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Biochemistry

Medición de consumo de oxígeno mitocondrial en las fibras Permeabilized de Drosophila utilizando cantidades mínimas de tejido

Published: April 7, 2018 doi: 10.3791/57376
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Département de chimie et biochimie, Université de Moncton, 2Département de biologie, Université de Moncton
* These authors contributed equally

Summary

En este artículo se describe un método para medir el consumo de oxígeno mediante respirometría de alta resolución de tórax permeabilized de Drosophila. Esta técnica requiere una cantidad mínima de tejido en comparación con la técnica de aislamiento mitocondrial clásica y los resultados obtenidos son más fisiológicamente relevantes.

Abstract

La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, representa un modelo emergente para el estudio del metabolismo. De hecho, drosophila tienen estructuras homólogas a los órganos humanos poseen rutas metabólicas altamente conservados y tienen una vida útil relativamente corta que permite el estudio de los mecanismos fundamentales diferentes en un período corto de tiempo. Sin embargo, es sorprendente que uno de los mecanismos esenciales para el metabolismo celular, la respiración mitocondrial, no ha sido bien investigada en este modelo. Es probable porque la medida de la respiración mitocondrial en Drosophila requiere generalmente un gran número de personas y los resultados obtenidos no son altamente reproducibles. Aquí, se describe un método que permite la medición precisa del consumo de oxígeno mitocondrial utilizando cantidades mínimas de tejido de Drosophila. En este método, los tórax son disecados y permeabilized mecánicamente con pinzas afiladas y químicamente con saponina, permitiendo que diferentes compuestos cruzar la membrana celular y modular la respiración mitocondrial. Después de permeabilización, se realiza un protocolo para evaluar la capacidad de los diferentes complejos del sistema de transporte de electrones (ETS) para la oxidación de diferentes sustratos, así como su respuesta a un uncoupler y varios inhibidores. Este método presenta muchas ventajas comparados aislamientos mitocondriales, ya que es más fisiológico relevante porque la mitocondria todavía está interactuando con los otros componentes celulares y la morfología mitocondrial se conserva. Además, preparaciones de la muestra son más rápidas, y los resultados obtenidos son altamente reproducibles. Combinando las ventajas de la Drosophila como modelo para el estudio del metabolismo con la evaluación de la respiración mitocondrial, importante nueva información puede ser revelada, sobre todo cuando las moscas están experimentando diferentes ambientales o fisiopatológico condiciones.

Introduction

La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se ha utilizado como organismo modelo para la investigación genética para sobre un siglo1. El estudio de este organismo no sólo ha conducido a importantes conocimientos fundamentales sobre herencia ligada al sexo2, mutación tarifa3, el desarrollo del sistema de los nervios y la celda destino determinación4, pero recientemente también se ha convertido en un herramienta valiosa para estudiar los mecanismos inherentes a varias enfermedades tales como Alzheimer y Parkinson5,6. Por otra parte, es un modelo popular para estudiar el proceso de envejecimiento, ya que se pueden levantar en gran número en un período corto de tiempo y tienen una vida corta. También poseen estructuras homólogas a los órganos humanos, como un corazón, cuerpos grasos (funciona de manera similar como el tejido adiposo hígado y blanco), oenocytes (células similares a hepatocitos), células (equivalentes a las células β-pancreáticas), productoras de insulina, así como la hemolinfa transporta metabolitos (análogo a la sangre de vertebrados)7. Además, las vías centrales del metabolismo intermediario (incluyendo la vía de señalización insulina/insulina-como factor de crecimiento similar y vías del blanco de rapamicina-TOR) son también altamente conservado7. Por estas razones, Drosophila han explotado recientemente para describir los mecanismos fundamentales que controlan el metabolismo, especialmente en condiciones patológicas inherentes a humanas enfermedades metabólicas como diabetes8. Un componente importante del metabolismo es la mitocondria que integra múltiples vías y realiza una de las funciones biológicas más importantes de la vida, la producción de ATP, mediante el proceso de fosforilación oxidativa (OXPHOS). Teniendo en cuenta su papel central en el metabolismo del organismo, no es de extrañar que las disfunciones mitocondriales están implicadas en muchas enfermedades como enfermedad de Parkinson9 y enfermedad de Alzheimer enfermedades10, así como en la esclerosis lateral amiotrófica 11 , 12. también son determinantes fundamentales del proceso de envejecimiento. De hecho, son los principales productores de especies reactivas del oxígeno (ROS) en la célula, que puede ser perjudicial para la célula en alta concentración a través del daño oxidativo11. Envejecimiento también se ha asociado a la acumulación de mutados o dañados del ADN mitocondrial13, mitofagia disfunciones14,15 , así como alteración de la Biogénesis mitocondrial16. Las mitocondrias también son determinantes de la homeostasis de la célula pueden utilizar diferentes sustratos para ajustar varias funciones celulares según la abundancia o escasez de macronutrientes17,18.

