Summary
여기, 선물이 쥐 하 정 맥에서 혈액 샘플을 수집 하는 프로토콜.
Abstract
충분 한 혈액 량과 혈 동물 실험에 필수적 이다. 쥐의 꼬리 정 맥에서 혈액 컬렉션은 인기와 보다 적게 스트레스가 많은 복고풍 궤도 총 샘플 컬렉션 같은 다른 공격적인 방법에 비해. 그러나,이 혈액 수집 방법 때로는 불만족 성공률 제한 됩니다. 여기, 우리 하 정 맥 빵 꾸를 통해 혈액 수집 하는 방법을 소개합니다. 하 정 맥은 쇄 골 바로 아래 있으며이 정 맥은 혈액 컬렉션의 볼륨 요구 사항을 충족 하기에 충분 합니다. 우리의 결과이 방법은 안전 하 고 적용 가능한 필요한 혈액 량과 혈액 컬렉션 샘플링에 대 한 보여 줍니다. 하 정 맥 빵 꾸를 통해 혈 쥐에서 실패 한 꼬리 정 맥 혈액 샘플링의 경우 대체 혈액 수집 방법 될 수 있습니다.
Introduction
혈액 컬렉션은 동물 연구에 필수적입니다. 혈액 컬렉션에 대 한 대상 혈관 등 복고풍 궤도 총, 경 정 맥, saphenous 정 맥, 꼬리 혈관, 경 동맥1,2,,34. 가끔은, 혈액에서 복 부 대동맥, 베 나 정 맥 또는 심지어 심장5,,67얻을 수 수 있습니다. 같은 경우에는 동물 희생 해야 하 고 이후의 관찰; 사용할 수 없습니다. 이러한 메서드는 사용 하는 따라서, 매일 실험적인 작품에는 더 적은. 쥐의 꼬리 정 맥에서 혈액 컬렉션은 대중적이 고 덜 스트레스에 비해 위에 언급 한 방법8.
그러나, 꼬리 정 맥에서 혈액 컬렉션 때로는 불만족 성공률 제한 됩니다. 때때로, 그것은 또한이 방법으로 충분 한 혈액 량을 얻기 어렵다입니다. 하 정 맥은 충분히 큰 쇄 골 뼈 바로 아래 위치 하 고, 빵 꾸 하 정 맥 혈액 샘플링 일상적인 혈액 수집 방법 성공 하지 않는 경우 다른 방법을 할 수 있다. 여기, 우리가 쥐 빵 꾸 하 정 맥을 통해 혈액 수집 방법 소개.
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Protocol
이 연구는 두 번째 Xiangya 병원 (창사, 중국)에서 동물 연구에 대 한 중앙 남쪽 대학 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 원고는 도착에 따르면 준비 했다 (동물 연구: 보고의 Vivo 실험) 지침9.
1. 재료 및 동물 준비
- 필요한 재료 준비: 접착 테이프, 제 모 제, 75% 에탄올, 혈액 컬렉션 튜브, 2.5 mL 주사기와 바늘 (24 G, 0.6 m m x 25 m m), 헤어 면도기, 전자 규모, 게이지 ( 재료의 표참조) 연결.
- 20 Sprague-Dawley (SD) 쥐, 세 8-10 주 및 무게 153-200 g ( 재료의 표참조)를 사용 합니다. 유지 관리 및 실험 동물 사용10에 대 한 가이드에 따라 쥐.
- 식품 및 식 수와 표준 조건 하에서 집 쥐 나무-면도 침구 (2 쥐 감 금 소 당) 530 cm2 장에 그들을 유지. 약 25 ° c.에 온도 제어 실내 온도에 동물 유지
- 전신 마 취를 유도 (sodium pentobarbital 40 mg/kg) 하 정 맥 펑크 전에 복 주사를 통해 모든 동물에.
- 부정사 위치에 쥐를 놓습니다. 편안한 자세로 뒷 다리 사지를 해결 하 고 상 지 트렁크 옆에 그냥 몸 축에 평행한 수정.
