as fibras para os poços adjacentes, preenchidos com o meio de respiração com agitação suave, no gelo, por 5 min enxaguar a saponina.
4. determinação do peso seco
- Secar o avermelhado permeabilized sobre uma superfície absorvente e virar 3 - 4 vezes usando a pinça de ponta fina para certificar-se de que toda a umidade é removida.
- Pese o três avermelhado juntos em uma micro-balança. Observe o peso obtido como ele será usado para normalizar as taxas de consumo de oxigênio mitocondrial.
- Transferi os tecidos imediatamente em uma gota de meio de respiração no gelo.
5. determinação de taxas de consumo de oxigênio
- Abra as câmaras do respirometer (retire as rolhas) e adicionar 10 mM de piruvato e de malato de 2 milímetros em cada câmara.
- Adicione os tecidos permeabilized directamente para as câmaras, preenchidas com o meio de respiração.
- Substitua as rolhas usando o espaçador.
- Com uma seringa de 60 mL, coletar oxigênio diretamente de um tanque de oxigênio e Injete 2-5 mL de oxigênio através do capilar de rolha de cada câmara para certificar-se de difusão de oxigênio através dos tecidos não vai limitar o consumo de oxigênio.
- Introduza uma seringa Hamilton capilar de cada rolha para certificar-se de que o avermelhado permanecem na câmara.
- Fechar as câmaras completamente quando a concentração de oxigênio é de cerca de 400 nM, alcançando níveis de oxigênio acima de saturação do ar (cerca de 160% ar saturação) dentro das câmaras.
- Parar e reiniciar os agitadores para verificar se há bolhas de ar nas câmaras.
- Insira a massa de tecido pesado anteriormente para normalizar as taxas de respiração em massa de tecido (mg), exibindo o consumo de oxigênio de massa específica (pmol O2 consumed.s-1.mg-1 do tecido).
- Uma vez que o consumo de oxigênio é estabilizado (traço vermelho), adicione 5 mM ADP com uma seringa de Hamilton.
- Após cada injeção, enxágue as seringas com água destilada, etanol a 70% e água destilada novamente.
- Uma vez que o consumo de oxigênio é estável novamente, injete 5 µ l de 4 mM de citocromo c.
- Prossiga para as injeções sequenciais dos seguintes substratos para avaliar o consumo de oxigênio mitocondrial em etapas diferentes do RCLE:
- Adicione 5 µ l de uma prolina 2m.
- Adicione 10 µ l de um succinato de 1m.
- Adicione 30 µ l de um M 1 glicerol-3-fosfato.
- Injetar o Compararia desacoplador de uma forma de titulação por passos de 0,5-1 µM (2 µ l de uma solução de 1 mM) até a concentração ideal é alcançado, ou seja, a concentração para atingir o mais alto possível sem inibição de consumo de oxigênio (atenção: ver tabela de materiais).
- Injetar os seguintes inibidores sequencialmente para inibir totalmente o fluxo de elétrons na ETS para medir o consumo de oxigênio residual (ROX) ou seja, não respiratória reações tais como reações de oxigenase, entre outros:
- Adicione 1 µ l de rotenona um 1mm (atenção: ver Tabela de materiais).
- Adicionar 5 µ l de um malonato de 2m (atenção: ver Tabela de materiais).
- Adicione 1 µ l de uma antimycin de 5 mM A (atenção: ver Tabela de materiais).
- Adicione o ascorbato de 0,2 mM e 0,5 mM TMPD sequencialmente para as câmaras, começando com o ascorbato para medir o consumo de oxigênio pelo complexo IV.
- Adicionar 20 mM de azida de sódio para inibir o complexo IV (atenção: ver Tabela de materiais).
- Uma vez que o sinal está estável, abrir as câmaras com o espaçador, re-oxigenar as câmaras injetando 2 mL de oxigênio puro e fechar as câmaras quando a concentração é em torno de 250-300 nmol.mL-1.
- Medir o sinal por 10-15 min e calcular o fundo químico, ou seja, o consumo de oxigênio devido à auto-oxidação de TMPD.
