Summary
En metode for å måle oksygenforbruk med høy oppløsning respirometry i permeabilized thoraxes av Drosophila er beskrevet i dette dokumentet. Denne teknikken krever minimalt med vev sammenlignet med klassisk mitokondrie isolasjon teknikken og resultatene er mer fysiologisk relevante.
Abstract
Frukt fly, Drosophila melanogaster, representerer en ny modell for studiet av metabolismen. Faktisk drosophila har strukturer homologe til organer, har høyt konservert metabolske veier og har en relativt kort levetid der studie av ulike grunnleggende mekanismer i en kort periode. Imidlertid er det overraskende at en av mekanismene som er avgjørende for cellenes stoffskifte, mitokondrie åndedrett, ikke har blitt grundig undersøkt i denne modellen. Det er sannsynligvis fordi mål på mitokondrie åndedrett i Drosophila krever vanligvis et stort antall individer og resultatene er ikke svært reproduserbare. Her, er en metode som tillater presis måling av mitokondrie oksygenforbruk med minimale mengder vev fra Drosophila beskrevet. Denne metoden er thoraxes dissekert og permeabilized både mekanisk med skarpe tang og kjemisk saponin, slik at ulike forbindelser å krysse cellemembranen og modulere mitokondrie åndedrett. Etter permeabilization utføres en protokoll for å evaluere kapasiteten til de ulike kompleksene av elektronet transportsystem (ETS) å oksidere ulike underlag, og deres svar til en uncoupler og flere hemmere. Denne metoden gir mange fordeler sammenlignet med ved hjelp av mitokondrie isolasjoner, som det er mer fysiologisk relevant fordi mitokondrier er fortsatt i samspill med andre cellulære komponenter og mitokondrie morfologi er bevart. Videre eksempel forberedelsene er raskere, og resultatene er svært reproduserbare. Ved å kombinere fordelene med Drosophila som modell for studiet av metabolisme med evalueringen av mitokondrie åndedrett, viktig ny innsikt kan bli offentliggjort, spesielt når flyr opplever ulike miljømessige eller patofysiologiske forhold.
Introduction
Frukt fly, Drosophila melanogaster, har blitt brukt som en modell organisme for genetisk forskning for tallet1. Studiet av denne organismen har ikke bare ført til betydelige grunnleggende kunnskaper om sex-linked arv2, mutasjon rate3, utviklingen av nevrale systemet og cellen skjebne besluttsomhet4, men har også nylig dukket opp som en verdifullt verktøy for å studere mekanismer ligger flere sykdommer som Alzheimers og Parkinsons5,6. Videre er det en populær modell å studere aldringsprosessen, som de kan heves i mange over en kort periode og har en kort levetid. De har homologe strukturer til organer, som et hjerte, oenocytes (hepatocyte-lignende celler), fett organer (fungerer på samme måte som fettvev leveren og hvite), insulin produserende celler (tilsvarer β-bukspyttkjertelen celler), samt hemolymph transport metabolitter (analog til blodet av virveldyr)7. Videre er sentrale veiene av mellomledd metabolisme (inkludert insulin/insulin-lignende vekstfaktor-lignende signalveien og målet på Rapamycin-TOR veier) også høyt konservert7. For disse grunner, Drosophila har nylig blitt utnyttet for å beskrive de grunnleggende mekanismene som styrer metabolisme, spesielt i patologiske forhold iboende menneskelige metabolske sykdommer som diabetes8. En viktig komponent i stoffskiftet er mitokondrie som integrerer flere veier og utfører en av livets viktigste biologiske funksjoner, ATP produksjon, via oxidative fosforylering prosessen (OXPHOS). Vurderer deres sentrale rolle i organismes metabolisme er det ikke overraskende at mitokondrie dysfunksjoner er involvert i mange sykdommer som Parkinsons9 og Alzheimers sykdommer10og amyotrofisk lateral sklerose 11 , 12. de er også grunnleggende determinanter av aldringsprosessen. Faktisk er de produsenter av reaktive oksygen arter (ROS) i cellen, som kan være skadelig for cellen i høy konsentrasjon til oksidative skader11. Aldring har også vært knyttet til opphopning av skadet eller mutert Mitokondrielt DNA13, mitophagy dysfunksjoner14,15 , samt verdifall mitokondrie biogenesis16. Mitokondrier er også viktige determinanter av cellens homeostase som de kan bruke ulike underlag for å justere flere cellulære funksjoner etter overflod eller mangel av makronæringsstoffer17,18.
