Summary
I den här artikeln beskrivs en metod för att mäta syreförbrukningen med högupplösta respiration i permeabilized thoraxes av Drosophila. Denna teknik kräver en minimal mängd vävnad jämfört med den klassiska mitokondriella isolering tekniken och resultaten är mer fysiologiskt relevanta.
Abstract
Bananflugan, Drosophila melanogaster, representerar en framväxande modell för studier av metabolism. Faktiskt, drosophila har strukturer homolog till mänskliga organ, besitter mycket metaboliska vägar och har en relativt kort livslängd som gör studien av olika grundläggande mekanismer i en kort tidsperiod. Det är dock förvånande att en av mekanismerna som är nödvändiga för cellulär metabolism, mitokondriell respirationen, inte grundligt undersökts i denna modell. Det är troligt eftersom måttet på mitokondriell respirationen i Drosophila kräver oftast ett mycket stort antal individer och de uppnådda resultaten är inte mycket reproducerbara. Här beskrivs en metod som möjliggör exakt mätning av mitokondriell syreförbrukningen med minimala mängder av vävnad från Drosophila. Den här metoden är thoraxes dissekeras och permeabilized både mekaniskt med vassa pincetten och kemiskt saponin, så att olika föreningar att korsa cellmembranet och modulera mitokondriella respirationen. Efter permeabilisering utförs ett protokoll för att utvärdera de olika komplexen av elektronen transportsystemet (ETS) förmåga att oxidera olika substrat, samt deras svar på en uncoupler och flera hämmare. Denna metod ger många fördelar jämfört med metoder som använder mitokondriell isoleringar, eftersom det är mer fysiologiskt relevanta eftersom mitokondrierna fortfarande interagerar med andra cellulära komponenter och mitokondrie morfologi är bevarad. Dessutom prov preparat är snabbare, och resultaten är mycket reproducerbara. Genom att kombinera fördelarna med Drosophila som modell för studier av metabolism med utvärderingen av mitokondriell respiration, viktiga nya insikter kan vara avtäcka, särskilt när flugorna upplever olika miljömässiga eller patofysiologiska villkor.
Introduction
Bananflugan, Drosophila melanogaster, har använts som modellorganism för genetisk forskning för över ett århundrade1. Studiet av denna organism har inte bara lett till betydande grundläggande kunskap om könsbunden arv2, mutation rate3, utvecklingen av neurala system och cell öde bestämning4, men har också nyligen framträtt som en värdefullt verktyg för att studera mekanismerna som är inneboende till flera sjukdomar som Alzheimers och Parkinsons5,6. Dessutom är det en populär modell att studera åldrandet, eftersom de kan höjas i stort antal under en kort tidsperiod och har en kort livslängd. De äger också homologa strukturer till mänskliga organ, såsom oenocytes (hepatocyte-liknande celler), fett organ (fungerar på samma sätt som levern och vit fettvävnad), ett hjärta, insulinproducerande celler (motsvarar β-bukspottkörtelns celler), samt hemolymph transporterar metaboliter (analogt med blod av ryggradsdjur)7. Dessutom, de centrala vägarna i intermediär ämnesomsättning (inklusive insulin/insulin-liknande tillväxtfaktor-liknande signalväg och mål av Rapamycin-TOR vägar) är också mycket7. Av dessa skäl har Drosophila nyligen exploaterats för att beskriva de grundläggande mekanismer som styr ämnesomsättning, särskilt i sjukdomstillstånd inneboende mänskliga metabola sjukdomar som diabetes8. En viktig del av metabolismen är mitokondrien som integrerar flera vägar och utför en av livets viktigaste biologiska funktioner, ATP-produktion, via oxidativ fosforylering processen (OXPHOS). Med tanke på deras centrala roll i organismens ämnesomsättning är det inte förvånande att mitokondriella dysfunktioner är inblandade i många sjukdomar som Parkinson9 och Alzheimers sjukdomar10samt i amyotrofisk lateralskleros 11 , 12. de är också grundläggande determinanter av åldrandet. De är faktiskt de största producenterna av reaktiva syreradikaler (ROS) i cellen, vilket kan vara skadligt för cellen vid hög koncentration genom oxidativa skador11. Åldrande har också associerats till ackumulation av skadade eller muterade mitokondrie DNA13, mitophagy dysfunktioner14,15 , liksom nedsatt mitokondriell biogenes16. Mitokondrierna är också viktiga faktorer som påverkar cellernas homeostas som de kan utnyttja olika substrat för att justera flera cellulära funktioner enligt överflöd eller brist på makronäringsämnen17,18.