6. limpeza do Respirometer
- Após as medições, enxágue as câmaras com água destilada uma vez e lave as câmaras três vezes em etanol a 70%.
- Incube em etanol absoluto por 10 min inactivar os inibidores.
- Lavar três vezes com água destilada, encher as câmaras com 70% de etanol e substituir as rolhas e as tampas até a próxima utilização.
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Representative Results
Um traço representativo do consumo de oxigênio mitocondrial usando o protocolo descrito acima é fornecido na Figura 2. O piruvato e malato injetado nas câmaras juntamente com as fibras musculares permeabilized são chamados para a respiração de CI-fuga, ou seja, quando o complexo I de ETS é estimulada pelo NADH produzido através da oxidação do piruvato e malato através do ciclo do ácido cítrico (CI). Durante esta taxa de respiração, o oxigênio mitocondrial é principalmente mantido para compensar a fuga de prótons, ou seja, prótons cruzando do espaço intermembranar para a matriz mitocondrial, quando a ATP sintase não é ativo (vazamento)30. Quando o ADP é adicionado, a ATP sintase é ativado e os elétrons são transferidos do complexo I para o complexo IV com simultânea fosforilação de ADP em ATP (CI-OXPHOS), resultando em aumento do consumo de oxigênio mitocondrial. A relação de acoplamento OXPHOS é calculada como CI-OXPHOS/CI-vazamento e é geralmente tomada como um bom indicador da qualidade mitocondrial e do acoplamento mitocondrial30. Em Drosophila, esta relação pelo menos deve exceder 6.0 (Figura 3). Se estiver abaixo deste valor, isso poderia indicar um problema com a preparação do tecido ou uma disfunção mitocondrial. A adição de citocromo c permite a determinação da integridade da membrana mitocondrial externa e, portanto, é usada como um controle de qualidade da preparação (Figura 4). Com efeito, o citocromo c está frouxamente ligado a membrana mitocondrial interna e normalmente lavada se a membrana mitocondrial externa é danificada durante o processo de permeabilização. Como resultado, adição exógena citocromo c aumentará significativamente o consumo de oxigênio se a membrana mitocondrial externa é danificada e o endógeno citocromo c é perdida. Um aumento de menos de 10-15% no consumo de oxigênio (Figura 4) geralmente ilustra adequada integridade da membrana mitocondrial externa29. Na Figura 3 e 4, obtiveram-se os traços verdes de permeabilização não-adequada e manipulação das amostras (excessivas rasgando o tecido para a Figura 3e pesadas depois de um tempo maior na superfície absorvente para Figura 4), Considerando que os traços vermelhos representam amostras permeabilizado e tratada adequadamente. Esses resultados destacam que condições de permeabilização apropriados são cruciais para uma avaliação confiável do consumo de oxigênio mitocondrial.
Os seguintes substratos utilizados durante os experimentos fornecem elétrons para a ubiquinona e permitiram aumentar o fluxo de elétrons para o ETS. A prolina é um aminoácido que pode ser usado como substrato de energia, nomeadamente os insetos23, mas também em mamíferos durante a inanição aguda ou condições patológicas37. A adição de prolina nas câmaras permite avaliar a contribuição da desidrogenase de prolina (ProDH) para o fluxo de elétrons na ETS, quando os elétrons estão fluindo de ambos complexo I e ProDH e participam no processo de OXPHOS (CI + ProDH-OXPHOS). Com adição de ácido succínico, a contribuição do complexo II (Succinato desidrogenase) os ETS pode ser observada (CI + ProDH + CII-OXPHOS). Injeção de glicerol-3-fosfato (G3P), aumenta ainda mais o consumo de oxigênio mitocondrial como este substrato estimula o mitocondrial glicerol-3-fosfato desidrogenase (G3PDH) que é parte do transporte de glicerofosfato e transferência elétrons para o ETS (CI + ProDH + CII + G3PDH-OXPHOS). Tanto ProDH e G3PDH foram mostrados para ser particularmente ativo em diversas espécies de insetos e, portanto, são importantes neste protocolo com Drosophila20,21,22,23,32 .
