Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאסוף דגימות דם מן הווריד בריחי של חולדה.
Abstract
איסוף דם עם מספיק נפח הדם חיונית בניסויים על בעלי חיים. איסוף דם מן הווריד של הזנב של חולדות הוא פופולרי פחות מלחיץ לעומת שיטות אחרות אגרסיבי יותר כמו רטרו-מסלולית מקלעת לטעום אוסף. עם זאת, שיטה זו של אוסף דם לפעמים מוגבל על ידי שיעור ההצלחה משביעת רצון. כאן, אנחנו מציגים את שיטת איסוף דם דרך הווריד בריחי הניקוב. תקחי את בריחי ממוקם בדיוק מתחת לעצם הבריח, הוריד הזה הוא מספיק גדול כדי למלא את דרישות האחסון של איסוף דם. התוצאות שלנו מראים כי בשיטה זו הוא בטוח וישימים לדיגום אוסף דם עם נפח הדם הנדרשת. איסוף דם דרך הווריד בריחי הניקוב יכול לשמש כמו שיטת איסוף דם חלופי במקרה של לקיחת דמים וריד הזנב שנכשלו בחולדות.
Introduction
איסוף דם חיוני בתחום המחקר בבעלי חיים. הורידים היעד עבור איסוף דם כוללים את מקלעת רטרו-מסלולית, ומוחלף על, וריד saphenous, כלי הדם הזנב את העורק הראשי1,2,3,4. לפעמים, דם יכולה להיות מושגת העורק הראשי, הנבוב או אפילו את הלב5,6,7. במקרים כאלה, בעלי החיים חייבים להיות מוקרבים ואין אפשרות להשתמש להשגחה הבאים; לכן, שיטות אלה משמשים פחות בעבודה היומיומית ניסיוני. איסוף דם מן הווריד של הזנב של חולדות הוא פופולרי ומלחיץ פחות לעומת שיטות8שהוזכרו לעיל.
עם זאת, איסוף דם מן הווריד של הזנב לפעמים מוגבל על ידי שיעור ההצלחה משביעת רצון. לפעמים, זה גם קשה להשיג מספיק נפח הדם בשיטה זו. כפי הווריד בריחי גדול מספיק והוא ממוקם בדיוק מתחת לעצם הבריח, ניקוב בריחי הווריד יכולה להיות שיטה חלופית עבור דגימה דם אם דם שגרתית אוסף שיטות נכשלות. כאן, אנחנו מציגים את שיטת איסוף דם דרך הווריד בריחי לנקב בחולדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושרה על ידי ועדת האתיקה המרכזית של אוניברסיטת דרום לחקר בעלי חיים מבית החולים Xiangya השני (צ'אנג-שא, סין). כתב היד הוכן לפי יגיעו (חיה מחקר: דיווח ב- Vivo ניסויים) הנחיות9.
1. החומר של בעלי חיים הכנה
- להכין חומרים הדרושים: דבק, הסוכן epilating, 75% אתנול, דם אוסף שפופרת, מזרק 2.5 מ ל מחובר עם מחט (24 G, 0.6 מ"מ x 25 מ"מ), גילוח שיער, מידה אלקטרוניים מד (ראה טבלה של חומרים).
- השתמש 20 חולדות ספראג-Dawley (SD), בגילאי 8-10 שבועות, במשקל 153-200 g (ראה טבלה של חומרים). לשמור על חולדות לפי המדריך בשביל טיפול, שימוש של חיות מעבדה10.
- חולדות House בתנאים סטנדרטיים עם גישה חופשית שתייה ואוכל. לשמור אותם בכלובים2 ס מ 530 עם מצעים עץ גילוח (שני עכברושים לכל הכלוב). לשמור על חיות מבוקרי טמפרטורה טמפרטורת החדר. ב בסביבות 25 º C.
- זירוז הרדמה כללית (סודיום פנטוברביטל 40 מ"ג לק"ג) כל בעלי החיים באמצעות הזרקה בקרום הבטן לפני הניקוב בריחי וריד.
