Summary
在这里,我们提出一个协议,以测量KDM1A靶向在使用KDM1A抑制剂处理的人或动物细胞、组织或血液样本中的参与度。该协议采用自由KDM1A酶的化学探针标记,并使用基于化学探针的免疫测定直接定量目标职业,可用于临床前和临床研究。
Abstract
对靶向参与的评估,即药物与其设计的蛋白质相互作用,是解释药物开发或基础研究项目中任何化合物的生物活性的基本要求。在表观遗传学中,目标参与度通常通过分析代理标记而不是测量化合物与目标的结合来评估。已分析的下游生物读出包括组蛋白标记调制或基因表达变化。KDM1A是一种以源脱甲基酶,从单甲基和二甲基化H3K4中去除甲基组,这是一种与基因表达沉默相关的修饰。代理标记的调制取决于被调查细胞的细胞类型和功能,这使得解释和交叉案例比较相当困难。为了规避这些问题,提出了一个通用的协议,以评估直接KDM1A目标参与的剂量效应和动态。所述测定利用KDM1A化学探针捕获和量化无抑制酶,可广泛应用于细胞或组织样本,无需基因改造,具有极好的检测窗口,可用于基础研究临床样本分析。
Introduction
莱辛特异性脱甲基酶1(KDM1A)1是一种参与控制基因转录的脱甲基酶。这种蛋白质已成为肿瘤学的候选药理靶点2;包括急性骨髓性白血病3(AML),骨髓增生综合征(MDS)4,骨髓纤维化(MF)5,6,小细胞肺癌(SCLC)7;在病变细胞病(SCD)8,9,和在中枢神经系统疾病,包括阿尔茨海默氏病(AD),多发性硬化症(MS);并在侵略10。
临床开发中的大多数KDM1A抑制化合物是环丙胺衍生物,通过共价结合其片苷二核苷酸(FAD)联因子11来抑制蛋白质。KDM1A的抑制诱导基因表达变化,但这些变化在组织、细胞类型或疾病病例之间变化很大。抑制KDM1A也改变组蛋白标记12,但这些变化一般在基因组的特定部位本地产生,并再次是高度组织和细胞特异性。
该协议旨在直接测量KDM1A目标在生物样品中的参与度,并针对环丙胺衍生抑制剂的使用进行了优化。该测定基于ELISA技术,并并行分析从生物样品中提取的天然蛋白质提取物中的KDM1A(非约束抑制剂)。作为第一步,生物样品在存在生物异化KDM1A选择性化学探针OG-88113,14,来自选择性KDM1A抑制剂ORY-1001(iadademstat),一种临床KDM1A的强效抑制剂的存在下进行。肿瘤病的治疗发展。化学探针具有 IC50,用于 KDM1A 的 120 nM,并包括与生物素化聚乙烯乙二醇 (PEG) 尾部相关的 FAD 结合功能。化学探针专门绑定到游免费的KDM1A,但不与样品中的抑制剂结合的KDM1A结合。在化学探针结合后,在具有链球菌素涂层表面的微子板上捕获含有复合物的KDM1A,以确定游脱KDM1A,或在涂有单克隆抗KDM1A捕获抗体的板上捕获,以确定总KDM1A。洗涤后,两个板均用抗KDM1A检测抗体孵育,再次洗涤,并用二级HRP结合的驴抗兔IgG抗体孵育,使用发光基板进行检测,并通过测量相对光照仪 (RLU) 中的光度计 (图 1)。
图 1.ELISA酶与化学探针免疫吸收测定的架构为KDM1A靶点:A)使用三明治ELISA和B确定总KDM1A(使用化学探针ELISA)的游出KDM1A。请点击此处查看此图的较大版本。
两个 ELISA 板中都包含一条标准曲线,用于验证每个测定的线性度。然后,将确定每个样品中的KDM1A目标参与度作为预剂量或车辆处理样品的相对值计算。
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Protocol
根据西班牙立法(第1716/2011年《生物资源研究法》)并经当地道德委员会批准,从圣保生物库研究所获得血液样本。动物组织研究是根据动物实验伦理委员会制定的关于护理和使用实验室动物的机构准则(欧洲共同体理事会第86/609/EEC号指令)进行的。普拉-多氯联苯。
1. 制备用于检测的生物样本。
注意:本协议涉及操纵可能受职业安全与健康管理局 (OSHA) 血液传播病原体标准 (29 CFR 1910.1030)、 欧洲议会指令 2000/54/EC 和2000年9月18日理事会或同等条例。此外,生物样品可能含有生物活性研究性化合物的痕迹,该议定书可能涉及进一步操作此类化合物。查看实验开始前使用的化合物的安全数据表 (SDS),并严格遵守研究中心制定的所有适用安全措施,包括使用适当的个人防护设备 (PPE)。在实验过程中,请穿适当的防护服并使用适当的屏蔽。丢弃适当废物容器中的残留物(生物/细胞毒性废物)。