Quando o desacoplador que COMPARARIA é adicionada, a respiração não acoplados (estado ETS) é obtido, ou seja, o consumo máximo de oxigênio que representa a capacidade máxima do RCE (CI + ProDH + CII + G3P-ETS). O FCCP é um protonophore que transporta os prótons do espaço intermembranar para a matriz mitocondrial sem passar por complexo V. O FCCP tem de ser cuidadosamente titulado, como concentrações abaixo melhor resultado no consumo de oxigênio máximo não e taxas de respiração não-estável, enquanto concentrações acima de melhor resultado na inibição do consumo de oxigênio mitocondrial (Figura 5). Uma vez que os substratos e o desacoplador são adicionados, inibição dos complexos que i, II e III podem ser sequencialmente executada usando a rotenona, malonato e antimycin A, respectivamente. Com cada inibidor usado, observa-se uma diminuição do consumo de oxigênio mitocondrial, até atingir o menor consumo de oxigênio após a adição de antimycin A. A taxa alcançada após a adição de todos os inibidores é o consumo de oxigênio residual30. Representa o consumo de oxigênio devido a reacções oxidativas mitocondrial-não como reações de oxigenase e produção de espécies reactivas por exemplo, e tem, portanto, ser subtraída de todas as outras taxas de medida.
TMPD é um transportador de elétrons artificial que fornece elétrons diretamente para o complexo IV, ignorando todos os complexos, permitindo a medição da capacidade de respiração máxima de complexo IV. Este substrato é no entanto propenso a auto-oxidação, ascorbato tem de ser adicionado prior para TMPD para limitar, mas não completamente evitar este auto-oxidação. Para corrigir para a restante auto-oxidação de TMPD, a complexo IV inibidor de azida de sódio é adicionada para a câmara e o consumo de oxigênio é então gravado por 10-15 minutos. Esse consumo de oxigênio, portanto, representa o fundo químico, ou, em outras palavras, a auto-oxidação de TMPD que deve ser tomada em consideração para o cálculo da capacidade de respiração máxima complexo IV.
Figura 1 . Representação esquemática do transporte de elétrons mitocondrial pelo sistema de transporte de elétrons e fosforilação oxidativa na membrana interna mitocondrial. I: complexo eu; II: complexo II; III: complexo III; IV: complexo IV; V: ATP sintase; Acetil-CoA: Acetil Coenzima A; C: CYT citocromo c; e–: elétron; G3P: glicerol-3-fosfato; G3PDH: mitocondrial glicerol-3-fosfato desidrogenase; H+: próton; PRODH: desidrogenase de prolina; TCA: ciclo do ácido cítrico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Representante vestígios de concentração de oxigênio mitocondrial (traço azul) e o consumo (traço vermelho) permeabilized avermelhado da drosófila. Cada injecção é representada com uma seta indicando o composto injetado (Pyr: piruvato; mal: malato; ADP; C: CYT citocromo c; Pro: prolina; Succ: succinato; G3P: glicerol-3-fosfato; Compararia: cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi) phenylhydrazone; Podridão: rotenona; Malo: malonato; Formiga r: antimycin A; TMPD: N, N, N', N, - tetrametil - p-fenilenodiamina; ASC: ascorbato; SAZ: azida de sódio). Cada taxa de consumo de oxigênio mitocondrial é indicada no gráfico, quando estabilizou-se o consumo de oxigênio (traço vermelho). Efeito de citocromo c denota a integridade da membrana mitocondrial externa (veja texto para detalhes). Consumo de oxigênio residual representa o consumo de oxigênio devido a reações de lado oxidativo nas células e tem que ser subtraído de todas as outras taxas de medida. Fundo de químico indica o consumo de oxigênio somente devido à auto-oxidação de TMPD e tem que ser levado em consideração para o cálculo da capacidade de respiração máxima de complexo IV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Traços representativos de um válido (vermelho rastreamento, câmara A) e insuficiente (traço verde, câmara B) respostas