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Biochemistry

ショウジョウバエのティッシュの最小限の量を使用してのグリセリンの繊維でミトコンドリアの酸素消費量の測定

Published: April 7, 2018 doi: 10.3791/57376
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Département de chimie et biochimie, Université de Moncton, 2Département de biologie, Université de Moncton
* These authors contributed equally

Summary

本稿で、ショウジョウバエのグリセリン thoraxes による高解像度の呼吸の酸素消費量を測定する方法を説明します。この手法は古典的なミトコンドリアの分離法と比較して組織の最小限の量を必要として得られた結果、もっと生理学的に関連します。

Abstract

ショウジョウバエ、キイロショウジョウバエ代謝の研究のための新たなモデルを表します。確かに、ショウジョウバエは、構造の人間の臓器に相同性を持つし、非常に節約された代謝経路を持っている時間の短い期間で別の基礎的メカニズムの研究を可能にする比較的短い寿命を持っています。しかし、意外な細胞の代謝、ミトコンドリア呼吸に不可欠なメカニズムの 1 つは徹底的に触れられていないこのモデルです。ショウジョウバエにおけるミトコンドリア呼吸の測定は通常非常に多数の個人を必要とし、得られた結果が再現性が高いのでそうです。ここでは、ショウジョウバエから組織の最小限の量を使用してミトコンドリアの酸素消費量の正確な測定を許可する方法を説明します。この方法では、thoraxes を切除し、両方鋭い鉗子で機械的と化学的にサポニン、異なる化合物は細胞膜を通過し、ミトコンドリア呼吸を調節することができますグリセリンです。透過処理、したプロトコルが、ランプといくつかの阻害剤に彼らの対応だけでなく、異なる基質を酸化する電子輸送システム (ETS) の異なる複合体のキャパシティを評価する実行されます。このメソッドは、ミトコンドリアがまだ他の細胞成分との相互作用とミトコンドリアの形態が保存されているので、それはもっと生理学的に関連するとミトコンドリアの分離を用いた方法と比較して多くの利点を示します。また、サンプル準備の速度が速い、得られた結果が再現性が高い。ミトコンドリア呼吸性と代謝の研究のためのモデルとしてショウジョウバエの利点を組み合わせることにより新たな洞察が、発表することができます重要な特にときハエが発生している異なる環境や病態生理学的条件。

Introduction

ミバエショウジョウバエは、1世紀以上の遺伝子研究のモデル生物として使用されています。この生物の研究伴性継承2、突然変異率3、ニューラル システムの開発と細胞運命決定の4の重要な基礎知識にしかつながっていないが、また最近として浮上している、アルツハイマー病やパーキンソン病の5,6などいくつかの疾患に固有のメカニズムを研究する貴重なツールです。さらに、彼らは時間の短い期間で大量に発生する可能性が、寿命が短いと老化のプロセスを勉強する人気のあるモデルです。彼らはまた、インスリン産生細胞 (β 膵細胞に相当)、脂肪体 (同様には肝と白脂肪組織として機能している)、oenocytes (肝細胞様細胞)、心臓などの臓器に相同構造を所有しているだけでなく、体液代謝産物 (脊椎動物の血に似ています)7を輸送します。また、中間代謝 (インスリン/インスリン様成長因子のようなシグナル伝達経路およびラパマイシン ターゲット TOR 経路含む) の中央の道は、また非常に節約された7です。これらの理由から、ショウジョウバエは最近8糖尿病など代謝疾患固有の病態を中心に、代謝を制御する基本的なメカニズムを記述するため悪用されています。代謝の主要なコンポーネントは酸化的リン酸化プロセス (OXPHOS) を通じて ATP 生産、ミトコンドリア複数の経路を統合し、生命の最も重要な生物学的機能のいずれかを実行します。生物の代謝の中心的な役割を考慮したそれは、ミトコンドリアの機能障害がパーキンソン病9とアルツハイマー病10のような多くの病気だけでなく、筋萎縮性側索硬化症に関与していること意外ではないです。11,12. 老化プロセスの基本的な決定要因があります。確かに、酸化損傷11を通じて高濃度の細胞に有害なことができる細胞活性酸素種 (ROS) の主要な生産者しています。高齢化はまた破損または変異ミトコンドリア DNA13mitophagy 機能障害14,15ミトコンドリア生合成16障害の蓄積に関連付けられています。ミトコンドリアは細胞の恒常性の重要要因ではまた豊富や栄養素17,18の希少性によるといくつかの細胞機能を調節する別の基板を利用することができます。