- מקם את החולדה במצב פרקדן. לתקן את הגפיים האחוריות בתנוחה נוחה ולתקן את הגפיים העליונות מקביל לציר הגוף ליד תא המטען.
הערה: אין אוורור מכני נדרש עבור הליך זה (איור 1). - לנקות את שני הצדדים של המרחב infraclavicular להסרת פרווה (עם גילוח שיער, הסוכן epilating, ראה טבלה של חומרים) ולכלוך לעין כל. נגב את הצוואר, בית החזה העור עם 75% אתנול. שמור על האזור עבור ניקוב נקי ויבש עם גזה.
2. הליך איסוף הדם
הערה: שני צידי הווריד בריחי מתאימים לנקב ולאחר כאן בחרנו את הצד הנכון עבור ניקוב. המיקום והכיוון של הבריח הימנית מזוהים על ידי האגודל השמאלית של המפעיל (איור 2). Fossae suprasternal הם נגע בעדינות עם האצבע. כמו fossae suprasternal הוא בכיוון של המחט (איור 2).
- לשטוף מזרק 2.5 מ ל סטרילי עם הפרין פתרון (10 IU/mL).
- אתר החדירה 0.5 מ מ סימטרית לאזור 1/3 החיצוני של הבריח הימנית (איור 3). הזז את המזרק בעדינות לתוך העור של החדירה. ברגע שהמחט מזין את העור infraclavicular, הפעילו לחץ שלילי עם יד ימין של המפעיל (איור 4).
הערה: נפח הדם הממוצע ואת מירבית הן 1.0 mL ומל ' 1.4, בהתאמה. כיוון המחט נמצאת בעמדה כלפי fossae suprasternal לבין צריך להיות כמעט מקבילים עצם הבריח אחורי רק אליו. בדרך כלל, תקחי את בריחי ניתן להגיע על ידי החדרת המחט בערך 2 מ מ בכיוון הזה. ברגע שהמחט נכנסת את הווריד, דם יזין את המזרק בלחץ שלילי.- לשמור על לחץ שלילי עד נמשך מספיק נפח הדם (איור 5).
- אם האוסף דם בריחי וריד אינה מוצלחת, לשלוף את המחט אל אזור תת עורית ולהתאים את הכיוון של המחט מעט פנים לעצם החזה.
- אם שלושת הניסיונות, למנוע את הווריד בריחי מן הצד אותו ולהשתמש הצד contralateral עבור לקיחת דמים.
- לאחר איסוף דם, הסר את המחט לנקב, והפעילו לחץ כדי החדירה במשך 1-2 דקות לעצור את הדימום.
הערה: הלחץ חייב להיות עדין מאוד כדי למנוע חנק.
3. דם לטעום עיבוד
- להעביר את דגימת הדם שפופרת ריק מצופים קרישה (עם EDTA) לתוך צנטריפוגה 10 דקות ב g x 1600 לאסוף פלזמה.
- וארוקן את תגובת שיקוע צינור נקי ו החנות ב-80 מעלות צלזיוס (איור 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סכום כולל של 20 של חולדות SD (זכר n = 10, נקבה n = 10) שימשו כאן. Collectionwas דם המבוצעת על ידי מפעילי מיומן, אשר יש לבצע יותר מ-20 samplings דם הווריד בריחי בחולדות, ועל ידי האופרטורים מתחיל, שיש להם אין לנקב בריחי וריד ניסיון של חולדות או חיות אחרות. לפני פעולות, למתחילים צפו לפחות 3 הטיפולים על ידי מפעילים מיומנים.