Faktisk er de ulike næringsstoffene i dietten (karbohydrater, lipider og proteiner) fordøyd, absorberes og transportert i cellene. De deretter transformeres i stoffer og avledede substrater transporteres inn i mitokondrie matrix der de produserer redusere ekvivalenter, som NADH og FADH219. Disse redusere ekvivalenter er deretter oksidert av ulike enzymatisk komplekser av elektronet transportsystem (ETS). Disse kompleksene er innebygd i mitokondrie interne membran, som kompleks I og komplekse II. I tillegg representerer andre enzymatisk komplekser som mitokondrie glyserol-3-fosfat dehydrogenase og proline dehydrogenase alternative ruter for oppføringen av elektroner i ETS20,21. Disse "alternative" komplekser er spesielt viktig i insekter, som ifølge arter, de kan delta aktivt for å øke åndedrett20,22,23,21. Elektroner fra disse ETS fôring systemer overføres til ubiquinone og senere til komplekse III, og deretter komplekse IV, før den endelige acceptor, molekylær oksygen. Denne elektron overføringen genererer en proton motiv kraft over interne mitokondrie membran kjører fosforylering av ADP til ATP på komplekse V (figur 1). Vurderer sentral rolle i mitokondrier i celle homeostase, studere mitokondrie metabolisme med relevante model D. melanogaster representerer et kraftig verktøy for å avgrense de underliggende mekanismene av ulike patofysiologiske betingelser eller under mobilnettet og miljømessige påkjenninger. Overraskende imidlertid målt bare en håndfull studier faktisk mitokondrie åndedrett i Drosophila24,25,26. Eksperimenter sikte på å evaluere mitokondrie oksygenforbruk krever isolering av mitokondrier. Men en fordel for måling av forskjellige mitokondrie funksjoner (som ROS produksjon eller P/O forholdet som markør mitokondrie effektivitet27,28), krever disse isolasjoner vanligvis ganske store mengder vev fra flere personer24,29. Dette kravet for store mengder vev og enkeltpersoner er en viktig begrensende faktor, spesielt med tanke på at alle individer bør være på samme alder og fortrinnsvis av samme kjønn for eksperimenter, gjøre mål på åndedrett på ulike tidspunkt poeng arbeidskrevende i beste fall. Videre mens mitokondrie isolasjoner kan gi betydelig innsikt i grunnleggende mekanismer for mitokondrie metabolisme, har metodene som brukes til å isolere mitokondrier flere ulemper som er vanskelig å få repliserbar resultater , avbrudd i mitokondrie nettverket og endring av mitokondrie29,30,31-med struktur og funksjon.
Målet med denne studien er å presentere en robust protokoll for å måle mitokondrie oksygenforbruk i Drosophila bruker bare en begrenset mengde av svært få individer. Denne protokollen består av måle mitokondrie oksygen forbruk i situ med permeabilized muskelfibre29 fra Drosophila thoraxes i kombinasjon med høy oppløsning respirometry32,33, 34 , 35. denne metoden har også flere fordeler sammenlignet med metoden klassiske mitokondrie isolasjon siden samhandling med andre komponenter cellen som vel som mitokondrie struktur og funksjon er mer bevart i permeabilized fiber29,31,36, som gjør denne metoden mer fysiologisk relevant. Med denne protokollen, kan mitokondrie funksjoner nøyaktig evalueres med høy oppløsning respirometry i tre thoraxes i Drosophila, underlag slik at fastsetting av oksygenforbruk i flere forskjellige trinn av ETS. Derfor kunne denne protokollen hjelpe svar på viktige spørsmål om grunnleggende mekanismer som styrer forbrenningen i sammenheng med mange miljømessige eller patofysiologiske forhold ved å utnytte Drosophila modellen.
Å måle oksygenforbruk i flere forskjellige trinn av ETS og vurdere hvordan ulike underlag bidra til respirasjon, ulike underlag (figur 1), uncoupler og hemmere er brukt30 etter permeabilization av den vev. Spesielt utføres sekvensielle filer av forskjellige underlag for å stimulere oppføringen av elektroner gjennom ulike komplekser av ETS. En uncoupler, karbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), deretter lagt på optimal konsentrasjon for å måle ikke-kombinert åndedrett, dvs. ikke-phosphorylating åndedrett stimulert til maksimalt oksygenopptak. Sekvensiell hemninger av komplekser I, II og III utføres da for å overvåke de resterende oksygenforbruk som skyldes ikke-ETS reaksjoner. Til slutt, komplekse IV maksimal åndedrett kapasitet kan evalueres ved injeksjon av N, N, N', N - Tetramethyl - p-phenylenediamine (TMPD), en kunstig elektron leverandør og ascorbate. Det er viktig å merke seg at eksperimenter er gjennomført på 24 °C siden det er temperaturen som fluene er hevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. reagenser forberedelse
- Klargjør følgende løsninger for disseksjon og permeabilization av vev.
