Summary
Aquí, presentamos un protocolo para recolectar muestras de sangre de la vena subclavia de rata.
Abstract
Colección de la sangre con suficiente volumen de sangre es esencial en los experimentos con animales. Colección de la sangre de la vena de la cola de las ratas es popular y menos estresante en comparación con otros métodos más agresivos como el plexo retro orbitario muestra colección. Sin embargo, este método de colección de sangre a veces está limitada por una tasa de éxito insatisfactoria. Aquí, presentamos un método para la recolección de la sangre mediante la punción de la vena subclavia. La vena subclavia se encuentra justo debajo de la clavícula y esta vena es lo suficientemente grande como para cumplir con los requisitos de volumen de colección de la sangre. Nuestros resultados demuestran que este método es seguro y aplicable para el muestreo de colección de sangre con el volumen necesario de sangre. Colección de la sangre mediante la punción de la vena subclavia podría servir como un método de colección de sangre alternativa en caso de tomar muestras de sangre de vena cola fallidas en ratas.
Introduction
Colección de la sangre es esencial en la investigación animal. Las venas de blanco para la colección de la sangre incluyen el plexo retro orbital, la vena yugular, la vena safena, vasos de cola y la arteria carótida1,2,3,4. A veces, se podía obtener sangre de la aorta abdominal, vena cava o incluso el corazón5,6,7. En tales ocasiones, los animales deben ser sacrificados y no se puede utilizar para observación posterior; así, estos métodos se utilizan menos en trabajo experimental. Colección de la sangre de la vena de la cola de las ratas es popular y menos estresante en comparación con lo anterior mencionado métodos8.
Sin embargo, muestras de sangre de la vena de la cola a veces está limitada por una tasa de éxito insatisfactoria. En ocasiones, también es difícil obtener suficiente volumen de sangre por este método. Como la vena subclavia es bastante grande y está situada justo debajo del hueso de la clavícula, punción de la vena subclavia puede ser un método alternativo para el muestreo de sangre si son exitosos métodos de recolección de sangre de rutina. Aquí, presentamos un método de colección de sangre mediante punción de la vena subclavia en ratas.
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Protocol
Este estudio fue aprobado por el Comité de ética de la Universidad del Sur Central de investigación Animal del segundo Xiangya Hospital (Changsha, China). El manuscrito fue preparado según llegar (investigación Animal: informes de en Vivo los experimentos) directrices9.
1. material y Animal preparación
- Preparar materiales: cinta adhesiva, agente depilador, etanol del 75%, tubo de la colección de sangre, jeringa de 2,5 mL, conectado con la aguja (24 G, 0,6 x 25 mm), pelo máquina de afeitar, balanza electrónica y calibre (véase Tabla de materiales).
- Utilice 20 ratas Sprague-Dawley (SD), de 8-10 semanas y pesa 153-200 g (véase Tabla de materiales). Mantener las ratas según la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio10.
- Ratas de la casa en condiciones estándar con libre acceso a alimentos y agua potable. Mantenerlos en jaulas de2 530 cm con ropa de cama de madera-afeitado (2 ratas por jaula). Mantener los animales en una temperatura ambiente de temperatura controlada en alrededor de 25 ° C.
- Inducir la anestesia (pentobarbital sódico 40 mg/kg) en todos los animales mediante la inyección intraperitoneal de antes de la punción de la vena subclavia.
- Colocar la rata en una posición supina. Fijar las extremidades traseras en una posición cómoda y fijar la extremidad superior paralela al eje del cuerpo justo al lado del tronco.
Nota: No ventilación mecánica es necesaria para este procedimiento (figura 1). - Limpiar ambos lados del espacio infraclavicular para quitar la piel (con pelo máquina de afeitar y agente depilador, véase Tabla de materiales) y cualquier suciedad visible. Limpie el cuello y la piel torácica con etanol al 75%. Mantenga el área de punción limpio y seco con una gasa.
2. procedimiento de recogida de sangre
Nota: Ambos lados de la vena subclavia son convenientes para la punción, y aquí elegimos el lado derecho para punción. La ubicación y dirección de la clavícula derecha se identifican con el pulgar izquierdo del operador (figura 2). La fosa suprasternal se tocó suavemente con el dedo índice como la fosa suprasternal en la dirección de la aguja (figura 2).
