Summary
Bu yazıda, oksijen tüketimi yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri Drosophila permeabilized thoraxes içinde kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu teknik doku klasik mitokondrial yalıtım tekniği için karşılaştırıldığında çok az bir miktar gerektirir ve elde edilen sonuçlar daha fizyolojik ilgilidir.
Abstract
Meyve sineği Drosophila melanogaster, metabolizma incelenmesi için gelişmekte olan bir modeli temsil eder. Nitekim, drosophila yapıları için insan organlarını homolog var, son derece korunmuş metabolik yollar sahip ve farklı temel mekanizmaları çalışmanın kısa bir süre içinde sağlar nispeten kısa bir ömrü var. Ancak, bir hücre metabolizması, mitokondrial solunum için gerekli mekanizmaları iyice bu modelde araştırmış değil ki şaşırtıcı olduğunu. Çünkü Drosophila mitokondrial solunum ölçüsü genellikle bireylerin çok sayıda gerektirir ve elde edilen sonuçlar son derece tekrarlanabilir değildir muhtemeldir. Burada, hassas ölçüm Drosophila dokudan en az miktarda kullanarak mitokondrial oksijen tüketimi sağlayan bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntemde, thoraxes disseke ve hem keskin Forseps ile mekanik ve kimyasal olarak farklı bileşikleri hücre zarı geçmek ve mitokondrial solunum modüle izin saponin ile permeabilized. Permeabilization sonra bir uncoupler ve birkaç inhibitörleri onların yanıt yanı sıra farklı yüzeylerde, okside için farklı kompleksler elektron taşıma sistemi (ETS) kapasitesini değerlendirmek için bir iletişim kuralı gerçekleştirilir. Bu yöntem olarak daha fizyolojik ilgili çünkü mitokondri hala hücresel diğer bileşenlerle etkileşim vardır ve mitokondrial Morfoloji korunmuş mitokondrial izolasyonları, kullanma yöntemlerine göre birçok avantajı sunuyor. Ayrıca, örnek hazırlıklar daha hızlı, ve elde edilen sonuçlar son derece tekrarlanabilir. Metabolizma çalışma ile mitokondrial solunum değerlendirilmesi için bir model olarak Drosophila avantajları birleştirerek, önemli yeni bir bilgi-ebilmek var olmak örtüsünü açmak, özellikle ne zaman sinekler karşılaşan farklı çevresel veya patofizyolojik koşullar.
Introduction
Meyve sineği Drosophila melanogaster, bir model organizma genetik araştırma için bir yüzyıl1kullanılmıştır. Bu organizma çalışmanın yalnızca önemli temel bilgi sex-linked miras2, mutasyon oranı3, sinir sisteminin geliştirilmesi ve hücre kader tayini4hakkında yol açmıştır değil ama aynı zamanda son zamanlarda ortaya çıkmıştır bir 5,6Alzheimer ve Parkinson gibi çeşitli hastalıklara doğal mekanizmaları incelemek için değerli bir araç. Ayrıca, yaşlanma sürecini çalışma boşluğunda büyük numara kısa bir süre içinde yükseltilebilir ve kısa bir ömrü var gibi popüler modelidir. Onlar da bir kalp, oenocytes (hepatosit benzeri hücreleri), yağ (karaciğer ve beyaz yağ dokusu benzer şekilde işleyen) organları, insülin üreten hücreleri (β-pankreas hücreleri eşdeğeri), gibi insan organlarını homolog yapılara sahip yanı sıra metabolitler (omurgalılar kan için benzer)7taşıma hemolymph. Ayrıca, ara metabolizma (insülin/İnsülin benzeri büyüme faktörü benzeri sinyal yolu ve hedef Rapamycin-TOR yolları dahil olmak üzere) Merkezi yollar da son derece korunmuş7vardır. Bu nedenlerden dolayı Drosophila son zamanlarda istismar metabolizmasında, patolojik koşulları diyabet8gibi insan metabolik hastalıklar için doğal özellikle kontrol temel mekanizmaları açıklamak için. Metabolizma bir büyük mitokondri ATP üretimi, oksidatif fosforilasyon süreci (OXPHOS) ile birden çok yolları entegre ve hayatın en önemli biyolojik işlevlerden birini gerçekleştiren bileşendir. Organizmanın metabolizma onların merkezi rolü göz önüne alındığında, mitokondriyal işlev bozuklukları Parkinson9 ve Alzheimer hastalıkları10gibi birçok hastalığın yanı sıra amyotrofik lateral skleroz katılmaktadırlar şaşırtıcı değil. 11 , 12. onlar da yaşlanma sürecini temel belirleyicileri bulunmaktadır. Nitekim, hücresinde, hücre-oksidatif hasar11yüksek konsantrasyon, zararlı olabilen Reaktif oksijen türleri (ROS) ana ürete ülkelerdir. Yaşlanma da zarar görmüş veya mutasyona uğramış mitokondrial DNA13, mitophagy işlev bozuklukları14,15 yanı sıra mitokondrial Biyogenez16bozulma birikimi ilişkili olduğu düşünülmektedir. Onlar-ebilmek kullanmak belgili tanımlık bolluk ya da kıtlık macronutrients17,18göre çeşitli hücresel fonksiyonları ayarlamak için farklı yüzeylerde gibi mitokondri anahtar hücrenin homeostazı belirleyicileri de vardır.