לקיחת דמים הצליח ללבנים דרך הגישה וריד בריחי הנכון. הליך זה נכשל בחולדות 3 (1 בקבוצה מיומן) ו- 2 הקבוצה למתחילים, לקיחת דמים הצליחה לעבור כניסות וריד בריחי השמאלי בחולדות 3 אלה. זמן האחסון קורס והדם נאסף עבור כל מקרה מומחשים טבלה 1. שיעור ההצלחה היה דומה בין הקבוצה למתחילים (80%) לקבוצת מיומן (90%, p = 0.531). שיעור ההצלחה היה 100% עבור שתי הקבוצות כאשר כולל כניסות נוספות וריד בריחי השמאלי את החולדות 3. שניים זנבית של סטודנט t-הבדיקה מראים כי אין הבדל משמעותי בזמן שהושקעו בין למתחילים וקבוצת מיומן (102.1 ± 14.9 s לעומת 84.3 ± 9.7 s, p = 0.33, איור 7). אין סיבוכים חמורים אירעה בכל ההליכים כגון חזה אוויר, hemopneumothorax או דימום העיקריים במהלך או אחרי ניתוח. כל החיות ניצל ושוחזר בתוך 30 דקות לאחר דגימה דם.
כדי להדגים את הקשיים של למידה ההליך לנקב, השווינו עוד יותר את מספר משיכות בין מיומן וקבוצות למתחילים. כפי שמוצג בטבלה 2, המספר הממוצע של משיכות בקבוצה מיומן הוא קצת פחות הקבוצה למתחילים (1.6 ±0.3 לעומת 2.5 ±0.4), אבל יש אין מובהקות סטטיסטית (p = 0.0913).
איור 1 : המיקום של חולדות. העכברושים הונחו במצב פרקדן, הגפיים העליונות הן קבועות במקביל לציר הגוף, ליד תא המטען. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : לזהות את הסמלים משטח של חולדות. (א) האגודל השמאלי של המפעיל הוא על הבריח הימנית כדי לזהות את המיקום ואת מערך של העצם הזו; (B) suprasternal fossae הם נגע בעדינות עם האצבע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : מיקום פנצ'רים. החדירה הוא 0.5 מ מ ממוקם סימטרית לאתר 1/3 החיצוני של הבריח הימנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : ויוצרים לחץ שלילי במזרק. ברגע שהמחט מזין את העור infraclavicular, להזיז אצבעות יד ימין ליצור לחץ שלילי במזרק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : נסיגה דם לתוך המזרק. כאשר המחט מזין את הווריד בריחי, דם יזין את המזרק בלחץ שלילי. הלחץ השלילי נשמרת עד מספיק דם מתקבל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : פלזמה החילוץ לאחר צריך שתוציאו. לאחר, צריך שתוציאו הדם מחולק פלזמה ותאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 : קורס והצלחתה זמן בין קבוצות שונות. תרשים זה מציג אין הבדלים משמעותיים בשיעור הזמן המושקע (פאנל שמאלי) או הצלחה (לוח נכון) בין הקבוצה מיומן הקבוצה למתחילים. הזמן קורס למתחילים וקבוצת מיומנים הם 102.1 ± 14.9 s ו- s 84.3 ± 9.7, בהתאמה, p = 0.33 בין קבוצות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8 : האנטומיה של וריד בריחי. תקחי את בריחי ממוקם רק האחורי, סימטרית. יווארה לעצם הבריח. זה מצטרף עם הפנימי, ווריד הצוואר לטופס הווריד brachiocephalic ו מנקז לתוך הנבוב סופר, מתחת fossae suprasternal. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| קבוצה מיומן | קבוצה למתחילים | |||||||||
| מגדר | משקל הגוף (g) | נפח הדם (mL) | מסלול הזמן (S) | מגדר | משקל הגוף (g) | נפח הדם (mL) | מסלול הזמן (S) | |||
| S1 | זכר | 153 | 1.6 | 70 | B1 | זכר | 149 | 1.6 | 72 | |
| S2 | זכר | 168 | 1.6 | 60 | B2 | זכר | 158 | 1.6 | 68 | |
| S3 | נקבה | 183 | 1.6 | 75 | B3 | נקבה | 190 | 1.6 | 83 | |
| S4 | נקבה | 170 | 1.6 | 74 | B4 | נקבה | 160 | 1.6 | 77 | |
| S5 | נקבה | 159 | 1.6 | 65 | B5 | נקבה | 153 | 1.6 | 200 | |
| S6 | זכר | 200 | 1.6 | 83 | B6 | זכר | 187 | 1.6 | 92 | |
| S7 | זכר | 178 | 1.6 | 86 | B7 | זכר | 164 | 1.6 | 99 | |
| S8 | זכר | 187 | 1.6 | 168 | B8 | זכר | 200 | 1.6 | 82 | |
| S9 | נקבה | 192 | 1.6 | 83 | B9 | נקבה | 198 | 1.6 | 70 | |
| S10 | נקבה | 157 | 1.6 | 79 | B10 | נקבה | 175 | 1.6 | 178 | |
טבלה 1: דם זמן ונפח הקורס של ניקוב לאוסף דם סיים. S: קבוצה מיומן; ב': למתחילים.