確かに、ダイエット (炭水化物、脂質および蛋白質) のさまざまな栄養素に消化され、吸収され、細胞に運ばれます。細胞質に転化し、派生の基板は NADH や FADH219などの削減の同等物を製造しているミトコンドリアのマトリックスに運ばれます。これらの削減の同等は、電子輸送システム (ETS) の異なる酵素の複合体によって酸化されてし。これらの複合体は複合体など、ミトコンドリア内膜に埋め込まれている私と複合体 II。さらに、ミトコンドリアのグリセロール-3-リン酸脱水素酵素およびプロリン脱水素酵素など他の酵素の複合体は、ETS20,21に電子のエントリの代替ルートを表します。これらの 'alternative' 複合体は昆虫、特に重要として、種に応じて彼ら積極的に参加できる呼吸20,22,23,21を増加します。これらの ETS の供給システムからの電子は、最終的なアクセプター分子酸素まで、ユビキノン、その後複合体 III にし複雑な IV が転送されます。この電子の移動は、複雑な V (図 1) で ATP を ADP のリン酸化を運転内部のミトコンドリア膜プロトン動機力を生成します。病態生理学的ミトコンドリア細胞の恒常性は、キイロショウジョウバエ関連するモデルを表しますを用いたミトコンドリア代謝の勉強の中心的な役割の様々 なメカニズムを記述する強力なツールを検討条件または細胞と環境ストレスの下で。驚くほどしかし、研究の一握りだけは実際にショウジョウバエ24,25,26のミトコンドリアの呼吸を測定しました。確かに、ミトコンドリアの酸素消費量を評価することを目指して実験はミトコンドリアの分離を必要とします。分離が一般的にむしろ大量を必要とする (活性酸素産生やミトコンドリア効率27,28のマーカーとしての P/O 率) などさまざまなミトコンドリア機能の測定のために有利、いくつか個人24,29からのティッシュ。組織や個人の多量のためのこの要件は、重要な制限要因、特にすべての個人が同じ年齢であることを考えるとできれば実験のための同性の異なる時間に呼吸のメジャーを作る最高の状態で骨の折れるポイントします。さらに、ミトコンドリアの分離は、ミトコンドリア代謝を支配する根本的なメカニズムに重要な洞察力を提供できますが、ミトコンドリアの分離に使用するメソッドはレプリケート可能な結果を得ることの難しさなどいくつか欠点を持ってください。、ミトコンドリアのネットワークおよびミトコンドリアの構造と機能29,30,31の変質の中断。

本研究の目的は、非常に少数の個人から組織の最小限の量だけを用いたショウジョウバエのミトコンドリアの酸素消費量を測定するための堅牢なプロトコルを提示することです。このプロトコルでミトコンドリアの酸素消費量測定の in situショウジョウバエ thoraxes からグリセリン筋線維29を使用して高解像度呼吸32,33,との組み合わせで構成されています34,35ですこのメソッドも古典的なミトコンドリアの分離メソッドからセルの他のコンポーネントとの相互作用としても、ミトコンドリアの構造と機能はの保存よりグリセリンに比べて利点があります。繊維29,31,36, もっと生理学的に関連するこのアプローチになります。このプロトコルで、基板 ETS のいくつかの異なる段階で酸素消費量の決定をすること、ショウジョウバエの唯一の 3 つの thoraxes で使用する高解像度の呼吸ミトコンドリア機能することができます正確に評価されます。したがって、このプロトコルはショウジョウバエ モデルの利点を生かして多くの環境または病態生理学的条件のコンテキストで代謝を制御する基本的なメカニズムに関する質問に回答キーを助けることができます。

ETS のいくつかの異なる手順で酸素消費量を測定し、どのように異なる基板を評価する呼吸、別基板 (図 1)、ランプに貢献し、阻害剤が使用される30の透過後、組織。具体的には、異なる基板上の順次追加、ETS の異なる複合体を介して電子のエントリを刺激するために実行されます。シアン化物のカルボニル、ランプ 4-(フッ素系低分子) phenylhydrazone (FCCP) は非結合呼吸を測定するための最適な濃度で追加した、すなわち、非リン酸化呼吸筋酸素消費量刺激されます。複合体 I、II、および III は ETS 非酸化反応により、残留酸素の消費量を監視する実行し、順次抑制。N, N, N の注入による複雑な IV 最大呼吸能力を評価できる最後に、'、N - テトラメチル - p-フェニレンジアミン (受けた東京都警視庁)、人工電子プロバイダーとアスコルビン酸。それはハエの発生する温度なので、24 °C で実験が行われているに注意してくださいすることが重要です。