Gerçekten de, diyet (karbonhidratlar, yağlar ve proteinler) farklı besinleri sindirmek, emilir ve hücrelere taşınan. O zaman içinde sitozol dönüştürülür ve türetilmiş yüzeylerde NADH ve FADH219gibi azalan bakiyeli eşdeğerleri nerede ürettikleri mitokondrial matris içine taşınır. Bu azalan bakiyeli eşdeğerleri sonra elektron taşıma sistemi (ETS) farklı enzimatik kompleksleri tarafından okside. Bu komplekslerin mitokondriyal iç zar gibi karmaşık katıştırılır ben ve karmaşık II. Ayrıca, mitokondrial gliserol-3-fosfat dehidrogenaz ve prolin dehidrojenaz gibi enzimatik diğer kompleksler elektron girileceği alternatif rotalar ETS20,21temsil eder. 'Alternatif' Bu komplekslerin böcekler, özellikle önemlidir olarak tür göre onlar aktif olarak solunum20,22,23,21artırmak için katılabilir. Besleme sistemleri bu ETS elektron ubiquinone ve daha sonra karmaşık III ve sonra için karmaşık IV, son alıcısı, moleküler oksijen kadar aktarılır. Bu elektron transferi karmaşık V (şekil 1), ATP ADP fosforilasyon giderken iç mitokondri zar arasında bir proton-güdü güç oluşturur. Mitokondri içinde hücrenin Homeostazı, mitokondriyal metabolizma ilgili modeli D. melanogaster temsil kullanarak eğitim merkezi rolü çeşitli temel mekanizmaları betimlemek için güçlü bir araç patofizyolojik dikkate alınarak koşullar veya hücresel ve çevresel stres altında. Şaşırtıcı ancak, çalışmalar sadece bir avuç aslında Drosophila24,25,26mitokondrial solunum ölçülür. Nitekim, mitokondrial oksijen tüketimi değerlendirmek amaçlayan deneyler mitokondri yalıtımı. Farklı mitokondrial işlevleri (örneğin, ROS üretim veya P/O oranına işaret mitokondrial verimliliği27,28) ölçümü için avantajlı olmasına rağmen bu izolasyonların genel olarak oldukça büyük miktarda gerektirir dokusunun birkaç bireyler24,29. Önemli bir sınırlayıcı faktör, özellikle tüm kişiler aynı yaşta olmalıdır dikkate alınarak ve tercihen deneyler için aynı Cinsiyeti, solunum farklı zamanda ölçüsü yapım yüksek miktarda doku ve bireyler için bu gereklidir En iyi ihtimalle zahmetli işaret eder. Mitokondrial izolasyonların mitokondriyal metabolizma yöneten temel mekanizmaları önemli içgörü sağlayabilir, Ayrıca, mitokondri ayırmak için kullanılan yöntemleri yinelenebilir sonuçları elde etmek için zorluk gibi çeşitli dezavantajları vardır , bozulma mitokondrial ağın ve değişiklik mitokondri yapısı ve fonksiyonu29,30,31.
Bu çalışmada dokudan çok kaç kişi en az bir miktarda kullanarak Drosophila mitokondrial oksijen tüketimini ölçmek için sağlam bir protokolü sunmaktır. Bu iletişim kuralı mitokondrial oksijen tüketimi in situ permeabilized kas lifleri29 Drosophila thoraxes üzerinden yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri32,33, ile birlikte kullanarak ölçme oluşur 34 , 35. bu yöntem aynı zamanda diğer bileşenlerle etkileşimleri hücrenin de mitokondri yapısı ve fonksiyonu daha içinde korunur gibi permeabilized bu yana klasik mitokondrial izolasyon yöntemine göre ek avantajları vardır Bu yaklaşım daha fizyolojik ilgili yapan lifleri29,31,36. Bu iletişim kuralıyla, mitokondriyal işlev doğru yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri Drosophila, sadece üç thoraxes içinde oksijen tüketimi belirlenmesi ETS birkaç farklı adımları izin yüzeyler ile değerendirilmek. Bu nedenle, bu iletişim kuralını Drosophila modeli yararlanarak metabolizma birçok çevresel veya patofizyolojik durum bağlamında kontrol temel mekanizmaları hakkında önemli sorulara cevap yardımcı olabilir.
ETS birkaç farklı adımlar oksijen tüketimini ölçmek ve ne kadar farklı yüzeylerde değerlendirmek için katkıda solunum, farklı yüzeylerde (şekil 1), uncoupler ve inhibitörleri vardır kullanılan30 sonra permeabilization doku. Özellikle, farklı yüzeylerde sıralı eklemeler elektronları ETS farklı kompleksleri ile giriş uyarmak için yapılır. Bir uncoupler karbonil siyanür 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), sonra sigara birleştiğinde solunum ölçmek için en uygun konsantrasyonu ekledi, Yani, sigara phosphorylating solunum maksimal oksijen tüketimi teşvik. Sıralı engellemeler konut projeleri ı, II ve III sonra sigara-ETS oksidasyon tepkiler nedeniyle kalan oksijen tüketimini izlemek için gerçekleştirilir. Son olarak, karmaşık IV maksimal solunum kapasitesi N, N, N iğne ile değerlendirilebilir ', N, - Tetramethyl - p-boya (TMPD), bir yapay elektron sağlayıcı ve askorbat. Ondan beri onun'hangi sinekler yetiştirilir sıcaklık deneyleri 24 °C yürütülen unutmamak gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. reaktifler hazırlık
- Aşağıdaki çözümleri diseksiyon ve permeabilization doku için hazırlayın.