De hecho, los diferentes nutrientes en la dieta (carbohidratos, lípidos y proteínas) son digeridos, absorbidos y transportados en las células. Luego se transforman en el citosol y los substratos derivados son transportados a la matriz mitocondrial donde se producen reduciendo equivalentes, tales como NADH y FADH219. Estos equivalentes reductores son oxidados luego por diferentes complejos enzimáticos del sistema de transporte de electrones (ETS). Estos complejos están incrustados en la membrana interna mitocondrial, como el complejo I y complejo II. Además, otros complejos enzimáticos como el glicerol-3-fosfato deshidrogenasa mitocondrial y la deshidrogenasa de prolina representan rutas alternativas para la entrada de electrones en la ETS20,21. Estos complejos 'alternativos' son particularmente importantes en los insectos, como según la especie, pueden participar activamente para aumentar la respiración20,22,23,21. Electrones de estas ETS sistemas de alimentación se transfieren a la ubiquinona y posteriormente al complejo III y luego al complejo IV, hasta el aceptor final, oxígeno molecular. Esta transferencia de electrones genera una fuerza protón-motriz a través de la membrana interna mitocondrial conduce a la fosforilación de ADP a ATP en el complejo V (figura 1). Teniendo en cuenta el papel central de la mitocondria en la homeostasis de la célula, estudiando el metabolismo mitocondrial utilizando el modelo relevante D. melanogaster representa una poderosa herramienta para delinear los mecanismos subyacentes de diversos fisiopatológicos condiciones o bajo estrés celulares y medio ambiente. Sorprendentemente sin embargo, sólo un puñado de estudios realmente mide la respiración mitocondrial en Drosophila24,25,26. De hecho, experimentos con el objetivo de evaluar el consumo de oxígeno mitocondrial requieren el aislamiento de las mitocondrias. Aunque ventajosa para la medición de funciones mitocondriales (como producción de ROS o relación P/O como marcador de la eficiencia mitocondrial27,28), estos aislamientos generalmente requieren grandes cantidades de tejido de varios individuos24,29. Este requisito para grandes cantidades de tejido y de los individuos es un factor limitante importante, teniendo en cuenta que todos los individuos deben ser la misma edad y preferiblemente del mismo sexo para los experimentos, haciendo la medida de la respiración en diferentes tiempo puntos laborioso en el mejor. Por otra parte, mientras que aislamientos mitocondriales pueden proporcionar la penetración importante en los mecanismos fundamentales que rigen el metabolismo mitocondrial, los métodos utilizados para aislar mitocondrias tienen varios inconvenientes como la dificultad para obtener resultados reproducibles , interrupción de la red mitocondrial y alteración de mitochondrial estructura y función de29,30,31.

El objetivo de este estudio es presentar un protocolo robusto para medir consumo de oxígeno mitocondrial en Drosophila utilizando sólo una cantidad mínima de tejido a partir de muy pocos individuos. Este protocolo consiste en la medición de oxígeno mitocondrial consumo en situ con fibras musculares permeabilized29 de tórax de Drosophila en combinación con alta resolución respirometria32,33, 34 , 35. este método tiene también ventajas adicionales en comparación con el método clásico de aislamiento mitocondrial puesto que las interacciones con los otros componentes de la célula como estructura y la función mitocondrial así como más se conservan en permeabilized las fibras29,31,,36, que hace que este enfoque más fisiológico relevantes. Con este protocolo, funciones mitocondriales pueden evaluarse con precisión con alta resolución respirometría en tórax solamente tres de Drosophila, sustratos permitiendo la determinación del consumo de oxígeno en varios pasos diferentes del ETS. Por lo tanto, este protocolo podría ayudar a responder preguntas clave sobre los mecanismos fundamentales que controlan el metabolismo en el contexto de muchas condiciones ambientales o patofisiológicos aprovechando el modelo de Drosophila.

Para medir el consumo de oxígeno en varios pasos diferentes del ETS y evaluar diferentes sustratos contribuyen a la respiración, diferentes sustratos (figura 1), uncoupler, y los inhibidores son usados30 después de permeabilización de las tejido. En concreto, se realizan adiciones secuenciales de diferentes sustratos para estimular la entrada de electrones a través de diversos complejos de la ETS. Cianuro de carbonilo de un uncoupler, 4-(de trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), luego se agrega en la concentración óptima para medir la respiración no juntada, es decir, estimula la respiración sin fosforilar al consumo máximo de oxígeno. Inhibiciones secuenciales de los complejos que i, II y III estamos entonces realizado para monitorear el consumo de oxígeno residual que se debe a reacciones de oxidación no-ETS. Por último, capacidad de respiración máxima de complejo IV puede ser evaluado por la inyección de N, N, N', N, - tetrametil - p-Fenilendiamina (debe), un proveedor de electrones artificial y ascorbato. Es importante tener en cuenta que los experimentos se llevan a cabo a 24 °C ya que es la temperatura a la que se crían las moscas.

