Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para coletar amostras de sangue de rato veia subclávia.
Abstract
Coleta de sangue com o volume de sangue suficiente é essencial em experiências com animais. Coleta de sangue da veia da cauda de ratos é popular e menos estressante, comparado a outros métodos mais agressivos, tais como retro-orbital plexo coleta da amostra. No entanto, este método de coleta de sangue às vezes é limitado por uma taxa de sucesso insatisfatório. Aqui, apresentamos um método para coleta de sangue através de punção da veia subclávia. A veia subclávia está localizada logo abaixo da clavícula e esta veia é grande o suficiente para cumprir os requisitos de volume de coleta de sangue. Nossos resultados mostram que este método é seguro e aplicável para amostragem de coleta de sangue com o volume de sangue necessário. Coleta de sangue através de punção da veia subclávia poderia servir como um método de coleta de sangue alternativos em caso de colheita de sangue de veia de cauda falhou em ratos.
Introduction
Coleta de sangue é essencial em pesquisas com animais. As veias de destino para coleta de sangue incluem o plexo retrô-orbital, a veia jugular, a veia safena, os vasos sanguíneos de cauda e a artéria carótida1,2,3,4. Às vezes, sangue, poderia ser obtido da aorta abdominal, veia cava ou até mesmo o coração5,6,7. Em tais ocasiões, os animais devem ser sacrificados e não podem ser usados para observação posterior; assim, esses métodos são usados menos no trabalho diário experimental. Coleta de sangue da veia da cauda de ratos é popular e menos estressante em comparação com o acima mencionado métodos8.
No entanto, coleta de sangue da veia da cauda é às vezes limitada por uma taxa de sucesso insatisfatório. Ocasionalmente, também é difícil de obter suficiente volume de sangue por esse método. Como a veia subclávia é grande o suficiente e está localizada logo abaixo do osso da clavícula, punção de veia subclávia pode ser um método alternativo para amostragem de sangue se métodos de coleta de sangue de rotina são mal sucedidos. Aqui, apresentamos um método de coleta de sangue por meio de punção da veia subclávia em ratos.
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Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética de Universidade de South Central para a pesquisa Animal do segundo Xiangya Hospital (Changsha, China). O manuscrito foi preparado de acordo com a chegada (pesquisa Animal: relatórios no Vivo experimentos) orientações9.
1. material e Animal preparação
- Preparar os materiais necessários: fita adesiva, agente de depilação, 75% de etanol, tubo de coleta de sangue, seringa de 2,5 mL, conectado com agulha (24 G, 0,6 x 25 mm), máquina de cabelo, balança eletrônica e calibre (ver Tabela de materiais).
- Use 20 ratos Sprague-Dawley (SD), envelhecidas 8-10 semanas e pesando 153-200 g (ver Tabela de materiais). Manter ratos de acordo com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório,10.
- Ratos de casa sob condições normais, com livre acesso à comida e água potável. Mantê-los em gaiolas de2 cm 530 com camas de madeira de barbear (2 ratos por gaiola). Manter os animais em uma temperatura temperatura controlada em torno de 25 ° C.
- Induzir a anestesia geral (pentobarbital de sódio 40 mg/kg) em todos os animais através de injeção intraperitoneal antes da punção da veia subclávia.
- Coloque o rato em uma posição supina. Membros posteriores em uma posição confortável e sujeite o membro superior paralela ao eixo do corpo ao lado do tronco.
Nota: Não há ventilação mecânica é necessária para este procedimento (Figura 1). - Limpe ambos os lados do espaço infraclavicular para remover a pele (com a máquina de barbear cabelo e agente de depilação, consulte Tabela de materiais) e qualquer sujidade visível. Limpe o pescoço e torácica pele com 75% de etanol. Mantenha a área de punção com gaze seca e limpa.
2. procedimento de coleta de sangue
Nota: Ambos os lados da veia subclávia são adequados para punção, e aqui nós escolhemos o lado direito para punção. A localização e a direção da clavícula direita são identificados pelo polegar esquerdo do operador (Figura 2). O suprasternal fossae é tocadas suavemente com o dedo indicador como o suprasternal fossae é na direção da agulha (Figura 2).
