Summary
Burada, bir insan veya hayvan hücresi, KDM1A inhibitörleri ile tedavi edilen doku veya kan örneklerinde KDM1A hedef etkileşimi ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Protokol, serbest KDM1A enziminin chemoprobe etiketlemesini ve hedef işgali kemoprob bazlı immünozit kullanarak doğrudan ölçülmesini kullanır ve preklinik ve klinik çalışmalarda kullanılabilir.
Abstract
Bir ilacın, tasarlandığı protein ile etkileşimi olarak tanımlanan hedef etkileşiminin değerlendirilmesi, ilaç gelişiminde veya temel araştırma projelerinde herhangi bir bileşiğin biyolojik aktivitesinin yorumlanmasında temel bir gerekliliktir. Epigenetik olarak, hedef nişan en sık hedef bileşik Birliği ölçmek yerine vekil işaretçileri analizi ile değerlendirilir. Analiz edilmiş olan akım biyolojik okuymalar histon işareti modülasyonu veya gen ifadesi değişikliklerini içerir. KDM1A, metil gruplarını Mono-ve dimethylated H3K4, Gen ifadesinin susturulması ile ilişkili bir modifikasyondan kaldıran bir lizin demethylase 'dir. Vekil işaretçileri modülasyonu hücre türü ve fonksiyon genetik makyaj, incelenen hücreleri bağlıdır, hangi yorumlama ve çapraz durum karşılaştırma oldukça zor yapabilirsiniz. Bu sorunları aşmak için, doğrudan KDM1A hedef etkileşimi doz etkilerini ve dinamiklerini değerlendirmek için çok yönlü bir protokol sunulmaktadır. Tahlil açıklanan bir KDM1A chemoprobe yakalamak ve Unin, enzim ölçmek için yaygın olarak hücreler veya doku örnekleri genetik modifikasyon için gerek kalmadan uygulanabilir, algılama mükemmel bir pencere vardır ve kullanımı yapar temel araştırma için hem de kullanılabilir ve klinik numunelerin analizi.
Introduction
Lizin spesifik demethylase 1 (KDM1A)1 Gen transkripsiyonu kontrolünde yer alan bir demethylase 'dir. Bu protein, Onkoloji 'de bir aday farmakolojik hedef2 olarak ortaya çıkmıştır; Akut myeloid lösemi3 (ayl), myelodisplazi Sendromu (MDS)4, myelofibroz (MF)5,6, küçük hücreli akciğer kanseri (sclc)7; orak hücre hastalığı (SCD)8,9ve Alzheimer hastalığı (reklam), multipl skleroz (MS) dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi hastalıklarında; ve saldırganlık10.
Klinik gelişiminde KDM1A inhibe bileşiklerin çoğu siklopropilamin türevleri ve flavin adenin dinükleotid (FAD) kofaktör11için kovalent bağlayıcı tarafından protein inhibe. KDM1A inhibisyonu gen ifade değişikliklerini indükler, ancak bu değişiklikler, doku, hücre türleri veya hastalık vakaları arasında muazzam farklılık gösterir. KDM1A inhibisyonu da histon işaretleri değiştirir12, henüz bu değişiklikler genellikle genom belirli bir sitede yerel olarak üretilir, ve yine, yüksek doku ve hücre spesifik.
