Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at indsamle blodprøver fra rotte subclavia vene.
Abstract
Blod samling med nok blodvolumen er afgørende i dyreforsøg. Indsamling fra hale vene af rotter er populære og mindre stressende sammenlignet med andre mere aggressive metoder såsom retro-orbital plexus prøve samling. Men, dette blod indsamlingsmetoden er undertiden begrænset af en utilfredsstillende succesrate. Her, vil vi præsentere en metode for indsamling gennem subclavia vene punktering. Subclavia vene er placeret lige under kravebenet og denne vene er stor nok til at opfylde kravene volumen af blod samling. Vores resultater viser, at denne metode er sikker og gældende for blod stikprøvetagning med den nødvendige blodvolumen. Blod samling gennem subclavia vene punktering kunne tjene som en alternativ blod indsamlingsmetoden i tilfælde af fejlslagne hale vene blod prøveudtagning i rotter.
Introduction
Indsamling er afgørende i dyreforsøg. Target venerne for blod samling omfatter retro-orbital plexus, halsfedt, den saphenous vene, hale blodkar og halspulsåren1,2,3,4. Nogle gange, kunne blod indhentes fra den abdominale aorta, vena cava eller endda hjertet5,6,7. Ved sådanne lejligheder, dyrene skal ofres og kan ikke bruges til efterfølgende observationsperiode således, disse metoder der bruges mindre i daglige eksperimentelt arbejde. Indsamling fra hale vene af rotter er populære og mindre stressende i forhold til de ovenfor nævnte metoder8.
Men, blod samling fra hale vene er undertiden begrænset af en utilfredsstillende succesrate. Lejlighedsvis, er det også svært at få nok blodvolumen ved denne metode. Som subclavia vene er stor nok og er placeret lige under kravebenet knogle, kan subclavia vene punktering være en alternativ metode til blod prøveudtagning hvis rutinemæssig blod samling metoder er mislykket. Her, indfører vi en metode til indsamling af subclavia vene punktering i rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt ved Central South University etiske komité for Animal forskning fra anden Xiangya Hospital (Changsha, Kina). Håndskriftet blev tilberedt efter ANKOMME (Animal forskning: rapportering af i Vivo eksperimenter) retningslinjer9.
1. materiale og dyr forberedelse
- Forberede krævede materialer: selvklæbende tape, epilering agent, 75% ethanol, blod collection tube, 2,5 mL sprøjte forbundet med nål (24 G, 0,6 mm x 25 mm), hår shaver, elektronisk skala og gauge (Se Tabel af materialer).
- Bruge 20 Sprague-Dawley (SD) rotter, alderen 8-10 uger og vejer 153-200 g (Se Tabel af materialer). Vedligeholde rotter i overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr10.
- House rotter under standardbetingelser med fri adgang til fødevarer og drikkevand. Holde dem i 530 cm2 bure med træ-barbering sengetøj (2 rotter pr. bur). Vedligeholde dyr i en temperatur-kontrolleret rum temperatur på omkring 25 ° C.
- Fremkalde generel anæstesi (natrium pentobarbital 40 mg/kg) i alle dyr gennem intraperitoneal injektion før subclavia vene punktering.
- Placere rotten i en liggende stilling. Fix hind lemmer i en behagelig stilling og lave overekstremiteterne parallelt med kroppens akse lige ved siden af stammen.
Bemærk: Ingen mekanisk ventilation er nødvendig for denne procedure (figur 1). - Rense begge sider af infraclavicular plads til at fjerne skind (med hår shaver og epilering agent, se Tabel af materialer) og synligt snavs. Tør hals og bryst huden med 75% ethanol. Holde området for punktering, rent og tørt med gaze.
2. blod samling Procedure
Bemærk: Begge sider af subclavia vene er egnet for punktering, og her vælger vi til højre for punktering. Placering og retning af den rigtige kravebenet er identificeret af operatørens venstre tommelfinger (figur 2). Suprasternal under øjnene er forsigtigt rørt med pegefingeren som suprasternal under øjnene er i retning af nål (figur 2).
- Skyl en steril 2,5 mL sprøjte med heparin løsning (10 IU/mL).
