Summary
Qui, presentiamo un protocollo per misurare kDM1A target engagement in una cellula umana o animale, tessuto o campioni di sangue trattati con inibitori KDM1A. Il protocollo utilizza l'etichettatura chemioprobe dell'enzima KDM1A gratuito e la quantificazione diretta dell'occupazione target utilizzando immunoasisti basati sulla chemiospa e può essere utilizzato in studi preclinici e clinici.
Abstract
La valutazione dell'impegno target, definita come l'interazione di un farmaco con la proteina per cui è stato progettato, è un requisito fondamentale per l'interpretazione dell'attività biologica di qualsiasi composto nello sviluppo di farmaci o nei progetti di ricerca di base. Nell'epigenetica, l'impegno target è più spesso valutato mediante l'analisi dei marcatori proxy invece di misurare l'unione del composto al bersaglio. Le letture biologiche a valle che sono state analizzate includono la modulazione del marchio dell'istorio o i cambiamenti dell'espressione genica. KDM1A è una lisila demetila si riparte da H3K4 mono e dimetilata, una modifica associata al silenziamento dell'espressione genica. La modulazione dei marcatori proxy dipende dal tipo di cellula e dalla funzione della composizione genetica delle cellule studiate, il che può rendere piuttosto difficile l'interpretazione e il confronto tra maiuscole e minuscole. Per aggirare questi problemi, viene presentato un protocollo versatile per valutare gli effetti della dose e la dinamica del coinvolgimento diretto del target KDM1A. L'analisi descritta fa uso di una chemoprobe KDM1A per catturare e quantificare l'enzima disinibito, può essere ampiamente applicato a cellule o campioni di tessuto senza necessità di modificazione genetica, ha un'eccellente finestra di rilevamento e può essere utilizzato sia per la ricerca di base e l'analisi di campioni clinici.
Introduction
La lisina demetilasi specifica 1 (KDM1A)1 è un demetilare coinvolto nel controllo della trascrizione genica. Questa proteina è emersa come bersaglio farmacologico candidato2 in oncologia; tra cui acuta mieloide Leucemia3 (AML), Sindrome da Mielodisplasia (MDS)4, Mielofibrosi (MF)5,6, Cancro polmonare a piccole cellule (SCLC)7; nella malattia delle cellule falciformi (SCD)8,9, e nelle malattie del sistema nervoso centrale tra cui il morbo di Alzheimer (AD), la sclerosi multipla (MS); e nell'aggressione10.
La maggior parte dei composti inibitori di KDM1A nello sviluppo clinico sono derivati della ciclopropilaree e inibiscono la proteina legandosi covalente al suo cofattore dinucleotide di flavin adenina (FAD)11. L'inibizione di KDM1A induce cambiamenti nell'espressione genica, ma questi cambiamenti variano enormemente tra i tessuti, i tipi di cellule o i casi di malattia. L'inibizione di KDM1A cambia anche i segni itoni12, ma questi cambiamenti sono generalmente prodotti localmente in un sito specifico del genoma, e sono ancora una volta, altamente tessuto e cellule specifiche.
Il protocollo è stato sviluppato per misurare direttamente l'impegno del target KDM1A in campioni biologici ed è stato ottimizzato per l'uso con inibitori derivati dalla ciclopropile. Il saggio si basa sulla tecnologia ELISA e analizza, in parallelo, Total e Free (cioè non legato dall'inibitore) KDM1A in un estratto di proteina autoctona da un campione biologico in un saggio in fase solida. Come primo passo, il campione biologico viene lizzato in presenza della chemoprobe selettiva KDM1A biomutlata OG-88113,14, derivata dall'inibitore selettivo di KDM1A ORY-1001 (iadademstat), un potente inibitore di KDM1A in sviluppo per il trattamento della malattia oncologica. La chemiosche ha un IC50 per KDM1A di 120 nM e comprende una moiety legante FAD collegata a una coda di glicole di polietilene biotinyato (PEG). La chemiosa si lega esclusivamente al KDM1A gratuito, ma non al KDM1A inibitore nel campione. Dopo la rilegatura della chemiosa, il KDM1A contenente complessi nel campione vengono catturati su piastre di microtitro con superficie rivestita di streptavidin per determinare kDM1A libero, o su piastre rivestite con un anticorpo di cattura anti-KDM1A monoclonale per determinare il totale KDM1A. Dopo il lavaggio, entrambe le piastre vengono incubate con un anticorpo anti-rilevamento anti-KDM1A, lavate di nuovo e incubate con un anticorpo igG con asino concatenato HRP secondario per la rilevazione utilizzando un substrato luminescente e la quantificazione misurando unità di luce (RLU) in un luminometro (Figura 1).
come illustrato nella Figura 1. Schema di ELISA Enzima collegato chemioprobeata saggio immunoassorante per KDM1A target engagement: A) Determinazione del totale KDM1A utilizzando sandwich ELISA e B) Determinazione di KDM1A gratuito utilizzando chemioprobe ELISA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
In entrambe le piastre ELISA è inclusa una curva standard per verificare la linearità di ogni analisi. La determinazione dell'impegno target KDM1A in ogni campione viene quindi calcolata come valore relativo al campione pre-dose o al veicolo trattato.