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Protocol

1. 試薬の調製

  1. 解剖と組織の透過の以下のソリューションを準備します。
    1. 保存液を準備: 2.77 ミリメートル CaK27.23 mM K2グリコールエーテルジアミン四酢酸、5.77 mM Na2ATP、6.56 mM MgCl2、タウリン、20 mM 15 mM Na2クレアチンリン酸、20 mM のイミダゾール、0.5 mM ジチオトレイトール グリコールエーテルジアミン四酢酸と 50 ミリメートル K-MES の pH 7.1 (格納できます。-20 ° c)。
    2. サポニン溶液の準備: 保存液の 1 mL のサポニンの 5 mg (新鮮な毎日を準備)。
  2. 呼吸の測定のための次のソリューションを準備します。
    1. 呼吸メディアの準備: 120 mM KCl、5 mM KH2PO4、3 mM HEPES、1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、1 mM MgCl2、および 0.2 %bsa (w/v)、pH 7.2。
    2. 基板、ランプ、阻害剤を準備します。H2O、すべての基板を溶解し、エタノール (H2O で希釈したマロン酸) を除いて絶対に阻害剤と同様、FCCP ランプを解散します。ほとんど、基板と同様のマロン酸 (材料の表を参照) を中和します。プロトコルは、すべての濃度は、2 mL 槽内最終濃度です。

2. 準備中と高解像度計のキャリブレーション。

  1. 洗浄室、キャップ、および蒸留水 70% エタノールで 3 回と 3 回の呼吸のストッパー。
  2. ゼロ酸素濃度調整: チャンバ内呼吸媒体の 2.3 mL ピペットで移しなさい、亜ジチオン酸ナトリウム 10 mg を追加。商工会議所の最大の量は 2 mL が、2.3 mL は、維持気泡なし、ストッパーの下チャンバーを閉じるときに追加されます。ストッパーで部屋を閉じ、酸素濃度が 10-20 分調整結果の酸素消費量と酸素濃度がゼロで電極を測定します。
  3. 芳醇な水で部屋を洗って 10 分、無水エタノールで孵化させなさい蒸留水で洗い流し。
  4. 空気飽和状態における調整: ピペット 2.3 mL 呼吸室、中のストッパーを挿入、ストッパーの上に余分な培地を吸引、スペーサー、ストッパーを持ち上げます。戻過剰呼吸媒体は、部屋を閉じた後、気泡の存在を避けるために室 (合計 2 mL の体積) で。
  5. 酸素濃度 (ブルー トレース) が 250 前後安定するまで 1 時間 45 分の酸素消費量を監視 24 の ° C で nM

3. ハエや組織の透過の郭清

  1. 氷の上のすべての手順を実行していることを確認します。
  2. 同じ系統の六つの男性のハエを anaesthetize、同じ年齢、同じ食事 (野生型 w1118, 15 日齢、コーンミール培地に供給) ハエの解離を容易にするために氷の上で発生します。
  3. 飛翔筋を含む thoraxes のみを維持する (頭と腹部を削除) ハエを解剖メスと細い鉗子を使用する。この手順は、肉眼で行うことができます。先の細いピンセットで結果の thoraxes を処理します。
  4. 25 mm シャーレ、鉗子を用いた氷冷保存液 2 mL を含む 3 つの解剖 thoraxes を転送します。
  5. 先の細いピンセットで機械的に鉗子の先端を挿入、thoraxes、thoraxes を permeabilize し、繰り返し緩く接続されたネットワークを取得する組織を引き裂きます。
  6. 24 ウェル プレートでサポニン溶液と、サポニンの 62.5 μ G/ml の濃度が最終的な保存液 1 mL 12.5 μ L で 2 つの井戸を埋めます。呼吸中の 1 mL の 2 つの隣接する井戸を埋めます。
  7. 先の細いピンセットで希釈したサポニン溶液に 3 グリセリン thoraxes を転送し、軌道シェーカーで、氷の上に 20 分間の軽度の動揺と孵化します。
  8. 後者のインキュベーション後軽度の動揺、サポニンを洗うこと 5 分間氷の上で呼吸中でいっぱい隣接する井戸に繊維を転送します。

4. 乾燥減量の定量

  1. グリセリン thoraxes 吸収性の表面上の乾燥し、3-4 回はすべての水分が除去されるかどうかを確認する細い鉗子を使用してフリップします。
  2. 発振に一緒に 3 つの thoraxes の重量を量る。ミトコンドリアの酸素消費量が正規化される、得られた重みに注意してください。
  3. 氷の上、呼吸中のドロップですぐに組織を転送します。