- Forberede bevaring løsning: 2,77 mM CaK2EGTA, 7.23 mM K2EGTA, 5.77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, 20 mM taurine, 15 mM Na2phosphocreatine, 20 mM imidazole, 0,5 mM dithiothreitol, og 50 mM K-MES, pH 7.1 (kan lagres på 20 ° C).
- Forberede saponin løsning: 5 mg saponin i 1 mL av bevaring løsning (forberede fresh daglig).
- Klargjør følgende løsninger for måling av åndedrett.
- Forberede åndedrett medium: 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 3 mM HEPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2og 0,2% BSA (w/v), pH 7.2.
- Forberede underlag, uncoupler, hemmere. Oppløse alle underlag i H2O og oppløse uncoupler FCCP samt hemmere i etanol absolutt (unntatt malonate som blir fortynnet i H2O). Nøytralisere de fleste av de underlag samt malonate (se Tabell for materiale). Alle konsentrasjoner i protokollen er endelige konsentrasjoner inne 2 mL kamre.
2. forberedelse og kalibrering av høy oppløsning Respirometer.
- Vask kamre, caps og propper av respirometer tre ganger med 70% etanol og tre ganger med destillert vann.
- Kalibrere på null oksygen konsentrasjon: Pipetter 2.3 mL åndedrett medium i chambers og legge 10 mg av natrium dithionite. Selv om maksimal volumet av kammer 2 mL, legges 2.3 mL for å sikre at ingen luftboble forblir under stopperen når du lukker kamrene. Lukk kamrene med stoppers og måle oksygen konsentrasjon i 10-20 min. Kalibrer elektrodene på null oksygen konsentrasjon med resulterende oksygen forbruksraten.
- Vask kamrene med distillated vann, ruge i absolutt etanol i 10 minutter og skyll med destillert vann.
- Kalibrere på luften metning: Pipetter 2.3 mL åndedrett medium i chambers, sett stoppers, Sug opp overflødig mediet på stoppers og løft stoppers med mellomlegget. Overflødig åndedrett medium er pipetted i kamre (volum 2 ml totalt) for å unngå tilstedeværelsen av luftbobler etter stengetid kamrene.
- Overvåke oksygenforbruk for 45 minutter til en time, til oksygen konsentrasjon (blå trace) er stabil rundt 250 nM på 24 ° C.
3. Disseksjon av fluer og Permeabilization av vev
- Kontroller at alle trinnene utføres på is.
- Anaesthetize seks mannlige fluer av den samme stammen, samme alder og oppvokst på samme diett på is å lette Disseksjon av fluene (vill-type w1118, 15 dager gammel, matet på cornmeal medium).
- Ved hjelp av en skalpell og tynn tang, dissekere fluene (fjerne hoder og sklerotisert) for å holde bare thoraxes som inneholder flygingen musklene. Dette trinnet kan gjøres med det blotte øye. Håndtere de resulterende thoraxes med tynn tang.
- Overføre tre dissekert thoraxes i et 25 mm Petriskål inneholder 2 mL iskald bevaring løsning ved hjelp av pinsett.
- Med tynn tang, mekanisk permeabilize i thoraxes ved å sette spissen av tang til thoraxes og gjentatte ganger flerre vev for å få et løst sammenkoblede nettverk.
- I en 24-vel plate, fylle to brønner med 12.5 µL av saponin løsningen og 1 mL av bevaring løsning å få en endelig konsentrasjon av 62.5 µg/mL saponin. Fylle de to tilstøtende brønnene med 1 mL av åndedrett medium.
- Med tynn tang, overføre tre permeabilized thoraxes til utvannet saponin løsningen og ruge med mild agitering på en orbital shaker, på is, for 20 min.
- Etter den siste inkubering, overføre fibrene i de tilstøtende brønnene fylt med åndedrett mediet med mild agitasjon, på is, 5 min til skyll saponin.
4. fastsettelse av tørr vekt
- Tørk de permeabilized thoraxes på en absorberende overflate og vende 3 - 4 ganger med tynn tang for å kontrollere fuktighet er fjernet.
- Veie de tre thoraxes sammen på en microbalance. Merk innhentet vekten som brukes å normalisere mitokondrie oksygen forbruk priser.
- Overføre vev umiddelbart i en dråpe åndedrett medium på is.
5. oksygen forbruk priser besluttsomhet
- Åpne kamrene av respirometer (Fjern stoppers) og legge 10 mM pyruvate og 2 mM malate inn hvert kammer.
- Legg permeabilized vev direkte i kamrene fylt med åndedrett medium.
- Erstatte stoppers bruker mellomlegget.