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Protocol
I campioni di sangue sono stati ottenuti dall'Instituto de Investigaciàn Biomédica Sant Pau Biobank secondo la legislazione spagnola (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) e l'approvazione dei comitati etici locali. Gli studi con tessuti animali sono stati effettuati in conformità con gli orientamenti istituzionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (direttiva del Consiglio delle Comunità europee 86/609/CEE) istituito dal Comitato etico per la sperimentazione animale PRAAL-PCB.
1. Preparazione di campioni biologici per il saggio.
AVVISO: Questo protocollo comporta la manipolazione di campioni biologici che possono essere soggetti allo standard OSHA (Occupational Safety and Health Administration)OSHA) Blood Borne Pathogens (29 CFR 1910.1030), alla direttiva 2000/54/EC del Parlamento europeo e del del 18 settembre 2000 o regolamenti equivalenti. Inoltre, i campioni biologici possono contenere tracce di composti chimici sperimentalmente attivi e il protocollo può comportare un'ulteriore manipolazione di tali composti. Rivedere la scheda dati di sicurezza (SDS) dei composti utilizzati prima dell'avvio dell'esperimento e osservare rigorosamente tutte le misure di sicurezza applicabili stabilite nel centro di ricerca, compreso l'uso di adeguate attrezzature di protezione personale (PPE). Indossare indumenti protettivi adeguati e utilizzare una schermatura adeguata durante il corso dell'esperimento. Eliminare i residui nei contenitori di rifiuti appropriati (rifiuti biologici/citotossici).
NOTA: Questo protocollo inizia con cellule o campioni di soggetti trattati con un inibitore KDM1A e i controlli trattati non trattati o veicoli/placebo3.
- Cellule trattate con veicolo o inibitore KDM1A in vitro
- Per le cellule coltivate in sospensione, come colture da 10 mL, trasferire le sospensioni in tubi conici puliti da 15 mL e procedere a 1.1.3.
- Per le cellule aderenti (coltivate in fiasche da 75 cm2), rimuovere il mezzo dal flacone e lavare brevemente utilizzando 4 mL PBS. Staccare le cellule dai loro vasi utilizzando 1,5 mL di 0,5% Trypsin-EDTA durante 2 - 5 min (le condizioni di prova possono variare, seguire le raccomandazioni del fornitore per la linea cellulare), aggiungere 4 mL PBS e trasferire le cellule in tubi conici puliti da 15 mL.
- Inserire i tubi in una centrifuga top panca e raccogliere le cellule con centrifugazione per 5 min a 400 x g a 4 gradi centigradi. Rimuovere il supernatante, rimettere in sospensione il pellet in 1 mL di PBS erogato utilizzando una micropipetta e trasferire la sospensione in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL.
- Inserire i campioni in una centrifuga microtubi e centrifugarli per 5 min a 400 x g a 4 gradi centigradi. Rimuovere il PBS per aspirazione con una micropipetta e tenere i pellet sul ghiaccio e procedere al passo 2; o congelare i pellet sul ghiaccio secco e conservarli a -80 gradi centigradi fino al punto 3.
- Campioni di soggetti o animali trattati con veicolo/placebo o inibitore KDM1A
- Tessuti: Tagliare il tessuto in piccoli pezzi di 1 cme 3 utilizzando un bisturi. Congelare i pezzi di tessuti nel liquido N2 in un contenitore Dewar e conservarli a -80 gradi fino al passaggio 3.
- Cellule mononucleari del sangue polimorfico (PBMC): diluire 10 mL di sangue fresco (processo massimo 2 h dopo il ritiro del sangue) raccolti in tubi K2-EDTA con 2 volumi di PBS in un tubo conico da 50 mL. Isolare i PBCM dal sangue utilizzando tubi di separazione PBMC ottenuti commercialmente secondo le istruzioni del produttore. Tenere i pellet sul ghiaccio e procedere al passo 3.2; o congelare i pellet sul ghiaccio secco e conservarli a -80 gradi centigradi fino al punto 3.
NOTA: Un pellet di cellule bagnate da 20 a 50 celle contiene 1 x 107 celle, a seconda delle dimensioni della cella. Un pellet PBMC bagnato ottenuto da 10 mL di sangue umano sano ha un volume di 20 , E contiene 1 x 107 PBMC. I tessuti o i pellet cellulari possono essere immagazzinati a -80 oC per un massimo di 6 mesi.
2. Preparazione della soluzione
- Preparare 2 soluzione di lavoro OG-881: Prendere una soluzione di 10 -l monouso della sonda biotinylat a 20 mM OG-881 con il frigorifero 4 C e lasciarla a temperatura ambiente (RT) per 10 min. ione in PBS, utilizzando una micropipetta con punte di filtro e cambiando la punta tra le diverse fasi di diluizione.
- Preparare 10x Inibitore della proteasi: sciogliere 1 compressa in 1 mL di PBS in un tubo di microcentrifuga.