- Find webstedet punktering 0,5 mm caudale til regionen ydre 1/3 af den rigtige nøgleben (figur 3). Flytte sprøjten forsigtigt ind i huden af webstedet punktering. Når kanylen træder infraclavicular hud, anvende undertryk med operatørens højre hånd (figur 4).
Bemærk: Gennemsnitlig og maksimal blodvolumen er 1,0 mL og 1,4 mL, henholdsvis. Retning af nålen placeres mod suprasternal under øjnene og bør være næsten parallel med nøgleben lige posteriort for det. Normalt, kan subclavia vene nås ved at indsætte nålen omkring 2 mm i denne retning. Når nålen ind i venen, træder blod i sprøjten under undertryk.- Vedligeholde undertryk indtil nok volumen af blod er tegnet (figur 5).
- Hvis samlingen subclavia vene blod ikke er vellykket, hæve nålen til subkutan området og justere retningen af nålen lidt interiør til brystbenet.
- Hvis tre forsøg mislykkes, undgå subclavia vene fra samme side og bruge de kontralaterale side for udtagning af blodprøve.
- Efter indsamling, fjerne punktering nålen, og lægge pres på webstedet punktering i 1-2 minutter til at stoppe blødninger.
Bemærk: Trykket skal være meget blid at forhindre kvælning.
3. blod prøve behandling
- Overføre blodprøven i en antikoagulans-belagt vakuum rør (med EDTA) og centrifugeres i 10 min. ved 1600 x g at indsamle plasma.
- Opsug supernatanten til en ren rør og opbevares ved-80 ° C (figur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ialt 20 SD rotter (mandlige n = 10, kvindelige n = 10) blev brugt her. Blod collectionwas udføres af kvalificerede operatører, som har udført mere end 20 blod prøveudtagninger fra subclavia vene i rotter, og driftslederne nybegynder, der har ingen subclavia vene punktering erfaring med rotter eller andre dyr. Før operationer set begyndere mindst 3 procedurer gjort af operatorer.
Udtagning af blodprøve lykkedes 17 rotter gennem den rigtige subclavia vene adgang. Denne fremgangsmåde i 3 rotter (1 i gruppen faglært) og 2 i gruppen begynder, og udtagning af blodprøve var succes gennem de venstre subclavia vene adgange i disse 3 rotter. Tid kurset og blod volumen indsamles for hvert enkelt tilfælde er illustreret i tabel 1. Succesraten var ens mellem gruppen nybegynder (80%) og den dygtige gruppe (90%, p = 0.531). Succesraten var 100% for begge grupper, når herunder yderligere venstre subclavia vene adgange i de 3 rotter. To tailed Student's t-test viste, at der var ingen signifikant forskel på tid brugt mellem nybegynder og dygtige gruppen (102,1 ± 14,9 s versus 84.3 ± 9,7 s, p = 0,33, figur 7). Ingen alvorlige komplikationer opstod i alle procedurer såsom pneumothorax, hemopneumothorax, eller større blødning under eller efter operationen. Alle dyr overlevede og inddrevet inden for 30 minutter efter udtagning af blodprøve.
For at demonstrere vanskelighederne af læring punktering procedure, vi yderligere sammenlignet antallet af hævninger mellem faglærte og nybegynder grupper. Som vist i tabel 2, det gennemsnitlige antal udbetalinger i gruppen dygtige er lidt mindre end gruppen nybegynder (1,6 ±0.3 vs. 2,5 ±0.4), men der er ingen Statistisk signifikans (p = 0.0913).
