Summary
Her presenterer vi en protokoll for å samle blodprøver fra til rotte vena subclavia.
Abstract
Blod samling med nok blodvolum er viktig i dyreforsøk. Blod samling fra halen åre rotter er populære og mindre stressende forhold til andre mer aggressive metoder som retro-orbital plexus prøve samling. Men er dette blod samling metoden noen ganger begrenset av en utilfredsstillende suksessrate. Her introduserer vi en metode for blodgivning gjennom vena subclavia punktering. Denne stemningen er stor nok til å oppfylle kravene volum av blod samling vena subclavia ligger like under krageben. Våre resultater viser at denne metoden er sikker og gjelder for blod samling prøvetaking med nødvendige blodvolum. Blodgivning gjennom vena subclavia punktering kunne tjene som en alternativ blod samling metoden ved mislykkede hale blodåre blod prøvetaking i rotter.
Introduction
Blod samling er viktig i Forsøksdyrutvalget. Målet årer for blod samling inkluderer retro-orbital plexus, vena jugularis, saphenous fotsporene, hale blodkar og arteria carotis1,2,3,4. Noen ganger kan blod hentes fra abdominal aorta, vena cava eller selv hjertet5,6,7. I slike tilfeller dyrene må ofres og kan ikke brukes for påfølgende observasjon; dermed disse metodene brukes mindre i daglige eksperimentelt arbeid. Blod samling fra halen åre rotter er populære og mindre stressende forhold til nevnte metodene8.
Imidlertid begrenset blod samling fra halen venen noen ganger av en utilfredsstillende suksessrate. Noen ganger er det også vanskelig å skaffe nok blodvolum av denne metoden. Vena subclavia er stor nok og er plassert rett under krageben benet, kan vena subclavia punktering være en alternativ metode for blod prøvetaking hvis rutinemessig blodet samling metoder er mislykket. Her introduserer vi en metode for blod samling med vena subclavia punktering i rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av den sentrale Sør University etikk for dyr forskning fra andre Xiangya sykehuset (Changsha, Kina). Manuskriptet ble utarbeidet etter ANKOMME (dyr forskning: rapportering av i Vivo eksperimenter) retningslinjer9.
1. materialet og dyr forberedelse
- Forbered nødvendig materiale: teip, epileringen agent, 75% etanol, blod samling rør, 2,5 mL sprøyte med p (24 G, 0,6 x 25 mm), hår barbermaskin, elektronisk skala og måle (se Tabell for materiale).
- Bruk 20 Sprague-Dawley (SD) rotter, alderen 8-10 uker og veiing 153-200 g (se Tabell for materiale). Opprettholde rotter i samsvar med veiledningen for omsorg og bruk av forsøksdyr10.
- Huset rotter under standard betingelser med fri tilgang til mat og drikkevann. Oppbevar dem i 530 cm2 bur med tre-barbering sengetøy (2 rotter per bur). Opprettholde dyr romtemperaturen temperaturkontrollert på rundt 25 ° C.
- Indusere narkose (natrium pentobarbital 40 mg/kg) i alle dyr gjennom intraperitoneal injeksjon før vena subclavia punktering.
- Sett rotta i supine posisjon. Fikse bakbeina i en komfortabel stilling og fikse den øvre lem parallelt med kroppen aksen like ved bagasjerommet.
Merk: Ingen mekanisk ventilasjon er nødvendig for denne prosedyren (figur 1). - Feilfri begge sider av infraklavikulær plass å fjerne pels (se Tabell for materialemed hår barbermaskinen og epileringen agent,) og noen synlig skitt. Tørk av halsen og bryst hud med 75% etanol. Holde området for punktering ren og tørr med gasbind.
2. blod datainnsamling prosedyre
Merk: Begge sider av vena subclavia er egnet for punktering, og her er vi velge høyre side for punktering. Plasseringen og retning høyre krageben identifiseres av operatørens venstre tommel (figur 2). Suprasternal fossae berøres forsiktig med pekefingeren som suprasternal fossae i retning av nålen (figur 2).
- Skyll sterilt 2,5 mL sprøyte med heparin-oppløsningen (10 IU/mL).