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Protocol

1. preparación de reactivos

  1. Preparar las siguientes soluciones para la disección y permeabilización del tejido.
    1. Preparar la solución de preservación: 2,77 mM CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, taurina, 20 mM 15 mM fosfocreatina de Na2, 20 mM imidazol, dithiothreitol de 0,5 mM y 50 mM K-MES, pH 7.1 (se pueden almacenar a-20 ° C).
    2. Preparar la solución de saponina: 5 mg de saponinas en 1 mL de solución de preservación (preparar diariamente).
  2. Preparar las siguientes soluciones para la medición de la respiración.
    1. Preparar el medio de la respiración: 120 mM KCl 5 mM KH2PO4, 3 mM HEPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2y 0.2% BSA (w/v), pH 7,2.
    2. Preparar sustratos, uncoupler, inhibidores. Disolver todos los sustratos en H2O y disolver el uncoupler FCCP, así como los inhibidores en etanol absoluto (excepto malonato que se diluye en H2O). Neutralizar la mayoría de los sustratos así como malonato (véase Tabla de materiales). Todas las concentraciones en el protocolo son concentraciones finales dentro de cámaras de 2 mL.

2. preparación y calibración de la alta resolución respirómetro.

  1. Lavar las cámaras, tapas y tapones del respirómetro tres veces con etanol al 70% y tres veces con agua destilada.
  2. Calibrar a cero concentración de oxígeno: pipeta 2,3 mL de medio de la respiración en la cámara y añadir 10 mg de Ditionito de sodio. Aunque el volumen máximo de la cámara es de 2 mL, se agregan 2.3 mL para asegurar que ninguna burbuja de aire se mantiene bajo el tope al cerrar las cámaras. Las cámaras con los tapones de cierre y medir la concentración de oxígeno de 10-20 min calibrar los electrodos en cero concentración de oxígeno con la resultante tasa de consumo de oxígeno.
  3. Lavar las cámaras con agua destilada, incubar en etanol absoluto durante 10 minutos y luego enjuague con agua destilada.
  4. Calibrar en la saturación del aire: pipeta 2,3 mL de medio de la respiración en las cámaras, inserte los tapones de aspirar el exceso medio encima de los tapones y luego levante los tapones con el espaciador. Medio de exceso de respiración se pipetea en la cámara (volumen de 2 mL total) para evitar la presencia de burbujas de aire después del cierre de las cámaras.
  5. Controlar el consumo de oxígeno por 45 min a una hora, hasta que la concentración de oxígeno (trazo azul) es estable alrededor de 250 nM a 24 ° C.

3. disección de moscas y permeabilización del tejido

  1. Asegúrese de que todas las medidas se realizan en el hielo.
  2. Anestesie seis moscas macho de la misma cepa, misma edad y se crió en la misma dieta en hielo para facilitar la disección de las moscas (wild-type w1118, 15 días de edad, alimentado en medio de la harina de maíz).
  3. Con un bisturí y pinzas de punta fina, diseccionar las moscas (quitar la cabeza y el abdomen) para mantener sólo el tórax contiene los músculos de vuelo. Este paso puede hacerse con el ojo desnudo. Manejar los tórax resultantes con pinzas de punta fina.
  4. La transferencia de tres tórax disecada en 25 mm placa de Petri que contiene 2 mL de solución de preservación fría usando el fórceps.
  5. Con las pinzas de punta fina, mecánicamente permeabilizar los tórax insertando la punta de las pinzas en el tórax y varias veces desgarrar el tejido para obtener una red libremente.
  6. En una placa de 24 pocillos, se llenan dos pozos 12,5 μl de la solución de saponina y 1 mL de solución de preservación para obtener una concentración final de 62.5 μg/mL de saponina. Llene los dos pozos adyacentes con 1 mL de medio de respiración.
  7. Con las pinzas de punta fina, tres tórax permeabilized de transferencia en la solución de saponina diluida e incubar con agitación suave en un agitador orbital, en el hielo, durante 20 minutos.
  8. Después de la incubación de estos última, transferir las fibras en los pozos juntos con el medio de la respiración con agitación suave, en hielo durante 5 minutos enjuagar la saponina.

4. determinación de peso seco

  1. Seque el tórax permeabilized sobre una superficie absorbente y flip 3 - 4 veces con las pinzas de punta fina para asegurarse de que se quita toda la humedad.
  2. Pesar el tres tórax juntos en una Microbalanza. Tenga en cuenta el peso obtenido como antes para normalizar las tasas de consumo de oxígeno mitocondrial.
  3. Transferencia de los tejidos inmediatamente en una gota de medio de la respiración en el hielo.