- Med en 60 mL sprøyte, samle oksygen direkte fra en oksygentank og injisere 2-5 mL av oksygen gjennom disables kapillær av hvert kammer å kontrollere at oksygen spredning gjennom vev ikke vil begrense oksygenforbruk.
- Hamilton sprøyte inn av kapillær på hver stopper å sørge for at thoraxes forblir i kammeret.
- Lukk kamrene helt når oksygen konsentrasjonen er rundt 400 nM, oppnå oksygen nivåer over luften metning (rundt 160% luft metning) i kamrene.
- Stopp og start stirrers etter luftbobler i kamrene.
- Angi masse vev veide tidligere for å normalisere åndedrett priser av masse vev (mg), viser masse-spesifikke oksygenforbruk (pmol O2 consumed.s-1.mg-1 av vev).
- Når oksygen forbruket er stabilisert (rød trace), legger du til 5 mM ADP med Hamilton sprøyte.
- Etter hver injeksjon, skyll sprøyter med destillert vann, 70% etanol, og destillert vann igjen.
- Når oksygen forbruket er stabil igjen, injisere 5 µL av en 4 mM cytochrome c.
- Fortsett til sekvensielle injeksjoner av følgende underlagene evaluere mitokondrie oksygen forbruket i forskjellige trinn av ETS:
- Legge til 5 µL av en 2 M Proline.
- Legge til 10 µL av en 1 M succinate.
- Legge til 30 µL av en 1 M glyserol-3-fosfat.
- Injisere uncoupler FCCP på en måte som titrering trinn på 0,5-1 µM (2 µL av en 1 mM løsning) til optimal konsentrasjon er nådd, dvs. konsentrasjon å oppnå høyest mulig uten hemming oksygenforbruk (Advarsel: se tabell materialer).
- Injisere de følgende hemmere sekvensielt å hemme helt elektronet fluks i ETS for å måle den gjenværende oksygenforbruk (ROX) dvs ikke-luftveier reaksjoner som oxygenase reaksjoner blant andre:
- Legge 1 µL en 1 mM rotenon (Advarsel: se Tabell for materiale).
- Legge til 5 µL av et 2 M malonate (Advarsel: se Tabell for materiale).
- Legge 1 µL av en 5 mM antimycin A (Advarsel: se Tabell for materiale).
- Legg 0.2 mM ascorbate og 0,5 mM TMPD sekvensielt i chambers, starter med ascorbate måle oksygenforbruk av komplekse IV.
- Legge til 20 mM Natriumazid å hemme komplekse IV (Advarsel: se Tabell for materiale).
- Når signalet er stabil, åpne kamrene med mellomlegget, nytt oxygenate kamrene ved å injisere 2 mL av rent oksygen og lukke kamrene når konsentrasjonen er rundt 250-300 nmol.mL-1.
- Måle signalet for 10-15 min og beregne kjemiske bakgrunnen, dvs. oksygenforbruk på grunn av autoxidation av TMPD.
6. rengjøring av Respirometer
- Etter målinger, skyll kamrene med destillert vann en gang og skyll kamrene tre ganger på 70% etanol.
- Inkuber i absolutt etanol i 10 min å deaktivere hemmere.
- Skyll tre ganger med destillert vann, fyll kamrene med 70% etanol og erstatte stoppers og caps til neste utnyttelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representant spor av mitokondrie oksygenforbruk ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor gis i figur 2. Den pyruvate og malate injisert i kamre sammen med permeabilized muskelfibre henvises til CI-lekkasje åndedrett, dvsnår komplekset I ETS er stimulert av NADH produsert gjennom oksidering av pyruvate og malate via den tricarboxylic syre syklus (CI). Under denne pustefrekvens opprettholdes hovedsakelig mitokondrie oksygen for å kompensere for proton lekkasjen, dvsprotoner krysset fra intermembrane plass til mitokondrie matrise, når ATP syntase ikke er aktiv (lekkasje)30. Når ADP legges, ATP syntase er aktivert og elektroner overføres fra komplekset jeg til komplekse IV med samtidige fosforylering av ADP i ATP (CI-OXPHOS), som resulterer i økt mitokondrie oksygenforbruk. OXPHOS kobling forholdet beregnes som CI-OXPHOS/CI-lekkasje og er vanligvis tatt som en god indikator av mitokondrie kvalitet og mitokondrie kopling30. I Drosophila, bør dette forholdet minst overstige 6.0 (Figur 3). Hvis det er under denne verdien, kan det indikere et problem med vev utarbeidelse eller en mitokondrie dysfunksjon. Tillegg av cytochrome c tillater fastsetting integriteten til den ytre mitokondrie membranen og brukes derfor som en kvalitetskontroll av preparatet (Figur 4). Faktisk cytochrome c er løst bundet til indre mitokondrie membranen og er vanligvis vasket bort hvis den ytre mitokondrie membranen er skadet under permeabilization prosessen. Derfor vil legger eksogene cytochrome c øke betydelig oksygenforbruk hvis ytre mitokondrie membranen er skadet og endogene cytochrome c er tapt. En økning på mindre enn 10-15% i oksygenforbruk (Figur 4) illustrerer vanligvis passende integriteten til den ytre mitokondrie membran29. I Figur 3 og 4, grønne sporene ble innhentet fra ikke-tilstrekkelig permeabilization og håndtering av prøvene (overdreven rive av vev for Figur 3og vektet etter lengre tid på absorberende overflaten for Figur 4), mens røde spor representerer prøver tilstrekkelig permeabilized og håndtert. Disse resultatene markere at riktig permeabilization betingelser er avgjørende for pålitelig vurdering av mitokondrie oksygenforbruk.
