Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Måling af mitokondrie iltforbrug i Permeabilized fibre fra Drosophila bruger minimale mængder af væv

Published: April 7, 2018 doi: 10.3791/57376
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Département de chimie et biochimie, Université de Moncton, 2Département de biologie, Université de Moncton
* These authors contributed equally

Summary

I dette papir, er der beskrevet en metode til at måle iltforbrug ved hjælp af høj opløsning respirometri i permeabilized thoraxes i Drosophila. Denne teknik kræver en minimal mængde af væv i forhold til den klassiske mitokondrie isolation teknik og de opnåede resultater er mere fysiologisk relevante.

Abstract

Frugtflue, Drosophila melanogaster, repræsenterer en spirende model for studiet af stofskiftet. Faktisk, drosophila har strukturer homologe til menneskelige organer, besidder meget bevaret stofskifteveje og har en relativt kort levetid, der giver mulighed for undersøgelse af forskellige grundlæggende mekanismer i en kort periode. Det er imidlertid overraskende, at en af de mekanismer, der er afgørende for cellulære stofskifte, den mitokondrielle respiration, ikke er blevet grundigt undersøgt i denne model. Det er sandsynligvis fordi foranstaltning af den mitokondrielle respiration i Drosophila kræver som regel et meget stort antal enkeltpersoner og de opnåede resultater er ikke meget reproducerbare. Her, er en metode, der giver den præcise måling af mitokondrie iltforbrug ved hjælp af minimale mængder af væv fra Drosophila beskrevet. I denne metode, er thoraxes dissekeret og permeabilized både mekanisk med skarpe pincet, og kemisk saponin, giver mulighed for forskellige stoffer til at krydse cellemembranen og modulere den mitokondrielle respiration. Efter permeabilization, er en protokol, der udført for at evaluere de forskellige komplekser af elektronen transportsystem (ETS) evne til at oxidere forskellige substrater, samt deres svar på en uncoupler og på flere hæmmere. Denne metode indebærer mange fordele i forhold til metoder ved hjælp af mitokondrie isolering, som det er mere fysiologisk relevante fordi mitokondrier stadig interagerer med andre cellulære komponenter og mitokondriel morfologi er bevaret. Desuden prøve præparater er hurtigere, og de opnåede resultater er yderst reproducerbare. Ved at kombinere fordelene ved Drosophila som en model for studiet af stofskifte med evalueringen af mitokondrie respiration, vigtige nye indsigter kan blive afsløret, især hvor fluerne oplever forskellige miljømæssige eller patofysiologiske betingelser.

Introduction

Bananfluen Drosophila melanogaster, har været brugt som en model organisme for genetisk forskning for over et århundrede1. Studiet af denne organisme har ikke kun ført til betydelig grundlæggende viden om kønsbunden nedarvning2, mutation sats3, udvikling af neurale system og celle skæbne bestemmelse4, men har også for nylig dukket op som en værdifuldt redskab til at studere de mekanismer, der er forbundet med flere sygdomme som Alzheimers og Parkinsons5,6. Derudover er det en populær model til at studere aldringsprocessen, da de kan blive rejst i stort antal over en kort periode og har en kort levetid. De også besidder homolog strukturer til menneskelige organer, som et hjerte, oenocytes (hepatocyt-lignende celler), fedt organer (fungerer på samme måde som den lever og hvidt fedtvæv), insulin producerende celler (svarende til β-pancreas celler), samt den hemolymph transporterer metabolitter (analog med blod fra hvirveldyr)7. Desuden er de centrale veje i formidlende stofskifte (herunder insulin/insulin-lignende vækstfaktor-lignende signalvejen og målet på Rapamycin-TOR veje) også meget bevaret7. Af disse grunde Drosophila er for nylig blevet udnyttet til at beskrive de grundlæggende mekanismer, der styrer stofskiftet, især i patologiske tilstande forbundet med menneskelige metaboliske sygdomme som diabetes8. En større komponent af stofskiftet er mitokondriet, der integrerer flere veje og udfører en af livets mest vigtige biologiske funktioner, ATP produktion, via oxidativ fosforylering proces (OXPHOS). I betragtning af deres centrale rolle i organismes metabolisme er det ikke overraskende, at mitokondriel dysfunktioner er involveret i mange sygdomme som Parkinsons9 og Alzheimers sygdomme10samt Amyotrofisk lateral sklerose 11 , 12. de er også grundlæggende determinanter for aldringsprocessen. De er de største producenter af reaktive ilt arter (ROS) i den celle, som kan være skadelig for cellen i høj koncentration gennem oxidative skader11. Aldring er også blevet forbundet til ophobning af beskadigede eller muterede mitokondriel DNA13, mitophagy dysfunktioner14,15 samt værdiforringelse af mitokondriel Biogenese16. Mitokondrier er også vigtige determinanter af cellens homøostase, som de kan anvende forskellige substrater for at justere flere cellulære funktioner henhold til overflod og knaphed på makronæringsstoffer17,18.