참고:이 절차 (그림 1)에 대 한 아무 기계 환기 필요 합니다. - 모피를 제거 하려면 infraclavicular 공간의 양쪽 청소 (머리 면도기와 제 모 에이전트 참조 테이블의 재료) 및 어떤 눈에 보이는 먼지. 목 및 75% 에탄올과 흉부 피부를 닦아냅니다. 깨끗 하 고 마른 거 즈로 펑크에 대 한 영역을 유지.
2. 혈액 수집 절차
참고: 하 정 맥의 양쪽 모두는 펑크, 적합 그리고 여기 우리는 펑크에 대 한 오른쪽 선택. 오른쪽 쇄 골의 방향과 위치 연산자의 왼쪽된 엄지손가락 (그림 2)에 의해 식별 됩니다. Suprasternal fossae는 suprasternal fossae (그림 2) 바늘의 방향에서으로 검지 손가락으로 부드럽게 감동 됩니다.
- 헤 파 린 솔루션 (10 IU/mL)으로 균 2.5 mL 주사기를 씻어.
- 0.5 m m 오른쪽 쇄 골 (그림 3)의 바깥쪽 1/3 지역에 꼬리 펑크 사이트를 찾습니다. 펑크 사이트의 피부에 주사기를 부드럽게 이동 합니다. 일단 바늘 infraclavicular 피부를 입력, 부정적인 압력 연산자의 오른손 (그림 4)와 함께 적용 됩니다.
참고: 평균 및 최대 혈액 볼륨은 1.0 mL와 1.4 mL, 각각. 바늘의 방향 suprasternal fossae로 배치 하 고 단지 그것에 후부 쇄 골에 거의 평행 해야 합니다. 일반적으로, 하 정 맥이 방향으로 약 2 mm 바늘을 삽입 하 여 도달할 수 있습니다. 일단 바늘 들어가는 정 맥, 혈액 부정적인 압력에서 주사기를 입력 합니다.- 부정적인 압력을 유지 하는 충분 한 양의 혈액을 그릴 때까지 (그림 5).
- 하 정 맥 혈 성공 하지 않으면 피하 영역에 바늘을 철회 하 고 흉 골에 약간 내부 바늘의 방향을 조정 합니다.
- 세 번 실패 하는 경우 같은 측면에서 하 정 맥을 방지 하 고 혈액 샘플링 contralateral 측을 사용 하 여.
- 혈액 수집 후 펑크 바늘을 제거 하 고 출혈을 멈추게 하 1-2 분 동안 펑크 사이트에 압력을 적용 합니다.
참고: 압력 질 식 방지에 매우 부드러운 되어야 합니다.
3. 혈액 샘플 처리
- 응고 제 코팅 진공 튜브 (EDTA)와 플라즈마를 수집 1600 x g에서 10 분 원심 분리기에 혈액 샘플을 전송 합니다.
- 깨끗 한 관을-80 ° C (그림 6)에 게 상쾌한 발음
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Representative Results
총 20 SD 쥐 (남성 n = 10, 여성 n = 10) 여기에서 사용 했다. 쥐에서 하 정 맥에서 20 개 이상의 혈액 samplings 수행한, 숙련 된 운영자에 의해 수행 아니 하 정 맥 빵 꾸가 초급 연산자로 혈액 collectionwas 쥐 또는 다른 동물에 있는 경험. 작업을 하기 전에 초보자 숙련 된 연산자에 의해 수행 3 절차를 보았다.
