Summary
Nous présentons ici un protocole visant à recueillir des échantillons de sang de la veine sous-clavière de rat.
Abstract
Collecte de sang avec assez de volume sanguin est indispensable lors des expérimentations animales. Collecte de sang de la veine caudale de rats est populaire et moins stressant par rapport à d’autres méthodes plus agressives comme les plexus rétro-orbitaire échantillon collection. Toutefois, cette méthode de collecte de sang est parfois limitée par un taux de réussite insatisfaisante. Ici, nous présentons une méthode de prélèvement de sang par le biais de la ponction de la veine sous-clavière. La veine sous-clavière est située juste sous la clavicule et cette veine est suffisante pour satisfaire aux exigences de volume du prélèvement sanguin. Nos résultats montrent que cette méthode est sûre et il y a lieu pour les prélèvements sanguins de collection avec le volume de sang nécessaire. Collecte de sang par le biais de la ponction de la veine sous-clavière pourrait servir d’une méthode de collecte de sang alternatifs en cas de prélèvement de sang de veine de queue ayant échoué chez les rats.
Introduction
Collecte de sang est essentielle dans la recherche sur les animaux. Les veines de la cible pour la collecte de sang comprennent le plexus rétro-orbitaire, la veine jugulaire, la veine saphène, queue des vaisseaux sanguins et l’artère carotide1,2,3,4. Parfois, sang pourrait provenir de l’aorte abdominale, la veine cave ou même le coeur5,6,7. En de telles occasions, les animaux doivent être sacrifiés et ne peut pas être utilisés pour observation subséquente ; ainsi, ces méthodes sont utilisées moins au quotidien travail expérimental. Collecte de sang de la veine caudale de rats est populaire et moins stressant par rapport à la méthodes8susmentionnés.
Cependant, la collecte de sang de la veine caudale est parfois limitée par un taux de réussite insatisfaisante. Parfois, il est également difficile d’obtenir assez de volume sanguin par cette méthode. Comme la veine sous-clavière est assez grande et se trouve juste sous l’os de la clavicule, ponction de la veine sous-clavière peut être une autre méthode d’échantillonnage de sang si les méthodes de collecte de sang de routine sont infructueuses. Ici, nous présentons une méthode de prélèvement de sang par ponction de la veine sous-clavière chez les rats.
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Protocol
Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Université South Central pour la recherche d’Animal de l’hôpital de Xiangya de seconde (Changsha, Chine). Le manuscrit a été établi selon l’arrivée (Animal Research : Reporting of In Vivo Experiments) lignes directrices9.
1. matériel et Animal préparation
- Préparer le matériel requis : ruban adhésif, agent de l’épilation, 75 % d’éthanol, tube de prélèvement de sang, seringue de 2,5 mL avec aiguille (24 G, 0,6 mm x 25 mm), rasoir cheveux, balance électronique et jauge (voir Table des matières).
- Utilisez 20 rats Sprague-Dawley (SD), âgés de 8 à 10 semaines et pesant 153-200 g (voir Table des matières). Maintenir des rats conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire,10.
- Rats de maison dans des conditions normalisées avec libre accès à la nourriture et l’eau potable. Gardez-les dans des cages de2 530 cm avec literie bois-rasage (2 rats par cage). Maintenir les animaux dans une température ambiante température contrôlée à environ 25 ° C.
- Induire l’anesthésie générale (pentobarbital sodique 40 mg/kg) chez tous les animaux par injection intrapéritonéale avant la ponction de la veine sous-clavière.
- Place le rat dans une position en décubitus dorsal. Fixez les pattes dans une position confortable et fixer le membre supérieur parallèle à l’axe du corps juste à côté du tronc.
Remarque : Aucune ventilation mécanique n’est nécessaire pour cette procédure (Figure 1). - Nettoyer des deux côtés de l’espace infraclaviculaire pour enlever la fourrure (avec cheveux rasoir et épilation agent, voir la Table des matières) et toute la saleté visible. Essuyer le cou et la peau thoracique avec 75 % d’éthanol. Garder la zone de ponction, propre et sec avec de la gaze.
2. procédure de collecte de sang
Remarque : Les deux côtés de la veine sous-clavière ne conviennent pas pour la ponction, et ici, nous choisissons le côté droit pour la ponction. L’emplacement et l’orientation de la clavicule droite sont identifiés par le pouce gauche de l’opérateur (Figure 2). Les fosses de creux sont touchés doucement avec l’index comme les fosses creux est en direction de l’aiguille (Figure 2).
