Summary
Здесь мы представляем протокол для сбора образцов крови от крыс подключичную Вену.
Abstract
Сбор крови с достаточным объемом крови имеет важное значение в подопытных животных. Забора крови из Вены хвост крысы является популярным и меньше стрессовых ситуаций по сравнению с другими более агрессивные методы, такие, как ретро орбиталь сплетения образец коллекции. Однако этот метод сбора крови иногда ограничивается неудовлетворительной успеха. Здесь мы представляем метод для сбора крови через пункция подключичной вены. Подключичную Вену расположен прямо под ключицы и этом ключе является достаточно большим, чтобы выполнить требования объем сбора крови. Наши результаты показывают, что этот метод является безопасным и применимо для сбора проб крови с объем требуемых крови. Сбор крови через пункция подключичной вены может служить метод коллекции альтернативных крови в случае неудачных хвост вен проб крови крыс.
Introduction
Сбор крови имеет важное значение в исследований на животных. Целевой вен для сбора крови включают сплетения ретро орбиталь, яремную Вену, подкожной вены, хвост кровеносных сосудов и сонной артерии1,2,3,4. Иногда крови могут быть получены от брюшной аорты, полой вены или даже сердца5,6,7. В таких случаях животные должны быть принесены в жертву и не может использоваться для последующего наблюдения; Таким образом, эти методы используются в повседневной работе экспериментальных. Сбор крови из Вены хвост крысы является популярным и меньше стрессовых ситуаций по сравнению с вышеупомянутые методы8.
Однако забора крови из Вены хвост иногда ограничивается неудовлетворительной успеха. Иногда это также трудно получить достаточный объем крови этим методом. Как подключичную Вену достаточно большой и расположен прямо под ключицы кости, пункция подключичной вены может быть альтернативный метод для отбора проб крови, если обычной крови коллекции методы оказываются безуспешными. Здесь мы представляем метод сбора крови посредством пункция подключичной вены в крыс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование был одобрен Комитетом Центральной Южной университета этики исследований животных из больницы Xiangya второй (Чанша, Китай). Манускрипт был подготовлен согласно прибытия (животное исследования: отчетности в Vivo экспериментов) рекомендации9.
1. материал и животных подготовка
- Подготовить необходимые материалы: Скотч, агент эпиляции, 75% этанола, пробирки, 2,5 мл шприц, связанных с иглой (24 G, 0.6 мм x 25 мм), волос бритва, электронные весы и колеи (см. Таблицу материалы).
- Используйте 20 крысах Sprague-Dawley (SD), возрасте 8-10 недель и массой 153-200 г (см. Таблицу материалы). Поддерживать крыс в соответствии с руководство по уходу и использованию лабораторных животных10.
- Дом крысы при стандартных условиях с бесплатным доступом к продовольствию и питьевой воде. Держите их в клетках2 530 см с постельным бельем древесно стружечные (2 крысы в клетке). Сохранить животных в комнатной температуре контролируемой температурой около 25 ° c.
- Вызвать общий наркоз (Натрий Пентобарбитал 40 мг/кг) в всех животных через внутрибрюшинной инъекции перед пункция подключичной вены.
- Место крыса в лежачем положении. Исправьте задних конечностей в удобном положении и исправить параллельно оси тела просто рядом ствола верхней конечности.
Примечание: Не механическая вентиляция необходима для выполнения этой процедуры (рис. 1). - Очистите обе стороны подключичный пространства для удаления шерсти (с волос бритва и эпиляции агента, см. Таблицу материалы) и любых видимых загрязнений. Протрите шеи и грудной клетки кожи с 75% этанола. Держите области для прокола, чистой и сухой марлей.
2. Процедура сбора крови
Примечание: Обе стороны подключичную Вену подходят для прокола, и здесь мы выбираем с правой стороны для прокола. Расположение и направление правой ключицы идентифицируются оператора большой палец левой руки (рис. 2). Супрастернальные ямки нежно коснулся с указательный палец, как супрастернальные ямки в направлении стрелки (рис. 2).
- Промывайте стерильной 2,5 мл шприц с раствором гепарина (10 МЕ/мл).