- Enjuague una jeringa estéril 2.5 mL con solución de heparina (10 IU/mL).
- Localizar el sitio de punción 0,5 mm de caudal a la región de 1/3 externa de la clavícula derecha (figura 3). Mueva la jeringa suavemente en la piel del sitio de punción. Una vez que la aguja penetra la piel infraclavicular, aplicar presión negativa con la mano del operador derecho (figura 4).
Nota: El volumen de sangre promedio y máxima son 1,0 y 1,4 mL, respectivamente. La dirección de la aguja se coloca hacia la fosa suprasternal y debe ser casi paralela a la clavícula sólo posterior a él. Por lo general, la vena subclavia puede llegar mediante la inserción de la aguja unos 2 mm en esta dirección. Una vez que la aguja entra en la vena, la sangre entrará la jeringa bajo presión negativa.- Mantener presión negativa hasta que se extrae suficiente volumen de sangre (figura 5).
- Si la colección de sangre de la vena subclavia no tiene éxito, retire la aguja a la zona subcutánea y ajustar la dirección de la aguja un poco interior a esternón.
- Si tres de los intentos fallan, evitar la vena subclavia del mismo lado y el lado contralateral para tomar muestras de sangre.
- Después de la recolección de sangre, retire la aguja de punción y aplique presión en el sitio de punción durante 1-2 minutos detener el sangrado.
Nota: La presión debe ser muy suave para evitar la asfixia.
3. procesamiento de la muestra de sangre
- Transferir la muestra de sangre a un anticoagulante-revestida del tubo de vacío (con EDTA) y centrifugar durante 10 minutos a 1600 g x para recoger el plasma.
- Aspirar el sobrenadante a un tubo limpio y conservar a-80 ° C (figura 6).
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Representative Results
Un total de 20 ratas SD (Varon n = 10, femenino n = 10) fueron utilizados aquí. Collectionwas de sangre realizados por operadores calificados, que han realizado más de 20 muestras de sangre de la vena subclavia en ratas y por los operadores del principiante, que no tienen punción de la vena subclavia experiencia en ratas u otros animales. Antes de operaciones, principiantes visto por lo menos 3 procedimientos realizados por operadores cualificados.
La muestra de sangre logró 17 ratas a través del acceso de la vena subclavia derecha. Este procedimiento fracasó en 3 ratas (1 en el grupo de experto) y 2 en el grupo de principiantes, y muestra de sangre fue exitosa a través de los accesos de la vena subclavia izquierda en estas 3 ratas. El volumen de sangre y curso del tiempo recogidos para cada caso se ilustran en la tabla 1. La tasa de éxito fue similar entre el grupo de principiante (80%) y el grupo de experto (90%, p = 0.531). La tasa de éxito fue 100% para ambos grupos al incluir los accesos de la vena subclavia izquierda adicional en las 3 ratas. Dos colas de Student t-test mostraron que no había ninguna diferencia significativa en tiempo gastado entre Grupo de principiantes y expertos (102.1 ± 14,9 s versus 84.3 ± 9.7 s, p = 0.33, figura 7). Complicaciones severas no ocurrieron en todos los procedimientos tales como neumotórax, Hemoneumotórax o hemorragia grave durante o después de la operación. Todos los animales sobrevivieron y recuperaron dentro de 30 minutos después de la toma de muestras de sangre.
Para demostrar las dificultades de aprender el procedimiento de la punción, además comparamos el número de abandonos entre experto y principiante grupos. Como se muestra en la tabla 2, el número promedio de retiros en el grupo de experto es ligeramente menor que el grupo de principiante (1,6 ±0. 3 vs 2,5 ±0, 4), pero hay no hay significación estadística (p = 0.0913).