Faktiskt, de olika näringsämnena i kosten (kolhydrater, lipider och proteiner) rötas, absorberas och transporteras i cellerna. De omvandlas sedan i cytosolen, och de härledda substratesna transporteras in i mitokondriell matrisen där de producerar reducerande medel, såsom NADH och Forslund219. Dessa reducerande medel oxideras sedan av olika enzymatisk komplex av elektronen transportsystemet (ETS). Dessa komplex är inbäddade i det mitokondriella inre membranet, såsom komplex I och komplex II. Dessutom representerar andra enzymatisk komplex såsom på mitokondriella glycerol-3-fosfat dehydrogenas och på proline-dehydrogenas alternativa rutter för tillträdeet av elektroner i de ETS20,21. Dessa 'alternativa' komplex är särskilt viktiga i insekter, som enligt arten, de kan delta aktivt för att öka de respiration20,22,23,21. Elektroner från dessa ETS matningssystem överförs till ubikinon och därefter till komplex III, och sedan till komplex IV, tills den slutliga acceptorn, molekylärt syre. Detta elektronöverföring genererar en proton-drivkraft över det inre mitokondriella membranet köra fosforyleringen av ADP till ATP i komplex V (figur 1). Överväger den centrala rollen som mitokondrier i cellens homeostas, studera mitokondriell metabolism med den relevanta modell D. melanogaster representerar ett kraftfullt verktyg att avgränsa vilka underliggande mekanismer olika patofysiologiska villkor eller under cellulära och miljömässiga påfrestningar. Överraskande men uppmätta bara en handfull studier faktiskt mitokondriell andning i Drosophila24,25,26. Faktiskt, experiment som syftar till att utvärdera mitokondriella syreförbrukning kräver isolering av mitokondrier. Även om det är fördelaktigt för mätning av olika mitokondriella funktioner (såsom ROS produktion eller som markör för mitokondriell effektivitet27,28baserat på P/O), kräver dessa isoleringar generellt ganska stora mängder vävnad från flera individer24,29. Detta krav för höga mängder av vävnad och individer är en viktig begränsande faktor, särskilt med tanke på att alla individer bör vara i samma ålder och helst av samma kön för experiment, att göra måttet på andning vid annan tidpunkt pekar mödosamma i bästa. Dessutom även mitokondriell isoleringar kan ge betydande insikt i de grundläggande mekanismer som styr mitokondriell ämnesomsättning, har de metoder som används för att isolera mitokondrierna flera nackdelar såsom svårigheten att erhålla reproducerbara resultat , störningar av mitokondriell nätverk och ändring av mitokondriell struktur och funktion29,30,31.
Syftet med denna studie är att presentera ett robust protokoll för att mäta mitokondriell syreförbrukning i Drosophila använder endast en minimal mängd vävnad från mycket få individer. Detta protokoll består av mäta mitokondriell syre förbrukning i situ med permeabilized muskelfibrer29 från Drosophila thoraxes i kombination med högupplösta respiration32,33, 34 , 35. denna metod har också ytterligare fördelar jämfört med den klassiska mitokondriella isolering metoden eftersom interaktionerna med andra komponenter av cellen som väl som mitokondrie struktur och funktion bevaras mer i permeabilized fibrer29,31,36, vilket gör denna metod mer fysiologiskt relevanta. Med detta protokoll, kan mitokondriella funktioner noggrant utvärderas med hjälp av högupplösta respiration i endast tre thoraxes av Drosophila, med substrat vilket möjliggör bestämning av syreförbrukning vid flera olika steg av ETS. Detta protokoll kan därför hjälpa besvara viktiga frågor om de grundläggande mekanismer som styr ämnesomsättningen i samband med många miljömässiga eller patofysiologiska förhållanden genom att utnyttja den Drosophila-modellen.
Att mäta syreförbrukningen vid flera olika steg av ETS och utvärdera hur olika substrat bidra till respiration, olika substrat (figur 1), uncoupler och -hämmare är begagnade30 efter permeabilisering av den vävnad. Specifikt, utförs sekventiell tillägg av olika substrat för att stimulera införandet av elektroner genom olika komplex av ETS. En uncoupler, karbonyl cyanid 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), sedan läggs vid optimal koncentration att mäta icke-kopplade respirationen, dvs icke-phosphorylating andningen stimuleras till maximal syreförbrukning. Sekventiell hämningar av komplex I, II och III skall sedan genomföras för att övervaka den kvarvarande syreförbrukning som beror på icke-ETS oxidationsreaktioner. Slutligen, komplex IV maximal andning kapacitet kan utvärderas genom injektion av N, N, N', N, - tetrametyl - p-fenylendiamin (TMPD), en leverantör av konstgjorda elektron och askorbat. Det är viktigt att notera att experimenten utförs vid 24 °C eftersom det är den temperatur vid vilken flugorna höjs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. reagenser förberedelse
- Förbered följande lösningar för dissekering och permeabilisering av vävnad.