- Найти узел прокол 0,5 мм каудально к внешней области 1/3 правой ключицы (рис. 3). Аккуратно переместите шприц в кожу на сайте проколам. После того, как игла входит в кожу подключичный, отрицательное давление оператора правой рукой (рис. 4).
Примечание: Объем средняя и максимальная крови являются 1.0 мл и 1.4 мл, соответственно. Направление иглы позиционируется к супрастернальные ямки и должно быть почти параллельно ключицы, он просто кзади. Обычно подключичной вены можно добраться, вставляя иглу около 2 мм в этом направлении. После того, как игла входит в Вену, кровь будет ввести шприц под отрицательным давлением.- Поддерживать отрицательное давление до тех пор, пока достаточное количество крови обращается (рис. 5).
- Если коллекция крови подключичную Вену не является успешным, снять иглу в подкожной области и Отрегулируйте направление иглы слегка интерьера к грудине.
- Если три попытки не удались, избежать подключичную Вену с той же стороны и использовать контралатеральную сторону для забора крови.
- После сбора крови удалить прокола иглой и приложите давление к проколам сайт для 1-2 минут, чтобы остановить кровотечение.
Примечание: Давление должно быть очень нежный для предотвращения удушья.
3. кровь образец обработки
- Перенесите крови в антикоагулянт покрытием вакуумная трубка (с ЭДТА) и центрифуги для 10 мин на 1600 x g для сбора плазмы.
- Аспирационная супернатант чистой трубки и хранить при температуре-80 ° C (рис. 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В общей сложности 20 SD крысы (мужской n = 10, женский n = 10) были использованы здесь. Collectionwas крови, выполняются квалифицированными операторами, которые провели более 20 крови выборок из подключичной вены в крыс, а также начинающих операторов, которые имеют не пункция подключичной вены опыт крыс и других животных. До операции начинающих смотрел по крайней мере 3 процедуры, выполняемые квалифицированными операторами.
Забор крови удалось 17 крыс через доступ к правой подключичной вены. Эта процедура не в 3 крысы (1 в группе квалифицированных) и 2 в группе начинающих, и забор крови был успешным через левую подключичную Вену доступ в эти 3 крысы. Время курса и кровь объем собранных для каждого случая приведены в таблице 1. Коэффициент успеха был похож между группой начинающих (80%) и группе квалифицированных (90%, p = 0.531). Коэффициент успеха был 100% для обеих групп при включении дополнительных левую подключичную Вену доступов в 3 крысы. Две хвостатые студента t-тест показал, что существует никакого существенного различия на время расходуется между группой начинающих и опытных группой (102,1 ± 14,9 s против 84.3 ± 9.7 s, p = 0,33, рис. 7). Никаких серьезных осложнений произошло во всех процедурах, например, пневмоторакс, hemopneumothorax или крупных кровотечение во время или после операции. Все животные выжили и восстановить в течение 30 минут после забора крови.
Чтобы продемонстрировать трудности обучения процедуре прокола, мы далее сравнивали количество вывода между квалифицированной и начинающих групп. Как показано в таблице 2, среднее количество снятия в группе квалифицированных немного меньше, чем в группе начинающих (1,6 ±0, 3 против 2,5 ±0, 4), но нет никакой статистической значимости (p = 0.0913).