- Rincez une seringue stérile de 2,5 mL avec la solution héparinée (10 UI/mL).
- Localiser le site de ponction caudale de la région de 1/3 externe de la clavicule droite (Figure 3) 0,5 mm. Déplacez doucement la seringue dans la peau de la ponction. Une fois que l’aiguille pénètre dans la peau d’infraclaviculaire, appliquer une pression négative avec la main droite de l’opérateur (Figure 4).
Remarque : Le volume sanguin moyenne et maximale sont 1,0 et 1,4 mL, respectivement. La direction de l’aiguille est positionnée vers les fosses de creux et devrait être presque parallèle à la clavicule juste postérieure à elle. Habituellement, la veine sous-clavière est accessible par l’insertion de l’aiguille de 2 mm environ dans cette direction. Une fois que l’aiguille pénètre dans la veine, sang entrera dans la seringue sous pression négative.- Maintenir une pression négative jusqu'à ce que suffisamment de volume de sang (Figure 5).
- Si la collecte de sang de la veine sous-clavière ne réussite pas, retirer l’aiguille dans la zone sous-cutanée et ajuster la direction de l’aiguille légèrement intérieur au sternum.
- Si trois tentatives échouent, évitez la veine sous-clavière du même côté et utilisez le côté controlatéral pour les prélèvements sanguins.
- Après le prélèvement de sang, retirer l’aiguille de ponction et appliquez une pression sur le site de ponction pendant 1-2 minutes arrêter le saignement.
Remarque : La pression doit être très douce pour prévenir l’étouffement.
3. sang échantillon traitement
- Transférer l’échantillon de sang dans un tube à vide anticoagulant-enduit (avec de l’EDTA) et centrifugation pendant 10 min à 1600 x g pour recueillir le plasma.
- Aspirer le surnageant dans un tube propre et les conserver à-80 ° C (Figure 6).
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Representative Results
Un total de 20 rats SD (mâle n = 10, femmes n = 10) ont été utilisés ici. Collectionwas de sang effectuées par des opérateurs qualifiés, qui ont effectué plus de 20 prélèvements de sang de la veine sous-clavière chez les rats et par les opérateurs de débutant, qui n’ont aucune ponction de la veine sous-clavière expérience chez les rats et autres animaux. Avant les opérations, les débutants ont regardé au moins 3 procédures fait par des opérateurs qualifiés.
Prélèvements sanguins a réussi 17 rats grâce à l’accès de la veine sous-clavière droite. Cette procédure n’a pas 3 rats (1 dans le groupe qualifié) et 2 dans le groupe débutant et prélèvements sanguins a réussi sous les formes de la veine sous-clavière gauche dans ces 3 rats. Le volume de cours et le sang du temps recueillies pour chaque cas sont illustrés au tableau 1. Le taux de réussite était semblable entre le groupe débutant (80 %) et le groupe qualifié (90 %, p = 0.531). Le taux de réussite a été de 100 % pour les deux groupes lorsque vous incluez les accès de la veine sous-clavière gauche supplémentaire chez les 3 rats. Deux queue de Student t-test a montré qu’il n’y avait aucun différence significative sur le temps consacré entre débutant et groupe qualifié (102,1 ± 14,9 s contre 84,3 ± 9,7 s, p = 0,33, Figure 7). Aucune complication grave s’est produite dans toutes les procédures telles que le pneumothorax, Hémopneumothorax ou saignements majeurs pendant ou après l’opération. Tous les animaux ont survécu et récupérés dans les 30 minutes après le prélèvement de sang.
Pour illustrer les difficultés d’apprentissage de la procédure de ponction, nous a en outre comparé le nombre de retraits entre qualifiés et des groupes de débutants. Comme indiqué dans le tableau 2, le nombre moyen de retraits dans le groupe qualifié est légèrement inférieur à celui du groupe débutant (1,6 ±0, 3 vs 2,5 ±0. 4), mais il n’y a aucune signification statistique (p = 0.0913).