注:本协议从使用KDM1A抑制剂治疗的受试者的细胞或样本及其未经治疗或车辆/安慰剂处理对照组3开始。
- 在体外用车辆或KDM1A抑制剂处理的细胞
- 对于在悬浮液中生长的细胞,作为10 mL培养,将悬浮液转移到干净的15 mL锥形管中,然后转到1.1.3。
- 对于粘附细胞(生长在75厘米2瓶中),从烧瓶中取出培养基,使用4 mL PBS短暂清洗。在2-5分钟内使用1.5 mL的0.5%胰蛋白酶-EDTA从血管中分离细胞(胰蛋白酶化条件可能有所不同,遵循细胞系的提供者建议),加入4 mL PBS并将细胞转移到干净的15 mL锥形管中。
- 将管子插入台式离心机,在4°C下以400 x g离心收集细胞5分钟。去除上清液,用微移液器将颗粒重新悬浮在1 mL的PBS中,并将悬浮液转移到1.5 mL微离心管中。
- 将样品插入微管离心机,在4°C下以400 x g将其离心5分钟。用微移液器吸入PBS,将颗粒留在冰上,然后进入步骤2;或将颗粒冻结在干冰上,并将其储存在-80°C,直到步骤3。
- 使用车辆/安慰剂或KDM1A抑制剂治疗的受试者或动物的样本
- 组织:使用手术刀将组织切成小,+1厘米3片。将组织碎片冷冻在液体N2中的Dewar容器中,并储存在-80°C,直到步骤3。
- 多态血单核细胞(PBMC):在K 2-EDTA管中稀释10 mL新鲜血液(戒血后最多2小时),在50 mL锥形管中采集2卷PBS。根据制造商的说明,使用商业获得的 PBMC 分离管将 PBMC 从血液中分离出来。将颗粒保存在冰上,然后继续执行步骤 3.2;或将颗粒冻结在干冰上,并将其储存在-80°C,直到步骤3。
注: 20 至 50 μL 的湿细胞颗粒包含 ± 1 x 107细胞,具体取决于细胞大小。从健康人体血液10 mL获得的湿PBMC颗粒的体积为± 20 μL,含有1×107 PBMC。组织或细胞颗粒可在-80oC下储存长达6个月。
2. 解决方案准备
- 准备 2 μM OG-881 工作溶液:从 4 °C 冰箱中拿出 20 mM 生物异化探针 OG-881 库存溶液的 10 μL 一次性等分,并将其留在室温 (RT) 下 10 分钟。在PBS中,使用带有滤芯的微移液器,并在不同的稀释步骤之间改变尖端。
- 制备10x蛋白酶抑制剂:在微离心管中将1片片剂溶解在1mL PBS中。
- 用25 nM OG-881化学探针制备所需的1x细胞莱沙缓冲液。对于每mL,混合100μL商业获得的10x细胞解液缓冲液,150μL的10倍蛋白酶抑制剂,12.5μL的2μM OG-881,和737.5μL的1型双蒸馏水。
- 可选准备所需的1x细胞莱沙缓冲液,但使用25 nM ORY-1001,而不是步骤2.3中的OG-881。可能使用不太有效的抑制剂,但可能需要更高的浓度,用于具有100%抑制的正对照(参见步骤3.5)。
注:采取适当措施,避免OG-881或KDM1A抑制剂库存溶液对溶液或样品造成任何意外污染。要用 25 nM OG-881 计算所需的 1x 细胞莱沙缓冲液的所需体积,假设每 40 mg 粉碎组织需要 400 μL,或 107个细胞的湿颗粒需要 200 μL。
3. 原生蛋白提取
- 从组织:
- 粉碎和均匀化一个 ± 1 cm3块冷冻组织与砂浆和刺在干冰上冷却。将样品与含有40mg组织粉的一次性小瓶中加分,避免随时解冻。继续步骤 3.1.2。用于在-80°C下立即处理或储存。
- 在400μL的1x细胞莱沙缓冲液中重新悬浮40mg的粉末组织,带25 nM OG-881,涡旋10s,并通过18号钝注射器针至少强制样品5次,直到达到组织的流变,并且姜黄浅黄色到橙色悬浮液获得。避免气泡形成。
- 继续步骤 3.3
- 从细胞颗粒(PBMC和细胞系):
- 在含有25 nM OG-881的200μL1x细胞赖沙缓冲液中重新悬浮1×107细胞的颗粒。将样品短暂涡旋,并在冰上保存 5 分钟。
- 在45 kHz下使用3个脉冲,每个脉冲20s,在声波器中声波;把它们放在冰上20秒之间的脉冲。
注:一旦生物样品被重新悬浮在1x细胞赖沙缓冲液中,在其余过程中将其保存在冰上。
- 将样品在冰上再保存5分钟,短暂地涡旋,在4°C的预冷却离心机中,以14000 x g将样品离心10分钟。
- 使用1 mL微管,将上生子转移到新鲜的1.5 mL微离心管中,并在2小时内将其留在冰上。