5. determinación de las tasas de consumo oxígeno

  1. Abra las cámaras del respirómetro (Retire los tapones) y añadir 10 mM de piruvato y malato de 2 mM en cada cámara.
  2. Añadir los tejidos permeabilized directamente en las cámaras con el medio de la respiración.
  3. Reemplace los tapones usando al espaciador.
  4. Con una jeringa de 60 mL, recoger oxígeno directamente de un tanque de oxígeno e inyecte 2-5 mL de oxígeno a través de los capilares el tapón de cada cámara para asegurarse de que la difusión de oxígeno a través del tejido no limitará el consumo de oxígeno.
  5. Inserte una jeringa Hamilton en el capilar de cada tapón para asegurarse de que el tórax permanezcan en la cámara.
  6. Cerrar los compartimientos completamente cuando la concentración de oxígeno es alrededor de 400 nM, logrando niveles de oxígeno por encima de la saturación del aire (alrededor de 160% aire saturación) dentro de las cámaras.
  7. Detenga y reinicie los agitadores para comprobar si las burbujas de aire en las cámaras.
  8. Ingrese la masa de tejido pesado previamente para normalizar las tasas de respiración por masa de tejido (mg), mostrando el consumo de oxígeno de la masa específica (pmol O2 consumed.s-1.mg-1 de tejido).
  9. Una vez que el consumo de oxígeno se estabiliza (trazo rojo), agregar 5 mM ADP con una jeringa Hamilton.
  10. Después de cada inyección, enjuague la jeringa con agua destilada, etanol al 70% y otra vez de agua destilada.
  11. Una vez que el consumo de oxígeno es estable otra vez, inyectar 5 μl de 4 mM del citocromo c.
  12. Proceder a las inyecciones secuenciales de los siguientes substratos para evaluar el consumo de oxígeno mitocondrial en diferentes pasos del ETS:
    1. Añadir 5 μl de una prolina de 2 M.
    2. Añadir 10 μl de succinato de un de 1 M.
    3. Añadir 30 μl de un 1 M glicerol-3-fosfato.
  13. Inyecte uncoupler FCCP de manera valoración por pasos de 0.5-1 μm (2 μl de una solución de 1 mM) hasta que la concentración óptima es alcanzada, es decir, la concentración para lograr el consumo de oxígeno más alto posible sin inhibición (PRECAUCIÓN: ver tabla de de materiales).
  14. Inyectar los siguientes inhibidores secuencialmente para inhibir completamente el flujo de electrones en el ETS con el fin de medir el consumo de oxígeno residual (ROX) es decir, no-respiratoria las reacciones como reacciones oxigenasa entre otros:
    1. Añadir 1 μl de una rotenona de 1 mM (PRECAUCIÓN: véase Tabla de materiales).
    2. Añadir 5 μl de un malonato de 2 M (PRECAUCIÓN: véase Tabla de materiales).
    3. Añadir 1 μl de un 5 mM antimicina A (PRECAUCIÓN: véase Tabla de materiales).
  15. Añadir ascorbato de 0,2 mM y 0,5 mM debe secuencialmente en las cámaras, a partir del ascorbato para medir el consumo de oxígeno por el complejo IV.
  16. Añadir 20 mM de azida sódica para inhibir el complejo IV (PRECAUCIÓN: véase Tabla de materiales).
  17. Una vez que la señal es estable, abrir las cámaras con el espaciador, volver a oxigenar las cámaras mediante la inyección de 2 mL de oxígeno puro y cerrar las cámaras cuando la concentración es alrededor de 250-300 nmol.mL-1.
  18. Medir la señal de 10-15 minutos y calcular el fondo de la química, es decir, el consumo de oxígeno debido a la autoxidación de debe.

6. limpieza del respirómetro

  1. Después de las mediciones, enjuague los compartimientos con agua destilada una vez y enjuague la cámara tres veces en etanol al 70%.
  2. Incubar en etanol absoluto durante 10 minutos inactivar los inhibidores.
  3. Enjuagar tres veces con agua destilada, llene los compartimientos con etanol al 70% y vuelva a colocar los tapones y las tapas hasta la siguiente utilización.

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Representative Results

Se proporciona un rastro representativo del consumo de oxígeno mitocondrial utilizando el protocolo descrito en la figura 2. El piruvato y malato inyectado en las cámaras junto con las fibras del músculo permeabilized se refieren a la respiración de la CI-fuga, es decir, cuando el complejo I de la ETS es estimulada por el NADH producido por oxidación de piruvato y malato a través de la ciclo del ácido tricarboxílico (CI). Durante este tipo de respiración, el oxígeno mitocondrial se mantiene principalmente para compensar la fuga de protones, es decir, protones cruzando desde el espacio del intermembrane a la matriz mitocondrial, cuando la ATP sintasa no es activo (escape)30. Cuando se añade al ADP, ATP Sintetasa se activa y se transfieren los electrones desde el complejo I a la IV complejo con simultánea fosforilación de ADP en ATP (CI-OXPHOS), resultando en mayor consumo de oxígeno mitocondrial. La relación de acoplamiento de OXPHOS se calcula como CI-OXPHOS, CI-fuga y se toma generalmente como un buen indicador de calidad mitocondrial y de acoplamiento mitocondrial30. En Drosophila, esta relación debe superar al menos 6.0 (figura 3). Si está por debajo de este valor, podría indicar un problema con la preparación de tejido o una disfunción mitocondrial. La adición del citocromo c permite la determinación de la integridad de la membrana mitocondrial externa y por lo tanto se utiliza como un control de calidad de la preparación (figura 4). De hecho, el citocromo c está ligada a la membrana mitocondrial interna y normalmente se lava lejos si la membrana externa mitocondrial es dañada durante el proceso de permeabilización. Como resultado, adición exógena citocromo c aumentará significativamente el consumo de oxígeno si se daña la membrana mitocondrial externa y la endógena citocromo c se ha perdido. Generalmente, un aumento de menos de 10-15% en el consumo de oxígeno (figura 4) ilustra adecuada integridad de la membrana mitocondrial externa29. En la figura 3 y 4, se obtuvieron las huellas verdes de permeabilización no adecuada y la manipulación de las muestras (excesivas lagrimeo de los tejidos para la figura 3y pesadas después de un tiempo más largo en la superficie absorbente de la figura 4), Considerando que los rastros rojos representan muestras permeabilized y manejado adecuadamente. Estos resultados ponen de relieve que las condiciones adecuada permeabilización son cruciales para una evaluación fiable del consumo de oxígeno mitocondrial.