Faktisk, de forskellige næringsstoffer i kosten (kulhydrater, lipider og proteiner) er fordøjet, absorberet og transporteret i cellerne. De er så forvandlet i i cytosol, og de afledte substrater er transporteret ind i mitokondriets matrix, hvor de producerer reducerende ækvivalenter, såsom NADH og FADH219. Disse reducerende ækvivalenter oxideres derefter af forskellige enzymatiske komplekser af elektronen transportsystem (ETS). Disse komplekser er indlejret i den indre membran, som kompleks I og komplekse II. Derudover repræsenterer andre enzymatiske komplekser såsom den mitokondrielle glycerol-3-fosfat dehydrogenase og prolin dehydrogenase alternative ruter til indtastning af elektroner i ETS20,21. Disse «alternative» komplekser er særlig vigtig i insekter, som alt efter dyreart, de kan deltage aktivt for at øge respiration20,22,23,21. Elektroner fra disse ETS fodersystemer overføres til ubikinon og efterfølgende til komplekse III, og derefter til komplekse IV, indtil den endelige acceptor, Molekylær ilt. Denne elektron overførsel genererer proton-drivkraften i hele den indre mitokondrielle membran kørsel fosforylering af ADP at ATP på komplekse V (figur 1). Overvejer de centrale rolle af mitochondrier i cellen homøostase, studerer mitokondrie stofskifte ved hjælp af den relevante model D. melanogaster repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at afgrænse de underliggende mekanismer af forskellige patofysiologiske betingelser eller under cellulære og miljømæssige belastninger. Overraskende men målt kun en håndfuld af undersøgelser faktisk mitokondrie respiration i Drosophila24,25,26. Faktisk, eksperimenter med henblik på at evaluere mitokondrie iltforbrug kræver isolering af mitokondrier. Selv om fordelagtige for måling af forskellige mitokondriets funktioner (f.eks. ROS produktion eller P/O ratio som markør af mitokondrie effektivitet27,28), kræver disse isolering generelt temmelig store mængder væv fra flere personer24,29. Dette krav om høje mængder af væv og enkeltpersoner er en vigtig begrænsende faktor, især i betragtning af at alle individer skal være samme alder og helst af samme køn for eksperimenterne, at foranstaltningen af åndedræt på andet tidspunkt peger besværlige i bedste fald. Desuden mens mitokondrie isolering kan give betydelig indsigt i de grundlæggende mekanismer, der regulerer mitokondrie metabolisme, har de metoder, der anvendes til at isolere mitokondrier flere ulemper som er vanskeligheden at opnå reproducerbare resultater , afbrydelse af mitokondrie netværk og ændring af mitokondrie struktur og funktion29,30,31.

Formålet med denne undersøgelse er at præsentere en robust protokol for at måle mitokondrie iltforbrug i Drosophila ved hjælp af kun en minimal mængde af væv fra meget få personer. Denne protokol består af måling af mitokondrie ilt forbrug i situ ved permeabilized muskelfibre29 fra Drosophila thoraxes i kombination med høj opløsning respirometri32,33, 34 , 35. denne metode har også yderligere fordele i forhold til den klassiske mitokondrie isolation metode da interaktioner med andre komponenter i cellen som godt som mitokondrielle struktur og funktion er mere bevaret i permeabilized fibre29,31,36, hvilket gør denne metode mere fysiologisk relevante. Med denne protokol, kan mitokondrie funktioner præcist evalueres ved hjælp af høj opløsning respirometri i kun tre thoraxes i Drosophila, med substrater at tillade bestemmelse af iltforbrug på flere forskellige trin af ETS. Derfor kunne denne protokol hjælpe svar vigtige spørgsmål om de grundlæggende mekanismer, der styrer stofskiftet i forbindelse med mange miljømæssige eller patofysiologiske forhold ved at udnytte Drosophila modellen.

At måle iltforbruget på flere forskellige trin af ETS og vurdere, hvordan forskellige substrater bidrage til respiration, forskellige substrater (figur 1), uncoupler og -hæmmere er brugt30 efter permeabilization af den væv. Specifikt, er sekventiel tilføjelser af forskellige substrater udført for at stimulere optagelse af elektroner gennem forskellige komplekser af ETS. En uncoupler, carbonyl cyanid 4-(trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), derefter tilsættes på optimal koncentration for at måle den ikke-kombineret respiration, dvs. den ikke-phosphorylating respiration stimuleret til maksimal iltforbrug. Sekventiel hæmninger af komplekser I, II og III er derefter udført for at overvåge det resterende iltforbrug, der er på grund af ikke-ETS oxidation reaktioner. Endelig, komplekse IV maksimal respiration kapacitet kan evalueres ved injektion af N, N, N', Nielsen, - Tetramethyl - p-phenylendiamin (TMPD), en kunstig elektron udbyder, og Ascorbat. Det er vigtigt at bemærke, at forsøgene er udført på 24 °C, da det er den temperatur, hvor fluerne er rejst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. reagenser forberedelse

