Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att samla in blodprov från råtta subclavia venen.
Abstract
Bloduppsamling med tillräckligt blodvolym är viktigt i djurförsök. Blodinsamling från svans venen av råttor är populära och mindre stressande jämfört med andra mer aggressiva metoder såsom retro-orbital plexus prova samling. Detta blod insamlingsmetod begränsas dock ibland av en otillfredsställande framgång. Här, införa vi en metod för blodinsamling genom subclavia ven punkteringen. Den subclavia ven ligger precis under nyckelbenet och denna anda är tillräckligt stor för att uppfylla volym blodinsamling. Våra resultat visar att denna metod är säker och tillämpliga för blodprovstagning samling med krävs blodvolymen. Blodinsamling genom subclavia ven punkteringen kunde fungera som en alternativ blod insamlingsmetod vid misslyckade svans ven blodprovstagning hos råttor.
Introduction
Blodinsamling är viktigt i djurförsök. Målet venerna för blodinsamling inkluderar den retro-orbital plexus, halsvenen, den ytlig ven, svans blodkärl och halspulsådern1,2,3,4. Ibland kan kunde blod erhållas från bukaorta, vena cava eller ens hjärta5,6,7. Vid sådana tillfällen djuren måste offras och kan inte användas för efterföljande observationsperiodens längd. alltså, dessa metoder används mindre i dagliga experimentellt arbete. Blodinsamling från svans venen av råttor är populära och mindre stressigt jämfört med ovan nämnda metoder8.
Blodinsamling från svans venen begränsas dock ibland av en otillfredsställande framgång. Ibland är det också svårt att få tillräckligt blodvolym genom denna metod. Som den subclavia ven är tillräckligt stor och ligger precis under nyckelbenet benet, kan subclavia ven punktering vara en alternativ metod för blod provtagning om rutinmässig blod insamlingsmetoder misslyckas. Här, införa vi en metod för blodinsamling genom subclavia ven punktering på råttor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av Central South University etikkommitté för djur forskning från andra Xiangya sjukhuset (Changsha, Kina). Manuskriptet var beredd enligt ankomst (djur forskning: rapportering av i Vivo experiment) riktlinjer9.
1. material och djur förberedelse
- Förbereda material behövs: tejp, epilering agent, 75% etanol, bloduppsamlingsrör, 2,5 mL spruta med nål (24 G, 0,6 x 25 mm), hår rakapparat, elektroniska skala och spårvidd (se Tabell för material).
- Använd 20 Sprague-Dawley (SD) råttor, år 8-10 veckor och väger 153-200 g (se Tabell för material). Upprätthålla råttor enligt guiden för skötsel och användning av laboratoriedjur10.
- Hus råttor under standart villkorar med fri tillgång till mat och dricksvatten. Hålla dem i 530 cm2 burar med trä-rakning sängkläder (2 råttor per bur). Upprätthålla djur i en temperatur-kontrollerad rumstemperatur på runt 25 ° C.
- Framkalla narkos (natrium pentobarbital 40 mg/kg) hos alla djur genom intraperitoneal injektion innan subclavia ven punkteringen.
- Placera råtta i ryggläge. Fixa bakbenen i en bekväm ställning och fixa den övre extremiteten parallellt med kroppen axeln precis bredvid stammen.
Obs: Ingen mekanisk ventilation behövs för detta förfarande (figur 1). - Rengör båda sidorna av infraclavicular utrymmet att ta bort päls (med hår rakapparaten och epilering agent, se Tabell av material) och all synlig smuts. Torka av hals och bröstkorg hud med 75% etanol. Håll området för punktering ren och torr med gasbinda.
2. blod insamling förfarande
Obs: Båda sidor av subclavia ven är lämpliga för punktering, och här väljer vi höger sida för punktering. Plats och riktning av högra nyckelbenet identifieras av operatörens vänstra tummen (figur 2). Den suprasternal fossae berörs försiktigt med pekfingret som den suprasternal fossae är i riktning mot nålen (figur 2).
- Skölj en steril 2,5 mL spruta med heparin lösning (10 IU/mL).
- Leta upp webbplatsen punktering 0,5 mm kaudalt till regionen yttre 1/3 av det högra nyckelbenet (figur 3). Flytta sprutan försiktigt in i huden på injektionsstället. När nålen går infraclavicular huden, applicera undertrycket med operatörens högra hand (figur 4).