- 或者,可以按照以下方式准备用于模拟 100% 目标参与度的正控制:
- 用 25 nM ORY-1001 将细胞颗粒或粉末组织从车辆或未经处理(预剂量)样品中悬浮到所需的体积为 1x 细胞赖沙缓冲液,并按照步骤 3.1 到 3.3 所述进行处理。
- 将正对照的上生子转移到新鲜的1.5 mL微离心管中,并将其留在冰上1小时。ORY-1001故意抑制KDM1A并阻断化学探针结合。
- 将5μL的2μM OG-881工作溶液添加到正对照上清液(40mg组织样品产生的正对照体积)或2μM OG-881工作溶液的2.5μL(从10个7细胞样本生成的正控制体积),以获得与其他样品相同的OG-881浓度,并在2小时内留在冰上。
4. 使用布拉德福德测定法对本地蛋白质进行定量
- 用H2O型1双蒸馏水稀释商业来源的布拉德福德蛋白测定试剂5次。计算样品总量和标准所需的试剂体积(每个样品或标准 1 mL = 5 mL 过剩体积)。
- 对于牛血清白蛋白 (BSA) 标准曲线,准备一个微离心管,其中 1 mL 稀释布拉德福德蛋白分析溶液(空白)和 7 个微离心管,其稀释的布拉德福德蛋白分析溶液为 995 μL。将每个 BSA 标准(浓度范围从 125 到 2,000 μg/mL)加入 5 μL,然后通过轻轻反转管数次将其混合。在 RT 孵育 5 分钟。
- 将稀释的标准转移到比色皿中,并在 280 nm 的分光光度计中读取空白和牛血清白蛋白标准样品的 OD。
- 对于生物样品,制备一个微离心管,其中1mL稀释的布拉德福德蛋白分析溶液(空白)和尽可能多的微离心管,其稀释后的布拉德福德蛋白检测试剂为999 μL,作为需要量化的样品。使用自动 P2 微移液器,将步骤 3 中制备的 1 μL 原生蛋白提取物添加到每个微离心管中,并通过轻轻反转管数次进行混合。在 RT 孵育样品 5 分钟。
- 将体积转移到比色皿中,并在 280 nm 的分光光度计中读取样品的 OD。
- 优先,立即转到步骤 5。或者,将原生蛋白提取物储存在-80°C,直到步骤5。避免冻结解冻周期。
5. 用于总和免费 KDM1A 测定的发光 ELISA
注:保持实验室温度稳定在23-24 °C (RT)。
- 用捕获KDM1A抗体或链球菌剂涂覆微小板
- 总KDM1A ELISA:对于每个板,制备10 mL的KDM1A捕获抗体,最终浓度为2微克/mL在PBS中。将 100 μL 转移到板的每个孔中。
- 免费 KDM1A ELISA:对于每个板,在PBS中制备10μg/mL的10 mL链球菌。将 100 μL 转移到板的每个孔中。
- 用粘结膜密封全全和免费 KDM1A ELISA 板,并在冰箱中 4°C 孵育板过夜。
- 清洗和堵塞板
- 将盘子从冰箱中拿出来,在RT上平衡约45分钟,然后再使用。
- 每盘准备1,000 mL洗涤缓冲液(PBS中0.1%补间)和50 mL阻滞缓冲液(PBS中为1%BSA)。
- 用洗涤缓冲液清洗板3次。在此步骤和后续步骤中,在每次洗涤步骤后轻触纸巾上的板,以去除残留溶液。
- 将每孔200 μL的阻滞缓冲液添加到两个板中,用粘膜顶封两个板,并在RT处孵育2小时。
- 生物样品制备
- 使用PBS将步骤3结束时获得的原生蛋白提取物稀释至适当的浓度。推荐的浓度在生物样品中KDM1A表达水平的函数上会有所不同。适当范围的示例包括 (1) 细胞颗粒:每孔 0.5 - 10 μg。(2) PBMC:每井5 - 30微克。(3) 粉碎组织(脑、肺、皮肤):每孔20 -100微克。在准备过程中,将样品保存在冰上。如果可能,运行技术三元样品分析。
- 使用人 rKDM1A 准备标准曲线:
- 为了准备 KDM1A 标准工作解决方案,将适当的 rKDM1A 体积移至 25 pg/μL 的最终浓度,加入 75 μL 的 2 μM OG-881,并在 15 mL 猎鹰管的总体积 6 mL 中完成 1 x PBS。在 1 小时内保持 KDM1A 标准工作溶液在冰上,每 20 分钟反转 15 mL 猎鹰管几次,轻轻混合溶液。
- 根据表1(标准制备)在 1.5 mL 微离心管中制备 KDM1A 标准稀释系列,其体积足以对两个 96 孔微细管板进行三次分析。
| 标准系列 | KDM1A 标准工作解决方案 (μL) | |
| (pg KDM1A/井) | PBS (μL) | |
| 2500 表示 C-| | 800 | - |
| 2500 | 800 | - |