  1. Forberede følgende løsninger for dissektion og permeabilization af vævet.
    1. Forberede bevarelse løsning: 2.77 CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5.77 mM Na2ATP, 6.56 mM MgCl2, 20 mM taurin, 15 mM Na2fosforkreatin, 20 mM imidazol, 0,5 mM dithiothreitol, og 50 mM K-MES, pH 7.1 (kan gemmes ved-20 ° C).
    2. Forberede saponin løsning: 5 mg af saponin i 1 mL af bevarelse løsning (forberede frisk dagligt).
  2. Forberede følgende løsninger til måling af respiration.
    1. Forberede respiration medium: 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 3 mM HEPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2og 0,2% BSA (w/v), pH 7,2.
    2. Forberede substrater, uncoupler, hæmmere. Opløse alle substrater i H2O og opløse uncoupler FCCP samt hæmmere i ethanol absolut (undtagen malonate, som er fortyndet i H2O). Neutralisere de fleste af de substrater samt malonate (Se Tabel af materialer). Alle fusioner i protokollen er endelige koncentrationer inde 2 mL kamre.

2. forberedelse og kalibrering af høj opløsning Respirometer.

  1. Vask kamre, caps og propper af respirometer tre gange med 70% ethanol og tre gange med destilleret vand.
  2. Kalibrere ved nul iltkoncentration: afpipetteres 2,3 mL af respiration medium i afdelingerne og tilføje 10 mg natrium dithionite. Selv om den maksimal volumen af salen er 2 mL, tilsættes 2,3 mL til at sikre, at ingen luftboble forbliver under proppen, når du lukker kamrene. Luk kamre med propperne og måle koncentrationen af ilt i 10-20 min. kalibrere elektroderne på nul iltkoncentration med den resulterende ilt forbrugssats.
  3. Vaske kamre med distillated vand, inkuberes i absolut ethanol i 10 min. og skyl derefter med destilleret vand.
  4. Kalibrere på air mætning: afpipetteres 2,3 mL af respiration medium i afdelingerne, Indsæt propperne, Opsug den overskydende medium oven på propperne, og løft derefter propper med gif. Overskydende respiration medium er pipetted i afdelingerne (volumen 2 ml samlede) for at undgå tilstedeværelsen af luftbobler efter lukning af afdelingerne.
  5. Overvåge iltforbrug i 45 min til en time, indtil koncentrationen af ilt (blå trace) er stabil omkring 250 nM ved 24 ° C.

3. dissektion af fluer og Permeabilization væv

  1. Kontroller, at alle trin er udført på is.
  2. Anaesthetize seks mandlige fluer af samme stamme, samme alder og rejst på den samme kost på isen for at lette dissektion af fluer (wild-type w1118, 15 dage gammel, fodret majsmel medium).
  3. Ved hjælp af en skalpel og fine-tippet pincet, dissekere fluer (fjerne hoved og underliv) for at bevare kun de thoraxes, der indeholder flyvningen muskler. Dette trin kan gøres med det blotte øje. Håndtere de deraf følgende thoraxes med fine spids pincet.
  4. Overføre tre dissekeret thoraxes i en 25 mm petriskål indeholdende 2 mL iskold bevarelse løsning med pincet.
  5. Med bøde-tippet pincet, mekanisk permeabilize af thoraxes ved at indsætte spidsen af pincet i thoraxes og gentagne gange rive fra hinanden væv for at opnå et løst forbundne netværk.
  6. En 24-godt plade, Udfyld to brønde med 12,5 µL saponin løsning og 1 mL af bevarelse løsning til at opnå en endelig koncentration på 62,5 µg/mL saponin. Fyld de to tilstødende brønde med 1 mL af respiration medium.
  7. Med bøde-tippet pincet, overføre tre permeabilized thoraxes i den fortyndede saponin løsning og inkuberes med mild uro på en orbitalryster på isen, til 20 min.
  8. Efter den sidstnævnte inkubation, overføre fibrene i tilstødende brøndene fyldes med respiration medium med mild uro i isbad i 5 min at skylle saponin.

4. bestemmelse af tørstof

  1. Tør de permeabilized thoraxes på en absorberende overflade og flip 3 - 4 gange ved hjælp af den fine spids pincet til at sikre alle fugt fjernes.
  2. Veje de tre thoraxes sammen på en microbalance. Bemærk den opnåede vægt, som det vil blive brugt til at normalisere mitokondrie ilt forbrug satser.
  3. Overføre væv straks i en dråbe af respiration medium på is.