Obs: Den genomsnittliga och maximala blodvolymen är 1,0 mL 1,4 mL, respektive. Riktningen av nålen placeras mot den suprasternal fossae och bör vara nästan parallell med nyckelbenet bara posteriort det. Vanligtvis kan den subclavia ven nås genom att sätta in nålen cirka 2 mm i denna riktning. När nålen går venen, kommer blod in i sprutan under undertryck.- Upprätthålla undertryck tills tillräckligt mängd blod dras (figur 5).
- Om subclavia ven blodinsamling inte lyckas dra ut injektionsnålen till subkutan området och justera riktningen på nålen lite inredning till bröstbenet.
- Om tre försöken misslyckas undvika den subclavia ven från samma sida och använda den kontralaterala sidan för blodprovstagning.
- Efter blodinsamling, nålen punktering, och tryck till webbplatsen punktering i 1-2 minuter för att stoppa blödning.
Obs: Trycket måste vara mycket skonsam att förhindra kvävning.
3. blod prov bearbetning
- Över blodprovet till en antikoagulans-belagd vakuumrör (med EDTA) och Centrifugera i 10 min vid 1600 x g att samla plasma.
- Aspirera supernatanten till en ren tub och förvaras vid-80 ° C (figur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammanlagt 20 SD råttor (män n = 10, kvinnliga n = 10) användes här. Blod collectionwas utförs av skickliga operatörer, som har utfört mer än 20 blod provtagningar från den subclavia ven hos råttor, och av de nybörjare operatörer, som har ingen subclavia ven punktering erfarenhet hos råttor eller andra djur. Före operationer såg nybörjare minst 3 ingrepp görs av duktiga förare.
Blodprovstagning lyckades 17 råttor genom rätt subclavia ven tillgång. Den här proceduren misslyckades i 3 råttor (1 i gruppen skickliga) och 2 i gruppen nybörjare och blodprovstagning lyckades genom de vänstra subclavia ven öppningar i dessa 3 råttor. Den tid kursen och blod volymen samlas in för varje fall illustreras i tabell 1. Framgång var likartad mellan gruppen nybörjare (80%) och gruppen skickliga (90%, p = 0.531). Framgång var 100% i båda grupperna när inklusive de ytterligare vänstra subclavia ven öppningar i 3 råttor. Två tailed Student's t-test visade att det fanns ingen signifikant skillnad i tid förbrukade mellan nybörjare och skickliga gruppen (102,1 ± 14,9 s kontra 84,3 ± 9,7 s, p = 0,33, figur 7). Inga allvarliga komplikationer inträffade i alla förfaranden såsom pneumotorax hemopneumothorax eller större blödning under eller efter operationen. Alla djur överlevde och återvunnits inom 30 minuter efter blodprovstagning.
För att påvisa svårigheterna att lära sig förfarandet punktering, vi ytterligare jämfört antalet uttag mellan skickliga och nybörjare grupper. I tabell 2visas det genomsnittliga antalet uttag i gruppen skickliga är något mindre än gruppen nybörjare (1,6 ±0.3 vs. 2,5 0,4), men det finns ingen statistisk signifikans (p = 0.0913).