- Finne punktering området 0,5 mm caudal til den ytre 1/3 regionen rett krageben (Figur 3). Flytte sprøyten forsiktig inn i huden av webområdet punktering. Når nålen inn infraklavikulær huden, bruk negative trykk med operatøren sin høyre hånd (Figur 4).
Merk: Gjennomsnittlig og maksimal blod volumet er 1,0 mL og 1,4 mL, henholdsvis. Retning av nålen plasseres mot suprasternal fossae og skal være nesten parallelt krageben bare bakenfor den. Vena subclavia kan vanligvis nås ved å sette inn nålen ca 2 mm i denne retningen. Når nålen inn i venen, inn blod sprøyten under negative trykk.- Opprettholde negative trykket til nok volum av blod trekkes (figur 5).
- Hvis vena subclavia blod samling ikke er vellykket, trekke nålen subkutan området og justere retning av nålen litt innvendig til sternum.
- Hvis tre forsøk mislykkes, unngå vena subclavia fra samme side og bruke den kontralateral siden for blodprøve.
- Etter blod samling, fjerne nålen punktering og legge trykk punktering området for 1-2 minutter å opphøre blø.
Merk: Trykket må være veldig forsiktig å hindre choking.
3. blod prøve behandling
- Overfør blodprøve til en antikoagulerende-belagt vakuumrør (med EDTA) og sentrifuge for 10 min 1600 x g å samle plasma.
- Sug opp nedbryting til en ren rør og butikk på-80 ° C (figur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt 20 SD rotter (mannlige n = 10 kvinnelige n = 10) ble brukt her. Blod collectionwas utført av dyktige operatører, som har utført mer enn 20 blod prøvetaking fra vena subclavia i rotter og av nybegynner operatører, som har ingen vena subclavia punktering erfaring i rotter eller andre dyr. Før operasjoner så nybegynnere minst 3 prosedyrer utført av dyktige operatører.
Blodprøve lyktes i 17 rotter gjennom høyre vena subclavia tilgang. Denne prosedyren mislyktes i 3 rotter (1 i gruppen dyktige) og 2 i gruppen nybegynner blodprøve var vellykket gjennom venstre vena subclavia tilgang i disse 3 rotter. Tid kurs og blod volumet samlet for hvert tilfelle er vist i tabell 1. Suksessraten var mellom gruppen nybegynner (80%) og dyktige group (90%, p = 0.531). Suksessraten var 100% for begge grupper inkludert ekstra venstre vena subclavia tilgang i 3 rotter. To tailed Student t-test viste at det var ingen signifikant forskjell på tid brukt mellom nybegynner og dyktige gruppe (102,1 ± 14,9 s versus 84.3 ± 9,7 s, p = 0,33, figur 7). Ingen alvorlige komplikasjoner oppstått i alle prosedyrer som pneumothorax, hemopneumothorax eller store blødninger under eller etter operasjonen. Alle dyrene overlevde og kommet til hektene innen 30 minutter etter blod prøvetaking.
For å demonstrere vanskelighetene med å lære punktering prosedyren, vi ytterligere sammenlignet antallet uttak mellom dyktige og nybegynner grupper. Som vist i tabell 2, gjennomsnittlig antall uttak i gruppen dyktige er litt mindre enn gruppen nybegynner (1.6 ±0.3 vs 2,5 ±0.4), men det er ingen statistisk betydning (p = 0.0913).