Følgende substrater brukes under forsøkene gir elektronene å ubiquinone og kan øke elektron fluks i ETS. Proline er en aminosyre som kan brukes som energi substrat spesielt i insekter23, men også i pattedyr under akutt sult eller under pathological betingelser37. Tillegg av proline i kamrene kan evaluere bidrag av proline dehydrogenase (ProDH) elektron fluks i ETS, når elektroner strømmer fra begge komplekset jeg og ProDH og deltar i OXPHOS prosessen (CI + ProDH-OXPHOS). Med tillegg av succinate, kan bidrag av komplekse II (succinate dehydrogenase) til ETS observeres (CI + ProDH + CII-OXPHOS). Injeksjon av glyserol-3-fosfat (G3P), ytterligere øker i mitokondrie oksygenforbruk som dette underlaget stimulerer mitokondrie glyserol-3-fosfat dehydrogenase (G3PDH) som er en del av glycerophosphate transport og overføring elektroner til ETS (CI + ProDH + CII + G3PDH-OXPHOS). Både ProDH og G3PDH har vist seg å være aktiv i flere arter av insekter og er derfor viktig for denne protokollen med Drosophila20,21,22,23,32 .
Når uncoupler FCCP legges, ikke-kombinert åndedrett (ETS tilstand) er oppnådd, dvs., den maksimalt oksygenopptak representerer maksimal kapasitet på ETS (CI + ProDH + CII + G3P-ETS). FCCP er en protonophore som transporterer protoner fra intermembrane plass til mitokondrie matrix gjennom komplekse V. FCCP må være nøye titreres, som konsentrasjoner under optimalt resultat i ikke maksimal oksygenforbruk og ingen-stabile åndedrett priser mens konsentrasjoner over optimalt resultat i Hemming av mitokondrie oksygenforbruk (figur 5). Når substrater og uncoupler legges, hemming av komplekser I, II og III kan være sekvensielt utført med rotenon, malonate og antimycin A, henholdsvis. Med hver inhibitor brukes, er en nedgang i mitokondrie oksygenforbruk observert, fram den laveste oksygenforbruk etter at antimycin A. Prisen nådde etter tilsetting av alle hemmere gjenværende oksygen forbruk30. Det representerer oksygenforbruk skyldes ikke-Mitokondrielt oksidativt reaksjoner som oxygenase reaksjoner og reaktive arter produksjon for eksempel, og har derfor trekkes fra alle de andre prisene målt.
TMPD er en kunstig elektron transporter som gir elektroner direkte til komplekse IV, omgåelsen alle komplekser oppstrøms, slik at måling av komplekse IV maksimal åndedrett kapasitet. Dette underlaget er imidlertid utsatt for autoxidation, så ascorbate må være lagt før til TMPD å begrense, men ikke helt unngå denne autoxidation. Til rette for de resterende autoxidation av TMPD, komplekse IV inhibitor Natriumazid legges til kamre og oksygen forbruket registreres deretter i 10-15 minutter. Denne oksygenforbruk representerer derfor kjemiske bakgrunnen, eller med andre ord autoxidation av TMPD som bør tas hensyn til beregningen av komplekse IV maksimal åndedrett kapasitet.