5. 酸素消費率の定量

  1. 呼吸度計の室を開く (ストッパーを削除) し、各チャンバーに 10 mM ピルビン酸とリンゴ酸の 2 mM を追加。
  2. 呼吸の中で満たされた室に直接グリセリン組織を追加します。
  3. スペーサーを使用してストッパーを取り付けます。
  4. 60 mL シリンジと酸素タンクから直接酸素を収集し、組織中の酸素拡散が酸素消費量を制限していないかどうかを確認する各商工会議所のストッパー毛細血管を通して酸素の 2-5 mL を注入します。
  5. 商工会議所に、thoraxes が残っているかどうかを確認する各ストッパーの毛細血管にハミルトン シリンジを挿入します。
  6. 酸素濃度が約 400 室を完全に閉じる空気飽和上の酸素のレベルを達成する nM (約 160% は飽和空気) 部屋の中。
  7. 停止し、チャンバ内の空気の泡を確認するミキサーを再起動します。
  8. 組織呼吸の組織 (mg) の質量質量固有の酸素消費量 (pmol O2 consumed.s-1.mg-1組織) の表示を正常化する以前の重量を量った量を入力します。
  9. 酸素消費量が (赤いトレース) を安定して、5 mM ADP ハミルトン注射器を追加します。
  10. 各注入の後 70% エタノール蒸留水と注射器を洗い、再び水を蒸留します。
  11. 酸素消費量が再び安定、シトクロム c の 4 mM の 5 μ L を注入します。
  12. ETS のさまざまなステップでミトコンドリアの酸素消費量を評価する次の基板の連続注射を行います。
    1. 2 M のプロリンの 5 μ L を追加します。
    2. 1 M のコハク酸の 10 μ L を追加します。
    3. 1 M グリセロール-3-リン酸の 30 μ L を追加します。
  13. 0.5-1 の手順で滴定方法でランプ FCCP を注入 μ M (1 mM の溶液 2 μ L) 最適な濃度までは達された、すなわち、抑制することがなく可能な限り最高の酸素消費量を達成するために濃度 (注意:テーブルを参照してください材料の)。
  14. 完全 (ロックス) の残留酸素消費を測定するために ETS の電子流束を阻害する順番に次の阻害剤の注入など他の中ヘムオキシゲナーゼ反応すなわち非呼吸反応。
    1. 1 mM ロテノンの 1 μ L を追加 (注意:材料の表を参照してください)。
    2. 2 M のマロン酸の 5 μ L を追加 (注意:材料の表を参照してください)。
    3. 5 mM アンチマイシン A の 1 μ L を追加 (注意:材料の表を参照してください)。
  15. アスコルビン酸 0.2 mM や 0.5 mM 受けた東京都警視庁、室に順次複雑な IV による酸素消費量を測定するアスコルビン酸で始まるを追加します。
  16. 複雑な IV を阻害するアジの 20 mM を追加 (注意:材料の表を参照してください)。
  17. 信号が安定して、チャンバー スペーサーで、純粋な酸素の 2 mL を注射することによって部屋を再酸素開閉チャンバー濃度が 250-300 nmol.mL-1。
  18. 10-15 分のための信号を測定し、化学の背景、すなわち、受けた東京都警視庁の自動酸化による酸素消費量を計算します。

6. 工場の洗浄

  1. 測定後蒸留水でチャンバーを濯ぎ 1 回と 3 回 70% のエタノールのチャンバーをすすいでください。
  2. 阻害物質を不活化する 10 分の無水エタノールで孵化させなさい。
  3. 蒸留水すすぎ 3 回、70% エタノールで部屋を埋める、次利用までストッパーとキャップを交換します。

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Representative Results

上記で説明したプロトコルを使用してミトコンドリアの酸素消費量の代表的なトレースは、図 2で提供しています。ピルビン酸とリンゴ酸グリセリン筋線維とともにチャンバーに注入、呼ばれる CI リーク呼吸、すなわち、複雑な ETS の私がによって刺激されるとき、NADH 生産にピルビン酸とリンゴ酸による酸化を介して、トリカルボン酸 (CI)。この呼吸の中にミトコンドリアの酸素は主にプロトンが ATP 合成酵素がアクティブ (リーク)30ミトコンドリアのマトリックスを膜間腔からの交差点、すなわち、プロトン リークを補うために維持されます。ADP が追加され、ATP 合成酵素が活性化、電子転送コンプレックスから同時 ATP (CI OXPHOS) に ADP のリン酸化と複雑な iv の結果私はミトコンドリアの酸素消費量を増加します。OXPHOS の結合比は CI OXPHOS/CI リークとして計算され、通常ミトコンドリアの質とミトコンドリア結合30良いインジケーターとして使用されます。ショウジョウバエでは、この比率は 6.0 (図 3) を超えるべきでは少なくとも。この値を下回る場合、ティッシュの準備やミトコンドリアの機能不全の問題ことを示します。シトクロム c の添加により、ミトコンドリア膜の完全性の決定と準備 (図 4) の品質管理として利用されています。確かに、シトクロム c は、緩く内のミトコンドリアの膜にバインドされ、流されている通常ミトコンドリア膜透過処理中に破損している場合。その結果、ミトコンドリア膜が破損しているし、内因性シトクロム c が失われる外因性シトクロム c を追加する酸素消費量増加が大幅。酸素消費量 (図 4) で 10-15% 未満の増加は通常、ミトコンドリア外膜の29の適切な整合性を示しています。図 3および 4、緑のトレースが得られた十分な非透過と (図 3では、組織の断裂が過度と図 4の吸水性の表面に長い時間の後重量を量られた) サンプルの処理から一方、赤のトレースでは、サンプルの十分にグリセリンと処理を表します。これらの結果は、適切な透過条件はミトコンドリアの酸素消費量の信頼性の高い評価のために重要なことを強調します。