혈액 샘플링 오른쪽 하 정 맥 접근을 통해 17 쥐에 성공 했다. 이 절차 3 쥐 (숙련 된 그룹에서 1)와 초급 그룹에서 2에서에서 실패 하 고 혈액 샘플링이 3 쥐에서 왼쪽된 하 정 맥 접근을 통해 성공 했다. 시간 코스와 혈액 볼륨 각 사례는 표 1에 설명에 대 한 수집. 성공률 초보자 그룹 (80%)와 숙련 된 그룹 사이 유사 했다 (90%, p = 0.531). 성공률은 100% 두 그룹에 대 한 때 3 쥐에서 추가 왼쪽된 하 정 맥 접근을 포함 하 여. 두 학생의 t꼬리-테스트 시간 소비 초급 그룹 및 숙련 된 그룹 사이 큰 차이 보였다 (84.3 ± 9.7 s, p 대 102.1 ± 14.9 s = 0.33, 그림 7). 심각한 합병증 등 매, hemopneumothorax, 주요 출혈 또는 수술 후 모든 절차에서 발생 했습니다. 모든 동물은 살아 고 혈액 샘플링 후 30 분 이내 복구.
빵 꾸 절차 학습의 어려움을 보여, 우리는 더 숙련 된 사이 인출 수 비교 및 초보자 그룹. 표 2에서 같이, 숙련 된 그룹에서 철수의 평균 수는 초보자 그룹 (2.5 ±0.4 대 1.6 ± 0.3), 보다 약간 덜 하지만 아무 통계적 의미 (p = 0.0913).
그림 1 : 쥐의 위치. 쥐 부정사 위치에 놓여 있다 고 위 사지 트렁크 옆에 그냥 몸 축에 병렬 고정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 쥐의 표면 기호 식별. (A) 연산자의 왼쪽된 엄지 오른쪽 쇄 골이이 뼈;의 배열 위치를 식별 하는 (B)는 suprasternal fossae는 검지 손가락으로 부드럽게만 졌다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 펑크의 위치. 펑크 사이트 오른쪽 쇄 골의 바깥쪽 1/3 사이트에 꼬리 위치 0.5 m m입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 주사기에 부정적인 압력 형성. 일단 바늘 infraclavicular 피부를 입력, 오른손의 손가락 주사기에 부정적인 압력을 만드는 이동 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 주사기로 혈액을 철수. 바늘 들어갈 때 하 정 맥, 혈액 부정적인 압력에서 주사기를 입력 합니다. 부정적인 압력은 충분 한 혈액을 얻을 때까지 유지 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 플라즈마 추출 centrifuging 후. Centrifuging, 후 혈액 플라스마 및 셀으로 구분 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 다른 그룹 사이의 시간 코스와 성공 비율. 이 차트에서는 숙련 된 그룹 초급 그룹 사이의 시간 (왼쪽된 패널) 또는 성공 요금 (오른쪽 패널)에 상당한 차이가. 시간 코스 초보자 그룹 및 숙련 된 그룹에는 102.1 ± 14.9 및 84.3 ± 9.7 s 각각, p = 0.33 그룹 사이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8 : 하 정 맥의 해부학. 그냥 후부 및 꼬리는 쇄 골 하 정 맥은 있습니다. 그것은 양식 brachiocephalic 정 맥 내부 경 정 맥으로 조인 하 고 바로 아래에 suprasternal fossae 슈퍼 베 나 정 맥으로 빼낸. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 숙련 된 그룹 | 초급 그룹 | |||||||||
| 성별 | 몸 무게 (g) | 혈액 양 (mL) | 시간 코스 (S) | 성별 | 몸 무게 (g) | 혈액 양 (mL) | 시간 코스 (S) | |||
| S1 | 남성 | 153 | 1.6 | 70 | B1 | 남성 | 149 | 1.6 | 72 | |
| S2 | 남성 | 168 | 1.6 | 60 | B2 | 남성 | 158 | 1.6 | 68 | |
| S3 | 여성 | 183 | 1.6 | 75 | B 3 | 여성 | 190 | 1.6 | 83 | |
| S4 | 여성 | 170 | 1.6 | 74 | B4 | 여성 | 160 | 1.6 | 77 | |
| S5 | 여성 | 159 | 1.6 | 65 | B5 | 여성 | 153 | 1.6 | 200 | |
| S6 | 남성 | 200 | 1.6 | 83 | B 6 | 남성 | 187 | 1.6 | 92 | |
| S7 | 남성 | 178 | 1.6 | 86 | B7 | 남성 | 164 | 1.6 | 99 | |
| S8 | 남성 | 187 | 1.6 | 168 | B8 | 남성 | 200 | 1.6 | 82 | |
| S9 | 여성 | 192 | 1.6 | 83 | B9 | 여성 | 198 | 1.6 | 70 | |
| S10 | 여성 | 157 | 1.6 | 79 | B10 | 여성 | 175 | 1.6 | 178 | |
표 1: 혈액 볼륨 및 시간 코스 빵 꾸에서 완성 된 혈액 컬렉션에. S: 숙련 된 그룹; B: 초보자입니다.