Figura 1 : Posición de las ratas. Las ratas se colocan en una posición supina, y los miembros superiores se fijan paralelo al eje del cuerpo, justo al lado del tronco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Identificar los símbolos superficiales de las ratas. (A) el pulgar izquierdo del operador está en la clavícula derecha para identificar la ubicación y la variedad de este hueso; (B) del suprasternal fosas son tocados suavemente con el dedo índice. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Lugar de la punción. El sitio de punción está situado a 0,5 mm de caudal en el sitio de 1/3 externo de la clavícula derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Formación de presión negativa en la jeringa de. Una vez que la aguja penetra la piel infraclavicular, mueven los dedos de la mano derecha para crear presión negativa en la jeringa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Retiro de sangre en la jeringa. Cuando la aguja entra en la vena subclavia, sangre entrará la jeringa bajo presión negativa. La presión negativa se mantiene hasta que se obtenga suficiente sangre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Extracción de plasma después de la centrifugación. Después de centrifugar, la sangre se separa en plasma y glóbulos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 : La tasa de curso y el éxito de tiempo entre los diferentes grupos. Este cuadro no muestra ninguna diferencia significativa en la tasa de tiempo (panel izquierdo) o el éxito (panel derecho) entre el grupo de experto y el grupo de principiantes. El tiempo en curso en el grupo de principiante y el experto 102,1 ± 14.9 y 84.3 ± 9.7, respectivamente, p = 0.33 entre grupos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8 : La anatomía de la vena subclavia. La vena subclavia se encuentra sólo posterior y caudal a la clavícula. Se une a la vena yugular interna para formar la vena braquiocefálica y drena en el super de la vena cava, justo debajo de la fosa suprasternal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Grupo experto | Grupo principiante | |||||||||
| Género | Peso (g) | Volumen sanguíneo (mL) | Curso del tiempo (S) | Género | Peso (g) | volumen sanguíneo (mL) | Curso del tiempo (S) | |||
| S1 | hombre | 153 | 1.6 | 70 | B1 | hombre | 149 | 1.6 | 72 | |
| S2 | hombre | 168 | 1.6 | 60 | B2 | hombre | 158 | 1.6 | 68 | |
| S3 | mujer | 183 | 1.6 | 75 | B3 | mujer | 190 | 1.6 | 83 | |
| S4 | mujer | 170 | 1.6 | 74 | B4 | mujer | 160 | 1.6 | 77 | |
| S5 | mujer | 159 | 1.6 | 65 | B5 | mujer | 153 | 1.6 | 200 | |
| S6 | hombre | 200 | 1.6 | 83 | B6 | hombre | 187 | 1.6 | 92 | |
| S7 | hombre | 178 | 1.6 | 86 | B7 | hombre | 164 | 1.6 | 99 | |
| S8 | hombre | 187 | 1.6 | 168 | B8 | hombre | 200 | 1.6 | 82 | |
| S9 | mujer | 192 | 1.6 | 83 | B9 | mujer | 198 | 1.6 | 70 | |
| S10 | mujer | 157 | 1.6 | 79 | B10 | mujer | 175 | 1.6 | 178 | |
Tabla 1: El curso de volumen y tiempo sangre de punción a una colección de sangre acabado. S: Grupo experto de; B: principiantes.
| Grupo | n | Significa | SE | Intervalo de 95% conf. | |
| B | 10 | 2.5 | 0.4 | 1.59 | 3.41 |
| S | 10 | 1.6 | 0.3 | 0.91 | 2.29 |
Tabla 2: El número de abandonos entre los dos grupos. B: principiantes; S: Grupo experto de. p = 0.0913
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Discussion
Aquí, presentamos un método alternativo para la extracción de sangre de la vena subclavia y mostramos que este método es factible, seguro y aplicable para el muestreo de la sangre en ratas. Este método se deriva de la punción de la vena subclavia en implantación marcapasos para pacientes11. La vena subclavia se encuentra sólo posterior y caudal a la clavícula y es una continuación de la vena axilar. Va desde el borde externo de la primera costilla hasta el borde medial del músculo escaleno anterior12. Desde aquí, se une a la vena yugular interna para formar la vena braquiocefálica y drena en el super de la vena cava, justo por debajo de la fosa suprasternal (figura 8). La clavícula se identifica fácilmente y existe una relación clara anatómica entre la vena subclavia y la clavícula. Aquí, hemos aplicado esta habilidad clínica a la experimentación animal. Debido a la diferente orientación de la extremidad superior en los seres humanos y ratas, la extremidad superior está situada justo al lado del tronco durante el procedimiento para exponer el espacio caudal a la clavícula, que facilitará la punción (figura 1).