Figur 1 : Stand af rats. Rotter er lagt i en liggende stilling, og de øvre lemmer fastsættes parallelt med kroppens akse, lige ved siden af stammen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Identificere rotter overflade symboler. (A) den venstre tommelfinger af operatøren er på den rigtige kravebenet til at identificere placeringen og array af denne knogle; (B) suprasternal under øjnene er forsigtigt rørte med pegefingeren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Placering af punktering. Punktering websted er placeret 0,5 mm caudale til webstedet ydre 1/3 af den rigtige kravebenet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Danner undertryk i sprøjten. Når kanylen træder infraclavicular hud, flytte fingrene af højre hånd til at skabe undertryk i sprøjten. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Trække blod ind i sprøjten. Når nålen ind subclavia vene, træder blod i sprøjten under undertryk. Den negative presset holdes indtil nok blod er opnået. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Plasma udvinding efter centrifugering. Efter centrifugering, er blodet opdelt i plasma og celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Tid kurset og succes sats mellem forskellige grupper. Dette diagram viser ingen væsentlige forskelle i tidsforbrug (venstre panel) eller succes rate (højre panel) mellem faglærte og nybegynder-gruppen. Tiden kursus i nybegynder og dygtige-gruppen er 102,1 ± 14,9 s og 84.3 ± 9,7 s, henholdsvis p = 0,33 mellem grupper. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 : Anatomi af subclavia vene. Subclavia vene ligger lige posteriort og caudale til kravebenet. Det slutter med den interne halsfedt form brachiocephalic vene og afløb i super vena cava, lige under suprasternal under øjnene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| dygtig gruppe | Begynder gruppe | |||||||||
| Køn | Vægt (g) | Blodvolumen (mL) | Tidsforløb (S) | Køn | Vægt (g) | blodvolumen (mL) | Tidsforløb (S) | |||
| S1 | mand | 153 | 1,6 | 70 | B1 | mand | 149 | 1,6 | 72 | |
| S2 | mand | 168 | 1,6 | 60 | B2 | mand | 158 | 1,6 | 68 | |
| S3 | kvinde | 183 | 1,6 | 75 | B3 | kvinde | 190 | 1,6 | 83 | |
| S4 | kvinde | 170 | 1,6 | 74 | B4 | kvinde | 160 | 1,6 | 77 | |
| S5 | kvinde | 159 | 1,6 | 65 | B5 | kvinde | 153 | 1,6 | 200 | |
| S6 | mand | 200 | 1,6 | 83 | B6 | mand | 187 | 1,6 | 92 | |
| S7 | mand | 178 | 1,6 | 86 | B7 | mand | 164 | 1,6 | 99 | |
| S8 | mand | 187 | 1,6 | 168 | B8 | mand | 200 | 1,6 | 82 | |
| S9 | kvinde | 192 | 1,6 | 83 | B9 | kvinde | 198 | 1,6 | 70 | |
| S10 | kvinde | 157 | 1,6 | 79 | B10 | kvinde | 175 | 1,6 | 178 | |
Tabel 1: Blod volumen og tid kurset fra punktering til en færdig blod samling. S: kvalificerede gruppe; B: begyndere.
| Gruppe | n | Middelværdi | SE | 95% conf. Interval | |
| B | 10 | 2.5 | 0,4 | 1,59 | 3.41 |
| S | 10 | 1,6 | 0,3 | 0,91 | 2.29 |
Tabel 2: Antallet af hævninger mellem de to grupper. B: begyndere; S: kvalificerede gruppe. p = 0.0913
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her introducerer vi en alternativ metode til blod udvinding fra subclavia vene og vi viser, at denne metode er realistisk, sikker og gældende for udtagning af blodprøve i rotter. Denne metode er afledt af subclavia vene punktering i pacemaker fører implantation for patienter11. Subclavia vene ligger lige posteriort og caudale at kravebenet og er en fortsættelse af den aksillær vene. Det løber fra den ydre kant af det første ribben på den mediale kant af forreste scalene muskel12. Fra her, det slutter med den interne halsfedt til at danne brachiocephalic venen og afløb i super vena cava, lige under suprasternal under øjnene (figur 8). Kravebenet er let identificeres og der er et klart anatomiske forhold mellem subclavia vene og nøgleben. Her, anvendte vi denne kliniske færdigheder til dyreforsøg. På grund af den forskellige orientering af overekstremiteterne hos mennesker og rotter, er overekstremiteterne placeret lige ved siden af stammen under procedure at eksponere plads caudale at kravebenet, som vil lette punktering (figur 1).
Subclavia vene er meget større end den hale vene. Derfor er det lettere at få tilstrækkeligt blod fra subclavia vene end fra hale vene. Den samlede prøve volumen kunne nå 10% af den samlede cirkulerende blodvolumen hver gang1. Hvis konventionelle hale vene blod prøvetagning eller en anden rute mislykkes, kan forskere anser subclavia vene punktering. Generel anæstesi er nødvendig for denne procedure, og dette er en stor begrænsning af denne procedure. Her bruger vi pentobarbital natrium for generel anæstesi. Sammenlignet med andre agenter, pentobarbital natrium er let at injicere, og ingen andre særlige instrumenter er nødvendige. Tsukamoto et al. rapporteret at isofluran indånding havde den mest stabile SpO2 end andre agenter og havde korte inddrivelse gange. I centre med indånding udstyr, kan isofluran anses13. Desuden som subclavia vene er beliggende tæt på brysthulen, skal vi være omhyggelig med at forhindre alvorlige procedure-relaterede komplikationer såsom pneumothorax og hemopneumothorax. Retning af nålen skal omhyggeligt instrueret til at undgå disse komplikationer. Nålen placeres her, altid parallel med nøgleben og bare posteriort for det og flyttede forsigtigt mod suprasternal under øjnene. Resultaterne viser, at brug af ovenstående teknik kan undgå potentielle komplikationer. Undgå enhver nedadgående retning af nålen mod brysthulen i denne procedure. Også, dybden af subclavia vene skal altid holdes ca. 2 mm fra webstedet punktering.
Lejlighedsvis, kan forsøg på fra den ene side mislykkes. Vi foreslår ikke mere end 3 prøver fra samme side. I sådanne forhold, skal du bruge anden siden for punktering, som kan øge succesraten for udtagning af blodprøve. Illustrer yderligere gennemførligheden af vores metode, testede vi succesrate og tid brugt mellem en nybegynder og en dygtig gruppen. Interessant, der var ingen Statistisk signifikans mellem disse grupper (p = 0,33), som viste sig gennemførligheden af det nyligt udviklede metode.
Som diskuteret her, er den største begrænsning succesrate på den ene side. Hvis proceduren mislykkes, skal betragtes som anden siden af subclavia vene. Generel anæstesi er anvendt i denne procedure og inddrivelse tid i gennemsnit ca. 30 min. med pentobarbital natrium. Isofluran inhalation anæstesi har en meget kortere restitutionstid og vedtagelse af nye anæstesi metoder kan være nyttige i at reducere varigheden af proceduren. Vi viser, at denne metode gælder for rotter, men vi har ikke testet sin anvendelighed til mindre dyr som mus.
Afslutningsvis, viser undersøgelsens resultater, subclavia vene punktering metode for blod prøve samling er sikker og gennemførlige i rotter. Denne metode er særlig værdifuld når store mængder blod er nødvendige. Denne metode er et optimalt alternativ hvis konventionelle blod prøveudtagningsprocedurer mislykkes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation i Kina nr. 81670269, nr. 81500355 og nr. 81500226.
Acknowledgments
Ingen erklæret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rats | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| stastical software | SPSS Statistics 17 | ||
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co.,Ltd(Guangzhou, Guangdong Province ,China) | ||
| 2.5 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co.,Ltd(Weihai,Shandong Province ,China) | ||
| hair shaver | Shanghai FLYCO Electric Co., Ltd(Shanghai,China) | ||
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH(EdisonstraBe 6,59157 Kamen, Germany) | ||
| Pentobarbital sodium | Merck | ||
| 75% ethanol | Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | ||
| blood collection tube | Hubei Jinxing Technology&Development Co.,Ltd (Wuhan Hubei Province,China) (2ml) | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co.,Ltd (Dongguan,Guangdng Province,China) | ||
| canvas gloves | for anethesia | ||
| hepain | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co.,Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) (2mL, 12500 IU) | ||
| physical saline | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd(Yueyang ,Hunan Province,China) (100ml) |
References
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology, Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Feng, J., et al. Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Wickremsinhe, E. R., Renninger, M., Paulman, A., Pritt, M., Schultze, A. E. Impact of Repeated Tail Clip and Saphenous Vein Phlebotomy on Rats Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. 44 (7), 1013-1020 (2016).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments. (90), e51969 (2014).
- Cochran, B. J., et al. Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), 266 (2007).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Lab Animal. 44 (4), 377-378 (2010).
- National Institute of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th, National Academies Press (US). US (Washington DC). (2011).
- Antonelli, D., Feldman, A., Freedberg, N. A., Turgeman, Y. Axillary vein puncture without contrast venography for pacemaker and defibrillator leads implantation. Pacing and Clinical Electrophysiology. 36 (9), 1107-1110 (2013).
- Luis, A. L., et al. Microscopic magnetic resonance imaging of the thoracic venous system in rats with congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 27 (2), 175-180 (2011).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