- Preparare il volume desiderato di 1x cell lisis buffer con 25 nM OG-881 chemioprobe. Per ogni mL, mescolare 100 l ottenuto commercialmente 10x tampone di lisi cellulare, 150 l una di 10volte Inibitore Protease, 12,5 L di 2 OG-881 e 737,5 L di Tipo 1 doppia acqua distillata.
- Facoltativamente, preparare il volume desiderato di 1x cell lysis buffer ma con 25 nM ORY-1001 invece di OG-881 come nel passaggio 2.3. Gli inibitori meno potenti possono essere utilizzati, ma possono richiedere concentrazioni più elevate, per l'uso nel controllo positivo con inibizione al 100% (vedere Passo 3.5).
NOTA: adottare le misure appropriate per evitare qualsiasi contaminazione involontaria di soluzioni o campioni con le soluzioni di stock oG-881 o KDM1A. Per calcolare il volume desiderato di 1x buffer di lisi cellulare con 25 nM OG-881, si supponga che siano necessari 400 ll per 40 mg di tessuto polverizzato, o 200 L per pellet bagnato di 107 celle.
3. Estrazione di proteine native
- Dai tessuti:
- Polverizzare e omogeneizzare a 1 cm3 cube di tessuto congelato con un mortaio e pestello raffreddato su ghiaccio secco. I campioni in flac che ne monouso contengono 40 mg di polvere tissutale, evitare lo scongelamento in ogni momento. Procedere al passaggio 3.1.2. per l'elaborazione immediata o conservare a -80 gradi centigradi.
- Risospendere 40 mg di tessuto in polvere in 400 -L di 1x tampone di lis cell con 25 nM OG-881, vortice per 10 s, e forzare il campione almeno cinque volte attraverso un ago di siringa smussata 18-gauge fino a quando non si ottiene una sospensione torbida da giallo chiaro ad arancione è Ottenuto. Evitare la formazione di bolle.
- Proseguire con il passaggio 3.3
- Da pellet cellulari (PBMC e linee cellulari):
- Risospendere un pellet di 1 x 107 celle in 200 , L di 1x buffer di lisi cellulare contenente 25 nM OG-881. Vorticare brevemente i campioni e tenerli sul ghiaccio per 5 min.
- Sonicare i campioni in un sonicatore usando 3 impulsi di 20 s ciascuno a 45 kHz; metterli sul ghiaccio per 20 s tra un impulso e l'altro.
NOTA: Non appena i campioni biologici sono stati risospesi nel tampone di lisi 1x cellule, tenerli sul ghiaccio durante il resto del processo.
- Conservare i campioni sul ghiaccio per altri 5 min, vortice brevemente e centrifugare i campioni per 10 min a 14 000 x g in una centrifuga pre-raffreddata a 4 gradi centigradi.
- Utilizzando una micropipetta da 1 mL, trasferire i supernatanti in tubi freschi di microcentrifuga da 1,5 ml e lasciarli sul ghiaccio durante le 2 h. Continuare fino al passaggio 4.
- Facoltativamente, un controllo positivo per simulare l'engagement target del 100% può essere preparato come segue:Optionally, a positive control to simulate 100% target engagement may be prepared as follows:
- Risospendere il pellet cellulare o il tessuto in polvere da un veicolo o il campione non trattato (predose) nel volume richiesto di 1x buffer di lisi cellulare con 25 nM ORY-1001 ed elaborare come descritto nei passaggi da 3.1 a 3.3.
- Trasferire i supernatanti del controllo positivo in nuovi tubi di microcentrifuga da 1,5 ml e lasciarli sul ghiaccio per 1 h. ORY-1001 inibire volontariamente KDM1A e bloccare il legame chemiossina.
- Aggiungere 5 -L di 2 soluzione di lavoro OG-881 al supernatante di controllo positivo (volume per controllo positivo generato da un campione di tessuto da 40 mg) o 2,5 l di 2 soluzione di lavoro OG-881 (volume per controllo positivo generato da un campione di 107cellule) per ottenere la stessa concentrazione di OG-881 degli altri campioni e lasciare sul ghiaccio durante 2 h. Continuare con il passaggio 4.
4. Quantificazione della proteina autoctona usando il saggio Bradford
- Diluire il reagente Bradford Protein Assay di provenienza commerciale 5 volte con H2O Tipo 1 doppia acqua distillata. Calcolare il volume del reagente necessario per la quantità totale di campioni e standard (1 mL per campione o volume in eccesso standard di 5 mL).
- Per la curva standard dell'albumo del siero del siero bovino (BSA), preparare un tubo di microcentrifuga con soluzione Bradford Protein Assay diluita da 1 mL (a vuoto) e sette tubi microcentri fugacon cui 995 gradi della diluita soluzione Bradford Protein Assay. Aggiungete 5 l di ciascuno degli standard BSA (concentrazione che vanno da 125 a 2.000 g/mL) a ciascuno dei 7 tubi di microcentrismoezione e mescolateli invertendo delicatamente i tubi più volte. Incubare per 5 min a RT.