- Förbereda bevarande lösning: 2.77 mM CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5.77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, 20 mM taurin, 15 mM Na2phosphocreatine, 20 mM Imidazol, 0,5 mM Ditiotreitol, och 50 mM K-MES, pH 7.1 (kan lagras vid-20 ° C).
- Förbereda saponin lösning: 5 mg saponin i 1 mL bevarande lösning (förbereda färska dagligen).
- Förbered följande lösningar för mätning av respirationen.
- Förbereda respiration medium: 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 3 mM HEPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2och 0,2% BSA (w/v), pH 7,2.
- Förbereda substrat, uncoupler, -hämmare. Lös alla substrat i H2O, och lös upp uncoupler FCCP samt hämmare i etanol absolut (utom malonate som späds ut i H2O). Neutralisera de flesta av de substrat samt malonate (se Tabell för material). Alla koncentrationer anges i protokollet är slutliga koncentrationer släpper 2 mL chambers.
2. upprättande och kalibrering av den högupplösta Respirometer.
- Tvätta den kammare, caps och proppar av respirometer tre gånger med 70% etanol och tre gånger med destillerat vatten.
- Kalibrera vid noll syrekoncentration av: Pipettera 2,3 mL respiration medium i kamrarna och Lägg till 10 mg natrium Ditionit. Även om kammaren maximal volym är 2 mL, läggs 2,3 mL för att säkerställa att ingen luftbubbla förblir under proppen när stängningsen kamrarna. Nära kamrarna med proppar och mäta syrehalten för 10-20 min. Kalibrera elektroderna vid noll syrekoncentration av med resulterande syre materialåtgången.
- Tvätta kamrarna med destillerade vatten, inkubera i absolut etanol i 10 min och skölj sedan med destillerat vatten.
- Kalibrera på luft mättnad: Pipettera 2,3 mL respiration medium i kamrarna, infoga proppar, aspirera överskott medium ovanpå proppar och lyft sedan proppar med mellanlägget. Överskjutande respiration medium är pipetteras i kamrarna (volym av 2 mL totalt) för att undvika luft bubblor efter stängning kamrarna.
- Övervaka syreförbrukningen för 45 min till en timme, tills syrekoncentrationen (blå trace) är stabila runt 250 nM vid 24 ° C.
3. dissektion av flugor och permeabilisering vävnad
- Kontrollera alla åtgärder utförs på is.
- Bedöva sex manliga flugor av samma stam, samma ålder och uppvuxen på samma kost på is för att underlätta dissekering av flugor (vildtyp w1118, 15 dagar gammal, matas på majsmjöl medium).
- Använda en skalpell och spetsig pincett, dissekera flugor (ta bort huvuden och abdomens) för att hålla endast de thoraxes som innehåller flygmuskler. Detta steg kan göras med blotta ögat. Hantera de resulterande thoraxes med spetsig pincett.
- Överföra tre dissekerade thoraxes i en 25 mm petriskål innehållande 2 mL iskallt bevarande lösning med hjälp av tången.
- Med spetsig tången, mekaniskt permeabilize thoraxes genom att sätta spetsen på tången i thoraxes och upprepade gånger slita isär vävnaden för att erhålla ett löst sammanhållet nätverk.
- I en 24-well platta, Fyll två brunnar med 12,5 µL av saponin lösningen och 1 mL bevarande lösning att erhålla en slutlig koncentration på 62,5 µg/mL saponin. Fyll två intilliggande brunnarna med 1 mL av respiration medium.
- Med spetsig tången, överför tre permeabilized thoraxes till den utspädda saponin lösningen och inkubera med mild agitation i orbitalskak, på is, i 20 min.
- Efter den sistnämnda inkubationen, överföra fibrerna i intilliggande brunnar fyllda med respiration mediet med mild omskakning, på is, för 5 min att skölja av saponin.
4. bestämning av torrvikt
- Torka de permeabilized thoraxes på ett absorberande yta och flip 3 - 4 gånger med spetsig tången så att all fukt avlägsnas.
- Väga in de tre thoraxes tillsammans på en microbalance. Observera den erhållna vikten eftersom det kommer att användas att normalisera de mitokondriella syre förbrukning.
- Överföra vävnader omedelbart i en droppe av respiration medium på is.
5. syre förbrukning priser bestämning
- Öppna avdelningar med respirometer (ta bort proppar) och lägga till 10 mM av pyruvat och 2 mM i malate i varje kammare.
- Lägg till permeabilized vävnaderna direkt in i kamrarna fylld med respiration medium.
- Byt ut proppar med mellanlägget.