Figur 1 . Skjematisk fremstilling av mitokondrie elektronet transport av elektron transportsystemet og oxidative fosforylering i mitokondrie indre membranen. I: komplekse jeg; II: komplekse II; III: komplekse III; IV: komplekse IV; V: ATP syntase; Acetyl-CoA: acetyl coenzyme A; Cyt c: cytochrome c; e-: elektron; G3P: glyserol-3-fosfat; G3PDH: mitokondrie glyserol-3-fosfat dehydrogenase; H+: proton; PRODH: proline dehydrogenase; TCA: tricarboxylic syre syklus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant spor av mitokondrie oksygen konsentrasjon (blå trace) og forbruk (rød trace) på permeabilized thoraxes av Drosophila. Hver injeksjon er representert med en pil som angir sammensatt injisert (Pyr: pyruvate; mal: malate; ADP; Cyt c: cytochrome c; Pro: proline; Succ: succinate; G3P: glyserol-3-fosfat; FCCP: karbonyl cyanid 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone; Råte: rotenon; Malo: malonate; Maur A: antimycin A; TMPD: N, N, N', N - Tetramethyl - p-phenylenediamine; ASC: ascorbate; SAZ: Natriumazid). Hver mitokondrie oksygen forbruksraten er merket på grafen, når oksygenforbruk (rød trace) har stabilisert. Cytochrome c effekt angir integriteten til den ytre mitokondrie membranen (se tekst for detaljer). Gjenværende oksygenforbruk representerer oksygenforbruk skyldes oksidativt siden reaksjoner i cellene og har trekkes til alle andre priser målt. Kjemisk bakgrunnen angir oksygenforbruk bare på grunn av autoxidation av TMPD og må tas i betraktning for beregning av komplekse IV maksimal åndedrett kapasitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Representant spor av et gyldig (rød spor kammer A) og utilstrekkelig (grønn trace, kammer B) Svar å tillegg av ADP. Rød spor tilsvarer kammeret A og grønne spor tilsvarer kammeret B under samme eksperimentet. Rød sporingen ble Hentet fra thoraxes tilstrekkelig permeabilized mens grønne sporingen ble innhentet etter overdrevet rive vev under permeabilization. Når ADP legges, en økning i oksygen forbruket er ventet, som røde sporingen. OXPHOS kobling prosenter beregnes som CI-OXPHOS/CI-lekkasje og presenteres i diagrammet. En ratio på mindre enn 6.0 i Drosophila foreslår et problem i mitokondrie koblingen og er karakteristisk for eksempel degradering eller mitokondrie dysfunksjon representert av grønne spor. Pyr: pyruvate; mal: malate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Representant spor av et gyldig (rød spor kammer A) og utilstrekkelig (grønn trace, kammer B) svar på tillegg av cytochrome c. Rød spor tilsvarer kammeret A og grønne spor tilsvarer kammeret B under samme eksperimentet. Rød spor er Hentet fra thoraxes tilstrekkelig permeabilized og behandlet, mens grønne sporingen ble innhentet etter thoraxes var med hensikt tørket i lengre tid på absorberende overflaten før veier. Cytochrome c øke ikke vanligvis mitokondrie oksygenforbruk, sett på rød sporingen, angir at den ytre mitokondrie membranen intakt. Hvis imidlertid tillegg av eksogene cytochrome c øker betraktelig mitokondrie oksygenforbruk på mer enn 15%, sett på grønne spor, antyder det at ytre mitokondrie membranen er skadet og dermed at prøven er degradert og bør være forkastet. Pyr: pyruvate; mal: malate; Cyt c: cytochrome c. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Representant spor av mitokondrie oksygen konsentrasjon (blå trace) og forbruk (rød trace) etter Serine FCCP. Forskjellige injeksjoner av FCCP i flere konsentrasjoner må nøye utført for å avgjøre den maksimal oksygenforbruk utløst av denne uncoupler. Utilstrekkelig konsentrasjoner tillater ikke vurdering av maksimalt oksygenopptak og er preget av ingen-stabile åndedrett priser, mens FCCP overflødig hemmer mitokondrie oksygenforbruk. Piler betegne forskjellige injeksjoner av FCCP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Reproduserbarhet av mitokondrie oksygenforbruk priser under en typisk eksperiment får forskjellige kinesere (rød spor, kammer A, grønne spor, kammer B) av en respirometer. Rød spor tilsvarer kammeret A og grønne spor tilsvarer kammeret B, i samme eksperimentere med Drosophila fra samme alder, sex, belastning og oppvokst på samme diett, samt protokollen beskrevet. Begge eksemplene var normalisert med masse tørr vev veide som beskrevet i protokollen (0.53 og 0,66 mg for kamre A og B, henholdsvis). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En metode for eksempel forberedelse før målinger av mitokondrie oksygenforbruk i Drosophila er beskrevet i denne studien. Denne metoden ble utviklet for å overvinne ulike problemer knyttet til protokoller med mitokondrie isolasjoner, spesielt når det gjelder varighet og antall personer som kreves. I stedet for å arbeide med mitokondrie isolasjoner vanligvis krever store mengder vev fra flere personer, utføres dette eksperimentet på permeabilized muskel fiber fra thoraxes av noen Drosophila. I denne protokollen for bare tre personer å vise optimale resultater. Måling av mitokondrie oksygenforbruk på ulike tidspunkt er derfor mulig som det er mer oppnåelig for å synkronisere en mindre fluer har samme aldersgruppe og samme kjønn.