Los siguientes sustratos utilizados durante los experimentos proporcionan electrones a la ubiquinona y permitieron aumentar el flujo de electrones en el ETS. Prolina es un aminoácido que puede ser utilizado como sustrato de energía especialmente en insectos23, sino también en los mamíferos durante la inanición aguda o durante condiciones patológicas37. La adición de prolina en las cámaras permite para evaluar la contribución de la deshidrogenasa de prolina (ProDH) al flujo de electrones en el ETS, cuando los electrones fluyen de ambos complejos y ProDH y participan en el proceso OXPHOS (CI + ProDH-OXPHOS). Con adición de succinato, puede observarse la contribución del complejo II (Succinato deshidrogenasa) ETS (CI + ProDH + CII-OXPHOS). La inyección de glicerol-3-fosfato (G3P), aumenta aún más el consumo de oxígeno mitocondrial como este sustrato estimula mitocondrial glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) que es parte de la lanzadera de glicerofosfato y la transferencia electrones a la ETS (CI + ProDH + CII + G3PDH-OXPHOS). Tanto ProDH G3PDH han demostrado ser particularmente activo en varias especies de insectos y por lo tanto son importantes en este protocolo con Drosophila20,21,22,23,32 .

Cuando se obtiene el uncoupler que FCCP se agrega, la respiración no juntada (estado de ETS), es decir, el consumo de oxígeno máximo que representa la capacidad máxima del ETS (CI + ProDH + CII + G3P-ETS). El FCCP es un protonophore que transporta los protones desde el espacio del intermembrane a la matriz mitocondrial sin pasar por el complejo V. El FCCP debe titularse cuidadosamente como concentraciones por debajo del resultado óptimo en el consumo de oxígeno máximo no y las tasas de respiración no estable mientras que concentraciones superiores a un óptimo resultado en la inhibición del consumo de oxígeno mitocondrial (figura 5). Una vez que se agregan los sustratos y el uncoupler, inhibición de los complejos que i, II y III podemos ser secuencialmente realiza utilizando rotenona, malonato y antimicina A, respectivamente. Con cada inhibidor utilizado, se observa una disminución en el consumo de oxígeno mitocondrial, hasta alcanzar el menor consumo de oxígeno después de la adición de antimicina A. La tasa alcanzó después de la adición de los inhibidores es el consumo de oxígeno residual30. Representa el consumo de oxígeno debido a las reacciones oxidativas no mitocondrial como reacciones de ciclooxigenasa y la producción de especies reactivas por ejemplo, y ha por lo tanto a restarse de todos los tipos medidos.

DEBE es un transportador de electrones artificial que proporciona electrones directamente al complejo IV, pasando por alto todos los complejos, permitiendo medir la capacidad de respiración máxima complejo IV. Este sustrato es propenso a Autoxidación, ascorbato tiene que ser añadido a antes de a debe limitar pero no totalmente evitar este autoxidación. Para corregir para la autoxidación restantes del debe, el complejo IV inhibidor de azida de sodio se agrega a las cámaras y luego se registra el consumo de oxígeno de 10-15 minutos. Este consumo de oxígeno por lo tanto representa el fondo químico, o en otras palabras la autoxidación de debe que debe tenerse en cuenta para el cálculo de la capacidad de respiración máxima de complejo IV.