5. ilt forbrug satser bestemmelse

  1. Åbne kamre i respirometer (fjerne propperne) og tilføje 10 mM af pyruvat og 2 mM af malat i hver afdeling.
  2. Tilføj permeabilized væv direkte ind i kamrene fyldt med respiration medium.
  3. Erstatte propper ved hjælp af en spacer.
  4. Med en 60 mL sprøjte, indsamle ilt direkte fra en ilt tank og injicere 2-5 mL ilt gennem proppen kapillær af hvert kammer sørge for ilt diffusion gennem væv ikke vil begrænse iltforbrug.
  5. Indsæt en Hamilton sprøjte i kapillær i hver prop for at sikre thoraxes forblive i salen.
  6. Luk afdelingerne helt, når koncentrationen af ilt er omkring 400 nM, at opnå ilt niveauer over luft mætning (omkring 160% luft mætning) inde i afdelingerne.
  7. Stop og genstart omrørere til at kontrollere for luftbobler i afdelingerne.
  8. Angiv massen af væv vejes tidligere for at normalisere respiration satser af masse af væv (mg), visning af masse-specifikke iltforbrug (pmol O2 consumed.s-1.mg-1 væv).
  9. Når iltforbrug er stabiliseret (røde spor), tilføje 5 mM ADP med en Hamilton sprøjte.
  10. Efter hver injektion, skyl sprøjter med destilleret vand, 70% ethanol, og destilleret vand igen.
  11. Når iltforbrug er stabilt igen, indsprøjtes 5 µL af en 4 mM af cytokrom c.
  12. Gå videre til de sekventielle injektioner af de følgende substrater til at evaluere mitokondrie iltforbrug på forskellige trin af ETS:
    1. Tilsæt 5 µL af en 2 M prolin.
    2. Tilsæt 10 µL af en 1 M succinat.
    3. Tilføj 30 µL af en 1 M glycerol-3-fosfat.
  13. Injicere uncoupler FCCP på en måde, titrering af trin på 0,5-1 µM (2 µL af en 1 mM løsning) indtil den optimale koncentration er nået, dvs, koncentration at nå den højeste mulige uden hæmning forbrug af ilt (forsigtighed: Se tabel af materialer).
  14. Injicere de følgende hæmmere sekventielt for at helt hæmme elektron flux i Emissionshandelsordningen for at måle det resterende iltforbrug (ROX) dvs. ikke-respiratorisk reaktioner såsom oxygenase reaktioner blandt andre:
    1. Tilføj 1 µL af en 1 mM rotenon (forsigtighed: Se Tabel af materialer).
    2. Tilsæt 5 µL af en 2 M malonate (forsigtighed: Se Tabel af materialer).
    3. Tilføj 1 µL af en 5 mM antimycin A (forsigtighed: Se Tabel af materialer).
  15. Tilføje 0,2 mM Ascorbat og 0,5 mM TMPD sekventielt i kamre, begyndende med Ascorbat at måle iltforbruget af komplekse IV.
  16. Tilføj 20 mM af natriumazid til at hæmme komplekse IV (forsigtighed: Se Tabel af materialer).
  17. Når signalet er stabil, åbne kamre med spacer, re oxygenat afdelingerne ved at indsprøjte 2 mL ren ilt og lukke afdelingerne, når koncentrationen er omkring 250-300 nmol.mL-1.
  18. Måle signal for 10-15 min og beregne den kemiske baggrund, dvs., iltforbrug på grund af autoxidation af TMPD.

6. rengøring af Respirometer

  1. Efter målingerne, skyl kamre med destilleret vand en gang og skyl kamre tre gange i 70% ethanol.
  2. Inkuber i absolut ethanol for 10 min til at inaktivere hæmmere.
  3. Skylles tre gange med destilleret vand, udfylde kamrene med 70% ethanol og erstatte propperne og hætter indtil næste udnyttelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En repræsentativ spor af mitokondrie iltforbrug ved hjælp af den protokol, der er beskrevet ovenfor er fastsat i figur 2. Pyruvat og malat injiceres i kamre sammen med de permeabilized muskelfibre er henvist til CI-lækage respiration, dvs., når komplekset af Emissionshandelsordningen er stimuleret af NADH produceret gennem oxidation af pyruvat og malat via den tricarboxylic syre cyklus (CI). Under denne åndedræt sats opretholdes den mitokondrielle ilt primært for at kompensere for proton lækage, dvs, protoner passerer fra det intermembrane rum til mitokondriets matrix, når ATPsyntase ikke er aktive (lækage)30. Når ADP er tilføjede, ATPsyntase er aktiveret og elektronerne overføres fra komplekset I til den komplekse IV med samtidige fosforylering af ADP i ATP (CI-OXPHOS), hvilket resulterer i øget mitokondriel iltforbrug. OXPHOS kobling ratio beregnes som CI-OXPHOS/CI-lækage og er normalt taget som en god indikator af mitokondrie kvalitet og af mitokondrie kobling30. I Drosophila, bør dette forhold mindst overstiger 6.0 (figur 3). Hvis det er under denne værdi, kan det skyldes et problem med væv forberedelse eller en mitokondriel dysfunktion. Tilsætning af cytokrom c giver mulighed for bestemmelse af den ydre membran integritet og bruges derfor som en kvalitetskontrol af forberedelse (figur 4). Faktisk, cytokrom c er løst bundet til den indre mitokondrielle membran og er typisk vaskes væk, hvis den ydre membran er beskadiget under permeabilization processen. Som et resultat, vil tilføje eksogene cytokrom c øge iltforbrug hvis den ydre membran er beskadiget og endogene cytokrom c er tabt. En stigning på mindre end 10-15% i forbrug af ilt (figur 4) viser normalt passende integritet af den ydre membran29. I figur 3 og 4, de grønne spor blev indhentet fra ikke-tilstrækkelige permeabilization og håndtering af prøver (overdreven tåreflåd af væv til figur 3, og vejes efter længere tid på den absorberende overflade for figur 4), de røde spor udgoere prøver tilstrækkeligt permeabilized og håndteres. Disse resultater understreger, at passende permeabilization betingelser er afgørende for pålidelig vurdering af mitokondrie iltforbrug.