| 그룹 | n | 평균 | SE | 95% 컨퍼런스 간격 | |
| B | 10 | 2.5 | 0.4 | 1.59 | 3.41 |
| S | 10 | 1.6 | 0.3 | 0.91 | 2.29 |
표 2: 두 그룹 사이 인출 수. B: 초보자; S: 숙련 된 그룹입니다. p = 0.0913
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Discussion
여기, 우리 하 정 맥에서 혈액 추출에 대 한 다른 방법을 소개 하 고 우리는이 방법은, 안전, 및 적용 가능한 쥐에서 혈액 샘플링에 대 한 표시. 이 메서드는 맥 박 조정기 리드 이식 환자11에서 하 정 맥 펑크에서 파생 됩니다. 하 정 맥은 그냥 후부와 쇄 골에 꼬리 있으며 겨드랑이 정 맥의 연속 이다. 그것은 이전 scalene 근육12의 중간 국경에 첫 번째 갈비뼈의 외부 국경에서 실행 됩니다. 여기에서 그것은 brachiocephalic 정 맥을 형성 하는 내부 경 정 맥으로 조인 하 고 suprasternal fossae (그림 8)의 바로 아래 슈퍼 베 나 정 맥으로 빼낸. 쇄 골은 쉽게 식별 하 고 하 정 맥과 쇄 골 사이 명확한 해부학 관계 있다. 여기, 우리는 동물 실험에이 임상 기술 적용. 인간과 쥐에서 위 사지의 다른 방향으로 상 지 펑크 (그림 1)를 촉진 한다 쇄 골에 꼬리 공간을 노출 하는 절차 동안 그냥 트렁크 옆에 배치 됩니다.
하 정 맥 꼬리 정 맥 보다 훨씬 큽니다. 따라서, 꼬리 정 맥에서 보다 하 정 맥에서 충분 한 혈액을 얻을 쉽습니다. 총 샘플 볼륨 각 시간1순환 혈액 량의 10%를 도달할 수 있습니다. 평범한 꼬리 정 맥 혈액 샘플링 또는 다른 경로 실패 하면 연구원 하 정 맥 빵 꾸를 고려할 수 있습니다. 일반 마 취가이 절차에 대 한 필요 하며 이것은이 절차의 주요 한계입니다. 여기, pentobarbital 나트륨 사용 하 여 전신 마 취에 대 한. 다른 에이전트에 비해 pentobarbital 나트륨 주사, 쉽게 그리고 다른 특별 한 계기는 필요. 츠 카 모토 외. 보고 그 isoflurane 흡입 다른 에이전트 보다 가장 안정적인 SpO2 그리고 짧은 복구 번 했다. 흡입 장비 센터에서 isoflurane13을간주 될 수 있습니다. 또한, 하 맥은 흉 강에 가까이 있는, 우리 매 및 hemopneumothorax와 같은 심각한 절차 관련 합병증을 방지 하기 위해 주의 해야 것 이다. 바늘의 방향으로 이러한 합병증을 피하기 위해 신중 하 게 이동 해야 합니다. 여기, 바늘은 쇄 골에 평행 하 게 그리고 단지 그것에 후부 suprasternal fossae 쪽으로 부드럽게 이동에 항상 배치 됩니다. 결과 표시 기술 위에 사용의 잠재적인 합병증을 피할 수 있다. 이 절차에서 흉 강 쪽으로 바늘의 어떤 아래쪽 방향으로 하지 마십시오. 또한, 하 정 맥의 깊이 항상 유지 되어야 한다 약 2 mm 펑크 사이트에서.