Figure 1
Figura 1 . Representación esquemática del transporte mitocondrial de electrones por el sistema de transporte de electrones y fosforilación oxidativa en la membrana interna mitocondrial. I: complejo I; II: complejo II; III: complejo III; IV: complejo IV; V: ATP sintasa; Acetil-CoA: acetil coenzima A; Citocromo c: citocromo c; e–: electrón; G3P: glicerol-3-fosfato; G3PDH: mitocondrial glicerol-3-fosfato deshidrogenasa; H+: protón; PRODH: deshidrogenasa prolina; TCA: ciclo del ácido tricarboxílico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Restos representativos de concentración de oxígeno mitocondrial (trazo azul) y consumo (trazo rojo) en tórax permeabilized de Drosophila. Cada inyección se representa con una flecha que indica el compuesto inyectado (Pyr: piruvato; mal: malato; ADP; Citocromo c: citocromo c; Pro: prolina; Succ: succinato; G3P: glicerol-3-fosfato; FCCP: cianuro de carbonilo 4-(de trifluoromethoxy) phenylhydrazone; Putrefacción: rotenona; Malo: malonato; Hormiga A: antimycin A; DEBE: N, N, N', N, - tetrametil - p-Fenilendiamina; ASC: ascorbato; SAZ: azida de sodio). Cada tasa de consumo de oxígeno mitocondrial se denota en la gráfica, cuando se ha estabilizado el consumo de oxígeno (trazo rojo). Efecto c citocromo denota la integridad de la membrana externa mitocondrial (véase texto para más detalles). Consumo de oxígeno residual representa el consumo de oxígeno debido a reacciones laterales oxidativo en las células y tiene que restar a todos los índices medidos. Química denota el consumo de oxígeno sólo por autoxidación de debe y tiene que ser tomado en cuenta para el cálculo de la capacidad de respiración máxima complejo IV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Representante rastros de una válida (rojo traza, cámara) e inadecuada (trazo verde, cámara B) respuestas a la adición de ADP. El rastro rojo corresponde a la cámara y el rastro verde corresponde a la cámara B, durante el mismo experimento. Se obtuvo el rastro rojo de tórax permeabilized adecuadamente mientras que el rastro verde se obtuvo después de rasgar excesivamente los tejidos durante la permeabilización. Cuando se agrega ADP, se prevé un aumento en el consumo de oxígeno, como el rastro rojo. OXPHOS acoplamiento ratios se calculan como las CI-OXPHOS, CI-fuga y se presentan en el gráfico. Un cociente de menos de 6.0 en Drosophila sugiere un problema en el acoplamiento mitocondrial y es característica de la degradación de la muestra o de la disfunción mitocondrial representado por el rastro verde. Pyr: piruvato; mal: malato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Representante rastros de una válida (rojo traza, cámara) e inadecuada (trazo verde, cámara B) respuesta a la adición de citocromo c. El rastro rojo corresponde a la cámara y el rastro verde corresponde a la cámara B, durante el mismo experimento. Rastro de rojo se obtuvo de tórax permeabilized y adecuadamente manejado, mientras que el rastro verde se obtuvo después de que el tórax se secaron deliberadamente por más tiempo en la superficie absorbente antes del pesaje. Citocromo c no suelen aumentar el consumo de oxígeno mitocondrial, como se ve en el rastro rojo, denotando que la membrana mitocondrial externa está intacta. Si, sin embargo, además de exógeno citocromo c aumenta significativamente el consumo de oxígeno mitocondrial de más del 15%, como se ve en el rastro verde, sugiere que la membrana mitocondrial externa está dañada y por lo tanto que la muestra se degrada y debe ser descartada. Pyr: piruvato; mal: malato; Citocromo c: citocromo c. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Restos representativos de concentración de oxígeno mitocondrial (trazo azul) y consumo (trazo rojo) después de la titulación de FCCP. Diferentes inyecciones de FCCP a varias concentraciones deben realizarse cuidadosamente para determinar el consumo máximo de oxígeno provocado por este uncoupler. Concentraciones insuficientes no permiten la evaluación de consumo máximo de oxígeno y se caracterizan por tasas de respiración no estable, mientras que exceso del FCCP inhibe el consumo de oxígeno mitocondrial. Las flechas indican las diferentes inyecciones de FCCP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Tarifas de reproducibilidad del consumo de oxígeno mitocondrial durante un experimento típico obtenido mediante las dos cámaras diferentes (rastro rojo, cámara; rastro verde, cámara B) de un respirómetro. El rastro rojo corresponde a la cámara y el rastro verde corresponde a la cámara B, durante el mismo experimento usando Drosophila de la misma edad, sexo, cepa y criado en la misma dieta, así como el protocolo descrito. Ambas muestras se normalizaron con la masa de tejido seco pesada como se describe en el protocolo (0,53 y 0,66 mg para cámaras A y B, respectivamente). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este estudio, se describe un método para la preparación de la muestra antes de las mediciones de consumo de oxígeno mitocondrial en Drosophila. Este método fue desarrollado para superar diferentes problemas relacionados con los protocolos usando aislamientos mitocondriales, especialmente en cuanto a la duración y el número de personas requerido. En vez de trabajar con aislamientos mitocondriales generalmente que requieren gran cantidad de tejidos obtenidos de varios individuos, se realiza este experimento en permeabilized de las fibras musculares de tórax de algunos Drosophila. En el presente Protocolo, sólo tres personas se necesitan para mostrar los resultados óptimos. Por lo tanto, la medición del consumo de oxígeno mitocondrial en diferentes puntos del tiempo es posible ya que es más asequible para sincronizar un grupo más pequeño de las moscas tiene la misma edad y del mismo sexo.