Først er det viktig å bruke Drosophila av samme alder, kjønn, belastning og oppvokst i samme vilkår å få lav variasjon i resultatene (figur 6), som åndedrett kan endres med alderen, kjønn, genotype og diett fluene. Det viktigste trinnet i utførelsen av denne protokollen er permeabilization prosedyren for thoraxes. Det er svært viktig å fortsette raskt å unngå nedbrytning av vev, og det er også viktig å sørge for at thoraxes er godt permeabilized for å ha maksimal utbredelsen av oksygenforbruk. Å sikre at permeabilization blitt utført riktig og at mitokondrier strukturelle og funksjonelle integritet beholdes etter permeabilization, OXPHOS kobling forholdet (CI-OXPHOS/CI-lekkasje, Figur 3), samt svar på cytochrome c (Figur 4) brukes som kvalitetskontroll. Det er en hestekreftene ta hensyn mellom arbeider raskt og sørge for at permeabilization er godt utført. Det er også viktig å alltid jobbe med is når du manipulerer de dissekert thoraxes. For å få mest reproduserbar resultatene (figur 6), homogen permeabilization er nødvendig og praktisere teknikken for permeabilization bidrar til å sikre at de samme bevegelsene gjentas. Et annet viktig skritt er fastsettelse av tørrvekt av prøven. Faktisk, etter thoraxes er ruges, de er veldig følsom, skjøre og utsatt for degradering. Derfor tilsvarende er permeabilization, raskt fortsetter til fastsettelse av tørr vekt viktig. På den annen side, er det viktig å fastslå vekten med nøyaktighet som resultatene er normalisert av massen av vev. Antall thoraxes brukt kan også optimeres. Protokollen kan tilpasses for å bruke en enkelt thorax per kammer35, men en viss oppløsning kan gå tapt i måling av oksygenforbruk som i fastsettelse av tørr vekt. Antall thoraxes kan økes hvis nødvendig, men det er viktig å merke seg at mer mitokondrier i utvalget, jo høyere oksygenforbruk og chambers må derfor være reoxygenated. Denne reoxygenation kan gjøres ved å åpne chambers og injisere oksygen, men det vil øke sannsynligheten for å sette luftbobler i kammeret. Derfor, hvis mulig, prøv å unngå å reoxygenate kamrene (bortsett fra når komplekse IV maksimal åndedrett kapasitet har bestemmes). Før du kjører eksperimenter, er optimalisering av underlaget konsentrasjoner også nødvendig for å oppnå den høyeste mitokondrie oksygenforbruk uten observere hemmende virkninger som følge av en overdreven konsentrasjon. Kamrene av respirometer også må rengjøres grundig for å unngå potensielle forurensing. Det er viktig å starte rengjøringen med distillated vann og deretter 70% etanol å kvitte seg med potensielle biologiske forurensing. Etter dette, en inkubasjon i absolutt etanol i 10 min anbefales å unngå forurensning av hydrofobe hemmere. Til slutt vil skylling kamrene med distillated vann og fylle dem med 70% etanol unngå potensielle forurensing til neste utnyttelse.
Protokollen kan enkelt endres for å studere effekten av enten andre underlag eller annen hemmere. For eksempel er en interessant protein å studere mitokondrie pyruvate bærer (MPC). Rollen av dette proteinet er å transportere pyruvate generert i stoffer inn i mitokondrie matrix. Nylig har det vært foreslått for å spille en viktig rolle i modulering av stoffskifte under patologiske forhold som under type 2 diabetes38. For å studere effekten av protein MPC på mitokondrie metabolismen, er det nyttig å starte injeksjoner med pyruvate bare i stedet for pyruvate og malate samtidig. Dermed er effekten av pyruvate studert uavhengig effekten av malate, som sistnevnte injiseres bare støtter tricarboxylic syre syklusen og sikre at mellomprodukter ikke er tømt. Det er også mulig å bruke hemmere av MPC39 for å vurdere om en begrensning av dette transporter i stedet for oksidasjon av pyruvate er observert. Så, ville det være mulig å observere en potensiell endring i den foretrukne drivstoff kilden for åndedrett40. Det er også mulig å utelate noen underlag for å forenkle protokollen hvis det ikke er relevant for studier. For eksempel for å studere en dysfunksjon av komplekset jeg bare, det er ikke nødvendig å bruke alle underlag som er presentert i denne protokollen.