한쪽에서 시도 때때로, 실패할 수 있습니다. 우리 같은 측면에서 3 개 이상의 시도 제안 하지 않습니다. 같은 조건에서 펑크, 혈액 샘플링의 성공률을 향상 시킬 수 있습니다에 대 한 다른 측면을 사용 합니다. 우리의 방법의 타당성을 더 설명 하기 위해 초보자 그룹 및 숙련 된 그룹 사이 소비 시간과 성공률 테스트. 흥미롭게도,이 그룹 사이 아무 통계적 의미 했다 (p = 0.33), 방법 개발을 새로이 실행할 수 입증 했다.
여기에서 설명 했 듯이 주요 제한은 한쪽에 성공률입니다. 절차는 실패 하면, 하 정 맥의 다른 측면을 고려 되어야 한다. 일반 마 취는이 절차에서 사용 되 고 복구 시간 평균 pentobarbital 나트륨을 약 30 분. Isoflurane 흡입 마 취는 많은 짧은 복구 시간 그리고 새로운 마 취 방법의 채용 절차의 기간 단축에 도움이 될 수 있습니다. 우리는이 방법은 쥐에 해당 하지만 우리 쥐 같은 작은 동물에 게 그것의 적응성 테스트를 하지 않은 보여.
끝으로, 연구 결과 하 정 맥 펑크 혈액 샘플 컬렉션에 대 한 방법은 안전 하 고 가능한 쥐에서 나타냅니다. 이 메서드는 많은 양의 혈액이 필요한 경우에 특히 귀중 한. 이 방법은 기존의 혈액 샘플링 절차 실패 하는 경우 최적의 대안 이다.
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Disclosures
이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 제 81670269, 제 81500355 No. 81500226에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Acknowledgments
없음 선언입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rats | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| stastical software | SPSS Statistics 17 | ||
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co.,Ltd(Guangzhou, Guangdong Province ,China) | ||
| 2.5 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co.,Ltd(Weihai,Shandong Province ,China) | ||
| hair shaver | Shanghai FLYCO Electric Co., Ltd(Shanghai,China) | ||
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH(EdisonstraBe 6,59157 Kamen, Germany) | ||
| Pentobarbital sodium | Merck | ||
| 75% ethanol | Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | ||
| blood collection tube | Hubei Jinxing Technology&Development Co.,Ltd (Wuhan Hubei Province,China) (2ml) | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co.,Ltd (Dongguan,Guangdng Province,China) | ||
| canvas gloves | for anethesia | ||
| hepain | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co.,Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) (2mL, 12500 IU) | ||
| physical saline | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd(Yueyang ,Hunan Province,China) (100ml) |
References
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology, Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Feng, J., et al. Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Wickremsinhe, E. R., Renninger, M., Paulman, A., Pritt, M., Schultze, A. E. Impact of Repeated Tail Clip and Saphenous Vein Phlebotomy on Rats Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. 44 (7), 1013-1020 (2016).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments. (90), e51969 (2014).
- Cochran, B. J., et al. Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), 266 (2007).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Lab Animal. 44 (4), 377-378 (2010).
- National Institute of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th, National Academies Press (US). US (Washington DC). (2011).
- Antonelli, D., Feldman, A., Freedberg, N. A., Turgeman, Y. Axillary vein puncture without contrast venography for pacemaker and defibrillator leads implantation. Pacing and Clinical Electrophysiology. 36 (9), 1107-1110 (2013).
- Luis, A. L., et al. Microscopic magnetic resonance imaging of the thoracic venous system in rats with congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 27 (2), 175-180 (2011).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