Figur 1 : Plasseringen av rotter. Rotter er lagt i supine posisjon, og øvre lemmer er fast parallelt med kroppen aksen, like ved bagasjerommet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Identifisere overflaten symboler på rotter. (A) venstre tommel operatør er på høyre krageben identifisere plasseringen og rekke dette benet; (B) i suprasternal fossae berøres forsiktig med pekefingeren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Plasseringen av punktering. Webområdet punktering er ligger 0,5 mm caudal til området for ytre 1/3 av høyre krageben. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Danner negative trykket i sprøyten. Når nålen inn infraklavikulær huden, Flytt fingrene av høyre opprette negative trykket i sprøyten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Trekke blod i sprøyten. Når nålen inn vena subclavia, inn blod sprøyten under negative trykk. Den negative trykket holdes til nok blod er oppnådd. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Plasma utvinning etter sentrifugering. Etter sentrifugering, er blod delt inn i plasma og celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Tiden kurs og suksess rate mellom ulike grupper. Dette diagrammet viser ingen betydelige forskjeller i tidsbruk (venstre panel) eller suksess rate (høyre panel) mellom dyktige gruppen og gruppen nybegynner. Tiden gruppen nybegynnere og dyktig gruppen er 102,1 ± 14,9 s og 84.3 ± 9,7 s, henholdsvis p = 0,33 mellom grupper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 : Anatomien i vena subclavia. Vena subclavia ligger bare bakre og caudal til krageben. Det blir med vena jugularis skjemaet truncus venen og avløp til super vena cava, like under suprasternal fossae. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| dyktige gruppe | Nybegynner gruppe | |||||||||
| Kjønn | Kroppsvekt (g) | Blodvolum (mL) | Gang løpet (S) | Kjønn | Kroppsvekt (g) | blodvolum (mL) | Gang løpet (S) | |||
| S1 | mann | 153 | 1.6 | 70 | B1 | mann | 149 | 1.6 | 72 | |
| S2 | mann | 168 | 1.6 | 60 | B2 | mann | 158 | 1.6 | 68 | |
| S3 | kvinne | 183 | 1.6 | 75 | B3 | kvinne | 190 | 1.6 | 83 | |
| S4 | kvinne | 170 | 1.6 | 74 | B4 | kvinne | 160 | 1.6 | 77 | |
| S5 | kvinne | 159 | 1.6 | 65 | B5 | kvinne | 153 | 1.6 | 200 | |
| S6 | mann | 200 | 1.6 | 83 | B6 | mann | 187 | 1.6 | 92 | |
| S7 | mann | 178 | 1.6 | 86 | B7 | mann | 164 | 1.6 | 99 | |
| S8 | mann | 187 | 1.6 | 168 | B8 | mann | 200 | 1.6 | 82 | |
| S9 | kvinne | 192 | 1.6 | 83 | B9 | kvinne | 198 | 1.6 | 70 | |
| S10 | kvinne | 157 | 1.6 | 79 | B10 | kvinne | 175 | 1.6 | 178 | |
Tabell 1: Blod volum og tid kurset fra punktering til en ferdig blod samling. S: dyktige gruppen; B: nybegynnere.
| Gruppe | n | Mener | SE | 95% conf. intervall | |
| B | 10 | 2.5 | 0,4 | 1,59 | 3.41 |
| S | 10 | 1.6 | 0,3 | 0,91 | 2.29 |
Tabell 2: Antall uttak mellom de to gruppene. B: nybegynnere; S: dyktige gruppe. p = 0.0913
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her introduserer vi en alternativ metode for blod utvinning fra vena subclavia og vi viser at denne metoden er mulig, sikker og gjelder for blod prøvetaking i rotter. Denne metoden er avledet fra vena subclavia punktering i pacemaker bly implantasjon for pasienter11. Vena subclavia ligger bare bakre og caudal til krageben og er en videreføring av axillaris venen. Den går fra den ytre kanten av det første ribbenet mediale grensen fremre scalene muskler12. Herfra det blir med vena jugularis å danne truncus venen og avløp til super vena cava, like under suprasternal fossae (Figur 8). Det er en klar anatomiske forholdet mellom vena subclavia og krageben krageben er lett identifiseres. Her har vi brukt denne kliniske ferdigheter til dyreforsøk. På grunn av ulike orienteringen av den øvre lem hos mennesker og rotter, er den øvre lem plassert like ved bagasjerommet under prosedyren å avsløre plassen caudal til krageben, som vil lette punktering (figur 1).