Рисунок 1 : Позиция крысы. Крысы закладываются в лежачем положении, и верхних конечностей устанавливаются параллельно оси тела, просто рядом ствола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Определения поверхности символы крысы. (A) левый большой палец оператор находится на правой ключицы для определения местоположения и массив этой кости; (B) супрастернальные ямки нежно коснулся с указательный палец. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Место прокола. Пункция сайт является расположен 0,5 мм хвостовой на внешний сайт 1/3 правой ключицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Формирование отрицательного давления в шприце. После того, как игла входит в кожу подключичный, пальцы правой руки двигаться для создания отрицательного давления в шприц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Снятие крови в шприц. Когда игла входит подключичную Вену, кровь будет ввести шприц под отрицательным давлением. Отрицательное давление сохраняется до тех пор, пока получается достаточно крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Извлечение плазмы после центрифугирования. После центрифугирования, кровь разделяется на плазмы и клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : Курс и успех ставка время между различными группами. Эта диаграмма показывает нет значительной разницы в времени (левая панель) или успех ставка (правая панель) между квалифицированных группой и группой начинающих. Время, курс в группе начинающих и опытных группы являются 102.1 ± 14,9 s и s 84.3 ± 9.7, соответственно, p = 0,33 между группами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8 : Анатомия подключичную Вену. Подключичную Вену расположен только задняя и каудально до ключицы. Он соединяется с внутренней яремной форму плечеголовной вены и стекает в супер верхней полой вены, только под супрастернальные ямки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Опытные группы | Начальная группа | |||||||||
| Пол | Вес (г) | Объем крови (мл) | Время курса (S) | Пол | Вес (г) | объем крови (мл) | Время курса (S) | |||
| S1 | мужчины | 153 | 1.6 | 70 | B1 | мужчины | 149 | 1.6 | 72 | |
| S2 | мужчины | 168 | 1.6 | 60 | B2 | мужчины | 158 | 1.6 | 68 | |
| S3 | девушки | 183 | 1.6 | 75 | B3 | девушки | 190 | 1.6 | 83 | |
| S4 | девушки | 170 | 1.6 | 74 | B4 | девушки | 160 | 1.6 | 77 | |
| S5 | девушки | 159 | 1.6 | 65 | B5 | девушки | 153 | 1.6 | 200 | |
| S6 | мужчины | 200 | 1.6 | 83 | B6 | мужчины | 187 | 1.6 | 92 | |
| S7 | мужчины | 178 | 1.6 | 86 | B7 | мужчины | 164 | 1.6 | 99 | |
| S8 | мужчины | 187 | 1.6 | 168 | B8 | мужчины | 200 | 1.6 | 82 | |
| S9 | девушки | 192 | 1.6 | 83 | B9 | девушки | 198 | 1.6 | 70 | |
| S10 | девушки | 157 | 1.6 | 79 | B10 | девушки | 175 | 1.6 | 178 | |
Таблица 1: Курс объем и время от проколов, крови к коллекции готовой крови. S: квалифицированных группы; B: новичков.
| Группа | n | Среднее | SE | 95% conf. интервал | |
| B | 10 | 2.5 | 0.4 | 1,59 | 3.41 |
| S | 10 | 1.6 | 0,3 | 0.91 | 2.29 |
Таблица 2: Количество вывода между двумя группами. B: начинающих; S: квалифицированных группы. p = 0.0913
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем альтернативный метод для извлечения крови из подключичной вены и мы показываем, что этот метод является осуществимым и применимо для забора крови крыс. Этот метод является производным от пункция подключичной вены в вживления ритмоводителя свинца для пациентов11. Подключичную Вену расположен только задняя и каудально к ключицы и является продолжением подмышечные вен. Она работает от внешней границы первого ребра до медиальной границы передней Лестничные мышцы12. Отсюда он соединяется с внутренней яремной сформировать плечеголовной вены и стекает в супер верхней полой вены, просто под супрастернальные ямки (рис. 8). Ключицы легко идентифицируется, и есть четкие анатомические отношения между подключичной вены и ключицы. Здесь мы применили этот клинических навыков для экспериментов на животных. Из-за различных ориентации верхней конечности в организме человека и крыс верхней конечности помещается рядом ствола во время процедуры подвергать пространство каудально к ключицы, которая облегчит пункция (рис. 1).