Protokol, biyolojik örneklerde KDM1A hedef etkileşimi doğrudan ölçmek için geliştirilmiştir ve siklopropilamin türev inhibitörleri ile kullanılmak üzere optimize edilmiştir. Tahlil ELISA teknolojisi dayanmaktadır ve analiz, paralel olarak, Total ve ücretsiz (yani inhibitör tarafından ilişkisiz) KDM1A bir doğal protein özü bir biyolojik örnek bir katı faz tahlil. İlk adım olarak, biyolojik numune biyotinlenmiş KDM1A seçici chemoprobe OG-881, seçici KDM1A inhibitörü ORY-1001 (ıadademstat), KDM1A klinik olarak güçlü bir inhibitör türetilmiştir, varlığı içinde lysed onkolojik hastalığın tedavisi için gelişme. Chemoprobe bir IC50 için KDM1A 120 nm ve bir FAD bağlayıcı kısım bir biyotinlenmiş Polietilen glikol (PEG)-kuyruk bağlı içerir. Chemoprobe özel olarak ücretsiz KDM1A bağlar, ancak numunenin inhibitörü bağlı KDM1A. Chemoprobe bağladıktan sonra, örnekteki kompleksleri içeren KDM1A, ücretsiz KDM1A belirlemek için streptavidin kaplamalı yüzeyli mikrotiter plaklarda veya toplam KDM1A belirlemek için monoklonal Anti-KDM1A yakalama antikor ile kaplanmış plaklarda yakalanır. Yıkandıktan sonra, her iki plaka bir anti-KDM1A algılama antikor ile inkübe, tekrar yıkanır, ve göreli ölçüm tarafından bir Işıksaçan substrat ve Ölçüleme kullanarak algılama için ikincil bir HRP-konjuate eşek Anti-tavşan IgG antikor ile inkübe ışık ünitelerinin (RLU) bir Luminometre (Şekil 1).
Şekil 1. KDM1A hedef nişan için ELıSA enzim bağlantılı chemoprobe immunemici tahlil şeması: A) Toplam KDM1A sandviç ELISA ve B kullanarak belirlenmesi) ÜCRETSIZ KDM1A chemoprobe ELıSA kullanarak belirlenmesi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Her testin doğrusallık doğrulamak için her iki ELıSA plakaları standart bir eğrisi dahil edilir. Her örnekteki KDM1A hedef etkileşimi belirlenmesi daha sonra ön doz veya araç tedavi örnek göreli bir değer olarak hesaplanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kan numuneleri, Ispanyolca mevzuatına (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) ve yerel etik komitelerinin onayı uyarınca Instituto de Investis Biomédica Sant Pau biobank 'tan alınmıştır. Hayvansal dokularla yapılan çalışmalar, laboratuar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak (Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi 86/609/EEC), Hayvan deneyi Etik Komitesi tarafından kurulan PRAAL-PCB.
1. tahlil için biyolojik numunelerin hazırlanması.
DIKKAT: Bu protokol, Iş güvenliği ve sağlık Idaresi (OSHA) kan kaynaklı patojenler standardına (29 CFR 1910,1030), Avrupa Parlamentosu 'nun 2000/54/EC Direktifi ve 18 Eylül 2000 Konseyi veya eşdeğer düzenlemeler. Buna ek olarak, biyolojik numuneler biyolojik olarak aktif araştırma kimyasal bileşiklerin izlerini içerebilir ve protokol bu tür bileşiklerin daha fazla manipülasyon gerektirebilir. Denemenin başlangıcından önce kullanılan bileşiklerin güvenlik veri sayfasını (SDS) gözden geçirin ve yeterli kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanımı da dahil olmak üzere araştırma merkezinde kurulan tüm geçerli güvenlik önlemlerini kesinlikle gözlemlemek. Uygun koruyucu giysiler giyin ve deney süresince uygun kalkanı kullanın. Uygun atık konteynerlerde (biyolojik/sitotoksisik atık) kalıntıları atın.
Not: Bu protokol, hücreler veya KDM1A inhibitörü ile tedavi edilen konuların örnekleri ile başlar ve onların tedavi edilmemiş veya araç/plasebo tedavi kontrolleri3.
- Araç veya KDM1A inhibitörü içinde vitro ile tedavi edilen hücreler
- Süspansiyonda yetiştirilen hücreler için, 10 mL kültüründe, süspansiyonları temiz 15 mL konik tüplere aktarın ve 1.1.3 ' e geçin.