- Koruma çözüm hazırlamak: 2.77 mM CaK2EGTA, 7.23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6.56 mM MgCl2, 20 mM taurin, 15 mM Na2phosphocreatine, 20 mM imidazole, 0,5 mM dithiothreitol ve 50 mM K-MES, pH 7.1 (saklanabilir -20 ° C'de).
- Saponin çözüm hazırlamak: saponin koruma çözümü 1 ml 5 mg (taze günlük hazırlamak).
- Aşağıdaki çözümleri Solunum ölçüm için hazırlayın.
- Solunum orta hazırlamak: 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 3 mM HEPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2ve % 0,2 BSA (w/v), pH 7.2.
- Hazırlamak yüzeylerde, uncoupler, inhibitörleri. H2O tüm yüzeylerde dağıtılması ve uncoupler FCCP yanı sıra inhibitörleri (malonat H2O seyreltilmiş) dışında mutlak etanol içinde çözülür. En yüzeylerde hem de malonat ( Tablo malzemelerigörmek) etkisiz hale getirin. Tüm konsantrasyonları iletişim kuralında verilen 2 mL Odaları içinde son konsantrasyonları vardır.
2. hazırlık ve yüksek çözünürlüklü Respirometer kalibrasyonu.
- Chambers, kapaklar ve stoper respirometer % 70 etanol ile üç kez ve üç kez distile su ile yıkayın.
- Sıfır oksijen konsantrasyonu kalibre: solunum orta odalarında 2.3 mL damlalıklı ve 10 mg sodyum dithionite ekleyin. Odası maksimum hacmi 2 mL olsa da, 2.3 mL hiçbir hava kabarcığı odaları kapatırken tıpa altında kalmasını sağlamak için eklenir. Chambers stoper ile kapatın ve oksijen konsantrasyonu 10-20 dk. Ayarla'ya elektrotlar, sıfır oksijen konsantrasyonu ile elde edilen oksijen tüketim oranını ölçmek.
- Odaları distillated su ile yıkama, 10 min için mutlak etanol içinde kuluçkaya ve sonra distile su ile durulayın.
- Hava doygunluk ayarlama: solunum orta odalarında, 2.3 mL damlalıklı stoper yerleştirin, stoper üstüne fazla orta Aspire edin ve daha sonra stoper rondela ile kaldırın. Aşırı solunum orta odasında (2 mL toplam hacmi) odaları kapattıktan sonra hava kabarcıkları varlığı önlemek için pipetted.
- 45 dk kadar oksijen konsantrasyonu (Mavi izle) 250 istikrarlı bir saat için oksijen tüketimini izlemek 24 ° C'de nM
3. diseksiyon sinekler ve doku Permeabilization
- Buz üzerinde gerçekleştirilen tüm adımlar emin olun.
- Altı erkek sinek aynı baskı uyuşturan, aynı yaş ve aynı diyet (vahşi tipi w1118, 15 günlükken, Mısır unu ortamda beslenen) Sineklerin Tanrısı disseksiyon kolaylaştırmak için buz üzerinde büyüdü.
- Bir neşter ve ince uçlu forseps kullanarak, (başkanları ve abdomens kaldırmak) sinekler sadece uçuş kasları içeren thoraxes tutmak için incelemek. Bu adım-ebilmek kılınmak çıplak gözle. Elde edilen thoraxes ince uçlu Forseps ile başa.
- Üç disseke thoraxes 25 mm 2 mL forseps kullanarak buz gibi koruma çözeltisi içeren Petri kabına aktarın.
- İnce uçlu Forseps ile mekanik forseps ucu thoraxes ekleyerek thoraxes permeabilize ve art arda gevşek bağlı ağı elde etmek için doku altını üstüne getirin.
- 24-şey tabak içinde iki kuyu 12.5 µL saponin çözüm ve 1 mL saponin 62.5 µg/mL nihai bir konsantrasyon elde etmek için koruma çözeltisi ile doldurun. İki bitişik wells solunum orta 1 mL ile doldurulması.
- İnce uçlu Forseps ile seyreltilmiş saponin çözüm içine üç permeabilized thoraxes transfer ve üzerinde bir orbital Çalkalayıcı, buz üzerinde 20 dk hafif ajitasyon ile kuluçkaya.
- Sonra ikinci kuluçka, lifler buzda saponin durulama 5 min için hafif ajitasyon ile solunum orta dolu bitişik kuyu içine aktarın.
4. kuru ağırlığı tayini
- Emici bir yüzeyi permeabilized thoraxes kuru ve 3 - 4 kez tüm nem kaldırılır emin olmak için ince uçlu forseps kullanarak ters çevirin.
- Üç thoraxes birlikte bir microbalance üzerinde tartın. Mitokondrial oksijen tüketim oranları normalleştirmek için kullanılacak elde edilen ağırlık not edin.
- Solunum orta bir damla ve dokularda hemen buza aktarın.
5. oksijen tüketim oranları belirlenmesi
- Respirometer odaları açın (stoper kaldırmak) ve 10 mM pyruvate ve malat 2 mM her odanın içine ekleyin.