- Trasferire gli Standard diluiti in cuvette e leggere l'OD dei campioni vuoti e Bovine Serum Albumin Standard in uno spettrofotometro a 280 nm.
- Per i campioni biologici, preparare un tubo di microcentrifuga con soluzione Bradford Protein Assay diluita da 1 mL (vuoto) e il maggior numero di tubi di microcentrifuga con 999 . Utilizzando una micropipetta P2 automatica, aggiungere 1-L di estratto di proteina autoctona preparato nel Passo 3 ad ogni tubo di microcentrifuga e mescolare invertendo delicatamente i tubi più volte. Incubare i campioni 5 min a RT.
- Trasferire i volumi in cuvette e leggere l'OD dei campioni in uno spettrofotometro a 280 nm.
- Preferibilmente, procedere immediatamente al passo 5. In alternativa, conservare gli estratti di proteine autoctone a -80 gradi fino al punto 5. Evitare di congelare i cicli di disgelo.
5. Luminescente ELISA per la determinazione totale e gratuita KDM1A
NOTA: Mantenere la temperatura di laboratorio costante a 23-24 gradi centigradi (RT).
- Rivestimento di piastre microtiteri con cattura anticorpo KDM1A o Streptavidin
- Totale KDM1A ELISA: per ogni piastra, preparare 10 mL di KDM1A catturaanti anticorpo ad una concentrazione finale di 2 g/mL in PBS. Trasferire 100 l in ogni pozzetto della piastra.
- KDM1A ELISA gratuito: per ogni piatto, preparare 10 mL di streptavidina a 10 g/mL in PBS. Trasferire 100 l in ogni pozzetto della piastra.
- Sigillare le lastre Total e Free KDM1A ELISA con pellicola adesiva e incubare i piatti durante la notte a 4 gradi centigradi in frigorifero.
- Lavaggio e blocco delle piastre
- Togliere i piatti dal frigorifero e lasciarli ed essere equilibrati per circa 45 min al RT prima dell'uso.
- Preparare 1.000 mL di buffer di lavaggio (0,1% Tween in PBS) e buffer di blocco da 50 mL (1% di BSA in PBS) per piastra.
- Lavare le piastre 3 volte con il tampone di lavaggio. In questo e nei passaggi successivi, toccare la piastra su carta assorbente dopo ogni fase di lavaggio per rimuovere la soluzione residua.
- Aggiungere 200 l di buffer di blocco per bene a entrambe le piastre, sigillare entrambe le piastre con una pellicola adesiva e incubare 2 h a RT.
- Preparazione biologica dei campioni
- Diluire gli estratti di proteine nativi ottenuti alla fine del passaggio 3 alla concentrazione appropriata utilizzando PBS. La concentrazione raccomandata varierà in funzione del livello di espressione KDM1A nel campione biologico. Esempi di intervalli appropriati sono (1) Pellet cellulari: 0,5 - 10 g per pozzo. (2) PMC: 5 - 30 g per pozzo. (3) Tessuto polverizzato (cervello, polmone, pelle): da 20 a 100 g per pozzo. Conservare i campioni sul ghiaccio durante la preparazione. Quando possibile, eseguire analisi tecniche del campione di triplicare.
- Preparare una curva standard utilizzando rKDM1A umano:
- Per preparare la soluzione di lavoro KDM1A Standard, convogliare il volume appropriato di rKDM1A per una concentrazione finale di 25 pg/L, aggiungere 75 -L di 2 OG-881 e completare con 1 x PBS per un volume totale di 6 mL in un tubo di falco da 15 mL. Mantenere la soluzione di lavoro KDM1A Standard sul ghiaccio durante 1 h e mescolare delicatamente la soluzione invertendo il tubo falco 15 mL più volte ogni 20 min.
- Preparare la serie kDM1A Standard Dilution in tubi di microcentriera da 1,5 ml secondo la Tabella 1 (Preparazione Standard), in volume sufficiente per l'analisi triplice di due piastre da 96 pozzetti di microtitolo.
| SERIE STANDARD | KDM1A Soluzione di lavoro standard (L) | |
| (pg KDM1A/pozzo) | PBS (L) | |
| 2500 per C- | 800 | - |
| 2500 | 800 | - |
| 1750 | 560 | 240 del sistema |
| 1250 | 400 | 400 |
| 750 anni | 240 del sistema | 560 |
| 250 anni | 80 | 720 anni |
| 25 mi lato | 8 (IN vio | 792 199 |
| 0 (in vie | 0 (in vie | 800 |
| nota: | ||
| (1) Il volume preparato di ogni diluizione è sufficiente per funzionare in triplice 2 piastre di analisi. | ||
| (2) L'intervallo consigliato è compreso tra 2,5 e 5.000 pg / well | ||
| Per il controllo negativo C-, senza anticorpo di rilevamento KDM1A | ||
Tabella 1: Preparazione standard. Per preparare la serie Standard di proteina KDM1A, pipette i volumi indicati di KDM1A Standard soluzione di lavoro e PBS in otto tubi di microcentrismo da 1,5 ml correttamente etichettati.