| 1750 | 560 | 240 |
| 1250 | 400 | 400 |
| 750 | 240 | 560 |
| 250 | 80 | 720 |
| 25 | 8 | 792 |
| 0 | 0 | 800 |
| 注意： | ||
| (1) 每次稀释的体积足以在三联2盘的测定中运行。 | ||
| (2) 建议范围在 2.5 到 5,000 皮克 / 井之间 | ||
| * 对于阴性对照 C-,无 KDM1A 检测抗体 | ||
表1:标准准备。为了制备KDM1A蛋白的标准系列,将KDM1A标准工作溶液和PBS的指定体积移至8个正确标记的1.5 mL微离心管中。
表2:深井板设计。步骤 5.4.2 中的标准(蓝色)和样本(黄色)。被移入深井板的反射位置,以便按照蓝色(标准)和黄色(样品)箭头的方向装载到ELISA板中。请点击此处下载此文件。
表3:ELISA板设计。测定板包括重组KDM1A目标(蓝色)量递减的标准曲线;黄色生物样本(S);和相应的阴性对照(包含样品,但不包括初级检测抗体)为白色,从深井板加载到ELISA板上。空白(标准曲线为 0)包含所有捕获和检测试剂,但没有样品。请点击此处下载此文件。
- Elisa
- (续自步骤 5.2.4)孵育2小时后,丢弃阻塞缓冲液,用洗涤缓冲液清洗板。
- 按照表2(深井板设计)所示的板材分布,将适当稀释的样品(原生蛋白提取物和步骤 5.3.的标准曲线)转移到冷藏的 96 深井储存块。
- 按照表3(ELISA 板设计)所示的板分布,将此块保持在冰上,直到在总和游离 ELISA 板中移液 100 μL 样品 / 井。
- 在RT下孵育1小时,丢弃样品,用洗涤缓冲液洗板5次。
- 在0.125μg/mL的阻滞缓冲液中制备20 mL的兔子抗KDM1A检测抗体,在每孔的检测中每孔加入100μL,与负对照C-对应的孔除外。顶部密封板并在 RT 孵育 1 小时。
- 丢弃检测抗体溶液,用洗涤缓冲液清洗板 6 次。
- 制备25 mL的二级山羊抗兔抗体HRP,在阻滞缓冲液中稀释1:5,000,将每孔100μL添加到微细管片中;并在RT孵育1小时。
-
化学发光检测
- 步骤 5.4.7 结束前 30 分钟。在柔和的光线条件下,将Luminol增强剂和过氧化物溶液(10.5 mL:10.5 mL,2个板)的等份混合在琥珀瓶中,并将其留在RT处。
注:将 Luminol 工作溶液保存在琥珀色瓶中,避免长时间暴露在任何强光下。短期接触典型实验室照明不会损害工作解决方案。 - 在测量发光之前至少 20 分钟,在 25°C 下打开微孔板读取器,并将读出设置为 1,000 ms 的集成时间和 150 ms 的沉降时间。参数设置可能需要优化仪器的功能。
- 在步骤5.4.7.中孵育1小时后,丢弃二级抗体溶液,用洗涤缓冲液洗板6次。
- 步骤 5.5.1 中制备的 Luinol 工作溶液(化学发光基底)每井 100 μL 的移液器。移液速度很慢,避免气泡形成。使用定时器控制添加溶液和板的发光测量之间的时间,并保持此时间恒定,以实现良好的中间测定可重复性。
- 在板离心机中将板和离心机密封到 RT的 500 x g,为 45 s,以消除任何残留的气泡。以 100 rpm 在板摇杆上孵育板 1 分钟。
- 将板插入读卡器内,将其保留 3 分钟,以将温度稳定在 25°C(不带粘结膜)。始终从免费 ELISA 板开始。
- 读取每个 ELISA 板测定的相对发光单位 (RLU)(免费和总 KDM1A)。
- 从原始数据 Excel 文件中保存和复制原始 RLU 值,以便进一步分析结果。
- 步骤 5.4.7 结束前 30 分钟。在柔和的光线条件下,将Luminol增强剂和过氧化物溶液(10.5 mL:10.5 mL,2个板)的等份混合在琥珀瓶中,并将其留在RT处。
6. 计算目标参与度
- 在电子表格软件中,从其技术复制原始数据中计算样品 SX和参考样本 REF(未经处理、车辆或剂量前样本)的 RLU 免费和 RLU 总计值,详情如下:
- 在分析数据表中输入来自空白、标准曲线、负控制 C 和生物样本(SX和 REF)的单个原始 RLUi 总计和原始 RLUi 免费数据(例如 Excel)。此外,在数据表中从标准曲线输入 KDM1A 的数量(以 pg 表示)。
- 从每个技术复制数据点的各个原始总计和原始自由 RLUi 数据中计算原始平均 RLU、标准差 =RLU和变异系数 CVRLU。