- Enxague com uma seringa estéril 2,5 mL com solução de heparina (10 UI/mL).
- Localize o local de punção caudal à região de 1/3 externo da clavícula direita (Figura 3) 0,5 mm. Movimente suavemente a seringa na pele do local da punção. Uma vez que a agulha entra na pele de infraclavicular, aplique pressão negativa com a direita do operador (Figura 4).
Nota: O volume de sangue média e máxima são 1,0 mL e 1,4 mL, respectivamente. A direção da agulha é posicionada em direção a fossae suprasternal e deve estar quase paralela à clavícula só posterior a ele. Normalmente, a veia subclávia pode ser alcançada, inserindo a agulha aproximadamente 2mm nesta direção. Uma vez que a agulha entra na veia, o sangue vai entrar a seringa sob pressão negativa.- Manter a pressão negativa até volume suficiente de sangue é desenhado (Figura 5).
- Se a coleta de sangue da veia subclávia não for bem-sucedida, retirar a agulha na área subcutânea e ajustar a direção da agulha ligeiramente interior ao esterno.
- Se três tentativas falharem, evitar a veia subclávia do mesmo lado e use o lado contralateral para amostragem de sangue.
- Após a coleta de sangue, retirar a agulha de punção e aplicar pressão ao local de punção para 1-2 minutos parar o sangramento.
Nota: A pressão deve ser muito suave para evitar asfixia.
3. processamento da amostra sangue
- Transferi a amostra de sangue para um anticoagulante-revestido de tubo de vácuo (com EDTA) e centrifugar durante 10 minutos a 1600 x g para coleta de plasma.
- Aspire o sobrenadante para um tubo limpo e loja a-80 ° C (Figura 6).
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Representative Results
Um total de 20 ratos SD (masculino n = 10, feminino n = 10) foram utilizados aqui. Collectionwas de sangue realizadas por operadores qualificados, que tenham realizado a mais de 20 amostras de sangue da veia subclávia em ratos e dos operadores de iniciante, que tenham não punção da veia subclávia experiência em ratos ou outros animais. Antes de operações, iniciantes assistiram pelo menos 3 procedimentos feitos por operadores qualificados.
Amostragem de sangue conseguiu 17 ratos através do acesso de veia subclávia certa. Este procedimento falhou em 3 ratos (1 no grupo qualificado) e 2 no grupo iniciante, e colheita de sangue foi um sucesso através da veia subclávia esquerda acessos nestes 3 ratos. O volume de curso e sangue tempo coletados para cada caso são ilustrados na tabela 1. A taxa de sucesso foi semelhante entre o grupo iniciante (80%) e o grupo qualificado (90%, p = 0.531). A taxa de sucesso foi 100% para ambos os grupos quando incluindo acessos adicionais veia subclávia esquerda nos 3 ratos. Dois de cauda do aluno t-teste mostrou que não havia nenhuma diferença significativa no tempo gasto entre qualificados e grupo iniciante (102.1 s ± 14,9 contra 84,3 ± 9,7 s, p = 0,33, Figura 7). Não há complicações graves ocorreram em todos os procedimentos como pneumotórax, hemopneumotórax ou sangramento importante durante ou depois da operação. Todos os animais sobreviveram e recuperaram dentro de 30 minutos após a colheita de sangue.
Para demonstrar as dificuldades de aprendizagem o procedimento de punção, comparamos ainda mais o número de saques entre qualificados e grupos de iniciante. Conforme mostrado na tabela 2, o número médio de levantamentos no grupo qualificado é um pouco menor que o grupo iniciante (1,6 ± 0,3 vs ±0.4 2.5), mas não há nenhuma significância estatística (p = 0.0913).