Tabella 2: Progettazione di piastre per pozzi profondi. Standard (blu) e campioni (giallo) dal punto 5.4.2. sono stati reindirizzati nelle posizioni riflesse della piastra Deep Well per facilitare il caricamento nelle piastre ELISA seguendo la direzione delle frecce blu (standard) e gialle (campioni). Fare clic qui per scaricare questo file.
Tabella 3: ELISA Plate Design. La piastra di prova include la curva standard con quantità decrescenti di bersaglio KDM1A ricombinante (in blu); i campioni biologici (S) in giallo; e corrispondenti controlli negativi (contengono i campioni ma non l'anticorpo di rilevamento primario) in bianco, da caricare sulle piastre ELISA dal Deep Well Plate. Lo spazio vuoto (0 in curva standard) contiene tutti i reagenti di acquisizione e rilevamento, ma nessun campione. Fare clic qui per scaricare questo file.
- ELISA
- (Continua dal passaggio 5.2.4.) Dopo 2 h di incubazione, scartare il buffer di blocco e lavare le piastre con tampone di lavaggio.
- Trasferire i campioni opportunamente diluiti (estratti di proteine autoctone e curva standard dalla fase 5.3.) a un blocco di stoccaggio refrigerato 96 di pozzi profondi seguendo la distribuzione della piastra mostrata nella tabella 2 (Deep Well Plate Design).
- Mantenere questo blocco sul ghiaccio fino a quando il pipettaggio 100 campione l / bene nelle piastre Total e Free ELISA seguendo la distribuzione piastra mostrata nella Tabella 3 (ELISA Plate Design).
- Incubare per 1 h a RT, scartare i campioni e lavare le piastre 5 volte con il tampone di lavaggio.
- Preparare 20 mL di anticorpo di rilevamento anti-KDM1A del coniglio a 0,125 g/mL nel buffer di blocco, aggiungere 100 l per bene in ogni piastra dell'analisi, ad eccezione dei pozzi corrispondenti ai controlli negativi C-. Top-sigillare la piastra e incubare 1 h a RT.
- Eliminare la soluzione anticorpale di rilevamento e lavare le piastre 6 volte con il buffer di lavaggio.
- Preparare 25 mL di anticorpo secondario di capra anti-coniglio HRP a una diluizione 1:5.000 nel buffer di blocco, aggiungere 100 l per bene alle piastre dei microtiteri; e incubare 1 h a RT.
-
Rilevamento chemiluminescente
- 30 min prima della fine del passo 5.4.7. e in condizioni di luce morbida, mescolare parti uguali di Luminol-Enhancer e Perossido Soluzione (10.5 mL: 10.5 mL, per 2 piastre) in una bottiglia di ambra e lasciarlo a RT.
NOTA: Tenere la soluzione di lavoro Luminol in una bottiglia d'ambra ed evitare un'esposizione prolungata a qualsiasi luce intensa. L'esposizione a breve termine all'illuminazione tipica di laboratorio non danneggerà la soluzione di lavoro. - Almeno 20 min prima di misurare la luminescenza, accendere il lettore di microplacia a 25 gradi centigradi e impostare le letture a 1.000 ms tempo di integrazione e 150 ms tempo di stabilimento. Le impostazioni dei parametri possono richiedere l'ottimizzazione in funzione dello strumento.
- Dopo 1 h di incubazione nel passo 5.4.7., scartare la soluzione anticorpale secondaria e lavare le piastre 6 volte con il buffer di lavaggio.
- Pipetta 100 l per pozzetto della soluzione di lavoro Luminol (substrato chemiluminescente) preparata nella fase 5.5.1. Pipette molto lentamente ed evitare la formazione di bolle. Utilizzare un timer per controllare il tempo tra l'aggiunta della soluzione e la misurazione della luminescenza delle piastre e mantenere costante questo tempo per ottenere una buona riproducibilità dell'indice.
- Sigillare le piastre e centrifugare a 500 x g a RT per 45 s in una piastra centrifuga per eliminare eventuali bolle rimanenti. Incubare le piastre per 1 min su uno shaker a piastre a 100 giri/m.
- Inserire la piastra all'interno del lettore e lasciarla per 3 min per stabilizzare la temperatura a 25 gradi centigradi (senza pellicola adesiva). Inizia sempre con il piatto ELISA gratuito.
- Leggere le unità di luminescenza relative (RLU) di ogni saggio di piastra ELISA (KDM1A gratuito e totale).
- Salvare e copiare i valori RLU non elaborati dai file di Excel di dati non elaborati per un'ulteriore analisi dei risultati.
- 30 min prima della fine del passo 5.4.7. e in condizioni di luce morbida, mescolare parti uguali di Luminol-Enhancer e Perossido Soluzione (10.5 mL: 10.5 mL, per 2 piastre) in una bottiglia di ambra e lasciarlo a RT.