- Med en 60 mL spruta, samla syre direkt från en syre tank och injicera 2-5 mL syre genom propp kapillären för varje kammare så att syre diffusion genom vävnaden inte kommer att begränsa syreförbrukning.
- Infoga en Hamilton spruta i kapillären varje proppen att se till att thoraxes kvar i kammaren.
- Stäng kamrarna helt när syrehalten är runt 400 nM, uppnå syrenivåer ovanför air mättnad (omkring 160% luft mättnad) inuti kamrarna.
- Stoppa och starta om de omrörare till check för luftbubblor i kamrarna.
- Ange massan av vävnad som vägde tidigare för att normalisera andningen priser av massa vävnad (mg), visar massa-specifika syreförbrukning (pmol O2 consumed.s-1.mg-1 vävnad).
- När syreförbrukningen är stabiliserad (röda spår), lägga till 5 mM ADP med en Hamilton spruta.
- Efter varje injektion, skölj sprutorna med destillerat vatten, 70% etanol, och destillerat vatten igen.
- När syreförbrukningen är stabilt igen, injicera 5 µL av en 4 mM av cytokrom c.
- Gå vidare till de sekventiella injektionerna av de följande substratesna att utvärdera mitokondriella syreförbrukningen på olika steg av ETS:
- Tillsätt 5 µL av en 2 M prolin.
- Tillsätt 10 µL av en 1 M succinat.
- Tillsätt 30 µL av en 1 M glycerol-3-fosfat.
- Injicera uncoupler FCCP på ett sätt som titrering med 0,5-1 µM (2 µL 1 mM lösning) fram till den optimala koncentrationen är nådd, d.v.s. koncentrationen att uppnå den högsta syreförbrukningen som möjligt utan hämning (försiktighet: se tabellen material).
- Injicera de följande hämmare sekventiellt för att helt hämma elektron flux i ETS för att mäta kvarvarande syreförbrukningen (ROX) dvs icke-respiratoriska reaktioner såsom cyklooxygenas reaktioner bland andra:
- Tillsätt 1 µL av en 1 mM Rotenon (försiktighet: se Tabell för material).
- Tillsätt 5 µL av en 2 M malonate (försiktighet: se Tabell för material).
- Tillsätt 1 µL av en 5 mM antimycin A (försiktighet: se Tabell för material).
- Tillsätt 0,2 mM ascorbaten och 0,5 mM TMPD sekventiellt in i kamrarna, börjar med den askorbat att mäta syreförbrukningen av komplex IV.
- Lägg till 20 mM av natriumazid hämma komplex IV (försiktighet: se Tabell för material).
- När signalen är stabil, öppna avdelningar med mellanlägget, åter syresätta kamrarna genom att injicera 2 mL av rent syre och stänga avdelningar när koncentrationen är runt 250-300 nmol.mL-1.
- Mäta signalen för 10-15 min och beräkna kemiska bakgrunden, dvs syreförbrukningen på grund av autoxidation av TMPD.
6. rengöring av Respirometer
- Efter mätningar, skölj kamrarna med destillerat vatten en gång och skölj kamrarna tre gånger i 70% etanol.
- Inkubera i absolut etanol för 10 min att inaktivera hämmare.
- Skölj tre gånger med destillerat vatten, fylla kamrarna med 70% etanol och ersätta proppar och mössor till nästa användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett representativt spår av mitokondriell syreförbrukningen med hjälp av protokollet som beskrivs ovan ges i figur 2. De pyruvat och malate injiceras i kamrarna tillsammans med permeabilized muskelfibrerna hänvisas till CI-läcka respirationen, dvsnär anläggningen I av ETS stimuleras av NADH produceras genom oxidation av pyruvat och malate via den tricarboxylic syra cykel (CI). Under denna respiration klassar upprätthålls främst mitokondriell syret för att kompensera för proton läckan, dvsprotonerna passerar från det intermembrane utrymmet till mitokondriell matrisen, när ATP synthase inte är aktiv (läcka)30. När ADP läggs, ATP-syntas aktiveras och elektronerna överförs från anläggningen jag till komplex IV med samtidiga fosforylering av ADP till ATP (CI-OXPHOS), vilket resulterar i ökade mitokondriell syreförbrukning. OXPHOS koppling förhållandet beräknas som CI-OXPHOS/CI-läcka och tas vanligen som en bra indikator på mitokondriell kvalitet och mitokondrie koppling30. I Drosophila, skall detta minst än 6.0 (figur 3). Om det är under detta värde, bero det på problem med den vävnad förberedelsen eller en mitokondriell dysfunktion. Tillägg av cytokrom c tillåter bestämning av integriteten hos det yttre mitokondriella membranet och används därför som en kvalitetskontroll av preparatet (figur 4). Faktiskt, cytokrom c binds löst till det inre mitokondriella membranet och normalt tvättas bort om det yttre mitokondriella membranet är skadad under processen permeabilisering. Som ett resultat, kommer lägga exogena cytokrom c avsevärt öka syreförbrukningen om yttre mitokondriella membranet är skadad och den endogena cytokrom c bryts. En ökning på mindre än 10-15% syreförbrukning (figur 4) illustrerar vanligtvis lämpliga integritet av yttre mitokondriella membranet29. I figur 3 och 4, gröna spår erhölls från icke-adekvat permeabilisering och hantering av proverna (överdriven avrivning av vävnad för figur 3, och vägde efter en längre tid på absorberande ytan för figur 4), rött spår utgör proverna adekvat permeabilized och hanteras. Dessa resultat belysa att lämpliga permeabilisering villkor är avgörande för tillförlitlig bedömning av mitokondriell syreförbrukning.