Figure 1 : Position des rats. Les rats soient placés dans une position allongée, et les membres supérieurs sont fixés parallèlement à l’axe du corps, juste à côté du tronc. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Identifier les symboles surfaces de rats. (A), le pouce gauche de l’opérateur est sur la clavicule droite pour identifier l’emplacement et le tableau de cet OS ; Fossae (B), le creux est touchés doucement avec l’index. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Lieu de ponction. Le site de ponction est situé à 0,5 mm caudale sur le site de 1/3 externe de la clavicule droite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Formant une pression négative dans la seringue. Une fois l’aiguille pénètre dans la peau d’infraclaviculaire, les doigts de la main droite déplacent créer une pression négative dans la seringue. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Retire le sang dans la seringue. Quand l’aiguille pénètre dans la veine sous-clavière, sang entrera la seringue sous pression négative. La pression négative est maintenue jusqu'à obtention de suffisamment de sang. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Extraction de plasma après centrifugation. Après centrifugation, le sang est séparé en plasma et de cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Le taux de cours et la réussite des heures entre les différents groupes. Ce graphique ne montre aucune différence significative dans le taux de temps passé (panneau de gauche) ou de la réussite (panneau de droite) entre le groupe qualifié et le groupe de débutant. Le temps de parcours dans le groupe débutant et le groupe qualifié sont 102,1 ± 14,9 s et 84,3 ± 9,7 s, respectivement, p = 0,33 entre groupes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : L’anatomie des veines sous-clavières. La veine sous-clavière est située à postérieur et caudal à la clavicule. Il s’associe à la veine jugulaire interne pour former la veine brachiocéphalique et s’écoule dans la super de la veine cave supérieure, juste sous les fosses de creux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Groupe qualifié | Groupe débutant | |||||||||
| Entre les sexes | Poids (g) | Volume sanguin (mL) | Évolution temporelle (S) | Entre les sexes | Poids (g) | volume sanguin (mL) | Évolution temporelle (S) | |||
| S1 | mâle | 153 | 1.6 | 70 | B1 | mâle | 149 | 1.6 | 72 | |
| S2 | mâle | 168 | 1.6 | 60 | B2 | mâle | 158 | 1.6 | 68 | |
| S3 | femelle | 183 | 1.6 | 75 | B3 | femelle | 190 | 1.6 | 83 | |
| S4 | femelle | 170 | 1.6 | 74 | B4 | femelle | 160 | 1.6 | 77 | |
| S5 | femelle | 159 | 1.6 | 65 | B5 | femelle | 153 | 1.6 | 200 | |
| S6 | mâle | 200 | 1.6 | 83 | B6 | mâle | 187 | 1.6 | 92 | |
| S7 | mâle | 178 | 1.6 | 86 | B7 | mâle | 164 | 1.6 | 99 | |
| S8 | mâle | 187 | 1.6 | 168 | B8 | mâle | 200 | 1.6 | 82 | |
| S9 | femelle | 192 | 1.6 | 83 | B9 | femelle | 198 | 1.6 | 70 | |
| S10 | femelle | 157 | 1.6 | 79 | B10 | femelle | 175 | 1.6 | 178 | |
Tableau 1 : Le sang volume et le temps cours de perforation pour une collecte de sang fini. S: le groupe qualifié ; B: les débutants.
| Groupe | n | Moyenne | SE | Intervalle de 95 % CONF. | |
| B | 10 | 2.5 | 0,4 | 1,59 | 3.41 |
| S | 10 | 1.6 | 0,3 | 0,91 | 2.29 |
Tableau 2 : Le nombre de retraits entre les deux groupes. B: les débutants ; S: le groupe qualifié. p = 0.0913
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Discussion
Ici, nous présentons une méthode alternative pour l’extraction du sang de la veine sous-clavière et nous montrons que cette méthode est réalisable, sûre et applicable pour les prélèvements sanguins chez les rats. Cette méthode est dérivée de la ponction de la veine sous-clavière en implantation de plomb de stimulateur cardiaque pour les patients,11. La veine sous-clavière est située à postérieur et caudal à la clavicule et est un prolongement de la veine axillaire. Il s’étend de la frontière extérieure de la première côte à la frontière médiale du muscle scalène antérieur,12. De là, il s’associe à la veine jugulaire interne pour former la veine brachiocéphalique et se jette dans la veine cave super, juste en dessous de fosses creux (Figure 8). La clavicule est facilement identifiable et il existe une relation claire anatomique entre la veine sous-clavière et la clavicule. Ici, nous avons appliqué cette compétence clinique à l’expérimentation animale. En raison de l’orientation différente du membre supérieur chez les humains et les rats, le membre supérieur est placé juste à côté du tronc lors de la procédure d’exposer l’espace caudal à la clavicule, ce qui facilitera la ponction (Figure 1).