Vena subclavia er mye større enn hale venen. Derfor er det enklere å få nok blod fra vena subclavia enn fra halen venen. Totalt eksempel volumet kunne nå 10% av sirkulerende blodvolum hver time1. Hvis konvensjonelle hale blodåre blod prøvetaking eller en annen rute mislykkes, kan forskere vurdere vena subclavia punktering. Generell anestesi er nødvendig for denne prosedyren, og dette er en stor begrensning av denne prosedyren. Her bruker vi pentobarbital natrium for generell anestesi. Sammenlignet med andre agenter, pentobarbital natrium er lett å injisere, og ingen andre spesielle instrumenter er nødvendig. Tsukamoto et al. rapportert at isoflurane innånding hadde den mest stabile SpO2 enn andre agenter og hadde kort gjenopprettingstiden. I sentre med innånding utstyr, kan isoflurane bli vurdert13. Videre som vena subclavia ligger nær bryst hulrom, må vi være forsiktig å forhindre alvorlig prosedyre-relaterte komplikasjoner som pneumotoraks og hemopneumothorax. Retning av nålen må rettes nøye unngå disse komplikasjonene. Her, plasseres nålen alltid parallelt krageben og bare bakenfor den og flyttet forsiktig mot suprasternal fossae. Resultatene viser at bruk av over teknikk kan unngå mulige komplikasjoner. Unngå noen nedadgående retning av nålen mot bryst hulrom i denne fremgangsmåten. Også, dybden av vena subclavia alltid holdes om 2 mm fra webområdet punktering.
Noen ganger kan forsøk fra den ene siden mislykkes. Vi foreslår ikke mer enn 3 forsøk fra samme side. Under slike forhold kan du bruke den andre siden for punktering, som kan forbedre suksessrate på blodprøve. For å ytterligere illustrere muligheten for vår metode, testet vi suksessrate og tid brukt mellom en nybegynner gruppe og en dyktig gruppe. Interessant var det ingen statistisk signifikans mellom disse gruppene (p = 0,33), som viste seg gjennomførbarhet av dette nylig utviklet metode.
Som beskrevet her, er den viktigste begrensningen suksessrate på én side. Hvis prosedyren mislykkes, må den andre siden av vena subclavia vurderes. Generell anestesi brukes i denne prosedyren og gjenopprettingstiden gjennomsnitt ca 30 min med pentobarbital natrium. Isoflurane innånding anestesi har en mye kortere utvinning tid og innføringen av nye anestesi metoder kan være nyttig for å redusere varigheten av prosedyren. Vi viser at denne metoden gjelder rotter, men vi har ikke testet brukbarheten til mindre dyr som mus.
Avslutningsvis indikerer studiet resultatene at vena subclavia punktering metoden for eksempel blodgivning er trygt og gjennomførbart i rotter. Denne metoden er spesielt nyttig når store mengder blod er nødvendig. Denne metoden er en optimal alternativ hvis konvensjonelle blod utvalgstrekking mislykkes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation av Kina nei 81670269, nei 81500355 og nr. 81500226.
Acknowledgments
Ingen erklært.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rats | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| stastical software | SPSS Statistics 17 | ||
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co.,Ltd(Guangzhou, Guangdong Province ,China) | ||
| 2.5 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co.,Ltd(Weihai,Shandong Province ,China) | ||
| hair shaver | Shanghai FLYCO Electric Co., Ltd(Shanghai,China) | ||
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH(EdisonstraBe 6,59157 Kamen, Germany) | ||
| Pentobarbital sodium | Merck | ||
| 75% ethanol | Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | ||
| blood collection tube | Hubei Jinxing Technology&Development Co.,Ltd (Wuhan Hubei Province,China) (2ml) | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co.,Ltd (Dongguan,Guangdng Province,China) | ||
| canvas gloves | for anethesia | ||
| hepain | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co.,Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) (2mL, 12500 IU) | ||
| physical saline | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd(Yueyang ,Hunan Province,China) (100ml) |
References
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology, Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Feng, J., et al. Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Wickremsinhe, E. R., Renninger, M., Paulman, A., Pritt, M., Schultze, A. E. Impact of Repeated Tail Clip and Saphenous Vein Phlebotomy on Rats Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. 44 (7), 1013-1020 (2016).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments. (90), e51969 (2014).
- Cochran, B. J., et al. Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), 266 (2007).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Lab Animal. 44 (4), 377-378 (2010).
- National Institute of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th, National Academies Press (US). US (Washington DC). (2011).
- Antonelli, D., Feldman, A., Freedberg, N. A., Turgeman, Y. Axillary vein puncture without contrast venography for pacemaker and defibrillator leads implantation. Pacing and Clinical Electrophysiology. 36 (9), 1107-1110 (2013).
- Luis, A. L., et al. Microscopic magnetic resonance imaging of the thoracic venous system in rats with congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 27 (2), 175-180 (2011).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