à adição de ADP. O traço vermelho corresponde A câmara e o traço verde corresponde à câmara B, durante o mesmo experimento. O traço vermelho foi obtido avermelhado adequadamente permeabilizado Considerando o traço verde foi obtido após excessivamente rasgar os tecidos durante a permeabilização. Quando ADP é adicionado, é esperado um aumento do consumo de oxigênio, como o traço vermelho. OXPHOS acoplamento rácios são calculados como CI-OXPHOS/CI-vazamento e são apresentados no gráfico. Uma relação de menos de 6.0 em Drosophila sugere um problema no acoplamento mitocondrial e é característica de degradação de amostra ou de disfunção mitocondrial representada pelo rastreamento de verde. Pyr: piruvato; mal: malato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Traços representativos de um válido (vermelho rastreamento, câmara A) e insuficiente (traço verde, câmara B) resposta à adição de citocromo c. O traço vermelho corresponde A câmara e o traço verde corresponde à câmara B, durante o mesmo experimento. Traço vermelho foi obtido avermelhado permeabilizado e adequadamente tratada, Considerando que o traço verde foi obtido após o avermelhado propositadamente foram secas por mais tempo na superfície absorvente antes da pesagem. Citocromo c geralmente não aumenta o consumo de oxigênio mitocondrial, como visto sobre o traço vermelho, que indicam que a membrana mitocondrial externa está intacta. Se, no entanto, adição exógena citocromo c aumenta significativamente o consumo de oxigênio mitocondrial de mais de 15%, como visto sobre o traço verde, sugere que a membrana mitocondrial externa é danificada e, portanto, que a amostra é degradada e deve ser descartados. Pyr: piruvato; mal: malato; C: CYT citocromo c. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Representante vestígios de concentração de oxigênio mitocondrial (traço azul) e consumo (traço vermelho) após a titulação da FCCP. Diferentes injecções de Compararia em várias concentrações tem que ser cuidadosamente realizada para determinar o consumo máximo de oxigênio provocado por este desacoplador. Concentrações insuficientes não permitem a avaliação do consumo máximo de oxigênio e são caracterizadas por taxas de respiração não-estável, Considerando que Compararia excesso inibe o consumo de oxigênio mitocondrial. As setas denotam as injeções diferentes de FCCP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Reprodutibilidade do consumo de oxigênio mitocondrial taxas durante um experimento típico obtido usando as duas câmaras diferentes (traço vermelho, câmara A; traço verde, câmara B) de um respirometer. O traço vermelho corresponde A câmara e o traço verde corresponde à secção B, durante o mesmo experimento usando Drosophila da mesma idade, sexo, estique e erguido sobre a mesma dieta, bem como o protocolo descrito. Ambas as amostras foram normalizadas com a massa de tecido seco pesada conforme descrito no protocolo (0,53 e 0,66 mg para câmaras A e B, respectivamente). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, é descrito um método para a preparação da amostra antes das medições de consumo de oxigênio mitocondrial em Drosophila. Este método foi desenvolvido para superar os diferentes problemas relacionados aos protocolos usando isolamentos mitocondriais, nomeadamente em termos de duração e número de indivíduos necessários. Em vez de trabalhar com os isolamentos mitocondriais exigindo geralmente grande quantidade de tecidos provenientes de vários indivíduos, esta experiência é realizada em permeabilized fibras musculares de avermelhado de alguns da drosófila. Neste protocolo, apenas três indivíduos são necessários para exibir resultados óptimos. Portanto, a medição do consumo de oxigênio mitocondrial em vários pontos de tempo é possível, como é mais viável para sincronizar um grupo menor de moscas, tendo a mesma idade e do mesmo sexo.