De følgende substrater anvendes under forsøgene give elektroner til ubikinon og lov til at øge elektron flux til ETS. Prolin er en aminosyre, der kan bruges som energi substrat navnlig insekter23, men også i pattedyr under akut hungersnød eller patologiske tilstande37. Tilsætning af prolin i afdelingerne giver mulighed for at evaluere bidraget af prolin dehydrogenase (ProDH) til elektron flux i ETS, når elektroner flyder fra både komplekse og ProDH og deltager i OXPHOS processen (CI + ProDH-OXPHOS). Med tilføjelsen af succinat, kan komplekse II (succinat dehydrogenase) til ETS bidrag observeres (CI + ProDH + CII-OXPHOS). Injektion af glycerol-3-fosfat (G3P), øges yderligere mitokondrie iltforbrug som dette substrat stimulerer den mitokondrielle glycerol-3-fosfat dehydrogenase (G3PDH), som er en del af den glycerophosphate transport og overførsel elektroner til ETS (CI + ProDH + CII + G3PDH-OXPHOS). Både ProDH og G3PDH har vist sig at være særligt aktive i flere arter af insekter og er derfor vigtige i denne protokol med Drosophila20,21,22,23,32 .

Når uncoupler FCCP er tilføjet, ikke kombineret respiration (ETS state) opnås, dvs, den maksimale iltforbrug repræsenterer den maksimale kapacitet af ETS (CI + ProDH + CII + G3P-ETS). FCCP er en protonophore, der transporterer protoner fra det intermembrane rum til den mitokondriets matrix uden at passere gennem komplekse V. FCCP har at omhyggeligt titreres, som koncentrationer under optimale resultat i ikke-maksimal iltforbrug og ikke-stabil respiration satser mens koncentrationer over optimalt resultat i hæmning af mitokondrie iltforbrug (figur 5). Når substraterne og uncoupler er tilføjet, hæmning af komplekser I, II og III kan være fortløbende udført med rotenon, malonate og antimycin A, hhv. Med hver inhibitor anvendes, er et fald i mitokondrie iltforbrug observeret, indtil nå det laveste forbrug af ilt efter tilsætning af antimycin A. Prisen nåede efter tilsætning af alle hæmmere er resterende ilt forbrug30. Det repræsenterer iltforbruget på grund af ikke-mitokondrie oxidative reaktioner såsom oxygenase reaktioner og reaktive arter produktion for eksempel, og har derfor for at være trukket fra alle de andre satser målt.

TMPD er en kunstig elektron transporter, der giver elektroner direkte til komplekse IV, omgå alle de komplekser opstrøms, tillader måling af komplekse IV maksimal respiration kapacitet. Dette substrat er dog tilbøjelig til at autoxidation, så Ascorbat skal være tilføjet forudgående TMPD til at begrænse, men ikke helt undgå dette autoxidation. For at korrigere for de resterende autoxidation af TMPD, komplekse IV hæmmer natriumazid er føjet til afdelingerne og iltforbrug er indspillet i 10-15 minutter. Denne iltforbrug udgør derfor den kemiske baggrund, eller med andre ord autoxidation af TMPD, der bør tages i betragtning ved beregningen af komplekse IV maksimal respiration kapacitet.