Figura 1 : Posição de ratos. Os ratos são colocados em posição supina, e os membros superiores são fixos paralelo ao eixo do corpo, ao lado do tronco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Identificar os símbolos de superfície de ratos. (A), o polegar esquerdo do operador é na clavícula direita para identificar a localização e a matriz deste osso; (B) o suprasternal fossae é tocadas suavemente com o dedo indicador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Local de punção. O local da punção é localizado 0,5 mm caudal para o site de 1/3 externo da clavícula direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Formação de pressão negativa na seringa. Uma vez que a agulha entra na pele de infraclavicular, os dedos da mão direita movem para criar pressão negativa na seringa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Retirada de sangue para a seringa. Quando a agulha entra na veia subclávia, sangue entrará a seringa sob pressão negativa. A pressão negativa é mantida até à obtenção de sangue suficiente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Extração de plasma após centrifugação. Depois da centrifugação, o sangue é separado em plasma e células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : A taxa de sucesso e curso de tempo entre diferentes grupos. Este gráfico mostra que não há diferenças significativas na taxa de tempo despendido (painel esquerdo) ou sucesso (painel direito) entre o grupo qualificado e o grupo iniciante. O tempo de curso no grupo iniciante e o grupo qualificado são 102,1 ± 14,9 s e 84,3 ± 9,7 s, respectivamente, p = 0,33 entre grupos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 : A anatomia da veia subclávia. Veia subclávia situa-se apenas posterior e caudal à clavícula. Ele se une com a veia jugular interna para formar a veia braquiocefálica e drena para super veia cava, logo abaixo do suprasternal fossae. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| grupo qualificado | Grupo iniciante | |||||||||
| Sexo | Peso (g) | Volemia (mL) | Curso de tempo (S) | Sexo | Peso (g) | volemia (mL) | Curso de tempo (S) | |||
| S1 | macho | 153 | 1.6 | 70 | B1 | macho | 149 | 1.6 | 72 | |
| S2 | macho | 168 | 1.6 | 60 | B2 | macho | 158 | 1.6 | 68 | |
| S3 | fêmea | 183 | 1.6 | 75 | B3 | fêmea | 190 | 1.6 | 83 | |
| S4 | fêmea | 170 | 1.6 | 74 | B4 | fêmea | 160 | 1.6 | 77 | |
| S5 | fêmea | 159 | 1.6 | 65 | B5 | fêmea | 153 | 1.6 | 200 | |
| S6 | macho | 200 | 1.6 | 83 | B6 | macho | 187 | 1.6 | 92 | |
| S7 | macho | 178 | 1.6 | 86 | B7 | macho | 56° | 1.6 | 99 | |
| S8 | macho | 187 | 1.6 | 168 | B8 | macho | 200 | 1.6 | 82 | |
| S9 | fêmea | 192 | 1.6 | 83 | B9 | fêmea | 198 | 1.6 | 70 | |
| S10 | fêmea | 157 | 1.6 | 79 | B10 | fêmea | 175 | 1.6 | 178 | |
Tabela 1: Curso de volume e tempo de sangue da punção para uma coleta de sangue terminou. S: grupo qualificado; B: iniciantes.
| Grupo | n | Quer dizer | SE | Intervalo de 95% conf. | |
| B | 10 | 2.5 | 0.4 | 1,59 | 3,41 |
| S | 10 | 1.6 | 0.3 | 0.91 | 2.29 |
Tabela 2: o número de levantamentos entre os dois grupos. B: iniciantes; S: grupo hábil. p = 0.0913
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Discussion
Aqui, apresentamos um método alternativo para a extração de sangue da veia subclávia e mostramos que esse método é viável, seguro e aplicável para amostragem de sangue em ratos. Este método é derivado a punção da veia subclávia em implante de marcapasso chumbo para pacientes11. Veia subclávia situa-se apenas caudal à clavícula e posterior e é uma continuação da veia axilar. Corre da borda externa da primeira costela à borda medial do músculo escaleno anterior12. A partir daqui, ele se une com a veia jugular interna para formar a veia braquiocefálica e drena para super veia cava, logo abaixo do suprasternal fossae (Figura 8). A clavícula é facilmente identificada e existe uma relação clara anatômica entre a veia subclávia e a clavícula. Aqui, nós aplicamos esta habilidade clínica às experiências com animais. Devido à orientação diferente do membro superior em humanos e ratos, o membro superior é colocado ao lado do tronco durante o procedimento para expor o espaço caudal à clavícula, que facilitará a punção (Figura 1).