- Permeabilized dokuları doğrudan solunum orta ile dolu odaları içine ekleyin.
- Stoper spacer kullanarak değiştirin.
- 60 mL şırınga ile oksijen doğrudan bir oksijen tankından toplamak ve 2-5 mL oksijen tıpa kılcal Oksijen difüzyon yoluyla doku oksijen tüketimini sınırlamak değil emin olmak için her odası yoluyla enjekte.
- Bir Hamilton şırınga thoraxes odasında kalır emin olmak için her tıpa kılcal takın.
- Oksijen konsantrasyonu yaklaşık 400 olduğunda odaları tamamen kapatmak nM, hava doygunluk oksijen seviyeleri elde (yaklaşık %160 hava doygunluk) Odalar içinde.
- Durdurun ve hava kabarcıkları odalarında denetlemek için karıştırıcı başlatın.
- Daha önce kitle özgü oksijen tüketimi (pmol O2 consumed.s-1.mg-1 doku) görüntüleme solunum oranları doku (mg), kitle tarafından normalize etmek tartılır doku kütlesi girin.
- Oksijen tüketimi (kırmızı izle) stabil bir kez, 5 mM ADP Hamilton şırınga ile ekleyin.
- Şırınga ile distile su, % 70 etanol, her enjeksiyon sonra durulama ve tekrar distile su.
- Oksijen tüketimi daha istikrarlı bir kez, 4 mm sitokrom c 5 µL enjekte et.
- ETS mitokondrial oksijen tüketimi farklı adımları değerlendirmek için aşağıdaki yüzeylerde sıralı enjeksiyon için devam edin:
- 2 M prolin 5 µL ekleyin.
- 1 M süksinat 10 µL ekleyin.
- Bir 1 M gliserol-3-fosfat 30 µL ekleyin.
- Titrasyon şekilde uncoupler FCCP 0.5-1 adımlarla enjekte µM (1 mM çözüm 2 µL) en iyi toplama kadar olduğunu ulaştı, Yani, en yüksek oksijen tüketimi inhibisyon mümkün ulaşmak için konsantrasyon (dikkat: tablo bkz: malzemelerin).
- Ardışık olarak tamamen kalan oksijen tüketimi (ROX) ölçmek için ETS elektron akı etkisizleştirmek için aşağıdaki inhibitörü enjekte Siklooksijenaz reaksiyonlar diğerleri arasında gibi yani sigara-solunum reaksiyonları:
- 1 mM rotenon 1 µL ekleyin (dikkat: Tablo malzemelerigörmek).
- 2 M malonat 5 µL ekleyin (dikkat: Tablo malzemelerigörmek).
- 5 mM antimycin A 1 µL ekleyin (dikkat: Tablo malzemelerigörmek).
- 0.2 mM askorbat ve 0,5 karmaşık IV oksijen tüketimi ölçmek için askorbat ile başlayan mM TMPD Odaları, sırayla içine ekleyin.
- Karmaşık IV etkisizleştirmek için sodyum azid 20 mM ekleyin (dikkat: Tablo malzemelerigörmek).
- Sinyal sabit olduğunda, odaları rondela ile açık odaları 2 mL saf oksijen enjekte edilerek yeniden oksijen ve konsantrasyonu etrafta olduğunda odaları yakın 250-300 nmol.mL-1.
- 10-15 dk işaretimi ölçmek ve kimyasal arka planda, Yani, TMPD autoxidation nedeniyle oksijen tüketimini hesaplamak.
6. Respirometer temizlik
- Ölçümler sonra bir kez chambers distile su ile durulayın ve odalarında üç kez % 70 etanol durulayın.
- İnhibitörleri devre dışı bırakabilirsiniz için 10 dakika için mutlak etanol içinde kuluçkaya.
- Üç kez distile su ile durulayın, odaları ile % 70 etanol doldurmak ve Tıpalar ve kapaklar sonraki kullanımı kadar değiştirebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokolünü kullanarak mitokondrial oksijen tüketimi temsilcisi bir iz Şekil 2' de verilmiştir. Pyruvate ve odalarında permeabilized kas lifleri ile birlikte enjekte malat denir ne zaman karmaşık ben ETS tarafından uyarılır NADH pyruvate ve malat yolu ile oksidasyon yoluyla üretilen CI-sızıntı solunum için Yani, tricarboxylic asit döngüsü (CI). Bu solunum hızı sırasında mitokondrial oksijen çoğunlukla proton sızıntı için Yani, ATP sentaz etkin (kaçak)30olduğunda intermembrane uzaydan mitokondrial matris için geçiş proton telafi etmek için korunur. ADP eklendiğinde, ATP sentaz etkinleştirilir ve elektron transfer edilir karmaşık ben karmaşık IV ADP eşzamanlı fosforilasyon ATP (CI-OXPHOS), içine ile sonuçlanan mitokondrial oksijen tüketimi arttı. OXPHOS kaplin oranı CI-OXPHOS/CI-kaçak hesaplanır ve genellikle bir iyi göstergesi mitokondrial kalite ve mitokondrial kaplin30olarak alınır. Drosophila, bu oran en az 6.0 (şekil 3) fazla olmamalıdır. Bu değerin altında ise, doku hazırlanması veya mitokondrial disfonksiyon ilgili bir sorunu gösteriyor. Sitokrom c dış mitokondrial membran bütünlüğü tayini sağlar ve bu nedenle hazırlık (şekil 4) bir kalite kontrolünü kullanılır. Nitekim, sitokrom c iç mitokondrial membran için gevşek bağlı ve dış mitokondrial membran permeabilization işlemi sırasında hasar görmüşse genellikle uzakta yıkanır. Sonuç olarak, eksojen sitokrom c ekleme önemli ölçüde oksijen tüketimi dış mitokondrial membran oluşmuşsa ve endojen sitokrom c kaybolur artacaktır. Daha az oksijen tüketimi (şekil 4) 10-%15 artış genellikle uygun dış mitokondrial membran29bütünlüğünü göstermektedir. Şekil 3 ve 4, yeşil izleri elde yeterli olmayan permeabilization ve işleme örnekleri (aşırı doku şekil 3için yırtılma ve sonra şekil 4için emici yüzeyi daha uzun bir süre asılı) Kırmızı izler temsil yeterince permeabilized ve ele örnek ise. Bu sonuçlar uygun permeabilization koşulların mitokondrial oksijen tüketimi güvenilir değerlendirilmesi için çok önemli olduğunu vurgulamak.