Figure 1
Figur 1 . Skematisk fremstilling af mitokondrie elektron transport elektron transportsystem og oxidativ fosforylering i mitokondriets indre membran. I: komplekse; II: komplekse II; III: komplekse III; IV: komplekse IV; V: ATP syntase; Acetyl-CoA: acetyl coenzym A; Cyt c: cytokrom c; e-: elektron; G3P: glycerol-3-fosfat; G3PDH: mitokondrie glycerol-3-fosfat dehydrogenase; H+: proton; PRODH: prolin dehydrogenase; TCA: tricarboxylic syre cyklus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentant spor af mitokondrie iltkoncentration (blå trace) og forbrug (røde spor) på permeabilized thoraxes i Drosophila. Hver injektion er repræsenteret med en pil, der angiver den sammensatte injiceres (Pyr: pyruvat; mal: malat; ADP; Cyt c: cytokrom c; Pro: prolin; Succ: succinat; G3P: glycerol-3-fosfat; FCCP: carbonyl cyanid 4-(trifluormethoxy) phenylhydrazone; Rot: rotenon; Malo: malonate; Ant A: antimycin A; TMPD: N, N, N', Nielsen, - Tetramethyl - p-phenylendiamin; ASC: Ascorbat; SAZ: natriumazid). Hver mitokondrie ilt forbrugssats er angivet på grafen, når iltforbrug (rød trace) er blevet stabiliseret. Cytokrom c effekten betegner den ydre membran integritet (Se tekst for detaljer). Resterende iltforbrug repræsenterer iltforbrug på grund af oxidative side reaktioner i cellerne og skal trækkes til alle de andre satser målt. Kemiske baggrund betegner iltforbrug kun på grund af autoxidation af TMPD og skal tages i betragtning ved beregningen af den komplekse IV maksimale respiration kapacitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Repræsentant spor af en gyldig (røde spor, afdeling A) og utilstrækkelig (grønne spor, afdeling B) svar til tilsætning af ADP. Det røde spor svarer til afdeling A og det grønne spor svarer til afdeling B, under de samme eksperiment. Det røde spor blev fremstillet af thoraxes tilstrækkeligt permeabilized det grønne spor blev indsamlet efter overdreven tåreflåd væv under permeabilization. Når ADP er tilføjet, en stigning i iltforbrug forventes, ligesom det røde spor. OXPHOS kobling nøgletal er beregnet som CI-OXPHOS/CI-lækage og præsenteres i grafen. Et forhold på mindre end 6,0 i Drosophila antyder et problem i den mitokondrielle kobling og er karakteristisk for prøve nedbrydning eller af mitokondriel dysfunktion repræsenteret af det grønne spor. Pyr: pyruvat; Mal: malat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Repræsentant spor af en gyldig (røde spor, afdeling A) og utilstrækkelig (grønne spor, afdeling B) svar til tilsætning af cytokrom c. Det røde spor svarer til afdeling A og det grønne spor svarer til afdeling B, under de samme eksperiment. Røde spor blev fremstillet af thoraxes tilstrækkeligt permeabilized og håndteres, mens den grønne spor var opnået efter thoraxes var bevidst tørret i længere tid på den absorberende overflade før vejning. Cytokrom c øger ikke normalt mitokondrie iltforbrug, som det ses på det røde spor, betegner, at den ydre membran er intakt. Hvis imidlertid tilsætning af eksogene cytokrom c øger mitokondrie iltforbrug i mere end 15%, som det ses på det grønne spor, tyder det på, at den ydre membran er beskadiget, og dermed at stikprøven er nedbrudt og bør være kasseret. Pyr: pyruvat; Mal: malat; Cyt c: cytokrom c. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Repræsentant spor af mitokondrie iltkoncentration (blå trace) og forbrug (røde spor) efter titrering af FCCP. Forskellige injektioner af FCCP på flere koncentrationer skal udføres omhyggeligt for at bestemme den maksimal iltforbrug udløst af denne uncoupler. Utilstrækkelig koncentrationer tillader ikke vurderingen af maksimal iltforbrug og er karakteriseret ved ikke-stabil respiration satser, mens FCCP overskydende hæmmer mitokondrie iltforbrug. Pile angiver de forskellige injektioner af FCCP. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Reproducerbarhed af mitokondrie iltforbrug satser i løbet af en typisk eksperiment fremstillet ved hjælp af de to forskellige kamre (røde spor, afdeling A, grønne spor, afdeling B) af en respirometer. Det røde spor svarer til afdeling A og det grønne spor svarer til den afdeling B, under den samme eksperimentere med Drosophila fra samme alder, køn, stamme og rejst på den samme kost, samt protokollen beskrevet. Begge prøver var normaliseret med masse af tørt væv vejes som beskrevet i protokollen (0,53 og 0,66 mg for afdelingerne A og B, henholdsvis). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse, er en metode til prøveforberedelse forud for målingerne af mitokondrie iltforbrug i Drosophila beskrevet. Denne metode blev udviklet til at løse forskellige problemer relateret til protokoller ved hjælp af mitokondrie isolering, navnlig med hensyn til varighed og antal individer kræves. Stedet for at arbejde med mitokondrie isolering der normalt kræver store beløb af væv fra flere personer, er dette eksperiment udført på permeabilized muskelfibre fra thoraxes af par Drosophila. I denne protokol for kun tre personer at få vist optimale resultater. Derfor, måling af mitokondrie iltforbrug på forskellige tidspunkter er muligt, da det er mere realistisk at synkronisere en mindre gruppe af fluer har samme alder og samme køn.