En primer lugar, es importante utilizar Drosophila de la misma edad, sexo, cepa y criados en las mismas condiciones para obtener la baja variabilidad en los resultados (figura 6), como la respiración puede cambiar con la edad, el género, el genotipo y la dieta de las moscas. El paso más crítico en la ejecución de este protocolo es el procedimiento de permeabilización de los tórax. Es muy importante actuar rápidamente para evitar la degradación del tejido, y también es importante asegurarse de que el tórax se permeabilized bien para tener las máximas tasas de consumo de oxígeno. Para asegurar que la permeabilización se ha realizado correctamente y que la integridad estructural y funcional de las mitocondrias se conservan después de permeabilización, la OXPHOS acoplamiento ratio (CI-OXPHOS, CI-fuga, figura 3), así como respuesta a citocromo c (figura 4) se utilizan como controles de calidad. Hay un compromiso de tomar en consideración entre trabajar rápidamente y asegurándose de que la permeabilización es bien ejecutado. También es fundamental trabajar siempre en el hielo cuando manipulando los tórax disecados. Para obtener los resultados más reproducibles (figura 6), permeabilización homogénea es necesario y la práctica de la técnica para la permeabilización ayuda a asegurarse de que se repitan los mismos movimientos. Otro paso fundamental es la determinación del peso seco de la muestra. De hecho, después de que el tórax se incuban, son muy sensibles, frágiles y propensos a la degradación. Por lo tanto, de manera similar a la permeabilización, rápidamente proceder a la determinación de peso seco es importante. Por otro lado, es importante determinar el peso con precisión, los resultados son normalizados por la masa del tejido. También se puede optimizar la cantidad de tórax utilizado. El protocolo puede ser adaptado para utilizar un tórax solo por cámara35, pero un cierto nivel de resolución podría ser perdido en la medición del consumo de oxígeno tanto como en la determinación del peso seco. La cantidad de tórax puede aumentarse si es necesario, pero es importante tener en cuenta que la mitocondria más en la muestra, mayor el consumo de oxígeno y las cámaras tendrán por tanto que ser reoxigenación. Este reoxygenation puede hacerse abriendo las cámaras e inyectar oxígeno, pero aumentará la probabilidad para introducir burbujas de aire en la cámara. Por lo tanto, si es posible, intente evitar tener que reoxygenate las cámaras (excepto cuando la compleja capacidad de respiración máxima IV tiene que determinarse). Antes de ejecutar los experimentos, optimización de la concentración de sustrato es necesario para lograr el mayor consumo de oxígeno mitocondrial sin observar efectos inhibitorios debido a una excesiva concentración. Las cámaras del respirómetro también deban limpiarse a fondo con el fin de evitar posibles contaminaciones. Es importante empezar a limpiar con agua destilada y luego con etanol al 70% para eliminar posibles contaminaciones biológicas. Después de esto, una incubación en etanol absoluto durante 10 minutos se recomiendan para evitar la contaminación de inhibidores hidrofóbicos. Finalmente, enjuague las cámaras con agua destilada y llenar con etanol al 70% evitará posibles contaminaciones hasta la siguiente utilización.

El protocolo puede ser modificado fácilmente para estudiar el efecto de otros sustratos o inhibidores diferentes. Por ejemplo, una proteína interesante a estudiar es el portador de piruvato mitocondrial (MPC). El papel de esta proteína es para el transporte de piruvato generado en el citosol a la matriz mitocondrial. Recientemente, se ha sugerido para desempeñar un papel importante en la modulación del metabolismo durante condiciones patológicas, como en el tipo 2 diabetes38. Para estudiar el efecto de la proteína MPC en el metabolismo mitocondrial, es útil empezar las inyecciones con piruvato sólo en lugar de piruvato y malato a la vez. Así, estudió el efecto de la piruvato es independientemente de los efectos del malato, éste es inyectado para sólo apoyar el ciclo del ácido tricarboxílico y garantizar que no se agotan los productos intermedios. También es posible utilizar inhibidores de la MPC39 para evaluar si una limitación de este transportador en lugar de se observa la oxidación del piruvato. Entonces, sería posible observar un cambio potencial en la fuente de combustible preferida de respiración40. También es posible omitir algunos sustratos para simplificar el Protocolo si no es relevante para el estudio. Por ejemplo, para estudiar una disfunción del complejo yo sólo, no es necesario utilizar todos los sustratos presentados en este protocolo.

Este protocolo presenta algunas limitaciones que desviar de condiciones en vivo . Las mediciones de consumo de oxígeno mitocondrial se registran cuando el medio de la respiración está por encima de la saturación, como se inyecta oxígeno puro para evitar la limitación de difusión de oxígeno en el tejido30. Por otra parte, las concentraciones de sustratos son inyectadas en exceso, que no reflejan las condiciones en vivo . También es importante tener en cuenta que la edad, sexo, cepa y dieta de Drosophila pueden afectar los resultados. Estos parámetros son, por tanto, tenerse en cuenta al interpretar los resultados. Este método es sin embargo más cercano al fisiológico condiciones que métodos utilizar aislamientos mitocondriales para medir consumo de oxígeno mitocondrial, las interacciones con los otros componentes celulares y la integridad estructural de la mitocondria y morfología son conservados31. Es importante tener en cuenta que aislamientos mitocondriales son parámetros más ventajosos cuando adicionales tales como producción de ROS o la eficiencia mitocondrial (relación P/O) tiene que ser medido27.