Deneyler sırasında kullanılan aşağıdaki yüzeylerde ubiquinone için elektron sağlamak ve elektron akı ETS artırmak için izin verdi. Prolin, enerji substrat böcekler23başta olmak üzere, aynı zamanda memelilerde olarak akut açlık veya patolojik koşulları37sırasında kullanılabilir bir amino asittir. Elektron akan her iki karmaşık ben ve ProDH ve OXPHOS işlemi (CI + ProDH-OXPHOS) üyesi olan eklenmesi prolin odalarında prolin dehidrogenaz (ProDH) katkısını değerlendirmek için ETS elektron akı için sağlar. Süksinat eklenmesiyle, ETS için karmaşık II (süksinat dehidrogenaz) katkısı (CI + ProDH + CII-OXPHOS) görülebilir. Gliserol-3-fosfat (G3P), enjeksiyon daha fazla bu substrat gliserofosfat Servisi ve transfer parçası olan mitokondrial gliserol-3-fosfat dehidrogenaz (G3PDH) uyarır gibi mitokondrial oksijen tüketimi artar elektronları ETS (CI + ProDH + CII + G3PDH-OXPHOS) için. Her ikisi ProDH ve G3PDH özellikle böcekler birkaç tür etkin olduğu gösterilmiştir ve bu nedenle bunlar önemli bu iletişim kuralıyla Drosophila20,21,22,23,32 .
Ne zaman FCCP eklenir, uncoupler sigara birleştiğinde solunum (ETS devlet) elde edilir, Yani, ETS (CI + ProDH + CII + G3P-ETS) maksimum kapasitesini temsil eden maksimal oksijen tüketimi. FCCP karmaşık V aktarmadan intermembrane uzaydan gelen proton mitokondrial matris için aktarımları bir protonophore var. FCCP dikkatle, konsantrasyonları aşağıda sigara maksimal oksijen tüketimi ve kararlı-solunum oranları konsantrasyonları mitokondrial oksijen tüketimi (şekil 5) inhibisyonu içinde optimum sonuç yukarıda iken optimum sonuç olarak titre zorunda. Bir kez yüzeylerde ve uncoupler eklenir, ı, II ve III sırayla olabilir kompleksleri inhibisyonu rotenon, malonat ve antimycin A, sırasıyla kullanılarak gerçekleştirilir. Kullanılan her inhibitörü ile mitokondrial oksijen tüketiminde azalma, antimycin A. ilavesi sonra en düşük oksijen tüketimini erişene dek görülmektedir Sonra tüm inhibitörleri ilavesi kalan oksijen tüketimi30ulaştı. Oksijen tüketimi Siklooksijenaz reaksiyonlar ve reaktif türler üretim gibi sigara mitokondriyal oksidatif reaksiyonlar nedeniyle örneğin temsil eder ve bu nedenle diğer oranları düşülen için ölçülen.
TMPD ölçüm karmaşık IV maksimal solunum kapasitesi sağlayan bütün kompleksleri akıntıya karşı atlayarak doğrudan karmaşık IV için elektron sağlar bir yapay elektron taşıyıcı olduğunu. Autoxidation, eğilimli olmak askorbat sahiptir, bu nedenle önceden sınırı ama tamamen bu autoxidation önlemek için TMPD eklendi, ancak bu substrat dir. TMPD kalan autoxidation için düzeltmek için karmaşık IV inhibitörü sodyum azid odalarına eklenir ve oksijen tüketimi 10-15 dakika sonra kaydedilir. Bu oksijen tüketimi bu nedenle kimyasal arka plan, ya da başka bir deyişle karmaşık IV maksimal solunum kapasitesi hesaplanması için dikkate alınması gereken TMPD autoxidation temsil eder.