Em primeiro lugar, é importante o uso de Drosophila da mesma idade, sexo, estirpe e levantadas nas mesmas condições para obter baixa variabilidade nos resultados (Figura 6), como respiração pode mudar com a idade, o sexo, o genótipo e a dieta das moscas. O passo mais crítico na execução do presente protocolo é o procedimento de permeabilização do avermelhado. É muito importante avançar rapidamente para evitar a degradação do tecido, e também é importante ter a certeza de que o avermelhado é bem permeabilizado para ter as máximas taxas de consumo de oxigênio. Para garantir que a permeabilização foi executada corretamente e que a integridade estrutural e funcional das mitocôndrias são preservadas após a permeabilização, o OXPHOS acoplamento ratio (CI-OXPHOS/CI-vazamento, Figura 3), bem como a resposta a citocromo c (Figura 4) são usados como controles de qualidade. Há uma troca de tomar em consideração entre a trabalhar rapidamente e certificar-se de que a permeabilização é bem executada. Também é fundamental trabalhar sempre no gelo ao manipular o avermelhado dissecado. Para obter os resultados mais reprodutíveis (Figura 6), permeabilização homogênea é necessária e praticando a técnica para a permeabilização ajuda a certificar-se de que os mesmos movimentos são repetidos. Outro passo crítico é a determinação do peso seco da amostra. Com efeito, após o avermelhado é incubados, eles são muito sensíveis, frágeis e propensos a degradação. Portanto, da mesma forma para a permeabilização, rapidamente proceder à determinação do peso seco é importante. Por outro lado, é importante determinar o peso com precisão como os resultados são normalizados pela massa do tecido. A quantidade de avermelhado usado também pode ser otimizada. O protocolo pode ser adaptado para usar um único tórax por câmara35, mas um certo nível de resolução poderia ser perdido na medição do consumo de oxigênio, tanto quanto na determinação do peso seco. A quantidade de avermelhado pode ser aumentada, se necessário, mas é importante notar que as mitocôndrias mais na amostra, maior o consumo de oxigênio e as câmaras terão, portanto, de ser reoxygenated. Esta reoxigenação pode ser feito abrindo as câmaras e injetar oxigênio, mas aumentará a probabilidade para inserir as bolhas de ar na câmara. Portanto, se possível, tente evitar ter que reoxygenate as câmaras (exceto quando a capacidade de respiração máxima complexa IV tem que ser determinada). Antes de executar os experimentos, otimização das concentrações de substrato também é necessária para atingir o mais alto consumo de oxigênio mitocondrial sem observar efeitos inibitórios devido a uma concentração excessiva. As câmaras do respirometer também dispõem ser cuidadosamente limpo para evitar possíveis contaminações. É importante começar a limpeza com água destilada e, em seguida, 70% de etanol para se livrar de possíveis contaminações biológicas. Após isso, uma incubação em etanol absoluto por 10 min é recomendado para evitar a contaminação dos inibidores hidrofóbicas. Finalmente, enxaguar as câmaras com água destilada e enchendo-os com etanol a 70%... vai evitar potenciais contaminações... até a próxima utilização.
O protocolo pode ser facilmente modificado para estudar o efeito de outros substratos ou inibidores diferentes. Por exemplo, uma proteína interessante para estudar é o portador de piruvato mitocondrial (MPC). O papel desta proteína é transportar o piruvato gerado no citosol para a matriz mitocondrial. Recentemente, tem sido sugerido que desempenham um papel importante na modulação do metabolismo durante condições patológicas, tais como durante o tipo 2 diabetes38. Para estudar o efeito da proteína MPC no metabolismo mitocondrial, é útil começar as injeções com piruvato ao invés de piruvato e malato, ao mesmo tempo. Assim, o efeito do piruvato é estudada independentemente do efeito do malato, como este último é injetado para apenas apoiar o ciclo do ácido cítrico e certifique-se de que os intermediários não estão esgotados. Também é possível usar inibidores de MPC39 para avaliar se uma limitação deste transporte ao invés de oxidação do piruvato é observada. Então, seria possível observar uma potencial mudança na fonte de combustível preferencial para respiração40. Também é possível omitir alguns substratos para simplificar o protocolo se não é relevante para o estudo. Por exemplo, para estudar uma disfunção do complexo eu só, não é necessário utilizar todos os substratos apresentados neste protocolo.