Este método puede utilizarse para lograr varias metas, que van desde la comprensión de los trastornos mitocondriales y los mecanismos subyacentes de las enfermedades metabólicas, probando los efectos de diferentes compuestos en funciones mitocondriales en patológica condiciones. Además, puede utilizarse para observar los efectos de varias presiones ambientales sobre el metabolismo mitocondrial, tales como cambios en la dieta o la temperatura. Por ejemplo, es posible estudiar la eficacia de moléculas bioactivas sintético sobre las funciones mitocondriales y en el tratamiento de la disfunción mitocondrial. Este método también es una buena herramienta para el estudio de las funciones mitocondriales en diferentes puntos temporales, que hace que sea muy relevante para el estudio de los mecanismos fundamentales relacionadas con el proceso de envejecimiento. La evaluación del metabolismo mitocondrial vía consumo de oxígeno usando permeabilized tórax sin duda ayudará a mejorar nuestro conocimiento sobre el papel del metabolismo mitocondrial cuando la célula se expone a condiciones difíciles.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue financiado por becas del nacional Ciencias y Consejo de investigación Ingeniería (NSERC, discovery grant) y Université de Moncton a NP. LHB gustaría reconocer el apoyo financiero del Instituto canadiense de investigación de la salud (CIHR), la Fundación de innovación de Nuevo Brunswick (NBIF) y Université de Moncton. El trabajo de EHC es apoyado por la sociedad de Alzheimer de Canadá Canadá cerebro, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, Fundación de la innovación de New Brunswick, Fundación de investigación de salud de New Brunswick y Université de Moncton.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High-resolution respirometer Oxygraph O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 10022-02 Startup O2K respirometer kit
 
O2K-Titration Set  Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20820-03 Hamilton syringes with different volumes
 
Datlab software Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20700 Software for data acquisition and analysis
 
Fine-tipped antimagnetic forceps VWR 82027-400
 
Secura225D-1S-DQE Sartorius AG, Goettingen, Germany Semi-micro balance (distributed by several companies) 
 
Drosophila melanogaster wild-type w1118 Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA
Storage Condition: 24 °C
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378 EGTA
Storage Condition: RT
KOH Sigma-Aldrich P1767 CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity.
Storage Condition: RT
CaCO3 Sigma-Aldrich C4830
Storage Condition: RT
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383
Storage Condition: -20 °C
MgCl2.6H2O Sigma-Aldrich M9272
Storage Condition: RT
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Storage Condition: RT
Na2Phosphocreatine Sigma-Aldrich P7936
Storage Condition: -20 °C
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Storage Condition: RT
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Storage Condition: 2-8 °C
MES hydrate Sigma-Aldrich M8250
Storage Condition: RT
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S7900 Saponin
Storage Condition: RT
Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily.
KCl Sigma-Aldrich P9541
Storage Condition: RT
KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791
Storage Condition: RT
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Storage Condition: RT
BSA Sigma-Aldrich 05470
Storage Condition: 2-8 °C
Na2S2O4 Sigma-Aldrich 157953 Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity.
Storage Condition: RT
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Pyruvate
Storage Condition: 2-8 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily.
L-(-)-Malic acid Sigma-Aldrich M1000 Malate
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C.
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A5285 ADP
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C.
Cytochrome c from equine heart Sigma-Aldrich C7752 Cytochrome c
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.
L-Proline Sigma-Aldrich P0380 Proline
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma-Aldrich S2378 Succinate
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C.
sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt Sigma-Aldrich G7886 Glycerol-3-phosphate
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C.
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920 FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity.
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C.
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.
Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C.
Malonic acid Sigma-Aldrich M1296 Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage.
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily.
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674 Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C.
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine Sigma-Aldrich T7394 TMPD
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at  -20 °C.
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Ascorbate
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at  -20 °C.
NaN3 Sigma-Aldrich S2002 Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. 
Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.

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References

  1. Stephenson, R., Metcalfe, N. H. Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use. The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).
  2. Morgan, T. H. An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila. Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).
  3. Dobzhansky, T., Wright, S. Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura. Genetics. 26 (1), 23-51 (1941).
  4. Zipursky, S. L., Rubin, G. M. Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).
  5. Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease. The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).
  6. Blandini, F., Armentero, M. T. Animal models of Parkinson's disease. FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).
  7. Baker, K. D., Thummel, C. S. Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila. Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).
  8. Morris, S. N. S., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).
  9. Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).
  10. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
  11. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  12. Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).
  13. Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell. 120 (4), 483-495 (2005).
  14. Szibor, M., Holtz, J. Mitochondrial ageing. Basic Research in Cardiology. 98 (4), 210-218 (2003).
  15. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  16. López-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. Mitochondrial biogenesis and healthy aging. Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).
  17. Muoio, D. M. Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock. Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).
  18. Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M. Nutrient-sensing mechanisms and pathways. Nature. 517 (7534), 302-310 (2015).
  19. Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).
  20. McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. "Alternative" fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).
  21. Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production. PLOS ONE. 10 (3), e0120600 (2015).
  22. Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor. Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).
  23. Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333 (2016).
  24. Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster. The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).
  25. Miwa, S., Brand, M. D. The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).
  26. Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).
  27. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  28. St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).
  29. Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
  30. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  31. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  32. Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).
  33. Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria. Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).
  34. Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males. Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).
  35. Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., Côté, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies. Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).
  36. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  37. Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways. Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).
  38. Bender, T., Martinou, J. C. The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).
  39. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
  40. McCommis, K., et al. An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion. Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).

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Simard, C. J., Pelletier, G.,… More

Simard, C. J., Pelletier, G., Boudreau, L. H., Hebert-Chatelain, E., Pichaud, N. Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue. J. Vis. Exp. (134), e57376, doi:10.3791/57376 (2018).

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