6. Calcolo dell'impegno target
- In un software per fogli di calcolo, calcolare i valori RLU Free e RLU Total dei campioni SX e dei campioni di riferimento REF (non trattato, veicolo o pre-dose) dalla loro replica tecnica Dati grezzi come descritto di seguito:
- Immettere i singoli dati Raw RLUi Total e Raw RLUi Free da spazi vuoti, curve standard, controlli negativi campioni C e biologici (SX e REF) nel foglio dati di analisi (ad esempio Excel). Inoltre, immettere gli importi (in pg) di KDM1A dalla curva standard nel foglio dati.
- Calcolare la RLU media raw, le deviazioni standard ,RLUe il coefficiente di variazione CVRLU dai singoli dati Raw Total e Raw Free RLUi per ogni punto dati di replica tecnica.
- Applicare l'eliminazione outlier (ad esempio per i triplicati): per ogni singolo Raw RLU Total e Raw RLU Free data point RLUi da un punto dati di triplicare tecnico, applicare i criteri Grubbs quando il CV per il triplice > 0.15 e rifiutare il singolo valore Raw Raw RLU sospetto quando
,
per cui: 1,148 per n intervallo di confidenza (CI) per n - 3 e 90 %. - Se è stata applicata l'eliminazione anomala, ricalcolare la RLU media non elaborata, la deviazione standard ,RLU e CVRLU dai valori non rifiutati (nr) Raw RLUi Total e Raw RLUi Free per ogni punto dati.
- Applicare la correzione in background: Calcolare i valori medi RLU Free e RLU Total per ogni campione standard, e ogni campione SX e il campione di riferimento REF come:
- Rappresenta graficamente i dati come segue:
- Tracciare i valori RLUFree e RLUTotal (asse Y) in relazione all'identificazione del campione (asse X) in un grafico a barre.
- Tracciare anche i valori RLU (asse Y) degli standard in un grafico a dispersione rispetto alla loro quantità di pg di proteina rKDM1A (asse X) per le misurazioni Libero e Totale, nonché le linee di tendenza lineari corrispondenti e calcolare la r2 (il quadrato del quadrato del coefficiente di correlazione).
- Calcolare l'engagement target (TE); vale a dire la percentuale di KDM1A vincolata dall'inibitore KDM1A in ogni campione SX rispetto a un campione di riferimento REF (non trattato, veicolo o campione di pre-dose) come segue:
- Calcolare il rapporto R dei valori RLU Free-Total medi per i campioni SX e REF come:
- Calcolare quindi l'engagement di destinazione (TE) del campione SX come:
Facoltativo: (1) Se sono stati condotti n esperimenti di replica biologica, ciascuno con n repliche tecniche; calcolare prima il TESX per i set di replica tecnici. Successivamente, calcolare i valori medi di TE, SD e CV per il set di repliche biologiche.
- Calcolare il rapporto R dei valori RLU Free-Total medi per i campioni SX e REF come:
- Verificare se i criteri di accettazione del saggio sono soddisfatti: verificare che (1) lo sfondo del saggio sia accettabile e che la media Blank < 0,05 x 107 RLU; (2) il campione auto-luminescenza è assente e le RKU dei controlli negativi C- sono al di sotto del limite inferiore di quantificazione (LLOQ - Mean Blank - 10x SD); (3) la curva standard rKDM1A è lineare e r2 - 0,98; (4) i campioni biologici hanno valori RLU che rientrano nella gamma dinamica e lineare del saggio, cioè tra LLOQ e 2.500 pg/pozzetto.
NOTA: passaggi 6.1. al 6,4. può essere prontamente automatizzato in un foglio dati di calcolo. - Esportare i dati TE in un software di statistica open source o ottenuto commercialmente di scelta per la rappresentazione grafica dei valori TE e ulteriori valutazioni statistiche.
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Representative Results
La linearità della determinazione Total e Free KDM1A.
Una serie Standard è stata preparata come descritto nel passaggio 5.3.2., utilizzando da 0 a 2500 pg dell'enzima KDM1A ricombinante umano a lunghezza intera. I valori RLU di Total e Free rKDM1A sono stati valutati per verificare la linearità (Figura 2A e 2B). I dati sono rappresentati come media da 3 esperimenti con 3 repliche tecniche (n) - SD. I valori RLU di Total e Free KDM1A rilevati nei PMC umani dal sangue di 3 volontari indipendenti sono sovrapposti alla curva Standard nella Figura 2C e 2D. I campioni di sangue sono stati ottenuti dall'Instituto de Investigaciàn Biomédica Sant Pau Biobank secondo la legislazione spagnola (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) e l'approvazione dei comitati etici locali.