実験時に使用される次の基板は、ユビキノンへ電子を提供し、ETS への電子流束を増やすこと。プロリンは、急性飢餓時や病理学の条件37中に昆虫23、特に哺乳類においてもエネルギー基質として使用できるアミノ酸です。電子私と ProDH 両方の複雑なから流れている OXPHOS プロセス (CI + ProDH OXPHOS) に参加するいると、部屋中のプロリンの添加は、ETS の電子流束にプロリン脱水素酵素 (ProDH) の貢献を評価することができます。コハク酸の添加、ETS に複合体 II (コハク酸脱水素酵素) の貢献 (CI + ProDH + CII OXPHOS) を観察できます。この基板は、グリセロリン酸シャトルと転送の一部であるミトコンドリアのグリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (G3PDH) を刺激する、グリセロール-3-リン酸 (G3P) の注入はさらにミトコンドリアの酸素消費量を増加します。ets (CI + ProDH + CII + G3PDH OXPHOS) 電子。ProDH と G3PDH の昆虫のいくつかの種で特に活躍する示されているショウジョウバエ20,21,22,23,32 このプロトコルの重要なは、したがって両方.

ランプ FCCP を追加すると、非結合呼吸 (ETS 状態) が得られる、すなわちETS (CI + ProDH + CII + G3P ETS) の最大キャパシティを表す最大酸素消費量。FCCP は複雑な V を通過せずミトコンドリアのマトリックスを膜間腔からプロトンを輸送する protonophore です。FCCP が非最大酸素摂取量およびミトコンドリアの酸素消費量 (図 5) の抑制に最適な結果を超える濃度ながら非安定した呼吸の最適な結果は、以下の濃度として、慎重に滴定します。基板と、ランプを追加すると、I、II、および III は、順番にすることができます体の抑制は、ロテノン、マロン酸、およびアンチマイシン A をそれぞれ使用して実行されます。それぞれの阻害剤使用、ミトコンドリアの酸素消費量の減少が観察、アンチマイシン a. の付加の後で最低の酸素消費量に到達するまで率に達したすべての阻害剤の添加は残留酸素消費30後。たとえば、オキシゲナーゼ反応活性種生産など非ミトコンドリアの酸化反応による酸素消費量を表し、測定している従って他のすべての料金から減算されます。

受けた東京都警視庁はすべて複合体、複雑な IV 最大呼吸能力の測定をバイパスする複雑な IV に直接電子を提供する人工電子トランスポーターです。この基板はアスコルビン酸がなければならないので、自動酸化しやすい前を受けた東京都警視庁この自動酸化を完全に避けるために制限するに追加されます。受けた東京都警視庁残りネオペンチルエステルの修正、複雑な IV 阻害剤アジ化ナトリウムが室に追加され、酸素消費量は 10 〜 15 分を記録しました。したがって、この酸素消費量は化学背景または他の言葉で複雑な IV 最大呼吸容量の計算に考慮する必要がありますを受けた東京都警視庁の自動酸化を表します。