- 应用异常值消除(三元组示例):对于来自技术三元数据点的每个原始 RLU 总计和原始 RLU 自由数据点 RLUi,在三元组 CV 时应用 Grubbs 标准 > 0.15,并拒绝单个可疑原始 RLU 值当
,
其中 Z = 1.148 n = 3 和 90 % 置信区间 (CI)。 - 如果应用异常值消除,则从每个数据点的非拒绝 (nr) 原始 RLUi 总计和原始 RLUi 自由值重新计算原始均值 RLU、标准偏差 =RLU和 CVRLU。
- 应用背景校正:计算每个标准样品的平均 RLU 自由值和 RLU 总计值,以及每个样本 SX和参考样本 REF,如下:
- 以图形方式表示数据,如下所示:
- 在条形图中绘制相对于其样本标识(X 轴)的 RLU自由值和 RLU总计值(Y 轴)。
- 还要在散点图中绘制标准的 RLU 值 (Y 轴),相对于其用于自由测量和总测量的 rKDM1A 蛋白质(X 轴)的 pg 量,以及相应的直线趋势线,并计算r 2(线性的平方)相关系数)值。
- 计算目标参与度 (TE);即每个样品SX中KDM1A抑制剂所结合的KDM1A相对于参考样品REF(未经处理、车辆或剂量前样品)的百分比如下:
- 计算 SX 和 REF 样本的平均 RLU 免费值与总值的比率 R,如下:
- 然后计算样本 SX的目标参与度 (TE),如下:
可选:(1) 如果进行了N生物复制实验,每个实验都有n个技术复制;首先计算技术复制集的 TESX。随后,计算生物复制集的均值 TE、SD 和 CV 值。
- 计算 SX 和 REF 样本的平均 RLU 免费值与总值的比率 R,如下:
- 修改是否满足测定验收标准:验证 (1) 测定背景是否可接受且平均空白 < 0.05 x 107 RLU;(2) 样品存在自动发光,负控制 C- 的 RLU 低于定量的下限(LLOQ = 平均空白 = 10x SD);(3)rKDM1A标准曲线为线性曲线,r2 = 0.98;(4) 生物样品的RLU值属于测定的动态和线性范围,即LLOQ和2,500 pg/well之间。
注:步骤6.1。到 6.4。在微积分数据表中很容易自动。 - 将 TE 数据导出到开源或商业获取的统计信息软件,用于 TE 值的图形表示和其他统计评估。
,
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Representative Results
总和游免费 KDM1A 测定的线性度。
标准系列是编写步骤5.3.2.的,使用0至2500皮克的全长人体重组KDM1A酶。评估了总和自由 rKDM1A 的 RLU 值以验证线性度(图 2A和2B)。数据表示为 3 个实验的平均值,3 个技术复制 (n) = SD。在3个独立志愿者的血液中检测出人类PBMC中总和游离KDM1A的RLU值被叠加在图2C和2D的标准曲线上。根据西班牙立法(第1716/2011年《生物资源研究法》)并经当地道德委员会批准,从圣保生物库研究所获得血液样本。
图 2.健康志愿者在PBMC中总和免费rKDM1A的测定。ELISA (A) 评估的总 rKDM1A 和化学探针捕获 ELISA (B) 评估的自由 rKDM1A 的 RLU 值。数据来自3个复制实验,每个实验以三元(N = 3;n = 3)进行分析。ELISA (C) 评估的总 KDM1A 和 3 个独立未经处理的志愿者(红色、蓝色和绿色方块)的 PBMC 的免费 KDM1A (D) 的 RLU 值高于标准曲线上。数据来自一个在三元中分析的实验(N = 1;n = 3)。表示的值是均值 = SD。请点击此处查看此图的较大版本。
细胞中KDM1A目标参与的分析
根据提供者的建议培养 AML 细胞。细胞用车辆或ORY-1001以不同的浓度(0.25;0.5;1;5和25 nM)进行处理(图3)。本地蛋白提取物在25 nM OG-881化学探针的存在下获得。0.5 μg 的总蛋白质用于执行上述目标参与分析。确定了总和免费的KDM1A,并计算了ORY-1001与KDM1A的目标参与百分比。
图 3.人类AML细胞系中KDM1A目标参与的剂量反应。以不同浓度(0.25;0.5;1;1;5和25 nM)对细胞进行车辆或ORY-1001处理,并用于确定所述目标啮合。数据来自3个复制实验,每个实验以三元(N = 3,n = 3)进行分析。表示的值是均值 = SD。请点击此处查看此图的较大版本。