come illustrato nella Figura 2. Determinazione del totale e libero rKDM1A in PMC di volontari sani. Valori RLU di Total rKDM1A valutati da ELISA (A) e di Free rKDM1A valutati dalla chemioprobe capture ELISA (B). I dati sono stati ottenuti da 3 esperimenti di replica, ciascuno analizzato in triplice (N : 3; n - 3). Valori RLU di Total KDM1A valutati da ELISA (C) e free KDM1A (D) per i PBMC di 3 volontari non trattati indipendenti (quadrati rossi, blu e verdi) sovrapposti alla curva standard. I dati sono stati ottenuti da un esperimento analizzato in triplice copia (N : 1; n - 3). I valori rappresentati sono i mezzi : SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Analisi del coinvolgimento del target KDM1A nelle celle
Le cellule AML sono state coltivate seguendo le raccomandazioni del provider. Le cellule sono state trattate con veicolo o ORY-1001 a concentrazioni diverse (0,25; 0,5; 1; 5 e 25 nM) (Figura 3). Gli estratti di proteine native sono stati ottenuti in presenza di 25 nM OG-881 chemiosa. Per eseguire l'analisi di coinvolgimento come descritto in precedenza, sono stati utilizzati 0,5 g di proteine totali. Sono stati determinati KDM1A totali e gratuiti e la percentuale di coinvolgimento target tra ORY-1001 e KDM1A è stata calcolata rispetto al veicolo come descritto.
come illustrato nella figura 3. Dose-risposta di KDM1A Target Engagement in una linea cellulare UMANA AML. Le cellule sono state trattate con veicolo o ORY-1001 a concentrazioni diverse (0,25; 0,5; 1; 5 e 25 nM) e utilizzate per la determinazione dell'impegno del bersaglio come descritto. I dati sono stati ottenuti da 3 esperimenti di replica, ciascuno analizzato in triplice copia (N , n , n 3). I valori rappresentati sono i mezzi : SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Analisi del target di coinvolgimento in vivo di KDM1A
L'obiettivo di questo esperimento era quello di caratterizzare l'impegno target di ORY-1001 in diversi tessuti di ratto, in funzione del livello di dose. Per raggiungere questo obiettivo, 15 ratti Sprague-Dawley (200-250 g) sono stati alloggiati in una stanza di sicurezza citostatica per evitare potenziali contaminazioni da parte del composto testato. Un massimo di 3 ratti/gabbia sono stati assegnati casualmente a 5 gruppi di studio. I 5 diversi gruppi di studio hanno ricevuto, rispettivamente, veicoli; 1; 3, il 10 o 30 g / kg di ORY-1001 per somministrazione orale per 4 giorni consecutivi. Le soluzioni di stock composto sono state preparate giornalmente. Gli animali sono stati pesati prima di ogni somministrazione per regolare il volume richiesto. Tutti gli animali erano alloggiati a temperatura ambiente costante (20 - 24 oC) e relativa umidità (45 - 65 %) sotto un ciclo di 12 h luce-scuro (luci accese alle 6:00). Cibo e acqua erano disponibili ad libitum. I campioni di sangue sono stati raccolti 2 h dopo l'ultima somministrazione nei tubi K2EDTA e i PBMC sono stati isolati secondo la procedura descritta in precedenza al punto 1.2.2. e conservato a -80 gradi centigradi fino all'estrazione di proteine autoctone. I campioni polmonari sono stati raccolti anche 2 h dopo l'ultima somministrazione di farmaci, congelati immediatamente in azoto liquido e conservati a -80 gradi centigradi. Gli studi sono stati condotti in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (direttiva del Consiglio delle Comunità europee 86/609/EEC) stabilite dal Comitato etico per la sperimentazione animale presso il PRAAL-PCB.
Dopo la polverizzazione, gli estratti di proteine native dal polmone sono stati ottenuti come descritto e quantificato. Per eseguire il prosaggio dell'impegno del KDM1A sono stati utilizzati 5 g di proteine totali provenienti da PMCr ed è stato utilizzato di 7,5 g di proteine totali provenienti da polmone proveniente da 3 animali.
La risposta alla dose di KDM1A mira l'impegno nei PMC e nel trattamento polmonare dei ratti con ORY-1001 per gavage orale, calcolato in relazione al gruppo di veicoli è mostrato nella Figura 4A e 4B. Come si può vedere nella Figura 4C, l'incubazione ex vivo con 25 nM ORY-1001 di estratti di proteine polmonari dal veicolo animali trattati produce ancora TE completo, ma non aumenta ulteriormente TE in campioni da ratti trattati per 4 giorni con 30g /kg ORY-1001 , a conferma che KDM1A era già completamente inibito in vivo.
come illustrato nella Figura 4. Coinvolgimento del target KDM1A nativo in vivo ed ex vivo. Risposta alla dose dell'impegno target KDM1A nei pMC (A) e nei campioni polmonari (B) dei ratti trattati con ORY-1001 per 4 giorni consecutivi (p.o). I dati sono stati ottenuti da estratti PFC raggruppati da 3 animali per coorte, analizzati in duplicato (N , n ) o dai polmoni da 3 singoli animali per coorte, analizzati in triplice (N , 3, n ) . C. Confronto di TE in estratti di proteine polmonari raggruppati di ratti trattati con veicolo (a sinistra) o 30 g/kg ORY-1001; dopo 1 h ex vivo incubazione degli estratti senza (barre grigie) o con 25 nM ORY-1001 (barre blu) (N : n , n ) . Tutti i dati sono rappresentati come mezzi - SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui presentato è stato sviluppato per misurare direttamente il coinvolgimento del target KDM1A utilizzando una nuova chemoprobe KDM1A che coglie la base ELISA. Il metodo è stato convalidato su linee cellulari umane coltivate e campioni di ex vivo da esseri umani, ratti e topi e babbuini (compresi PMC, polmone, cervello, pelle, tumori), ma può essere facilmente applicato ad altre specie in cui l'anticorpo KDM1A bersaglio epitopi e cataliti centro sono conservati. Poiché OG-881 è una chemioprobe basata sull'attività, la qualità del campione è importante e la corretta manipolazione e conservazione dei campioni deve essere perseguita soprattutto durante le fasi iniziali del protocollo, per garantire che l'attività KDM1A sia conservata.