Figure 1
図 1.電子伝達系とミトコンドリア内膜での酸化的リン酸化によるミトコンドリアの電子輸送の略図。I: 複雑な;複雑な II;III: 複合体 III;IV: 複雑な IV;V: ATP 合成酵素;アセチル coa: アセチル補酵素 A;Cyt c: シトクロム c;e-: 電子;G3P: グリセロール-3-リン酸;G3PDH: ミトコンドリア グリセロール-3-リン酸脱水素酵素;H+: 陽子;PRODH: プロリン脱水素酵素;TCA: トリカルボン酸。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: ミトコンドリアの酸素濃度 (ブルー トレース)、ショウジョウバエのグリセリン thoraxes 上の消費 (赤のトレース) の代表的な痕跡。各注入は注入した化合物を示す矢印と表される (Pyr: ピルビン酸; マル: リンゴ酸;ADP;Cyt c: シトクロム c;プロ: プロリン。Succ: コハク酸;G3P: グリセロール-3-リン酸;FCCP: カルボニル シアン化 4-(フッ素系低分子) phenylhydrazone;腐: ロテノン;マロ: マロン酸;Ant a: アンチマイシン A;受けた東京都警視庁: N、N、N'、N - テトラメチル - p-フェニレンジアミン;Asc: アスコルビン酸;SAZ: アジ化ナトリウム)。酸素消費量 (赤のトレース) が安定化されているとき、各ミトコンドリアの酸素消費率がグラフに示されます。シトクロム c の効果はミトコンドリア膜の完全性を示します (詳細は本文を参照してください)。残留酸素消費量は細胞内の酸化側反応による酸素消費を表し、測定その他のすべての料金に減算するには。化学のバック グラウンドは、受けた東京都警視庁のみ自動酸化による酸素消費量を表し、複雑な IV 最大呼吸能力の計算のために考慮する必要があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 無効 (赤いトレース、チャンバー A) の代表的な跡および不十分な (緑トレース室 B) ADP 添加レスポンス。赤のトレースは、チャンバー A に対応し、緑のトレースは同じ実験中に商工会議所 B に対応します。赤のトレースは thoraxes 透過中に組織を過度に引き裂くことの後緑のトレースが得られたに対し十分にグリセリンから得られました。ADP を追加すると、赤のトレースのような酸素消費量の増加が期待されます。結合比 OXPHOS CI OXPHOS CI リークとして計算され、グラフで表示されます。ショウジョウバエの 6.0 未満の比率はミトコンドリアの結合の問題を示唆している、サンプル劣化または緑のトレースによって表されるミトコンドリア機能障害の特徴です。Pyr: ピルビン酸;マル: リンゴ酸。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 無効 (赤いトレース、チャンバー A) の代表的な跡および不十分な (緑トレース室 B) チトクローム c の付加への応答赤のトレースは、チャンバー A に対応し、緑のトレースは同じ実験中に商工会議所 B に対応します。Thoraxes がわざわざ計量する前に吸水性の表面に長い時間乾燥した後、緑のトレースが得られたに対し、十分にグリセリンと処理、thoraxes から赤いトレースが得られました。シトクロム c 通常増加しないミトコンドリアの酸素消費量、ミトコンドリアの外膜はそのままを示す赤のトレースで見られるように。ミトコンドリア膜が破損している、したがって、サンプルが低下する必要がありますを示唆している場合は、ただし、外因性シトクロム c の添加が大幅に増加 15% 以上のミトコンドリアの酸素消費量と緑のトレースで見た破棄されます。Pyr: ピルビン酸;マル: リンゴ酸;Cyt c: チトクローム c.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: ミトコンドリアの酸素濃度 (ブルー トレース)、FCCP の滴定後の消費 (赤のトレース) の代表的な痕跡。いくつかの濃度で FCCP の異なる注射が必要慎重にこのランプによって引き起こされる最大酸素消費量を決定するために。不十分な濃度は、最大酸素摂取量の評価を許可しないし、FCCP 余分なミトコンドリアの酸素消費量を抑制するのに対し、非安定した呼吸速度によって特徴付けられます。矢印は、FCCP の別の注射を示すため。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6: ミトコンドリアの酸素消費量の再現性は呼吸の別の 2 部屋 (赤のトレース、チャンバー A; 緑トレース、チャンバー B) を用いて典型的な実験中にレートします。赤のトレースはチャンバー A に対応し、緑のトレース対応室 B は、同じ時に同じ年齢からショウジョウバエを用いた実験、セックス、ひずみし、同じ食事として説明されたプロトコルで発生します。両方のサンプルは、プロトコルに記載の重量を量った乾燥組織の塊で正規化された (0.53 と 0.66 mg 室 A と B、それぞれ)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

本研究では、ショウジョウバエにおけるミトコンドリアの酸素消費量の測定前の試料の調製方法を説明します。このメソッドは、期間、必要な人数の面で特に、ミトコンドリアの分離を使用してプロトコルに関連するさまざまな問題を克服するために開発されました。通常いくつかの個人から得られた組織の大規模な量を必要とするミトコンドリアの分離ではなく、この実験はいくつかのショウジョウバエの thoraxes からのグリセリンの筋線維で実行されます。このプロトコルでは、最適な結果を表示するだけ 3 人が必要です。したがって、それはより小さいグループの同じ年齢を持つハエと同性の同期を達成可能なさまざまな時点におけるミトコンドリアの酸素消費量の測定が可能です。