La veine sous-clavière est beaucoup plus grande que la veine caudale. Par conséquent, il est plus facile d’obtenir suffisamment de sang de la veine sous-clavière que de la veine caudale. Le volume de l’échantillon total pourrait atteindre 10 % du total du volume sanguin en circulation chaque fois1. Si les prélèvements sanguins classiques queue veineuse ou une autre voie échoue, les chercheurs peuvent envisager la ponction de la veine sous-clavière. L’anesthésie générale est nécessaire pour cette procédure, et il s’agit d’une limitation majeure de cette procédure. Ici, nous utilisons le pentobarbital sodique pour l’anesthésie générale. Par rapport à d’autres agents, pentobarbital sodique est facile à injecter, et aucuns autres instruments spéciaux ne sont nécessaires. Tsukamoto et coll. ont signalé que l’inhalation isoflurane avait le plus stable de SpO2 que d’autres agents et temps de récupération court. Dans les centres avec l’équipement de l’inhalation, l’isoflurane peut être considéré comme13. En outre, comme la veine sous-clavière est située près de la cavité thoracique, il faut veiller à éviter de graves complications liées à la procédure comme un pneumothorax et Hémopneumothorax. La direction de l’aiguille doit viser soigneusement afin d’éviter ces complications. Ici, l’aiguille est toujours positionné parallèle à la clavicule et juste postérieure à elle et déplacé doucement vers les fosses de creux. Les résultats montrent que l’utilisation d’au-dessus de technique peut éviter les complications potentielles. Éviter tout mouvement descendant de l’aiguille vers la cavité thoracique dans cette procédure. En outre, la profondeur de la veine sous-clavière doit toujours être maintenue environ 2 mm sur le site de ponction.
Occasionnellement, les tentatives d’un côté peuvent échouer. Nous ne suggérons pas plus de 3 tentatives du même côté. Dans de telles conditions, utiliser l’autre côté pour la ponction, ce qui peut améliorer le taux de réussite des prélèvements sanguins. Pour mieux illustrer la faisabilité de notre méthode, nous avons testé le taux de réussite et de temps dépensé entre un débutant et un groupe qualifié. Fait intéressant, il n’y a aucune signification statistique entre ces groupes (p = 0,33), qui a prouvé la faisabilité de cette nouvellement mis au point la méthode.
Tel que discuté ici, la principale limitation est le taux de réussite d’un seul côté. Si la procédure échoue, l’autre côté de la veine sous-clavière doit considérer. L’anesthésie générale est utilisée dans cette procédure et le temps de récupération en moyenne environ 30 min avec le pentobarbital sodique. Anesthésie par inhalation isoflurane a un temps de récupération beaucoup plus court et l’adoption de nouvelles méthodes d’anesthésie pourrait être utile pour réduire la durée de la procédure. Nous montrons que cette méthode est applicable à des rats, mais nous n’avons pas testé son applicabilité aux plus petits animaux comme les souris.
En conclusion, les résultats de l’étude indiquent que la méthode de ponction de la veine sous-clavière pour prélèvement d’échantillons de sang est sécuritaire et réalisable chez le rat. Cette méthode est particulièrement utile lorsque de grandes quantités de sang sont nécessaires. Cette méthode est une alternative optimale si les procédures de prélèvements sanguins classiques échouent.
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Disclosures
Ce travail a été soutenu par la subvention du National Natural Science Foundation de Chine n° 81670269, n° 81500355 et n° 81500226.
Acknowledgments
Aucune n’est déclarée.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rats | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| stastical software | SPSS Statistics 17 | ||
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co.,Ltd(Guangzhou, Guangdong Province ,China) | ||
| 2.5 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co.,Ltd(Weihai,Shandong Province ,China) | ||
| hair shaver | Shanghai FLYCO Electric Co., Ltd(Shanghai,China) | ||
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH(EdisonstraBe 6,59157 Kamen, Germany) | ||
| Pentobarbital sodium | Merck | ||
| 75% ethanol | Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | ||
| blood collection tube | Hubei Jinxing Technology&Development Co.,Ltd (Wuhan Hubei Province,China) (2ml) | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co.,Ltd (Dongguan,Guangdng Province,China) | ||
| canvas gloves | for anethesia | ||
| hepain | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co.,Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) (2mL, 12500 IU) | ||
| physical saline | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd(Yueyang ,Hunan Province,China) (100ml) |
References
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