| קבוצה | n | זאת אומרת | SE | 95% conf. מרווח | |
| B | 10 | 2.5 | 0.4 | 1.59 | 3.41 |
| S | 10 | 1.6 | 0.3 | 0.91 | 2.29 |
בטבלה 2: מספר משיכות בין שתי הקבוצות. ב': למתחילים; S: קבוצה מיומן. p = 0.0913
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מציגים את שיטה חלופית לחילוץ דם מן הווריד של הבריח, אנו מראים כי בשיטה זו הוא ריאלי, בטוח ו ישימים עבור דגימה דם בחולדות. שיטה זו נגזרת הניקוב בריחי וריד ב קוצב הלב הראשי השרשה עבור חולים11. הווריד בריחי ממוקם רק האחורי, סימטרית. יווארה לעצם הבריח, המשך הווריד בבית השחי. הפעלת מהגבול החיצוני של הצלע הראשונה לגבול המדיאלי של השריר הקדמי scalene12. מכאן, זה מצטרף עם הפנימי, ווריד הצוואר כדי ליצור את הווריד brachiocephalic ו מנקז לתוך הנבוב סופר, מתחת suprasternal fossae (איור 8). עצם הבריח מזוהה בקלות ויש קשר אנטומי ברור בין את הווריד בריחי לבין עצם הבריח. כאן, אנחנו חלה זו מיומנות קלינית על ניסויים בבעלי חיים. בגלל המיקומים השונים של הגפיים העליונות בני אדם, חולדות, הגפיים העליונות ממוקם ליד תא המטען במהלך ההליך כדי לחשוף את החלל סימטרית. יווארה לעצם הבריח, אשר יקל הניקוב (איור 1).
תקחי את הבריח הוא הרבה יותר גדול מאשר הווריד הזנב. לכן, קל יותר להשיג מספיק דם הווריד בריחי יותר מן הווריד של הזנב. אמצעי האחסון המדגם יכול להגיע 10% מכלל מחזורי נפח הדם כל הזמן1. אם לקיחת דמים וריד הזנב קונבנציונאלי או מסלול נוסף נכשל, חוקרים יכול לשקול הניקוב בריחי וריד. הרדמה כללית נדרש עבור הליך זה, זו מגבלה עיקרית של הליך זה. כאן, אנו משתמשים סודיום פנטוברביטל הרדמה כללית. לעומת סוכנים אחרים, סודיום פנטוברביטל קל להחדיר, בלי כלים מיוחדים אחרים נדרשים. . Tsukamoto et al. דיווח את שאיפת איזופלוריין SpO2 הכי יציב יותר סוכנים אחרים, והיו פעמים התאוששות קצרה. במרכזי עם מכשירי אינהלציה, איזופלוריין יכול להיחשב13. יתר על כן, כפי הווריד הבריח הינו ממוקם קרוב בחלל בית-החזה, עלינו להיזהר למנוע סיבוכים חמורים הקשורים בהליך כגון חזה ו- hemopneumothorax. הכיוון של המחט חייב להיות מופנות בזהירות כדי למנוע סיבוכים אלה. . הנה, המחט ממוקם תמיד מקביל לעצם הבריח, רק האחוריים לזה ועבר בעדינות לכיוון fossae suprasternal. התוצאות מראים כי השימוש מעל בטכניקה יכול למנוע סיבוכים פוטנציאליים. להימנע מכל כיוון כלפי מטה של המחט לכיוון בחלל בית-החזה בהליך זה. כמו כן, עומק הווריד בריחי חייב תמיד להישמר בערך 2 מ מ מן החדירה.