De följande substrat som används under experimenten ger elektroner till ubikinon och får öka elektron flux i ETS. Prolin är en aminosyra som kan användas som energi substrat särskilt i insekter23, men också hos däggdjur under akut svält eller sjukdomstillstånd37. Tillägg av prolin i kamrarna tillåter för att utvärdera bidraget av prolin dehydrogenas (ProDH) till den elektron fluxen i ETS, när elektroner flödar från båda komplex jag och ProDH och deltar i OXPHOS-processen (CI + ProDH-OXPHOS). Med tillägg av Succinat, kan bidraget av komplex II (Succinat dehydrogenas) till ETS observeras (CI + ProDH + CII-OXPHOS). Injektion av glycerol-3-fosfat (G3P), ytterligare ökar mitokondriernas syreförbrukningen eftersom detta substrat stimulerar den mitokondriella glycerol-3-fosfat dehydrogenas (G3PDH) som är en del av glycerofosfat transfer och överföring elektroner till ETS (CI + ProDH + CII + G3PDH-OXPHOS). Både ProDH och G3PDH har visat sig vara särskilt aktiv i flera arter av insekter och är därför viktiga i detta protokoll med Drosophila20,21,22,23,32 .
När den uncoupler FCCP läggs, icke-kopplade respirationen (ETS tillstånd) erhålls, dvs, maximal syreförbrukningen som representerar den maximala kapaciteten av ETS (CI + ProDH + CII + G3P-ETS). FCCP är en protonophore som transporterar protonerna från intermembrane utrymme i mitokondriell matrisen utan att passera genom komplex V. FCCP har titreras noggrant, som koncentrationer under optimalt resultat i icke-maximal syreförbrukning och icke-stabil andning priser medan koncentrationer över optimalt resultat hämning av mitokondriell syreförbrukning (figur 5). När substratesna och uncoupler tillsätts, hämning av komplex I, II och III kan vara sekventiellt utförs med rotenon, malonate och antimycin A, respektive. Med varje hämmare används, observeras en minskning av mitokondriell syreförbrukning, tills de når den lägsta syreförbrukningen efter tillsats av antimycin A. Priset nådde efter tillägg av alla hämmare är de kvarvarande syre förbrukning30. Det representerar syreförbrukningen på grund av icke-mitokondriell oxidativ reaktioner såsom cyklooxygenas reaktioner och reaktiva arter produktion t ex, och har därför ska dras från alla de andra priserna mäts.
TMPD är en konstgjord elektron transportör som ger elektroner direkt till komplex IV, förbi alla komplexen uppströms, möjliggör mätning av komplex IV maximal andning kapacitet. Detta substrat är emellertid utsatt för autoxidation, så askorbat måste vara tillsätts före TMPD att begränsa men inte helt undvika detta autoxidation. För att korrigera för den återstående autoxidation av TMPD, den komplexa IV hämmare natriumazid läggs till kamrarna och syreförbrukningen registreras sedan i 10-15 minuter. Detta syreförbrukning representerar därför kemiska bakgrunden eller med andra ord autoxidation av TMPD som bör beaktas vid beräkningen av komplex IV maximal andning kapacitet.