体内KDM1A目标参与度分析
本实验的目的是描述ORY-1001在不同大鼠组织中在剂量水平功能中的目标参与。为了实现这一目标,15只斯普拉格-道利大鼠(200-250克)被安置在细胞静态安全室,以避免被测试化合物的潜在污染。随机分配5个研究组最多3只大鼠/笼子。5个不同的研究组分别收到车辆;1;3;10或30 μg / kg的ORY-1001通过口服给给连续4天。每天准备复合库存溶液。每次给动物称重之前,都要调整所需的体积。所有动物都位于恒定的室温(20 -24 oC)和相对湿度(45 - 65%)下在 12 小时明暗循环下(早上 6:00 亮起)。食物和水是可用的。 根据步骤1.2.2所述的程序,在K2 EDTA管和PBMC中分离出血液样本2小时后采集。并保存在-80°C,直到原生蛋白质提取。肺样在上次服药后2小时采集,立即冷冻在液氮中,并储存在-80°C。研究是根据PRAAL-PCB动物实验伦理委员会制定的关于照料和使用实验室动物的机构准则(欧洲共同体理事会第86/609/EEC号指令)进行的。
粉碎后,从肺中提取的本地蛋白质提取物得到描述和定量。每剂量组使用来自汇集的PBMC的总蛋白或来自3只动物的肺中7.5μg的总蛋白,以运行KDM1A靶点参与测定。
图4A和4B显示了KDM1A目标在PBMC中的剂量反应和口服口腔对ORY-1001大鼠的肺治疗,该剂量反应与车辆组相关。如图4C所示,从车辆处理的动物中含有25个nM ORY-1001肺蛋白提取物的活体孵育结果为全TE,但4天处理大鼠的样本中TE没有进一步增加,实验用30微克/千克ORY-1001,确认KDM1A在体内已经完全抑制。
图 4.体内和前体原生 KDM1A 目标参与。连续4天(p.o)治疗用ORY-1001的大鼠对PBMC(A)和肺样本(B)的KDM1A靶点反应。数据来自每组3只动物的汇集PBMC提取物,以重复(N = 1,n = 2)或从每组3只个体动物的肺部进行分析,以三联(N = 3,n = 3)进行分析。C. 用车处理大鼠(左)或30微克/千克ORY-1001的池肺蛋白提取物中的TE比较;1 h 前体孵育提取物后,无(灰条)或 25 nM ORY-1001 (蓝色条)(N = 3,n = 3)。所有数据均表示为均值 = SD。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
此处介绍的协议是使用基于新型 KDM1A 化学探针捕获的 ELISA 直接测量 KDM1A 目标参与度的。该方法已对培养的人类细胞系和来自人类、大鼠和小鼠和巨蜥(包括PBMC、肺、大脑、皮肤、肿瘤)的体外样本进行了验证,但可随时应用于KDM1A抗体靶向表位和催化的其他物种中心是保存的。由于OG-881是一种基于活性的化学探针,样品质量很重要,因此,特别是在协议的初始步骤中,应进行适当的操作和保护,以确保KDM1A活性得到保护。
通过共价FAD靶向抑制剂对目前的实验方案进行了优化,以分析KDM1A目标参与度。它还可用于可逆抑制剂,阻止对KDM1AFAD联因的接入。具有长时间停留的强效可逆抑制剂可采用未修改的协议。
OG-881化学探针可能不适合低效力可逆抑制剂的高离率。本手稿中使用的特定化学探针不是细胞渗透剂,因此对被分的样品进行活体分析。
该方法可在研究和分析实验室中广泛使用的仪器上运行;它不需要将基因修饰引入细胞,并且可以很容易地应用于不同的样本类型。另一个优点是,它可用于来自不同物种的样本,这些样本经常用于临床前概念证明研究和毒理学模型,并且已成功翻译用于分析临床样本。
其他方法还用于分析KDM1A目标参与度。许多这些方法使用代理标记,如 H3K4me2 组蛋白标记的变化,使用 AlphaLisa15;或使用qRT-PCR或FACS分析诱导表达标记16。然而,在细胞或组织中,组蛋白标记受多种因素控制,测量组蛋白标记变化的测定并不总是为分析提供良好的动态范围。KDM1A抑制可以诱导基因和蛋白质表达的强效变化,但反应往往非常异质和高度细胞上下文依赖,这会使剂量反应3,7的分析复杂化。
因此,直接评估对目标的占领是衡量目标参与情况的最佳选择。为此提出的一个测定是细胞热移测定(CETSA),基于抑制剂结合后目标蛋白的热稳定性增加。该方法原则上可应用于未改性细胞和不同组织类型,最近用于评估培养细胞中KDM1A抑制剂的细胞活性17。然而,这项技术很少用于体内药效动力学研究18,据我们所知,它的使用还没有报告在临床试验中。