Figur 1 : Ställning av råttor. Råttorna läggs i ryggläge och armar är fasta parallellt med kroppen axeln, precis bredvid stammen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Identifiera surface symbolerna för råttor. (A), den vänstra tummen av operatören är på högra nyckelbenet att identifiera läge och utbud av detta ben; (B) suprasternal fossae berörs försiktigt med pekfingret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Läge för punktering. Injektionsstället är belägen 0,5 mm kaudalt till webbplatsen yttre 1/3 av det högra nyckelbenet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Bildas undertryck i sprutan. När nålen går infraclavicular huden, flytta fingrarna av rätten hand att skapa undertryck i sprutan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Återkalla blod i sprutan. När nålen går den subclavia ven, in blod i sprutan under undertryck. Undertrycket hålls förrän tillräckligt med blod erhålls. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Plasma utvinning efter centrifugering. Efter centrifugering separeras blodet i plasma och celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Den tid kurs och framgång kursen mellan olika grupper. Detta diagram visar inga signifikanta skillnader i andelen tid (till vänster) eller framgång (höger panel) mellan skickliga gruppen och gruppen nybörjare. Tiden kurs i gruppen nybörjare och gruppen skickliga är 102,1 ± 14,9 s 84,3 ± 9,7 s, respektive, p = 0,33 mellan grupperna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 : Anatomi av subclavia ven. Den subclavia ven ligger bara bakre och stjärtfenan till nyckelbenet. Det går med den inre halsvenen att bilda brachiocephalic venen och rinner ut i super vena cava, precis under den suprasternal fossae. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| skicklig grupp | Nybörjare-gruppen | |||||||||
| Kön | Vikt (g) | Blodvolym (mL) | Tidsförlopp (S) | Kön | Vikt (g) | blodvolym (mL) | Tidsförlopp (S) | |||
| S1 | hane | 153 | 1.6 | 70 | B1 | hane | 149 | 1.6 | 72 | |
| S2 | hane | 168 | 1.6 | 60 | B2 | hane | 158 | 1.6 | 68 | |
| S3 | kvinna | 183 | 1.6 | 75 | B3 | kvinna | 190 | 1.6 | 83 | |
| S4 | kvinna | 170 | 1.6 | 74 | B4 | kvinna | 160 | 1.6 | 77 | |
| S5 | kvinna | 159 | 1.6 | 65 | B5 | kvinna | 153 | 1.6 | 200 | |
| S6 | hane | 200 | 1.6 | 83 | B6 | hane | 187 | 1.6 | 92 | |
| S7 | hane | 178 | 1.6 | 86 | B7 | hane | 164 | 1.6 | 99 | |
| S8 | hane | 187 | 1.6 | 168 | B8 | hane | 200 | 1.6 | 82 | |
| S9 | kvinna | 192 | 1.6 | 83 | B9 | kvinna | 198 | 1.6 | 70 | |
| S10 | kvinna | 157 | 1.6 | 79 | B10 | kvinna | 175 | 1.6 | 178 | |
Tabell 1: Blod volym och tid kursen från punktering till en färdig blodinsamling. S: skicklig grupp; B: nybörjare.
| Grupp | n | Menar | SE | 95% conf. intervall | |
| B | 10 | 2.5 | 0,4 | 1,59 | 3.41 |
| S | 10 | 1.6 | 0,3 | 0,91 | 2.29 |
Tabell 2: Antalet uttag mellan de två grupperna. B: nybörjare; S: skicklig grupp. p = 0.0913
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi en alternativ metod för blod från den subclavia ven och vi visar att denna metod är genomförbart, säker och tillämpliga för blodprovstagning hos råttor. Denna metod härstammar från att subclavia ven punktera i pacemaker bly implantation för patienter11. Den subclavia ven ligger bara bakre och stjärtfenan till nyckelbenet och är en fortsättning av axillär venen. Den går från den yttersta gränsen av det första revbenet till den mediala gränsen av främre scalene muskel12. Från här, det går med den inre halsvenen att bilda brachiocephalic venen och rinner ut i super vena cava, precis under suprasternal fossae (figur 8). Nyckelbenet är lätt identifieras och det finns en tydlig anatomiska relation mellan den subclavia ven och nyckelbenet. Här, tillämpat vi denna kliniska färdighet till djurförsök. På grund av olika inriktningen på de övre extremiteterna hos människor och råttor, är de övre extremiteterna placerad precis intill stammen under förfarandet för att exponera utrymmet kaudalt till nyckelbenet, vilket kommer att underlätta punkteringen (figur 1).