Figur 1 . Schematisk framställning av mitokondriell elektrontransport av elektronen transportsystemet och oxidativ fosforylering i mitokondriernas inre membranet. I: komplex I; II: komplex II; III: komplex III; IV: komplex IV. V: ATP synthase; Acetyl-CoA: acetyl-coenzym A; CYT c: cytokrom c; e–: elektron; G3P: glycerol-3-fosfat; G3PDH: mitokondriella glycerol-3-fosfat dehydrogenas; H+: proton; PRODH: proline dehydrogenas; TCA: tricarboxylic syra cykel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa spår av mitokondriell syrekoncentration (blå trace) och konsumtion (röda spår) på permeabilized thoraxes av Drosophila. Varje injektion är representerad med en pil som anger den förening som injiceras (Pyr: pyruvat; mal: malate; ADP; CYT c: cytokrom c; Pro: proline; Succ: succinat; G3P: glycerol-3-fosfat; FCCP: karbonylgruppen cyanid 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone; Röta: Rotenon; Malo: malonate; Ant A: antimycin A; TMPD: N, N, N', N, - tetrametyl - p-fenylendiamin; ASC: askorbat; SAZ: Natriumazid). Varje mitokondrie syre materialåtgång betecknas i diagrammet, när syreförbrukningen (röda trace) har stabiliserats. Cytokrom c effekt betecknar integriteten hos det yttre mitokondriella membranet (se text för detaljer). Kvarvarande syreförbrukning representerar syreförbrukningen på grund av oxidativ sida reaktioner i cellerna och har ska dras till alla de andra priserna mätt. Kemisk bakgrund betecknar syreförbrukningen endast tack vare autoxidation av TMPD och måste beaktas vid beräkningen av komplex IV maximal andning kapacitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Representativa spår av ett giltigt (röda spår, avdelning A) och otillräcklig (gröna spår, avdelning B) Svaren till tillägg av ADP. Rött spår motsvarar kammaren A och gröna tracen motsvarar kammaren B, under samma experiment. Rött spår erhölls från thoraxes tillräckligt permeabilized medan gröna tracen erhölls efter överdrivet tårflöde vävnader under permeabiliseringen. När ADP läggs, en ökning av syreförbrukningen förväntas, liksom det röda spåret. OXPHOS koppling nyckeltal beräknas som CI-OXPHOS/CI-läcka och presenteras i diagrammet. Ett ratio på mindre än 6.0 i Drosophila tyder på ett problem i den mitokondriella kopplingen och kännetecknas av provet nedbrytning eller mitokondriell dysfunktion företrädd av det gröna spåret. Pyr: pyruvat; mal: malate. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativa spår av ett giltigt (röda spår, avdelning A) och otillräcklig (gröna spår, avdelning B) svar på tillägg av cytokrom c. Rött spår motsvarar kammaren A och gröna tracen motsvarar kammaren B, under samma experiment. Rött spår erhölls från thoraxes tillräckligt permeabilized och hanteras, medan gröna tracen erhölls efter thoraxes var avsiktligt torkat under en längre tid på absorberande ytan före vägning. Cytokrom c ökar vanligtvis inte mitokondriell syreförbrukning, som kan ses på röda spåret, som betecknar att det yttre mitokondriella membranet är intakt. Om tillägg av exogena cytokrom c ökar dock betydligt mitokondriell syreförbrukning på mer än 15%, som kan ses på det gröna spåret, antyder det att det yttre mitokondriella membranet är skadad och därmed att provet bryts och bör vara kasseras. Pyr: pyruvat; mal: malate; CYT c: cytokrom c. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 : Representativa spår av mitokondriell syrekoncentration (blå trace) och konsumtion (röda spår) efter titrering av FCCP. Olika injektioner av FCCP vid flera koncentrationer måste utföras noga för att fastställa maximala syreförbrukningen utlöses av denna uncoupler. Otillräckliga koncentrationer tillåter inte bedömning av maximal syreförbrukning och kännetecknas av icke-stabil andning priser, medan FCCP överskott hämmar mitokondriell syreförbrukning. Pilarna anger de olika injektionerna av FCCP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Reproducerbarhet av mitokondriell syreförbrukning valutakurserna under en typisk experiment som erhålls med hjälp av två olika avdelningar (röda spår, kammare A; gröna spår, avdelning B) med en respirometer. Rött spår motsvarar kammaren A och gröna tracen motsvarar kammaren B, under samma experimentera med Drosophila från samma ålder, kön, stam och uppvuxen på samma kost, liksom protokollet beskrivs. Båda proverna var normaliserade med massa torr pappersnäsduk vägde som beskrivs i protokollet (0,53 och 0,66 mg för chambers A och B, respektive). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie beskrivs en metod för provberedning före mätningarna av mitokondriell syreförbrukning i Drosophila. Denna metod utvecklades för att lösa olika problem relaterade till de protokoll som använder mitokondriell isoleringar, särskilt när det gäller varaktighet och antal individer krävs. Istället för att arbeta med mitokondriell isoleringar som vanligtvis kräver stora beloppet av vävnaderna från flera individer, utförs detta experiment på permeabilized muskelfibrer från thoraxes av några Drosophila. I detta protokoll behövs endast tre individer optimala resultat ska visas. Därför är mätning av mitokondriell syreförbrukning vid olika tidpunkter möjligt eftersom det är mer möjligt att synkronisera en mindre grupp av flugor med samma ålder och av samma kön.