最初に、それは同じ年齢, 性別, ひずみのショウジョウバエを使用することが重要、結果 (図 6) の低可変性を得るため同じ条件で育った呼吸に変わる可能性が年齢、性別、遺伝子型とハエのダイエット。このプロトコルの実行の最も重要なステップは、thoraxes の透過プロシージャです。組織の劣化を避けるためにすぐに進むことが大切だし、も確認すること、thoraxes、よくグリセリン酸素消費量の最大料金が重要です。透過が正しく実行されていることとを結合比 (CI OXPHOS CI リーク、図 3) OXPHOS 透過処理したミトコンドリアの構造と機能の整合性は保持されることを確保するためだけでなく、シトクロム c (図 4) に対しては、品質管理として使用されます。迅速に作業と透過がうまく実行されるかどうかを確かめると考慮するトレードオフがあります。また、切り裂かれた thoraxes を操作するとき、常に氷の上機能が重要です。最も再現性のある結果 (図 6) を得るためには、同種の透過が必要と同じ動きが繰り返されることを確認することができます透過のテクニックを練習します。もう一つの重要なステップのサンプルの乾燥重量の決定であります。後、thoraxes に孵化する、実際、非常に機密性の高い、壊れやすい、劣化しやすいがいます。したがって、同様に、透過する乾物の定量に進んですぐに重要です。その一方で、組織の質量によって結果を正規化と精度で重量を決定することが重要です。Thoraxes 使用量を最適化することができます。商工会議所の35、あたり 1 つ胸郭を使用するプロトコルを合わせることができるが、乾燥重量の測定に限り、酸素消費量の測定で一定レベルの解像度が失われる可能性が。必要に応じて、thoraxes の量を増やすことができますが、サンプルでより多くのミトコンドリア、高く酸素消費量と室したがってする必要 reoxygenated することが重要です。この再酸素化室を開くことによって行うことができます、それは室内の空気の泡を挿入する確率を増加酸素を注入します。したがって、可能であれば (とき複雑な IV 最大呼吸容量は未定) を除く部屋を reoxygenate することを避けるためにください。実験を実行する前に、基質濃度の最適化も過度の集中による抑制効果を観察することがなく最高のミトコンドリアの酸素消費量を達成するために必要です。呼吸度計の部屋も潜在的な汚染を避けるために徹底的に掃除する必要があります。芳醇水とし、潜在的な生物学的汚染を取り除くために 70% のエタノール洗浄を開始することが重要です。疎水性阻害剤の汚染を避けるためには、次の 10 分の無水エタノールに潜伏することをお勧めします。最後に、芳醇な水でチャンバーの洗浄と 70% のエタノールでそれらを充填は、次の利用まで潜在的な汚染を避けます。

プロトコルは、他の基板、または異なる阻害剤の影響を検討する簡単に変更できます。たとえば、勉強する興味深い蛋白質はミトコンドリアのピルビン酸キャリア (MPC) です。このタンパク質の役割は、細胞質のミトコンドリアのマトリックスに生成されるピルビン酸を輸送することです。最近では、それは、タイプ 2 糖尿病38中など病態代謝の調節に重要な役割を果たすに示唆されています。ミトコンドリア代謝タンパク質 MPC の効果を勉強するには、だけではなく、ピルビン酸とリンゴ酸のピルビン酸と同時に注射を開始すると便利です。したがって、ピルビン酸の効果は独立して検討、リンゴ酸の効果から、後者は注入のみトリカルボン酸をサポートし、中間体が枯渇しないことを保証します。ピルビン酸の酸化反応が観察されるのではなく、また、MPC39の阻害剤を使用して場合このトランスポーターの制限を評価することが可能です。呼吸40最寄りの燃料源の潜在的な変化を観察することが可能になります。また、研究の関係でない場合、プロトコルを簡素化するいくつかの基板を省略することが可能です。たとえば、複合体の機能障害を勉強する私だけ、それ必要はありませんこのプロトコルですべての基板を使用します。

このプロトコルは、生体内での条件からそらすためいくつかの制限を示します。ミトコンドリアの酸素消費量の測定は呼吸媒体が空気飽和上純粋な酸素は30組織内酸素拡散の制限を防ぐために注入されるように記録されます。さらに、基質の濃度は、体内の状態を反映していないが過剰に注入されます。また、年齢、性別、ひずみ、ショウジョウバエのダイエットが結果に影響することができますに注意してくださいすることが重要です。これらのパラメーターは、結果を解釈するときを考慮するためです。このメソッドは、ミトコンドリアの分離を使用して他の細胞成分およびミトコンドリアの構造の整合性との相互作用としてのミトコンドリアの酸素消費を測定する手法よりも生理的にしかし近い条件と形態は、保存されている31。活性酸素産生またはミトコンドリア効率 (P/O 率) 測定27でなければならないなど、ミトコンドリアの分離がより有利なときに追加のパラメーターであることに注意してくださいすることが重要です。