Resim 1 . Mitokondrial elektron taşıma elektron taşıma sistemi ve mitokondriyal iç zarda oksidatif fosforilasyon tarafından şematik gösterimi. I: karmaşık ben; II: karmaşık II; III: karmaşık III; IV: karmaşık IV; V: ATP sentaz; Acetyl-CoA: asetil koenzim A; CYT c: sitokrom c; e-: Elektron; G3P: gliserol-3-fosfat; G3PDH: mitokondrial gliserol-3-fosfat dehidrojenaz; H+: proton; PRODH: prolin dehidrogenaz; TCA: tricarboxylic asit döngüsü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Mitokondrial oksijen konsantrasyonu (Mavi izle) ve tüketimi (kırmızı izle) permeabilized thoraxes üzerinde Drosophila temsilcisi izleri. Her enjeksiyon enjekte bileşik gösteren bir ok ile gösterilir (Pyr: pyruvate; mal: malat; ADP; CYT c: sitokrom c; Pro: prolin; Succ: süksinat; G3P: gliserol-3-fosfat; FCCP: karbonil siyanür 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone; Rot: rotenon; Malo: malonat; Karınca A: antimycin A; TMPD: N, N, N', N, - Tetramethyl - p-boya; ASC: askorbat; SAZ: sodyum azid). Her mitokondrial oksijen tüketim oranını, oksijen tüketimi (kırmızı izle) stabilize grafik üzerinde ı ile başlar. Sitokrom c etkisi gösterir dış mitokondrial membran bütünlüğü (metin Ayrıntılar için bakınız). Kalan oksijen tüketimi oksijen tüketimi hücrelerdeki oksidatif yan tepkiler nedeniyle temsil eder ve ölçülen tüm diğer tarifeleri için düşülen zorunda. Kimyasal arka plan TMPD autoxidation nedeniyle sadece oksijen tüketimini gösterir ve karmaşık IV maksimal solunum kapasitesi hesaplanması için dikkate alınması gerekir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Temsilcisi bir geçerli (kırmızı izle, odası A) izleri ve yetersiz (yeşil izle, odası B) yanıt ADP eklenmesi için. Kırmızı izleme odasına A karşılık gelen ve yeşil izleme odasına B, aynı deneme sırasında karşılık gelir. Kırmızı izleme yeşil izleme aşırı permeabilization sırasında dokularda yırtılma sonra elde edildi, ancak yeterli permeabilized thoraxes üzerinden elde edildi. ADP eklendiğinde, kırmızı izleme gibi oksijen tüketiminde bir artış bekleniyor. Oranları kaplin OXPHOS CI-OXPHOS/CI-kaçak hesaplanır ve grafikte sunulmaktadır. Az 6. 0'Drosophila oranında mitokondrial kaplin bir sorunu olduğunu düşünüyorum ve örnek bozulması veya yeşil izleme tarafından temsil edilen mitokondrial disfonksiyon özelliğidir. Pyr: pyruvate; mal: malat. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Temsilcisi bir geçerli (kırmızı izle, odası A) izleri ve yetersiz (yeşil izle, odası B) yanıt sitokrom c eklenmesi için Kırmızı izleme odasına A karşılık gelen ve yeşil izleme odasına B, aynı deneme sırasında karşılık gelir. Thoraxes bilerek ağırlığında önce daha uzun bir süre emici yüzeyi kuru sonra yeşil izleme elde edildi, ancak kırmızı iz yeterince permeabilized ve ele, thoraxes elde edildi. Sitokrom c, dış mitokondrial membran sağlam olduğunu ifade eden kırmızı izleme üzerinde görüldüğü gibi mitokondrial oksijen tüketimi, genellikle artırmaz. Ancak, ayrıca eksojen sitokrom c önemli ölçüde mitokondrial oksijen tüketimi fazla % 15, yeşil izleme üzerinde görüldüğü gibi artarsa, bu dış mitokondrial Membran zarar görmüş ve bu nedenle örnek düşer ve gerektiğini olmak öneriyor atılır. Pyr: pyruvate; mal: malat; CYT c: sitokrom c Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Mitokondrial oksijen konsantrasyonu (Mavi izle) ve tüketimi (kırmızı izle) sonra FCCP titrasyon temsilcisi izleri. FCCP farklı enjeksiyonları çeşitli konsantrasyonlarda dikkatle bu uncoupler tarafından tetiklenen maksimal oksijen tüketimini belirlemek için gerçekleştirilmesi gerekiyor. Yetersiz konsantrasyonları maksimal oksijen tüketimi değerlendirilmesi izin vermez ve FCCP aşırı mitokondrial oksijen tüketimini engeller, ancak kararlı-solunum oranları ile karakterizedir. Oklar FCCP farklı enjeksiyonlari göstermek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Tekrarlanabilirlik mitokondrial oksijen tüketim oranları iki farklı odaları (kırmızı izleme, odası A; yeşil izleme, odası B) bir respirometer kullanarak elde edilen tipik bir deneme sırasında. Kırmızı izleme odasına A karşılık gelen ve yeşil izleme odası B, aynı sırasında aynı yaşından itibaren Drosophila kullanarak deneme, seks, süzün ve aynı diyet yanı sıra açıklanan protokol kaldırdı karşılık gelir. Her iki örnek iletişim kuralında tanımlandığı gibi tartılır kuru doku kütlesi ile normalleştirilmiş (0,53 ve 0,66 mg A ve B, chambers için sırasıyla). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, Drosophila mitokondrial oksijen tüketimi ölçümleri önce numune hazırlama için bir yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem özellikle süresi ve gerekli bireylerin sayısı açısından mitokondriyal izolasyonların kullanarak iletişim kuralları ile ilgili farklı sorunların üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. Mitokondrial izolasyonların genellikle çeşitli bireyler elde edilen dokular, büyük miktarda gerektiren çalışma yerine, bu deney kaç Drosophila thoraxes permeabilized kas lifleri gerçekleştirilir. Bu protokol için sadece üç kişi en iyi sonuçları görüntülemek için ihtiyaç vardır. Bu nedenle, küçük bir grupla aynı yaşta olan uçar ve aynı cinsiyetten eşitlemek için daha ulaşılabilir olduğu gibi çeşitli zaman noktalarda mitokondrial oksijen tüketimi ölçümü mümkündür.