Først, det er vigtigt at bruge Drosophila af samme alder, køn, stamme og rejst i de samme betingelser at opnå lav variation i resultaterne (figur 6), som åndedræt kan ændre sig med alderen, køn, genotype og kost af fluer. Det mest afgørende skridt i gennemførelsen af denne protokol er proceduren, permeabilization af thoraxes. Det er meget vigtigt at fortsætte hurtigt at undgå nedbrydning af væv, og det er også vigtigt at sørge for, at thoraxes godt permeabilized for at få maksimal satserne for forbrug af ilt. At sikre, at permeabilization er udført korrekt og at mitokondrier strukturelle og funktionelle integritet bevares efter permeabilization, den OXPHOS kobling ratio (CI-OXPHOS/CI-lækage, figur 3), samt den svar til cytokrom c (figur 4) bruges som kvalitetskontrol. Der er en afvejning skal tage i betragtning mellem arbejder hurtigt og sørge for at permeabilization udføres godt. Det er også afgørende for altid arbejde på is, når manipulere de dissekeret thoraxes. For at opnå de mest reproducerbare resultater (figur 6), ensartede permeabilization er nødvendigt og øve teknikken for permeabilization med til at sikre, at de samme bevægelser gentages. En anden kritisk trin er bestemmelsen af tørvægt af prøven. Faktisk, efter at thoraxes er udruget, de er meget følsom, skrøbelig og udsat for nedbrydning. Derfor, på samme måde til permeabilization, hurtigt procedure til bestemmelse af toerstofindholdet er vigtigt. På den anden side er det vigtigt at bestemme vægten med nøjagtighed, da resultaterne er normaliseret med masse af væv. Mængden af thoraxes anvendes kan også optimeres. Protokollen kan tilpasses for at bruge en enkelt thorax pr. afdeling35, men en vis grad af beslutning kunne gå tabt i måling af iltforbrug så meget som ved fastsættelsen af tørvægt. Mængden af thoraxes kan forhøjes, hvis det er nødvendigt, men det er vigtigt at bemærke, at flere mitokondrier i prøven, jo højere iltforbrug og afdelingerne skal derfor være iltes. Denne reoxygenation kan gøres ved at åbne kamre og tilføre ilt, men det vil øge sandsynligheden for at indsætte luftbobler i salen. Derfor, hvis det er muligt, forsøge at undgå at skulle reoxygenate kamre (undtagen når komplekse IV maksimal respiration kapacitet har skal fastlægges). Før du kører eksperimenterne, er optimering af substrat koncentrationer også nødvendige for at nå den højeste mitokondrie iltforbrug uden observere hæmmende virkninger på grund af en overdreven koncentration. Kamre i respirometer skal også rengøres grundigt for at undgå potentielle forureninger. Det er vigtigt at begynde at rense med distillated vand og derefter 70% ethanol til at slippe af med potentielle biologiske forureninger. Efter dette, en inkubation i absolut ethanol for 10 min anbefales at undgå kontaminering af hydrofobe hæmmere. Endelig, skylning kamre med distillated vand og fylde dem med 70% ethanol vil undgå potentielle forureninger indtil den næste udnyttelse.

Protokollen kan let modificeret til at studere effekten af enten andre substrater, eller forskellige hæmmere. For eksempel, er et interessant protein til at studere mitokondrie pyruvat carrier (MPC). Dette protein rolle er at transportere pyruvat genereret i cytosol ind i mitokondriets matrix. For nylig, er det blevet foreslået for at spille en vigtig rolle i modulation af metabolisme under patologiske tilstande som under type 2 diabetes38. For at undersøge effekten af protein MPC på mitokondrie metabolisme, er det nyttigt at starte injektioner med pyruvat kun i stedet for pyruvat og malat på samme tid. Således er effekten af pyruvat studeret uafhængigt fra effekten af malate, som sidstnævnte sprøjtes kun støtte tricarboxylic syre cyklus og sikre at mellemprodukter ikke er udtømt. Det er også muligt at anvende hæmmere af MPC39 til at vurdere, om en begrænsning af denne transporter snarere end oxidation af pyruvat er observeret. Derefter, vil det være muligt at observere et potentielt skift i det foretrukne brændsel for respiration40. Det er også muligt at udelade nogle substrater for at forenkle protokollen, hvis det ikke er relevante for undersøgelsen. For eksempel, for at studere en dysfunktion af komplekset jeg kun, det er ikke nødvendigt at bruge alle de substrater, præsenteret i denne protokol.

Denne protokol præsenterer nogle begrænsninger, at aflede fra i vivo betingelser. Målinger af mitokondrie iltforbrug registreres når respiration medium er over luft-mætning, som ren ilt sprøjtes for at forhindre begrænsning af ilt diffusion inde væv30. Derudover injiceres koncentrationer af substrater i overskud, som overvejer ikke i vivo betingelser. Det er også vigtigt at bemærke, at alder, køn, stamme og kost af Drosophila kan påvirke resultaterne. Disse parametre skal derfor tages i betragtning ved fortolkningen af resultaterne. Denne metode er dog tættere på fysiologiske betingelser end metoder ved hjælp af mitokondrie isolering til at måle mitokondrie iltforbrug, som interaktioner med andre cellulære komponenter, og den strukturelle integritet af mitokondrier og morfologi er bevaret31. Det er vigtigt at bemærke, at mitokondriel isolering er mere fordelagtige, når yderligere parametre, såsom ROS produktion eller mitokondrie effektivitet (P/O ratio) skal være målt27.

Denne metode kan bruges til at nå forskellige mål, lige fra forståelse af mitokondrie dysfunktioner og de underliggende mekanismer af metabolisk sygdomme, til afprøvning af forskellige forbindelser virkninger på mitokondriets funktioner under patologiske betingelser. Det kan desuden bruges til at observere flere miljøbelastninger indvirkning på den mitokondrielle stofskifte, såsom ændringer i kost eller temperatur. For eksempel, er det muligt at undersøge effektiviteten af bioaktive syntetiske molekyler på mitokondriets funktioner og i behandlingen af mitokondrie dysfunktioner. Denne metode er også et godt redskab til at studere de mitokondrielle funktioner på forskellige tidspunkter, hvilket gør det meget relevante for undersøgelsen af de grundlæggende mekanismer relateret til aldringsprocessen. Vurdering af mitokondrie stofskifte via iltforbrug ved hjælp af permeabilized thoraxes vil helt sikkert hjælpe til at bedre vores viden om rollen mitokondriel metabolisme, når cellen er udsat for udfordrende forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Undersøgelsen blev finansieret af tilskud fra National Sciences og Engineering Research Council (NSERC, discovery grant) og Université de Moncton til NP. LHB vil gerne anerkende den finansielle støtte fra det canadiske Institut for sundhed Research (CIHR), New Brunswick Innovation Foundation (NBIF) og Université de Moncton. Arbejdet i EHC understøttes af Alzheimers Society of Canada, hjernen Canada, NSERC, canadiske Breast Cancer Foundation, New Brunswick Innovation Foundation, New Brunswick sundhed Research Foundation og Université de Moncton.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High-resolution respirometer Oxygraph O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 10022-02 Startup O2K respirometer kit
 