ミトコンドリア機能障害の理解と代謝性疾患の基になるメカニズムからさまざまな化合物の病理学的にミトコンドリアの機能に及ぼす影響をテストに至るまで、様々 な目標を達成するためにこのメソッドを使用することができます。条件。さらに、それを使用して、ダイエットや温度の変化など、ミトコンドリアの代謝に及ぼす種々 の環境ストレスを観察できます。たとえば、生理活性合成分子ミトコンドリアの機能とミトコンドリア機能障害の治療の有効性を考察することが可能です。この方法はまた非常に老化プロセスに関連する根本的なメカニズムの研究に関連するになる異なる時点でミトコンドリアの機能を勉強する良いツールです。グリセリン thoraxes を用いた酸素消費量を介してミトコンドリア代謝の評価はセルが厳しい条件にさらされて、ミトコンドリア代謝の役割に関する知識をより確かに役立ちます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この研究は、国立科学工学研究協議会 (レベル、探索許可) およびユニヴェルシテ ・ ド ・ モンクトンから NP に補助金によって賄われていた。1塩基変異は、健康研究 (機構)、ニュー ・ ブランズウィック州イノベーション財団 (NBIF) およびユニヴェルシテ ・ ド ・ モンクトンのカナダの研究所から資金調達のサポートを確認したいと思います。EHC の作業をサポートするには、カナダ、脳カナダ、レベル、カナダ乳がん基金、ニュー ・ ブランズウィック州技術革新基金、ニューブランズウィックの健康研究財団のアルツハイマー協会とユニヴェルシテ ・ ド ・ モンクトン。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High-resolution respirometer Oxygraph O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 10022-02 Startup O2K respirometer kit
 
O2K-Titration Set  Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20820-03 Hamilton syringes with different volumes
 
Datlab software Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20700 Software for data acquisition and analysis
 
Fine-tipped antimagnetic forceps VWR 82027-400
 
Secura225D-1S-DQE Sartorius AG, Goettingen, Germany Semi-micro balance (distributed by several companies) 
 
Drosophila melanogaster wild-type w1118 Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA
Storage Condition: 24 °C
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378 EGTA
Storage Condition: RT
KOH Sigma-Aldrich P1767 CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity.
Storage Condition: RT
CaCO3 Sigma-Aldrich C4830
Storage Condition: RT
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383
Storage Condition: -20 °C
MgCl2.6H2O Sigma-Aldrich M9272
Storage Condition: RT
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Storage Condition: RT
Na2Phosphocreatine Sigma-Aldrich P7936
Storage Condition: -20 °C
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Storage Condition: RT
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Storage Condition: 2-8 °C
MES hydrate Sigma-Aldrich M8250
Storage Condition: RT
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S7900 Saponin
Storage Condition: RT
Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily.
KCl Sigma-Aldrich P9541
Storage Condition: RT
KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791
Storage Condition: RT
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Storage Condition: RT
BSA Sigma-Aldrich 05470
Storage Condition: 2-8 °C
Na2S2O4 Sigma-Aldrich 157953 Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity.
Storage Condition: RT
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Pyruvate
Storage Condition: 2-8 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily.
L-(-)-Malic acid Sigma-Aldrich M1000 Malate
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C.
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A5285 ADP
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C.
Cytochrome c from equine heart Sigma-Aldrich C7752 Cytochrome c
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.
L-Proline Sigma-Aldrich P0380 Proline
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma-Aldrich S2378 Succinate
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C.
sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt Sigma-Aldrich G7886 Glycerol-3-phosphate
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C.
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920 FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity.
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C.
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.
Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C.
Malonic acid Sigma-Aldrich M1296 Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage.
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily.
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674 Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C.
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine Sigma-Aldrich T7394 TMPD
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at  -20 °C.
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Ascorbate
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at  -20 °C.
NaN3 Sigma-Aldrich S2002 Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. 
Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.

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生化学、問題 134、ミトコンドリア、電子伝達系、代謝、高解像度の呼吸、キイロショウジョウバエ、透過
ショウジョウバエのティッシュの最小限の量を使用してのグリセリンの繊維でミトコンドリアの酸素消費量の測定
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Simard, C. J., Pelletier, G.,… More

Simard, C. J., Pelletier, G., Boudreau, L. H., Hebert-Chatelain, E., Pichaud, N. Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue. J. Vis. Exp. (134), e57376, doi:10.3791/57376 (2018).

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