A veia subclávia é muito maior do que a veia da cauda. Portanto, é mais fácil de obter suficiente sangue da veia subclávia, do que da veia da cauda. O volume da amostra total poderia chegar a 10% do total de volume de sangue a circular cada vez1. Se a amostra de sangue de veia de cauda convencional ou outra rota falhar, pesquisadores podem considerar a punção da veia subclávia. Anestesia geral é necessária para este procedimento, e isto é uma grande limitação deste procedimento. Aqui, usamos o pentobarbital de sódio para anestesia geral. Comparado com outros agentes, pentobarbital de sódio é fácil injetar, e não outros instrumentos especiais são necessários. Tsukamoto et al relataram que inalação de isoflurano tinha o de SpO2 mais estável do que outros agentes e tempos de recuperação curto. Em centros com equipamento de inalação, isoflurano pode ser considerado13. Além disso, como a veia subclávia está localizada perto da cavidade torácica, nós deve ter cuidadosos para evitar complicações graves relacionadas ao procedimento, tais como pneumotórax e hemopneumotórax. A direção da agulha deve ser direcionada cuidadosamente para evitar estas complicações. Aqui, a agulha é sempre posicionada paralelo à clavícula e só posterior a ele e mudou-se suavemente em direção a suprasternal fossae. Os resultados mostram que o uso de acima técnica pode evitar complicações potenciais. Evite qualquer sentido descendente da agulha em direção a cavidade torácica neste procedimento. Além disso, a profundidade da veia subclávia deve sempre estar cerca de 2 mm do local da punção.
Ocasionalmente, as tentativas de um lado podem falhar. Sugerimos não mais de 3 tentativas do mesmo lado. Nessas condições, use o outro lado para punção, que pode melhorar a taxa de sucesso de colheita de sangue. Para ilustrar ainda mais a viabilidade de nosso método, testamos a taxa de sucesso e o tempo dispendido entre um grupo de iniciantes e um grupo qualificado. Curiosamente, foram sem significância estatística entre os grupos (p = 0,33), que provou a viabilidade deste recém desenvolvido método.
Como discutido aqui, a principal limitação é a taxa de sucesso de um lado. Se o procedimento falhar, deve considerar-se do outro lado da veia subclávia. Anestesia geral é usada neste procedimento e o tempo de recuperação em média cerca de 30 min com pentobarbital de sódio. Anestesia por inalação de isoflurano tem um tempo muito mais curto de recuperação e a adopção de novos métodos de anestesia pode ser útil em reduzir a duração do procedimento. Mostramos que este método é aplicável aos ratos, mas nós não testamos sua aplicabilidade para pequenos animais como ratos.
Em conclusão, os resultados do estudo indicam que o método de punção de veia subclávia para coleta de amostra de sangue é segura e viável em ratos. Este método é especialmente valioso quando grandes quantidades de sangue são necessários. Este método é uma alternativa ideal se os procedimentos de amostragem de sangue convencional falharem.
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Disclosures
Este trabalho foi financiado pela subvenção da Fundação de ciência Natural nacional da China n. º 81670269, n. º 81500355 e n. º 81500226.
Acknowledgments
Nenhum declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rats | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| stastical software | SPSS Statistics 17 | ||
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co.,Ltd(Guangzhou, Guangdong Province ,China) | ||
| 2.5 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co.,Ltd(Weihai,Shandong Province ,China) | ||
| hair shaver | Shanghai FLYCO Electric Co., Ltd(Shanghai,China) | ||
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH(EdisonstraBe 6,59157 Kamen, Germany) | ||
| Pentobarbital sodium | Merck | ||
| 75% ethanol | Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | ||
| blood collection tube | Hubei Jinxing Technology&Development Co.,Ltd (Wuhan Hubei Province,China) (2ml) | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co.,Ltd (Dongguan,Guangdng Province,China) | ||
| canvas gloves | for anethesia | ||
| hepain | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co.,Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) (2mL, 12500 IU) | ||
| physical saline | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd(Yueyang ,Hunan Province,China) (100ml) |
References
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