La vena subclavia es mucho mayor que la vena de la cola. Por lo tanto, es más fácil conseguir suficiente sangre de la vena subclavia que de la vena de la cola. El volumen total de la muestra podría alcanzar 10% del total de volumen de sangre que circula cada hora1. Si falla la muestra de sangre de vena convencional de la cola u otra ruta, los investigadores pueden considerar la punción de la vena subclavia. Anestesia general es requerida para este procedimiento, y esto es una limitación importante de este procedimiento. Aquí, utilizamos sodio pentobarbital para la anestesia general. En comparación con otros agentes, pentobarbital sódico es fácil de inyectar y no otros instrumentos especiales son necesarios. Tsukamoto et al informaron que la inhalación isoflurano más estable SpO2 que otros agentes y tiempos de recuperación cortos. En centros con equipos de inhalación isoflurano puede considerarse13. Por otra parte, como la vena subclavia se encuentra cerca de la cavidad torácica, debemos tener cuidadosos evitar graves complicaciones procedimiento-relacionadas, como neumotórax o Hemoneumotórax. La dirección de la aguja debe ser dirigida cuidadosamente para evitar estas complicaciones. Aquí, la aguja siempre se coloca paralelo a la clavícula y solo posterior a él y se movió suavemente hacia la fosa suprasternal. Los resultados muestran que el uso de técnica puede evitar posibles complicaciones. Evitar cualquier dirección hacia abajo de la aguja hacia la cavidad torácica en este procedimiento. También, la profundidad de la vena subclavia debe ser siempre unos 2 mm desde el sitio de punción.
En ocasiones, los intentos de un lado pueden fallar. No sugerimos más de 3 intentos desde el mismo lado. En estas condiciones, use el otro lado para la punción, que puede mejorar la tasa de éxito de la muestra de sangre. Para ilustrar aún más la viabilidad de nuestro método, hemos probado la tasa de éxito y tiempo gastado entre un grupo de principiantes y un grupo de experto. Curiosamente, no hubo ninguna significación estadística entre estos grupos (p = 0,33), que demostró la factibilidad de esto recientemente desarrollado método.
Como se explica aquí, la principal limitación es la tasa de éxito en un lado. Si el procedimiento fracasa, se debe considerar el otro lado de la vena subclavia. En este procedimiento se utiliza anestesia general y el tiempo de recuperación promedio de 30 minutos con pentobarbital sódico. Anestesia de inhalación isoflurano tiene un tiempo de recuperación mucho más corto y la adopción de nuevos métodos de anestesia podría ser útil en la reducción de la duración del procedimiento. Nos demuestran que este método es aplicable a las ratas, pero no hemos probado su aplicabilidad a animales más pequeños tales como ratones.
En conclusión, los resultados del estudio indican que el método de punción de la vena subclavia para recogida de muestras de sangre es segura y factible en ratas. Este método es especialmente valioso cuando se necesitan grandes cantidades de sangre. Este método es una alternativa óptima si no de procedimientos de muestreo de sangre convencional.
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Disclosures
Este trabajo fue apoyado por la beca del nacional Fundación Ciencia Natural de China Nº 81670269, Nº 81500355 y Nº 81500226.
Acknowledgments
Ninguno declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rats | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| stastical software | SPSS Statistics 17 | ||
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co.,Ltd(Guangzhou, Guangdong Province ,China) | ||
| 2.5 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co.,Ltd(Weihai,Shandong Province ,China) | ||
| hair shaver | Shanghai FLYCO Electric Co., Ltd(Shanghai,China) | ||
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH(EdisonstraBe 6,59157 Kamen, Germany) | ||
| Pentobarbital sodium | Merck | ||
| 75% ethanol | Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | ||
| blood collection tube | Hubei Jinxing Technology&Development Co.,Ltd (Wuhan Hubei Province,China) (2ml) | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co.,Ltd (Dongguan,Guangdng Province,China) | ||
| canvas gloves | for anethesia | ||
| hepain | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co.,Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) (2mL, 12500 IU) | ||
| physical saline | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd(Yueyang ,Hunan Province,China) (100ml) |
References
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