Denne protokollen gir noen begrensninger som avlede fra i vivo forhold. Målinger av mitokondrie oksygenforbruk registreres når åndedrett mediet er over luften-metning, som ren oksygen injiseres for å unngå begrensning av oksygen spredningen i vevet30. Videre er konsentrasjonen av underlag injisert i overkant, som ikke er reflektere i vivo betingelsene. Det er også viktig å merke seg at alder, sex, belastning og diett av Drosophila kan påvirke resultatene. Disse parameterne er derfor tas i betraktning når tolke resultatene. Denne metoden er imidlertid nærmere fysiologiske forhold enn ved hjelp av mitokondrie isolasjoner måle mitokondrie oksygenforbruk, i samspill med andre cellulære komponenter og den strukturelle integriteten til mitokondrier og morfologi er bevart31. Det er viktig å merke seg at mitokondrie isolasjoner er mer fordelaktig når flere parametere som ROS produksjon eller mitokondrie effektivitet (P/O ratio) må være målt27.
Denne metoden kan brukes til å oppnå forskjellige mål, alt fra forståelsen av mitokondrie dysfunksjoner og de underliggende mekanismene av metabolske sykdommer, til testing av ulike forbindelser på mitokondrie funksjoner under patologisk forhold. Videre kan det brukes til å observere effekten av flere miljømessige påkjenninger på mitokondrie metabolismen, for eksempel endringer i kosthold eller temperatur. Det er for eksempel mulig å studere effektiviteten av bioaktive syntetiske molekyler på mitokondrie funksjoner og i behandling av mitokondrie dysfunksjoner. Denne metoden er også et godt redskap å studere mitokondrie funksjonene på forskjellige tidspunkt, noe som gjør det svært relevant for studiet av de grunnleggende mekanismene knyttet til aldringsprosessen. Vurdering av mitokondrie metabolisme via oksygenforbruk ved hjelp av permeabilized thoraxes vil sikkert hjelpe til bedre vår kunnskap om rollen til mitokondrie metabolisme når cellen er utsatt for utfordrende forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert av tilskudd fra National Sciences og Engineering Research Council (NSERC, oppdagelsen grant) og Université de Moncton til NP. LHB ønsker å erkjenne finansiering støtte fra Canadian Institute of Health Research (CIHR), New Brunswick innovasjon Foundation (NBIF) og Université de Moncton. Arbeidet med EHC støttes av Alzheimers Society of Canada, hjernen Canada, NSERC, kanadiske Breast Cancer Foundation, New Brunswick innovasjon Foundation, New Brunswick Health Research Foundation og Université de Moncton.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Fine-tipped antimagnetic forceps | VWR | 82027-400 | |
| Secura225D-1S-DQE | Sartorius AG, Goettingen, Germany | Semi-micro balance (distributed by several companies) |
|
| Drosophila melanogaster wild-type w1118 | Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA | Storage Condition: 24 °C |
|
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA Storage Condition: RT |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | Storage Condition: RT |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Storage Condition: -20 °C |
| MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | Storage Condition: RT |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Storage Condition: RT |
| Na2Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | Storage Condition: -20 °C |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | Storage Condition: RT |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Storage Condition: 2-8 °C |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | Storage Condition: RT |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 | Saponin Storage Condition: RT Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily. |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | Storage Condition: RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | Storage Condition: RT |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Storage Condition: RT |
| BSA | Sigma-Aldrich | 05470 | Storage Condition: 2-8 °C |
| Na2S2O4 | Sigma-Aldrich | 157953 | Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Pyruvate Storage Condition: 2-8 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily. |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Malate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C. |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A5285 | ADP Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C. |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | Cytochrome c Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Proline Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | Succinate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C. |
| sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt | Sigma-Aldrich | G7886 | Glycerol-3-phosphate Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C. |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C. |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C. |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily. |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C. |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | TMPD Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Ascorbate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
References
- Stephenson, R., Metcalfe, N. H. Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use. The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).
- Morgan, T. H. An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila. Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).
- Dobzhansky, T., Wright, S. Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura. Genetics. 26 (1), 23-51 (1941).
- Zipursky, S. L., Rubin, G. M. Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).
- Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease. The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).
- Blandini, F., Armentero, M. T. Animal models of Parkinson's disease. FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).
- Baker, K. D., Thummel, C. S. Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila. Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).
- Morris, S. N. S., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).
- Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).
- Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T.
- Szibor, M., Holtz, J.
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- López-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. Mitochondrial biogenesis and healthy aging. Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).
- Muoio, D. M. Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock. Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).
- Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M.
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).
- McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. "Alternative" fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).
- Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production. PLOS ONE. 10 (3), e0120600 (2015).
- Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor. Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).
- Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333 (2016).
- Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster. The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).
- Miwa, S., Brand, M. D. The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).
- Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).
- Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria. Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).
- Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males. Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).
- Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., Côté, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies. Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways. Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).
- Bender, T., Martinou, J. C. The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- McCommis, K., et al. An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion. Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).