L'attuale protocollo sperimentale è stato ottimizzato per analizzare l'impegno del target KDM1A da inibitori mirati covalenti FAD. Può anche essere utilizzato con inibitori reversibili che bloccano l'accesso al cofattore FAD di KDM1A. I potenti inibitori reversibili con tempi di permaneo possono utilizzare il protocollo non modificato.
La chemiosa OG-881 potrebbe non essere adatta per inibitori reversibili a bassa potenza con alti tassi di off-rate. La particolare chemiossusa utilizzata in questo manoscritto non è penetrante cellulare e pertanto le analisi vengono eseguite ex vivo su campioni lisciviati.
Il metodo può essere eseguito su strumenti ampiamente disponibili nei laboratori di ricerca e analisi; non richiede modifiche genetiche da introdurre nelle cellule e può essere facilmente applicato a diversi tipi di campioni. Un altro vantaggio è che può essere utilizzato su campioni derivati da diverse specie che sono frequentemente utilizzati negli studi preclinici di prova di concetto e nei modelli tossicologici e che è stato tradotto con successo per analizzare campioni clinici.
Altri metodi sono stati utilizzati per l'analisi del coinvolgimento del target KDM1A. Molti di questi metodi utilizzano marcatori proxy come le modifiche del marchio di istone H3K4me2, utilizzando AlphaLisa15; o l'induzione di marcatori di espressione utilizzando l'analisi qRT-PCR o FACS16. Tuttavia, nelle cellule o nei tessuti, i segni itoni sono controllati da molteplici fattori e i saggi che misurano i cambiamenti nel marchio dell'istono non sempre forniscono una buona gamma dinamica per l'analisi. L'inibizione di KDM1A può indurre potenti cambiamenti nell'espressione genica e proteica, ma la risposta tende a dipendere dal contesto molto eterogeneo e altamente cellulare, che può complicare le analisi della risposta alla dose3,7.
La valutazione diretta dell'occupazione dell'obiettivo è quindi l'opzione migliore per misurare l'impegno target. Un saggio che è stato proposto per questo è l'angente del cambiamento termico cellulare (CETSA), basato sull'aumento della stabilità termica delle proteine bersaglio dopo il legame degli inibitori. Questo metodo può, in linea di principio, essere applicato a cellule non modificate e diversi tipi di tessuto ed è stato recentemente utilizzato per valutare l'attività cellulare degli inibitori KDM1A nelle cellule coltivate17. Tuttavia, questa tecnologia è stata raramente utilizzata per studi di farmacodinamica in vivo18 e per quanto ne abbiamo conoscenza, il suo uso non è stato segnalato negli studi clinici.
Il protocollo qui fornito descrive un metodo basato sulla chemiosche completamente convalidato che è stato utilizzato per determinare l'impegno del bersaglio KDM1A nelle cellule e nei campioni di tessuto. Il metodo è stato tradotto con successo per analizzare campioni di soggetti umani trattati con un inibitore KDM1A19 e sarà di grande utilità per modellare le risposte PK/PD negli studi clinici.
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Disclosures
L'autrice Tamara Maes è direttore esecutivo e azionista, e gli autori Cristina Mascara e Raquel Ruiz Rodriguez sono dipendenti di Oryzon Genomics S.A. Oryzon Genomics S.A. sviluppa inibitori KDM1A e detiene brevetti che coprono composti e metodi utilizzati in questo articolo.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato da Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche e parzialmente supportati dal programma di collaborazione CIIP-20152001 e RETOS RTC-2015-3332-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X Protease Inhibitor Tablets | Roche | #11836153001 | |
| 96 deep well storage block | VWR | #734-1679 | |
| 96 well ELISA plates | Nunc | #436110 | |
| Adhesive black Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Adhesive transparent Film | VWR | #60941-062 | |
| Biotinylated KDM1A probe OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | # 3117057001 | |
| Bovine Serum Albumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| Cell lysis buffer 10X | Cell Signaling | #9803 | |
| Centrifuge for 96- well plates | Hettich | Rotina 420R | |
| Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
| Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Microplate reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
| Needle G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| PBMC separation tubes 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| PBMC separation tubes 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Plate shaker | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
| Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
| Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| Spectrophotometer cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Spectrophotometer for cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| Syringe | BD | #303172 | |
| Type 1 ultrapure water | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | USC200T |
References
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