此处提供的协议描述了一种完全验证的基于化学探针的方法,该方法已用于确定细胞和组织样本中的 KDM1A 目标参与度。该方法已成功翻译为分析使用KDM1A抑制剂19治疗的人体受试者样本,在临床试验中对PK/PD反应进行建模将大有用。
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Disclosures
作者塔玛拉·梅斯是执行董事和股东,作者克里斯蒂娜·马斯卡雷和拉奎尔·鲁伊斯·罗德里格斯是奥里松基因组学公司的员工,奥里松基因组学S.A.开发KDM1A抑制剂,并拥有涉及化合物和所用方法的专利在本文中。
Acknowledgments
这项研究由奥里松基因组学资助。S.A.,霍夫曼-拉罗氏,部分支持CIIP-20152001和RETOS合作项目RTC-2015-3332-1。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X Protease Inhibitor Tablets | Roche | #11836153001 | |
| 96 deep well storage block | VWR | #734-1679 | |
| 96 well ELISA plates | Nunc | #436110 | |
| Adhesive black Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Adhesive transparent Film | VWR | #60941-062 | |
| Biotinylated KDM1A probe OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | # 3117057001 | |
| Bovine Serum Albumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| Cell lysis buffer 10X | Cell Signaling | #9803 | |
| Centrifuge for 96- well plates | Hettich | Rotina 420R | |
| Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
| Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Microplate reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
| Needle G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| PBMC separation tubes 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| PBMC separation tubes 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Plate shaker | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
| Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
| Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| Spectrophotometer cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Spectrophotometer for cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| Syringe | BD | #303172 | |
| Type 1 ultrapure water | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | USC200T |
References
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