Först, är det viktigt att använda Drosophila i samma ålder, kön, stam och uppvuxen i samma förutsättningar att få låg variabilitet i resultaten (figur 6), som andning kan förändras med ålder, kön, genotypen och kosten för flugorna. Det mest kritiska steget i genomförandet av detta protokoll är det vilket förfarandet av thoraxes. Det är mycket viktigt att gå vidare snabbt att undvika nedbrytning av vävnad, och det är också viktigt att se till att thoraxes är väl permeabilized för att ha den maximala andelen syreförbrukning. Att säkerställa att permeabiliseringen har utförts korrekt och att mitokondrierna strukturella och funktionella integritet bevaras efter permeabilisering, den OXPHOS koppling baserat (CI-OXPHOS/CI-läckage, figur 3), samt svar till cytokrom c (figur 4) används som kvalitetskontroller. Det är en avvägning att beakta mellan arbeta snabbt och göra säker vilket är välgjord. Det är också viktigt att alltid arbeta på is när manipulera de dissekerade thoraxes. För att erhålla de mest reproducerbara resultat (figur 6), homogen vilket är nödvändigt och öva tekniken för vilket hjälper till att se till att samma rörelser upprepas. Ett annat viktigt steg är bestämning av torrsubstansen av provet. Ja, efter thoraxes inkuberas, de är mycket känsliga, sköra och benägna att nedbrytning. Likaså att permeabiliseringen är snabbt vidare till bestämning av torrvikt därför viktigt. Däremot, är det viktigt att fastställa vikten med noggrannhet som resultaten är normaliserade genom massan av vävnaden. Mängden thoraxes används kan också optimeras. Protokollet kan anpassas för att använda en enda thorax per kammare35, men en viss nivå av resolutionen kan gå förlorade i mätningen av syreförbrukning som vid fastställandet av torrsubstansen. Mängden thoraxes kan ökas vid behov, men det är viktigt att notera att fler mitokondrier i provet, ju högre syreförbrukningen och kamrarna måste därför vara reoxygenated. Denna reoxygenation kan göras genom att öppna avdelningar och injicera syre, men det ökar sannolikheten för att infoga luftbubblor i kammaren. Därför, om möjligt, försöka undvika att syresätta kamrarna (utom när har komplex IV maximal andning kapacitet skall fastställas). Innan du kör experimenten, är optimering av substrat koncentrationer också nödvändigt för att uppnå högsta mitokondriell syreförbrukningen utan att iaktta hämmande effekter på grund av en överdriven koncentration. Avdelningar med respirometer måste också rengöras noggrant för att undvika potentiella föroreningar. Det är viktigt att starta rengöring med destillerade vatten och sedan 70% etanol bli av potentiella biologiska föroreningar. Efter detta, en inkubation i absolut etanol för 10 min rekommenderas att undvika kontaminering av hydrofoba hämmare. Slutligen, sköljning kamrarna med destillerade vatten och fylla dem med 70% etanol kommer att undvika potentiella föroreningar tills nästa utilizationen.
Protokollet kan enkelt modifieras för att studera effekten av andra substrat eller olika hämmare. Exempelvis är en intressant protein att studera mitokondriell pyruvat transportören (MPC). Rollen av detta protein är att transportera pyruvat genereras i cytosolen in i mitokondriell matrisen. Det har nyligen föreslagits för att spela en viktig roll i moduleringen av metabolism under sjukdomstillstånd såsom under typ 2-diabetes38. För att studera effekten av proteinet MPC på mitokondriell metabolism, är det lämpligt att börja injektionerna med pyruvat endast i stället för pyruvat och malate samtidigt. Således, effekten av pyruvat studeras självständigt från effekten av malate, som den senare injiceras för att endast stödja cykelns tricarboxylic syra och säkerställa att intermediärer inte är uttömda. Det är också möjligt att använda hämmare av MPC39 för att utvärdera om en begränsning av denna transportör i stället för att oxidation av pyruvat observeras. Sedan skulle det vara möjligt att observera en potentiell förskjutning i rekommenderad bränslekälla för respiration40. Det är också möjligt att utelämna vissa substrat för att förenkla protokollet om det inte är relevant för studien. Exempelvis för att studera en dysfunktion av komplexet jag bara, det är inte nödvändigt att använda alla de substrat som presenteras i detta protokoll.