Подключичную Вену гораздо больше, чем хвост вен. Таким образом это проще, чтобы получить достаточное количество крови из подключичной вены чем из Вены хвост. Объем общей выборки может достичь 10% от общего объема циркулирующей крови объем каждого времени1. Если обычные хвост забора крови в Вену или другой маршрут не удается, исследователи могут рассмотреть пункция подключичной вены. Для этой процедуры требуется общий наркоз, и это является одним из основных ограничений этой процедуры. Здесь мы используем Пентобарбитал натрия для общей анестезии. По сравнению с другими агентами, Пентобарбитал натрия легко придать, и без специальных инструментов не требуется. Цукамото et al. сообщили, что изофлюрановая ингаляции имел наиболее стабильных SpO2 чем другие агенты и имел короткие восстановления раз. В центрах с ингаляционного оборудования изофлюрановая можно считать13. Кроме того как подключичную Вену расположен недалеко от грудной полости, мы должны быть осторожны, чтобы избежать серьезных осложнений, связанных с процедуры, например пневмоторакса и hemopneumothorax. Направление иглы должны быть направлены тщательно, чтобы избежать этих осложнений. Здесь иглы всегда располагается параллельно ключицы и просто кзади он и переехал нежно к супрастернальные ямки. Результаты показывают, что использование выше технику можно избежать возможных осложнений. Избегайте любой вниз направление иглы к грудной полости в этой процедуре. Кроме того глубина подключичную Вену должны быть всегда около 2 мм от места прокола.
Иногда может произойти сбой попытки с одной стороны. Мы не предлагаем более чем 3 попытки с той же стороны. В таких условиях используйте другой стороне для прокола, что может улучшить показатель успеха проб крови. Для дальнейшей иллюстрации возможности нашего метода, мы проверили, успеха и время расходуется между группой начинающих и группу квалифицированных. Интересно, что между этими группами было не статистической значимости (p = 0,33), которая доказала осуществимость этого недавно разработали метод.
Как здесь уже говорилось, основным ограничением является успеха на одной стороне. Если процедура завершается ошибкой, необходимо рассматривать с другой стороны подключичную Вену. В этой процедуре используется общий наркоз и время восстановления составляет в среднем около 30 мин с Пентобарбитал натрия. Изофлюрановая Ингаляционная анестезия имеет гораздо меньше времени восстановления и принятие новых методов анестезии могут быть полезными в сокращении продолжительности процедуры. Мы показываем, что этот метод применим для крыс, но мы не испытали его применимость в небольших животных, таких как мышь.
В заключение результаты исследования показывают, что метод пункция подключичной вены для сбора проб крови является безопасным и осуществимым в крыс. Этот метод является особенно ценно, когда требуется большое количество крови. Этот метод является оптимальной альтернативой если забор крови обычных процедур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эта работа была поддержана грант от национального фонда естественных наук Китая № 81670269, № 81500355 и № 81500226.
Acknowledgments
Никто не заявил.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rats | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| stastical software | SPSS Statistics 17 | ||
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co.,Ltd(Guangzhou, Guangdong Province ,China) | ||
| 2.5 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co.,Ltd(Weihai,Shandong Province ,China) | ||
| hair shaver | Shanghai FLYCO Electric Co., Ltd(Shanghai,China) | ||
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH(EdisonstraBe 6,59157 Kamen, Germany) | ||
| Pentobarbital sodium | Merck | ||
| 75% ethanol | Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | ||
| blood collection tube | Hubei Jinxing Technology&Development Co.,Ltd (Wuhan Hubei Province,China) (2ml) | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co.,Ltd (Dongguan,Guangdng Province,China) | ||
| canvas gloves | for anethesia | ||
| hepain | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co.,Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) (2mL, 12500 IU) | ||
| physical saline | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd(Yueyang ,Hunan Province,China) (100ml) |
References
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology, Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Feng, J., et al. Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Wickremsinhe, E. R., Renninger, M., Paulman, A., Pritt, M., Schultze, A. E. Impact of Repeated Tail Clip and Saphenous Vein Phlebotomy on Rats Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. 44 (7), 1013-1020 (2016).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments. (90), e51969 (2014).
- Cochran, B. J., et al. Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), 266 (2007).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Lab Animal. 44 (4), 377-378 (2010).
- National Institute of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th, National Academies Press (US). US (Washington DC). (2011).
- Antonelli, D., Feldman, A., Freedberg, N. A., Turgeman, Y. Axillary vein puncture without contrast venography for pacemaker and defibrillator leads implantation. Pacing and Clinical Electrophysiology. 36 (9), 1107-1110 (2013).
- Luis, A. L., et al. Microscopic magnetic resonance imaging of the thoracic venous system in rats with congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 27 (2), 175-180 (2011).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