לעיתים, ניסיונות מצד אחד עלולה להיכשל. אנחנו לא מציע יותר מ-3 נסיונות מ באותו הצד. בתנאים כאלה, להשתמש בצד השני לנקב, אשר עשוי לשפר את שיעור ההצלחה של לקיחת דמים. כדי להמחיש עוד יותר את הכדאיות של השיטה שלנו, בדקנו את שיעור ההצלחה והזמן שהושקעו בין קבוצה למתחילים וקבוצת מיומנים. מעניין לציין, היו ללא מובהקות סטטיסטית בין הקבוצות האלה (p = 0.33), אשר הוכיחו את practicability זה עתה פיתח שיטה.
כפי שהוזכר כאן, המגבלה העיקרית היא שיעור ההצלחה בצד אחד. אם ההליך נכשל, יש לקחת בחשבון את הצד השני של הווריד בריחי. הרדמה כללית משמש בהליך זה, זמן ההחלמה הממוצע היה כ- 30 דקות עם סודיום פנטוברביטל. הרדמה שאיפה איזופלוריין יש הרבה זמן קצר יותר השחזור, האימוץ של שיטות הרדמה חדשות יכול לסייע בהקטנת משך ההליך. אנו מראים כי שיטה זו ישימה על חולדות, אבל לא בדקנו את תחולתן על חיות קטנות יותר כמו עכברים.
לסיכום, תוצאות המחקר מציינים כי שיטת לנקב בריחי וריד עבור איסוף דגימת דם הוא ריאלי בחולדות ובטוחה. בשיטה זו הוא יקר במיוחד כאשר יש צורך כמויות גדולות של דם. שיטה זו היא חלופה אופטימלית אם לקיחת דמים קונבנציונאלי הליכים נכשלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
עבודה זו נתמכה על ידי המענק מן הלאומי מדעי הטבע קרן של סין מס 81670269, מס 81500355 מס 81500226.
Acknowledgments
אף אחד לא הכריז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rats | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| stastical software | SPSS Statistics 17 | ||
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co.,Ltd(Guangzhou, Guangdong Province ,China) | ||
| 2.5 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co.,Ltd(Weihai,Shandong Province ,China) | ||
| hair shaver | Shanghai FLYCO Electric Co., Ltd(Shanghai,China) | ||
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH(EdisonstraBe 6,59157 Kamen, Germany) | ||
| Pentobarbital sodium | Merck | ||
| 75% ethanol | Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | ||
| blood collection tube | Hubei Jinxing Technology&Development Co.,Ltd (Wuhan Hubei Province,China) (2ml) | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co.,Ltd (Dongguan,Guangdng Province,China) | ||
| canvas gloves | for anethesia | ||
| hepain | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co.,Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) (2mL, 12500 IU) | ||
| physical saline | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd(Yueyang ,Hunan Province,China) (100ml) |
References
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology, Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Feng, J., et al. Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Wickremsinhe, E. R., Renninger, M., Paulman, A., Pritt, M., Schultze, A. E. Impact of Repeated Tail Clip and Saphenous Vein Phlebotomy on Rats Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. 44 (7), 1013-1020 (2016).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments. (90), e51969 (2014).
- Cochran, B. J., et al. Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), 266 (2007).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Lab Animal. 44 (4), 377-378 (2010).
- National Institute of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th, National Academies Press (US). US (Washington DC). (2011).
- Antonelli, D., Feldman, A., Freedberg, N. A., Turgeman, Y. Axillary vein puncture without contrast venography for pacemaker and defibrillator leads implantation. Pacing and Clinical Electrophysiology. 36 (9), 1107-1110 (2013).
- Luis, A. L., et al. Microscopic magnetic resonance imaging of the thoracic venous system in rats with congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 27 (2), 175-180 (2011).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