İlk olarak, solunum yaş, cinsiyet, genotip ve diyet "Sineklerin Tanrısı" ile değiştirebilirsiniz olarak Drosophila aynı yaş, cinsiyet, zorlanma, kullanmak önemli ve düşük değişkenliği (şekil 6), sonuçları elde etmek için aynı koşullarda büyüdü. Bu iletişim kuralı yürütülmesinde en önemli adım thoraxes permeabilization işlemdir. Doku bozulması önlemek için hızlı bir şekilde devam etmek çok önemlidir ve thoraxes de oksijen tüketimi maksimum hızları permeabilized emin olmak önemlidir. Permeabilization doğru şekilde sahne aldı ve mitokondri yapısal ve işlevsel bütünlüğü permeabilization sonra oranı (CI-OXPHOS/CI-kaçak, şekil 3), kaplin OXPHOS korunur emin olmak için hem de sitokrom c (şekil 4) yanıt kalite denetimleri kullanılır. Hızla çalışmaya ve permeabilization iyi idam emin arasında dikkate almak için bir tradeoff olduğunu. Her zaman disseke thoraxes işlenirken buz üzerinde çalışmak önemlidir. Homojen permeabilization (şekil 6) en tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için gerekli ve pratik teknik için permeabilization aynı hareketler tekrarlanır emin olmanıza yardımcı olur. Başka bir önemli adım örnek kuru ağırlığının belirlenmesidir. Gerçekten de, thoraxes inkübe sonra çok hassas, kırılgan ve yıkımı eğilimli demektir. Bu nedenle, benzer şekilde permeabilization için Kuru ağırlığı tayini için hızlı bir şekilde devam önemlidir. Öte yandan, sonuçları doku kitle tarafından normalleştirilmiş gibi hassasiyetle ağırlığı belirlemek önemlidir. Kullanılan thoraxes miktarı da getirilebilir. Protokol odası35başına tek bir göğüs kullanmak için adapte edilebilir, ancak çözünürlük belirli bir düzeyde oksijen tüketiminin olduğu kadar Kuru Ağırlık tayini ölçümdeki kaybedebilirdim. Thoraxes miktarı gerekirse artırılabilir, ancak daha fazla mitokondri örnek yüksek oksijen tüketimi ve odaları bu nedenle reoxygenated zorunda kalacak unutmamak gerekir. Bu reoxygenation odaları açarak yapılabilir ve oksijen enjekte, ancak hava kabarcıkları odasında eklemek için olasılığını artıracaktır. Bu nedenle, eğer mümkünse, chambers (dışında belirlenecek karmaşık IV maksimal solunum kapasitesi olduğunda) reoxygenate zorunda kalmamak deneyin. Deneyler çalıştırmadan önce substrat konsantrasyonu duruma getirilmesi de en yüksek mitokondrial oksijen tüketimi aşırı bir konsantrasyon nedeniyle inhibitör etkileri gözlemleyerek olmadan ulaşmak gereklidir. Respirometer odaları da potansiyel contaminations önlemek için iyice temizlenmesi gerekir. Distillated su ve potansiyel biyolojik contaminations kurtulmak için % 70 etanol ile temizlik başlatmak önemlidir. Bu, 10 min için mutlak etanol içinde bir kuluçka takip hidrofobik inhibitörleri kirlenmesini önlemek için tavsiye edilir. Son olarak, odaları distillated su ile durulama ve onları ile % 70 etanol doldurmak potansiyel contaminations kadar sonraki kullanımı önlemek olacaktır.
İletişim kuralı diğer yüzeylerde veya farklı inhibitörleri etkisini incelemek için kolayca değiştirilebilir. Örneğin, çalışma için ilginç bir protein mitokondrial pyruvate taşıyıcı (MPC) dir. Bu protein, mitokondrial Matrix'e sitozol içinde oluşturulan pyruvate taşımak için roldür. Son zamanlarda, tip 2 diyabet38sırasında gibi patolojik koşullarında metabolizmasının modülasyon önemli bir rol oynamaya sürülmüştür. Protein MPC mitokondriyal metabolizma üzerinde etkisini incelemek için aynı anda yalnızca yerine pyruvate ve malat pyruvate enjeksiyonları başlamak yararlıdır. Böylece, ikinci sadece tricarboxylic asit döngüsü destek ve ara ürün değil tükenmiş olan emin olmak için enjekte edilir gibi pyruvate etkisi bağımsız olarak malat, etkisi incelenmiştir. Bu taşıyıcı bir sınırlama yoksa değerlendirmek için MPC39 inhibitörleri kullanmak mümkündür yerine pyruvate oksidasyonunu görülmektedir. Sonra solunum40için tercih edilen yakıt kaynağı potansiyel bir vardiyada gözlemlemek mümkün. Çalışma için alakalı değilse protokol basitleştirmek için bazı yüzeylerde atlamak mümkündür. Örneğin, karmaşık bir fonksiyon bozukluğu çalışmaya ben sadece, bu protokol için sunulan tüm yüzeylerde kullanmak için gerekli değil.