O2K-Titration Set  Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20820-03 Hamilton syringes with different volumes
 
Datlab software Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20700 Software for data acquisition and analysis
 
Fine-tipped antimagnetic forceps VWR 82027-400
 
Secura225D-1S-DQE Sartorius AG, Goettingen, Germany Semi-micro balance (distributed by several companies) 
 
Drosophila melanogaster wild-type w1118 Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA
Storage Condition: 24 °C
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378 EGTA
Storage Condition: RT
KOH Sigma-Aldrich P1767 CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity.
Storage Condition: RT
CaCO3 Sigma-Aldrich C4830
Storage Condition: RT
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383
Storage Condition: -20 °C
MgCl2.6H2O Sigma-Aldrich M9272
Storage Condition: RT
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Storage Condition: RT
Na2Phosphocreatine Sigma-Aldrich P7936
Storage Condition: -20 °C
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Storage Condition: RT
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Storage Condition: 2-8 °C
MES hydrate Sigma-Aldrich M8250
Storage Condition: RT
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S7900 Saponin
Storage Condition: RT
Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily.
KCl Sigma-Aldrich P9541
Storage Condition: RT
KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791
Storage Condition: RT
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Storage Condition: RT
BSA Sigma-Aldrich 05470
Storage Condition: 2-8 °C
Na2S2O4 Sigma-Aldrich 157953 Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity.
Storage Condition: RT
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Pyruvate
Storage Condition: 2-8 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily.
L-(-)-Malic acid Sigma-Aldrich M1000 Malate
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C.
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A5285 ADP
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C.
Cytochrome c from equine heart Sigma-Aldrich C7752 Cytochrome c
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.
L-Proline Sigma-Aldrich P0380 Proline
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma-Aldrich S2378 Succinate
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C.
sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt Sigma-Aldrich G7886 Glycerol-3-phosphate
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C.
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920 FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity.
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C.
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.
Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C.
Malonic acid Sigma-Aldrich M1296 Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage.
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily.
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674 Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C.
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine Sigma-Aldrich T7394 TMPD
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at  -20 °C.
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Ascorbate
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at  -20 °C.
NaN3 Sigma-Aldrich S2002 Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. 
Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stephenson, R., Metcalfe, N. H. Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use. The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).
  2. Morgan, T. H. An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila. Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).
  3. Dobzhansky, T., Wright, S. Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura. Genetics. 26 (1), 23-51 (1941).
  4. Zipursky, S. L., Rubin, G. M. Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).
  5. Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease. The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).
  6. Blandini, F., Armentero, M. T. Animal models of Parkinson's disease. FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).
  7. Baker, K. D., Thummel, C. S. Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila. Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).
  8. Morris, S. N. S., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).
  9. Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).
  10. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
  11. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  12. Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).
  13. Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell. 120 (4), 483-495 (2005).
  14. Szibor, M., Holtz, J. Mitochondrial ageing. Basic Research in Cardiology. 98 (4), 210-218 (2003).
  15. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  16. López-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. Mitochondrial biogenesis and healthy aging. Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).
  17. Muoio, D. M. Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock. Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).
  18. Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M. Nutrient-sensing mechanisms and pathways. Nature. 517 (7534), 302-310 (2015).
  19. Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).
  20. McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. "Alternative" fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).
  21. Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production. PLOS ONE. 10 (3), e0120600 (2015).
  22. Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor. Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).
  23. Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333 (2016).
  24. Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster. The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).
  25. Miwa, S., Brand, M. D. The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).
  26. Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).
  27. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  28. St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).
  29. Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
  30. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  31. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  32. Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).
  33. Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria. Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).
  34. Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males. Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).
  35. Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., Côté, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies. Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).
  36. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  37. Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways. Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).
  38. Bender, T., Martinou, J. C. The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).
  39. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
  40. McCommis, K., et al. An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion. Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).

Tags

Biokemi spørgsmål 134 mitokondrier elektronen transportsystem stofskifte og høj opløsning respirometri Drosophila melanogaster permeabilization
Måling af mitokondrie iltforbrug i Permeabilized fibre fra Drosophila bruger minimale mængder af væv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Simard, C. J., Pelletier, G.,… More

Simard, C. J., Pelletier, G., Boudreau, L. H., Hebert-Chatelain, E., Pichaud, N. Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue. J. Vis. Exp. (134), e57376, doi:10.3791/57376 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter