Summary
Qui, presentiamo un protocollo per raccogliere campioni di sangue dalla vena succlavia del ratto.
Abstract
Raccolta di sangue con abbastanza volume di sangue è essenziale negli esperimenti sugli animali. Raccolta del sangue dalla vena della coda dei ratti è popolare e meno stressante rispetto ad altri metodi più aggressivi come retro-orbitale plesso raccolta dei campioni. Tuttavia, questo metodo di raccolta di sangue a volte è limitato da un tasso di successo insoddisfacente. Qui, presentiamo un metodo per la raccolta del sangue attraverso la puntura della vena succlavia. La vena succlavia si trova appena sotto la clavicola e questa vena è grande abbastanza per soddisfare i requisiti di volume della raccolta del sangue. I nostri risultati indicano che questo metodo è sicuro e applicabile per il campionamento di raccolta di sangue con il volume di sangue necessario. Raccolta del sangue attraverso la puntura della vena succlavia potrebbe servire come un metodo di raccolta di sangue alternativi in caso di prelievo di sangue della vena della coda non riuscita in ratti.
Introduction
Raccolta del sangue è essenziale nella ricerca animale. Le vene di destinazione per la raccolta del sangue includono il plesso di retro-orbitale, la vena giugulare, la vena safena, coda vasi sanguigni e l'arteria carotica1,2,3,4. A volte, potrebbe essere ottenuto sangue dall'aorta addominale, della vena cava o anche il cuore5,6,7. In tali occasioni, gli animali devono essere sacrificati e non possono essere utilizzati per l'osservazione successiva; così, questi metodi sono utilizzati meno nel quotidiano lavoro sperimentale. Raccolta del sangue dalla vena della coda dei ratti è popolare e meno stressante rispetto ad i suddetti metodi8.
Tuttavia, prelievo di sangue dalla vena caudale molte volte è limitato da un tasso di successo insoddisfacente. In alcuni casi, è anche difficile da ottenere abbastanza volume di sangue da questo metodo. Come la vena succlavia è abbastanza grande e si trova appena sotto l'osso della clavicola, puntura della vena succlavia può essere un metodo alternativo per il campionamento di sangue se i metodi di raccolta sistematica di anima non hanno esito positivo. Qui, presentiamo un metodo di raccolta del sangue mediante puntura della vena succlavia in ratti.
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Protocol
Questo studio è stato approvato dal comitato etico University South Central per ricerca animale dall'ospedale Xiangya secondo (Changsha, Cina). Il manoscritto è stato preparato secondo ARRIVE (Animal Research: Reporting di In Vivo esperimenti) linee guida9.
1. materiale e animale preparazione
- Preparare i materiali richiesti: nastro adesivo, agente di epilazione, 75% etanolo, tubo di raccolta sangue, 2,5 mL siringa collegata con ago (24 G, 0,6 mm x 25 mm), capelli rasoio, bilancia elettronica e calibro (Vedi Tabella materiali).
- Utilizzare 20 ratti Sprague-Dawley (deviazione standard), invecchiate 8-10 settimane e pesatura 153-200 g (Vedi Tabella materiali). Mantenere ratti in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio10.
- Ratti a casa in condizioni standard con accesso gratuito per cibo e acqua potabile. Tenerli in gabbie di2 cm 530 con biancheria da letto di rasatura di legno (2 ratti per gabbia). Mantenere gli animali in una temperatura ambiente temperatura controllata intorno ai 25 ° c.
- Indurre l'anestesia generale (sodio pentobarbital 40 mg/kg) in tutti gli animali tramite l'iniezione intraperitoneale prima della puntura della vena succlavia.
- Posto il ratto in posizione supina. Difficoltà arti posteriori in una posizione comoda e difficoltà dell'arto superiore parallela all'asse del corpo appena al lato del tronco.
Nota: Nessuna ventilazione meccanica è necessaria per questa procedura (Figura 1). - Pulire entrambi i lati dello spazio infraclavicular rimuovere pelliccia (con capelli rasoio e agente di epilazione, Vedi Tabella materiali) e lo sporco visibile. Pulire il collo e la pelle toracica con etanolo al 75%. Mantenere l'area per la puntura pulito e asciutto con una garza.
2. procedura di raccolta del sangue
Nota: Entrambi i lati della vena subclavian sono adatti per la puntura, e qui abbiamo scelto il lato destro per la puntura. La posizione e la direzione della clavicola di destra sono identificati da pollice sinistro dell'operatore (Figura 2). I fossae di suprasternal sono toccati delicatamente con il dito indice come i fossae di suprasternal è nella direzione dell'ago (Figura 2).
- Sciacquare una siringa sterile da 2,5 mL con soluzione di eparina (10 IU/mL).
- Individuare il sito di puntura 0,5 mm caudale nella regione di 1/3 esterno della clavicola di destra (Figura 3). Spostare delicatamente la siringa nella pelle del sito di puntura. Una volta che l'ago entra nella pelle infraclavicular, applicare una pressione negativa con la mano destra dell'operatore (Figura 4).
Nota: Il volume di sangue medio e massimo sono mL 1,0 e 1,4 mL, rispettivamente. La direzione dell'ago è posizionata verso i fossae di suprasternal e dovrebbe essere quasi parallela alla clavicola appena posteriormente ad esso. Di solito, la vena succlavia è raggiungibile inserendo l'ago di circa 2 mm in questa direzione. Una volta che l'ago entri la vena, sangue nella siringa entrerà sotto pressione negativa.- Mantenere la pressione negativa fino a quando viene disegnato un volume sufficiente di sangue (Figura 5).
- Se non viene completata la raccolta di sangue della vena subclavian, ritirare l'ago alla zona sottocutanea e regolare la direzione dell'ago leggermente interno allo sterno.
- Se tre tentativi falliscono, evitare la vena succlavia dallo stesso lato e utilizzare l'arto controlaterale per il prelievo di sangue.
- Dopo la raccolta del sangue, rimuovere l'ago di puntura e applicare pressione al sito della puntura per 1-2 minuti fermare l'emorragia.
Nota: La pressione deve essere molto delicata per evitare il soffocamento.
3. trattamento del campione di sangue
- Trasferire il campione di sangue in un tubo a vuoto rivestite con anticoagulante (con EDTA) e centrifugare per 10 min 1600 x g per la raccolta del plasma.
- Aspirare il surnatante in una provetta pulita e conservare a-80 ° C (Figura 6).
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Representative Results
Un totale di 20 ratti di SD (maschio n = 10, femmina n = 10) sono stati usati qui. Collectionwas di sangue eseguito da operatori specializzati, che si sono esibiti più di 20 campionamenti di sangue dalla vena succlavia in ratti e dagli operatori principianti, che non hanno nessuna puntura della vena succlavia esperienza nei ratti o altri animali. Prima delle operazioni, i principianti guardato almeno 3 procedure fare da operatori specializzati.
Prelievo di sangue è riuscito a 17 ratti attraverso l'accesso di vena succlavia destra. Questa procedura non è riuscita in 3 ratti (1 nel gruppo di qualificati) e 2 nel gruppo del principiante, e il prelievo di sangue riusciva attraverso il vena succlavia sinistra gli accessi in questi 3 ratti. Il volume di sangue e corso di tempo raccolti per ciascun caso sono illustrati nella tabella 1. Il tasso di successo era simile tra il gruppo di principianti (80%) e il gruppo di esperto (90%, p = 0,531). Il tasso di successo era al 100% per entrambi i gruppi quando si include il vena succlavia sinistra ulteriori accessi nei ratti di 3. Due dalla coda di Student t-test ha mostrato che non c'era differenza significativa sul tempo speso tra esperti e principianti gruppo (102,1 ± 14.9 s contro 84,3 ± 9,7 s, p = 0,33, Figura 7). Nessuna complicazione severa ha accaduto in tutte le procedure come pneumotorace, emopneumotorace o sanguinamento maggiore durante o dopo l'operazione. Tutti gli animali sono sopravvissuti e recupero entro 30 minuti dopo il prelievo di sangue.
Per illustrare le difficoltà di apprendimento la procedura di puntura, abbiamo confrontato ulteriormente il numero di prelievi tra esperti e gruppi di principianti. Come illustrato nella tabella 2, il numero medio di prelievi nel gruppo di esperto è leggermente inferiore rispetto al gruppo di principianti (1,6 ± 0,3 vs 2,5 ± 0,4), ma non c'è nessuna significatività statistica (p = 0.0913).
Figura 1 : Posizione dei ratti. I ratti vengono disposti in posizione supina e arti superiori sono fissati una parallela all'asse del corpo, appena al lato del tronco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Identificare i simboli di superficie dei ratti. (A), il pollice sinistro dell'operatore è sulla clavicola di destra per identificare la posizione e la matrice dell'osso; (B) il suprasternal fossae sono toccati delicatamente con il dito indice. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Posizione della puntura. Il sito di puntura è situato 0.5 mm caudale al sito esterno 1/3 della clavicola destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Formando pressione negativa nella siringa. Una volta che l'ago entra nella pelle infraclavicular, le dita della mano destra spostare creare pressione negativa nella siringa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Prelievo di sangue nella siringa. Quando l'ago entra in vena succlavia, sangue nella siringa entrerà sotto pressione negativa. La pressione negativa è mantenuta fino a quando non si ottiene abbastanza sangue. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Estrazione del plasma dopo centrifugazione. Dopo centrifugazione, il sangue è separato in plasma e cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 : Il tasso di corso e il successo di tempo tra i diversi gruppi. Questo grafico non Mostra differenze significative nel tempo trascorso (pannello sinistro) o successo tasso (pannello di destra) tra il gruppo di esperto e il gruppo di principianti. Il tempo in corso nel gruppo principiante e il gruppo di esperto sono 102,1 ± 14.9 s e 84,3 ± 9,7 s, rispettivamente, p = 0,33 tra gruppi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8 : L'anatomia della vena subclavian. La vena succlavia è situata a posteriori e caudale fino alla clavicola. Essa si unisce con la vena giugulare interna per formare la vena brachiocefalica e drena nella super vena cava, appena sotto i fossae di suprasternal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| gruppo di esperto | Gruppo di principianti | |||||||||
| Genere | Peso corporeo (g) | Volume del sangue (mL) | Corso di tempo (S) | Genere | Peso corporeo (g) | volume del sangue (mL) | Corso di tempo (S) | |||
| S1 | uomo | 153 | 1.6 | 70 | B1 | uomo | 149 | 1.6 | 72 | |
| S2 | uomo | 168 | 1.6 | 60 | B2 | uomo | 158 | 1.6 | 68 | |
| S3 | donna | 183 | 1.6 | 75 | B3 | donna | 190 | 1.6 | 83 | |
| S4 | donna | 170 | 1.6 | 74 | B4 | donna | 160 | 1.6 | 77 | |
| S5 | donna | 159 | 1.6 | 65 | B5 | donna | 153 | 1.6 | 200 | |
| S6 | uomo | 200 | 1.6 | 83 | B6 | uomo | 187 | 1.6 | 92 | |
| S7 | uomo | 178 | 1.6 | 86 | B7 | uomo | 164 | 1.6 | 99 | |
| S8 | uomo | 187 | 1.6 | 168 | B8 | uomo | 200 | 1.6 | 82 | |
| S9 | donna | 192 | 1.6 | 83 | B9 | donna | 198 | 1.6 | 70 | |
| S10 | donna | 157 | 1.6 | 79 | B10 | donna | 175 | 1.6 | 178 | |
Tabella 1: Il corso di volume e tempo di sangue da puntura a una raccolta di sangue finito. S: gruppo qualificato; B: principianti.
| Gruppo | n | Significa | SE | Conf. 95% intervallo | |
| B | 10 | 2.5 | 0.4 | 1.59 | 3,41 |
| S | 10 | 1.6 | 0.3 | 0.91 | 2.29 |
Tabella 2: Il numero di prelievi tra i due gruppi. B: principianti; S: gruppo qualificato. p = 0.0913
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Discussion
Qui, presentiamo un metodo alternativo per l'estrazione del sangue dalla vena succlavia e mostriamo che questo metodo è fattibile, sicura e applicabile per il prelievo di sangue in ratti. Questo metodo è derivato dalla puntura della vena succlavia in impianto di piombo dello stimolatore cardiaco per pazienti11. La vena succlavia si trova solo posteriore e caudale alla clavicola ed è una continuazione della vena ascellare. Va dal confine esterno della prima nervatura il bordo mediale del muscolo scaleni anteriore12. Da qui, unisce con la vena giugulare interna per formare la vena brachiocefalica e drena nella super vena cava, appena di sotto di suprasternal fossae (Figura 8). La clavicola è facilmente identificabile e c'è un rapporto chiaro anatomico fra la vena succlavia e la clavicola. Qui, abbiamo applicato questa abilità clinica agli esperimenti sugli animali. A causa del diverso orientamento dell'arto superiore in esseri umani ed in ratti, l'arto superiore è posizionato appena al lato del tronco durante la procedura di esporre lo spazio caudale fino alla clavicola, che faciliterà la puntura (Figura 1).
La vena succlavia è molto più grande vena caudale. Pertanto, è più facile ottenere abbastanza sangue dalla vena succlavia rispetto da vena caudale. Il volume totale del campione potrebbe raggiungere il 10% del totale volume di sangue circolante ogni volta1. Se il prelievo di sangue della vena della coda convenzionale o un altro percorso non riesce, i ricercatori possono considerare la puntura della vena succlavia. L'anestesia generale è necessaria per questa procedura, e si tratta di una limitazione importante di questa procedura. Qui, usiamo il sodio pentobarbital per l'anestesia generale. Rispetto ad altri agenti, sodio pentobarbital è facile da iniettare, e altri strumenti speciali non sono necessari. Tsukamoto et al ha segnalato che l'inalazione isoflurane aveva il più stabile di SpO2 rispetto ad altri agenti e aveva ridotti tempi di ripristino. Nei centri con dispositivi per l'inalazione, isoflurane può essere considerata13. Inoltre, come la vena succlavia si trova vicino la cavità toracica, dobbiamo essere attenti per evitare le complicazioni procedura-relative severe quali pneumotorace ed emopneumotorace. La direzione dell'ago deve essere diretto con attenzione per evitare queste complicazioni. Qui, l'ago viene sempre posizionato parallelo alla clavicola e solo posteriore ad esso e spostato dolcemente verso i fossae di suprasternal. I risultati mostrano che l'uso di sopra tecnica può evitare le complicazioni potenziali. Evitare qualsiasi verso il basso dell'ago verso la cavità toracica in questa procedura. Inoltre, la profondità della vena subclavian deve essere sempre circa 2 mm dal sito di puntura.
Occasionalmente, i tentativi da un lato potrebbero non riuscire. Noi non consigliamo di più di 3 tentativi dallo stesso lato. In tali condizioni, è possibile utilizzare l'altro lato per la puntura, che può migliorare il tasso di successo del prelievo di sangue. Per illustrare ulteriormente la fattibilità del nostro metodo, abbiamo testato il tasso di successo e il tempo speso tra un gruppo di principianti e un gruppo qualificato. Interessante, non c'erano nessun significato statistico tra questi gruppi (p = 0,33), che ha dimostrato la praticabilità di questa recente sviluppato metodo.
Come discusso qui, la limitazione principale è il tasso di successo su un lato. Se la procedura ha esito negativo, deve essere considerata da altra parte della vena subclavian. L'anestesia generale viene utilizzato in questa procedura e il tempo di recupero una media di circa 30 min con sodio pentobarbital. Anestesia per inalazione isoflurane ha un tempo di recupero molto più breve e l'adozione di nuovi metodi di anestesia potrebbe essere utile nel ridurre la durata della procedura. Mostriamo che questo metodo è applicabile ai ratti, ma che non abbiamo testato la sua applicabilità ai più piccoli animali come topi.
In conclusione, i risultati dello studio indicano che il metodo di puntura della vena subclavian per raccolta del campione di sangue è sicura e fattibile in ratti. Questo metodo è particolarmente utile quando sono necessarie grandi quantità di sangue. Questo metodo è un'alternativa ottima se le procedure di campionamento di sangue convenzionali non riescono.
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Disclosures
Questo lavoro è stato supportato dalla concessione dal National Natural Science Foundation di Cina n. 81670269, n. 81500355 e n. 81500226.
Acknowledgments
Nessuno ha dichiarato.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rats | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| stastical software | SPSS Statistics 17 | ||
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co.,Ltd(Guangzhou, Guangdong Province ,China) | ||
| 2.5 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co.,Ltd(Weihai,Shandong Province ,China) | ||
| hair shaver | Shanghai FLYCO Electric Co., Ltd(Shanghai,China) | ||
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH(EdisonstraBe 6,59157 Kamen, Germany) | ||
| Pentobarbital sodium | Merck | ||
| 75% ethanol | Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | ||
| blood collection tube | Hubei Jinxing Technology&Development Co.,Ltd (Wuhan Hubei Province,China) (2ml) | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co.,Ltd (Dongguan,Guangdng Province,China) | ||
| canvas gloves | for anethesia | ||
| hepain | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co.,Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) (2mL, 12500 IU) | ||
| physical saline | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd(Yueyang ,Hunan Province,China) (100ml) |
References
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