Bu iletişim kuralı in vivo koşullarda aktarma bazı sınırlamalar sunar. Solunum orta hava-doygunluk olduğunda saf oksijen Oksijen difüzyon doku30içinde sınırlandırılmasıdır önlemek için enjekte edilir gibi mitokondrial oksijen tüketimi ölçümleri kaydedilir. Ayrıca, yüzeylerde konsantrasyonları hangi vivo içinde koşullar yansıtan değil aşan, enjekte edilir. Yaş, cinsiyet, zorlanma ve diyet Drosophila sonuçları etkileyebilir unutmamak önemlidir. Bu nedenle ne zaman sonuçlarını yorumlama dikkate alınacak parametreleridir. Bu yöntem diğer hücresel bileşenleri ve mitokondri yapısı ile etkileşimler olarak mitokondriyal oksijen tüketimi ölçmek için mitokondrial izolasyonların kullanarak yöntemlerine göre ancak yakın fizyolojik koşullar olduğunu ve Morfoloji korunmuş31vardır. ROS üretim veya mitokondrial verimliliği (P/O oranı) gibi ölçülen27olmak mitokondrial izolasyonların daha avantajlı ne zaman ek parametreler olduğunu unutmamak gerekir.
Bu yöntem mitokondrial işlevler'in altında patolojik farklı bileşikler etkilerini test için mitokondriyal işlev bozuklukları anlayış ve metabolik hastalıklar, temel mekanizmaları arasında değişen çeşitli hedeflere ulaşmak için kullanılabilir koşullar. Ayrıca, mitokondriyal metabolizma, diyet veya sıcaklık değişiklikleri gibi çeşitli çevresel stresleri etkilerini gözlemlemek için kullanılabilir. Örneğin, biyoaktif sentetik moleküller mitokondrial işlevleri ve mitokondriyal işlev bozuklukları tedavisinde verimliliğini incelemek mümkündür. Bu yöntem da çok ilgili çalışma süreci yaşlanma ile ilgili temel mekanizmaları için yapar mitokondrial işlevleri farklı zaman noktalarda çalışma için iyi bir araçtır. Permeabilized thoraxes kullanarak oksijen tüketimi üzerinden mitokondriyal metabolizma değerlendirmesi kesinlikle hücre zorlu koşullara maruz kaldığında mitokondriyal metabolizma rolü hakkında bilgimizi daha iyi yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada NP Ulusal Bilimler ve mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC, keşif grant) ve Université de Moncton hibe tarafından finanse edildi. LHB Kanada Enstitüsü Sağlık Araştırma (CIHR), New Brunswick yenilik Vakfı (NBIF) ve Université de Moncton finansman desteğinden kabul etmek istiyorum. EHC çalışmalarını Université de Moncton ve Alzheimer Derneği Kanada, beyin Kanada, NSERC, Kanadalı göğüs kanseri Vakfı, New Brunswick yenilik Vakfı, New Brunswick sağlık Araştırmaları Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Fine-tipped antimagnetic forceps | VWR | 82027-400 | |
| Secura225D-1S-DQE | Sartorius AG, Goettingen, Germany | Semi-micro balance (distributed by several companies) |
|
| Drosophila melanogaster wild-type w1118 | Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA | Storage Condition: 24 °C |
|
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA Storage Condition: RT |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | Storage Condition: RT |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Storage Condition: -20 °C |
| MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | Storage Condition: RT |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Storage Condition: RT |
| Na2Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | Storage Condition: -20 °C |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | Storage Condition: RT |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Storage Condition: 2-8 °C |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | Storage Condition: RT |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 | Saponin Storage Condition: RT Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily. |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | Storage Condition: RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | Storage Condition: RT |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Storage Condition: RT |
| BSA | Sigma-Aldrich | 05470 | Storage Condition: 2-8 °C |
| Na2S2O4 | Sigma-Aldrich | 157953 | Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Pyruvate Storage Condition: 2-8 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily. |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Malate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C. |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A5285 | ADP Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C. |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | Cytochrome c Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Proline Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | Succinate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C. |
| sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt | Sigma-Aldrich | G7886 | Glycerol-3-phosphate Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C. |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C. |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C. |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily. |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C. |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | TMPD Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Ascorbate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
References
- Stephenson, R., Metcalfe, N. H. Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use. The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).
- Morgan, T. H. An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila. Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).
- Dobzhansky, T., Wright, S. Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura. Genetics. 26 (1), 23-51 (1941).
- Zipursky, S. L., Rubin, G. M. Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).
- Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease. The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).
- Blandini, F., Armentero, M. T. Animal models of Parkinson's disease. FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).
- Baker, K. D., Thummel, C. S. Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila. Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).
- Morris, S. N. S., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).
- Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).
- Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T.
- Szibor, M., Holtz, J.
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- López-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. Mitochondrial biogenesis and healthy aging. Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).
- Muoio, D. M. Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock. Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).
- Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M.
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).
- McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. "Alternative" fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).
- Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production. PLOS ONE. 10 (3), e0120600 (2015).
- Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor. Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).
- Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333 (2016).
- Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster. The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).
- Miwa, S., Brand, M. D. The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).
- Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).
- Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria. Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).
- Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males. Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).
- Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., Côté, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies. Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways. Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).
- Bender, T., Martinou, J. C. The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- McCommis, K., et al. An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion. Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).