Den subclavia ven är mycket större än svans venen. Därför är det lättare att få tillräckligt med blod från den subclavia ven än från svans venen. Den totala provvolymen kunde nå 10% av totala cirkulerande blodvolym varje tid1. Om konventionella svans ven blodprovstagning eller en annan rutt misslyckas, kan forskare anser subclavia ven punkteringen. Generell anestesi krävs för detta förfarande, och detta är en större begränsning av proceduren. Vi använder här, pentobarbital natrium för narkos. Jämfört med andra agenter, pentobarbital natrium är lätt att injicera, och inga andra särskilda instrument behövs. Tsukamoto et al. rapporterade att isofluran inandning hade den mest stabila SpO2 än andra agenter och kort återhämtning gånger. I centra med inandning utrustning, kan isofluran anses13. Dessutom som den subclavia ven ligger nära brösthålan, måste vi vara försiktiga att förhindra svår procedur-relaterade komplikationer såsom pneumotorax och hemopneumothorax. Riktningen av nålen riktas noggrant att undvika dessa komplikationer. Nålen är här, alltid placerad parallellt med nyckelbenet och bara posteriort det och flyttade försiktigt mot den suprasternal fossae. Resultaten visar att användningen av ovan teknik kan undvika komplikationer. Undvika eventuella nedåtgående riktning av nålen mot brösthålan i detta förfarande. Även måste djupet av subclavia ven alltid hållas ca 2 mm från injektionsstället.
Ibland misslyckas försök från ena sidan. Vi föreslår inte mer än 3 försök från samma sida. Under sådana förhållanden, Använd andra sida för punktering, vilket kan förbättra andelen framgångsrika blodprovstagning. För att ytterligare illustrera genomförbarheten av vår metod, testade vi den framgång och tid förbrukade mellan en nybörjare grupp och en skicklig grupp. Intressant nog fanns det ingen statistisk signifikans mellan dessa grupper (p = 0,33), som visade genomförbarheten av detta nyligen utvecklat metoden.
Som diskuteras här, är den största begränsningen framgång på ena sidan. Om förfarandet misslyckas, den andra sidan av subclavia ven måste beaktas. Narkos används i den här proceduren och återhämtningstiden i genomsnitt ca 30 min med pentobarbital natrium. Isofluran inandning anestesi har en mycket kortare återhämtningstid och antagandet av nya anestesi metoder kan vara till hjälp att minska varaktigheten av förfarandet. Vi visar att denna metod är tillämplig på råttor, men vi har inte testat dess tillämplighet på mindre djur som möss.
Sammanfattningsvis visar resultaten från studien att metoden subclavia ven punktering för blod provinsamling säker och möjlig hos råttor. Denna metod är speciellt värdefulla när stora mängder blod behövs. Denna metod är ett optimalt alternativ om konventionella blod provtagningsförfaranden misslyckas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta arbete stöds av bidraget från National Natural Science Foundation av Kina nr 81670269, nr 81500355 och nr 81500226.
Acknowledgments
Ingen förklarade.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rats | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| stastical software | SPSS Statistics 17 | ||
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co.,Ltd(Guangzhou, Guangdong Province ,China) | ||
| 2.5 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co.,Ltd(Weihai,Shandong Province ,China) | ||
| hair shaver | Shanghai FLYCO Electric Co., Ltd(Shanghai,China) | ||
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH(EdisonstraBe 6,59157 Kamen, Germany) | ||
| Pentobarbital sodium | Merck | ||
| 75% ethanol | Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | ||
| blood collection tube | Hubei Jinxing Technology&Development Co.,Ltd (Wuhan Hubei Province,China) (2ml) | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co.,Ltd (Dongguan,Guangdng Province,China) | ||
| canvas gloves | for anethesia | ||
| hepain | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co.,Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) (2mL, 12500 IU) | ||
| physical saline | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd(Yueyang ,Hunan Province,China) (100ml) |
References
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology, Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Feng, J., et al. Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Wickremsinhe, E. R., Renninger, M., Paulman, A., Pritt, M., Schultze, A. E. Impact of Repeated Tail Clip and Saphenous Vein Phlebotomy on Rats Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. 44 (7), 1013-1020 (2016).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments. (90), e51969 (2014).
- Cochran, B. J., et al. Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), 266 (2007).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Lab Animal. 44 (4), 377-378 (2010).
- National Institute of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th, National Academies Press (US). US (Washington DC). (2011).
- Antonelli, D., Feldman, A., Freedberg, N. A., Turgeman, Y. Axillary vein puncture without contrast venography for pacemaker and defibrillator leads implantation. Pacing and Clinical Electrophysiology. 36 (9), 1107-1110 (2013).
- Luis, A. L., et al. Microscopic magnetic resonance imaging of the thoracic venous system in rats with congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 27 (2), 175-180 (2011).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