Este protocolo apresenta algumas limitações que desviam de condições na vivo . As medições de consumo de oxigênio mitocondrial são registradas quando o meio de respiração é acima ar-saturação, como oxigênio puro é injetado para evitar a limitação da difusão do oxigênio dentro do tecido30. Além disso, as concentrações de substratos são injetadas em excesso, que não estão refletindo as condições na vivo . Também é importante observar que a idade, sexo, estirpe e dieta de Drosophila podem afetar os resultados. Esses parâmetros são, portanto, ser tidas em conta, ao interpretar os resultados. Este método é no entanto mais perto fisiológicas condições do que os métodos usando mitocondriais isolamentos para medir o consumo de oxigênio mitocondrial, como as interações com os outros componentes celulares e a integridade estrutural da mitocôndria e morfologia são conservadas31. É importante notar que os isolamentos mitocondriais são parâmetros mais vantajosos quando adicionais tais como produção de ROS ou eficiência mitocondrial (relação P/O) tem que ser medido27.
Esse método pode ser usado para atingir vários objetivos, que vão desde a compreensão das disfunções mitocondriais e os mecanismos subjacentes de doenças metabólicas, para testar os efeitos de diferentes compostos sobre funções mitocondriais sob patológica condições. Além disso, ele pode ser usado para observar os efeitos de várias tensões ambientais sobre o metabolismo mitocondrial, tais como mudanças na dieta ou temperatura. Por exemplo, é possível estudar a eficiência de moléculas sintéticas bioativas nas funções mitocondriais e no tratamento de disfunções mitocondriais. Esse método também é uma boa ferramenta para estudar as funções mitocondriais em pontos diferentes de tempo, que o torna muito relevante para o estudo dos mecanismos fundamentais relacionadas com o processo de envelhecimento. A avaliação do metabolismo mitocondrial através do consumo de oxigênio, usando permeabilized avermelhado certamente irá ajudar a melhor o nosso conhecimento sobre o papel do metabolismo mitocondrial, quando a célula é exposta a condições desafiadoras.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado por contribuições do nacional de Ciências e engenharia Research Council (NSERC, descoberta grant) e Université de Moncton, a NP. CLB gostaria de reconhecer o apoio de financiamento do Instituto canadense de pesquisa de saúde (CIHR), a Fundação de inovação de New Brunswick (NBIF) e Université de Moncton. O trabalho do EHC é apoiado pela sociedade de Alzheimer do Canadá, Canadá cérebro, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, Fundação de inovação de New Brunswick, New Brunswick saúde Research Foundation e Université de Moncton.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Fine-tipped antimagnetic forceps | VWR | 82027-400 | |
| Secura225D-1S-DQE | Sartorius AG, Goettingen, Germany | Semi-micro balance (distributed by several companies) |
|
| Drosophila melanogaster wild-type w1118 | Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA | Storage Condition: 24 °C |
|
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA Storage Condition: RT |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | Storage Condition: RT |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Storage Condition: -20 °C |
| MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | Storage Condition: RT |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Storage Condition: RT |
| Na2Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | Storage Condition: -20 °C |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | Storage Condition: RT |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Storage Condition: 2-8 °C |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | Storage Condition: RT |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 | Saponin Storage Condition: RT Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily. |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | Storage Condition: RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | Storage Condition: RT |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Storage Condition: RT |
| BSA | Sigma-Aldrich | 05470 | Storage Condition: 2-8 °C |
| Na2S2O4 | Sigma-Aldrich | 157953 | Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Pyruvate Storage Condition: 2-8 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily. |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Malate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C. |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A5285 | ADP Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C. |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | Cytochrome c Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Proline Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | Succinate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C. |
| sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt | Sigma-Aldrich | G7886 | Glycerol-3-phosphate Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C. |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C. |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C. |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily. |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C. |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | TMPD Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Ascorbate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
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