Detta protokoll presenterar vissa begränsningar att avleda från i vivo villkor. Mätningar av mitokondriell syreförbrukning bokförs när respiration medium över luft-mättnad, som rent syre sprutas för att förhindra begränsning av syre diffusion inuti vävnaden30. Dessutom injiceras koncentrationerna av substrat i överskott, vilket inte återspeglar villkoren i vivo . Det är också viktigt att notera att ålder, kön, stam och diet av Drosophila kan påverka resultaten. Dessa parametrar ska därför beaktas när man tolkar resultaten. Denna metod är emellertid närmare fysiologiska villkor än metoder med mitokondriell isoleringar för att mäta mitokondriell syreförbrukning, som interaktionen med andra cellulära komponenter och den strukturella integriteten av mitokondrier och morfologi är bevarade31. Det är viktigt att notera att mitokondriell isoleringar är mer fördelaktiga när ytterligare parametrar såsom ROS produktion eller mitokondrie effektivitet (P/O förhållandet) har uppmätta27.
Denna metod kan användas för att uppnå olika mål, allt från förståelsen av mitokondriella dysfunktioner och de bakomliggande mekanismerna av metabola sjukdomar, att testa effekterna av olika föreningar på mitokondriella funktioner under patologiska villkor. Dessutom kan det användas för att observera effekterna av flera miljöpåfrestningar på mitokondriell metabolism, såsom förändringar i kost eller temperatur. Det är exempelvis möjligt att studera effektiviteten av bioaktiva syntetiska molekyler på mitokondriella funktioner och behandling av mitokondriella dysfunktioner. Denna metod är också ett bra verktyg för att studera de mitokondriella funktionerna vid olika tidpunkter, vilket gör det mycket relevanta för studien av de grundläggande mekanismer relaterade till åldrandet. Bedömningen av mitokondriell metabolism via syreförbrukningen med permeabilized thoraxes kommer säkert att hjälpa dig för att förbättra vår kunskap om rollen av mitokondriell metabolism när cellen utsätts för utmanande förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie har finansierats genom bidrag från de nationella vetenskaperna och Engineering Research Council (NSERC, discovery grant) och Université de Moncton till NP. LHB vill erkänna finansieringsstöd från Canadian Institute of Health Research (CIHR), New Brunswick Innovation Foundation (NBIF) och Université de Moncton. Arbetet i EHC stöds av Alzheimers Society of Canada, hjärnan Kanada, NSERC, kanadensisk Breast Cancer Foundation, New Brunswick Innovation Foundation, New Brunswick hälsa Research Foundation och Université de Moncton.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Fine-tipped antimagnetic forceps | VWR | 82027-400 | |
| Secura225D-1S-DQE | Sartorius AG, Goettingen, Germany | Semi-micro balance (distributed by several companies) |
|
| Drosophila melanogaster wild-type w1118 | Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA | Storage Condition: 24 °C |
|
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA Storage Condition: RT |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | Storage Condition: RT |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Storage Condition: -20 °C |
| MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | Storage Condition: RT |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Storage Condition: RT |
| Na2Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | Storage Condition: -20 °C |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | Storage Condition: RT |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Storage Condition: 2-8 °C |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | Storage Condition: RT |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 | Saponin Storage Condition: RT Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily. |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | Storage Condition: RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | Storage Condition: RT |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Storage Condition: RT |
| BSA | Sigma-Aldrich | 05470 | Storage Condition: 2-8 °C |
| Na2S2O4 | Sigma-Aldrich | 157953 | Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Pyruvate Storage Condition: 2-8 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily. |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Malate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C. |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A5285 | ADP Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C. |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | Cytochrome c Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Proline Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | Succinate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C. |
| sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt | Sigma-Aldrich | G7886 | Glycerol-3-phosphate Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C. |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C. |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C. |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily. |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C. |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | TMPD Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Ascorbate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
References
- Stephenson, R., Metcalfe, N. H. Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use. The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).
- Morgan, T. H. An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila. Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).
- Dobzhansky, T., Wright, S. Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura. Genetics. 26 (1), 23-51 (1941).
- Zipursky, S. L., Rubin, G. M. Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).
- Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease. The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).
- Blandini, F., Armentero, M. T. Animal models of Parkinson's disease. FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).
- Baker, K. D., Thummel, C. S. Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila. Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).
- Morris, S. N. S., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).
- Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).
- Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T.
- Szibor, M., Holtz, J.
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- López-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. Mitochondrial biogenesis and healthy aging. Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).
- Muoio, D. M. Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock. Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).
- Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M.
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).
- McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. "Alternative" fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).
- Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production. PLOS ONE. 10 (3), e0120600 (2015).
- Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor. Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).
- Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333 (2016).
- Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster. The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).
- Miwa, S., Brand, M. D. The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).
- Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).
- Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria. Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).
- Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males. Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).
- Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., Côté, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies. Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways. Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).
- Bender, T., Martinou, J. C. The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- McCommis, K., et al. An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion. Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).