- Yapışan hücreler için (75 cm2 flsorunda yetiştirilen), ortamı Flask 'dan çıkarın ve 4 ml PBS kullanarak kısaca yıkayın. 0,5% Trypsin-ED2-5 ta 1,5 mL (tripsinizasyon koşulları değişebilir, hücre hattı için sağlayıcı önerileri takip), 4 mL PBS ekleyin ve temiz 15 mL konik tüplere hücreleri transfer kullanarak kendi gemilerin hücreleri ayırın.
- Tüpleri bir tezgah üstü santrifüjte yerleştirin ve 4 °C ' de 400 x g 'de 5 dakika santrifügasyon ile hücreleri toplayın. Supernatant çıkarın, bir micropipet kullanılarak dağıtılan 1 ml PBS içinde Pelet pelletini ve 1,5 ml microsantrifüz tüp içine süspansiyon transfer.
- Numuneleri bir mikrotüp Santrifüjüne takın ve 4 °C ' de 400 x g 'de 5 dakika santrifüj yapın. PBS 'i bir mikropipet ile aspirasyon ile çıkarın ve peletlerle buzun üzerinde tutun ve adım 2 ' ye geçin; veya kuru buz üzerinde Pellet dondurmak ve onları saklamak-80 °C adım 3 kadar.
- Araç/plasebo veya KDM1A inhibitörü ile tedavi edilen konularda veya hayvanlardan örnekler
- Dokular: küçük, ≈ 1 cm3 adet bir neşter kullanarak doku kes. Sıvı N2 ' de doku parçalarını bir Dewar konteynırı içinde dondurur ve adım 3 ' e kadar-80 °C ' ye saklayın.
- Polimorfik kan mononükleer hücreler (PBMCs): Seyreltmeli 10 mL taze kan (süreç maksimum 2 kan çekilmesinden sonra h) K2toplanan-EDTA tüpler bir 50 ml konik tüp PBS 2 hacimleri ile. Üreticinin talimatlarına göre ticari olarak elde edilen PBMC ayırma tüpleri kullanarak PBMCs kan izole. Buzun üzerinde Pelet tutun ve adım 3,2 devam; veya kuru buz üzerinde Pellet dondurmak ve onları saklamak-80 °C adım 3 kadar.
Not: 20 ila 50 μL ıslak hücreli Pelet, hücre boyutuna bağlı olarak ≈ 1 x 107 hücre içerir. 10 ml sağlıklı insan kanından elde edilen ıslak PBMC Pelet ≈ 20 μl hacmine sahiptir ve ≈ 1 x 107 pbmcs içerir. doku veya hücre pelalları 6 aya kadar-80 º c 'de depolanabilir.
2. çözüm hazırlığı
- Hazırlamak 2 μM OG-881 çalışma solüsyonu: 20 mm biyotinlenmiş Probe OG-881 stok çözeltisi 10 μL tek kullanımlık bir kısım alın 4 °c buzdolabı dışarı ve 10 dakika için oda sıcaklığında (RT) bırakın. OG-881 Stock broyler 'un seri seyreltilmesi ile 2 μM çalışma çözümünü hazırlayın PBS 'de iyon, filtre uçları ile bir mikropipet kullanarak ve farklı seyreltme adımları arasındaki ucu değiştirerek.
- 10X proteaz inhibitörü hazırlayın: 1 mL PBS 'de 1 tableti bir mikrosantrifüj tüpünde çözülür.
- İstenen hacmi hazırlayın 1x Cell liziz tampon ile 25 nM OG-881 chemoprobe. Her mL için, mix 100 μL ticari olarak elde edilen 10X Cell liziz tampon, 150 μL 10X proteaz Inhibitörü, 12,5 μL 2 μM OG-881 ve 737,5 μL tip 1 çift distile su.
- İsteğe bağlı olarak 1x Cell liziz tamponunun istenilen hacmini hazırlayın ama 25 nM ORY-1001 yerine OG-881 gibi adım 2,3. Daha az güçlü inhibitörler kullanılabilir ama yüksek konsantrasyonlar gerektirebilir, pozitif kontrol kullanımı için 100% inhibisyonu (bkz. Adım 3,5).
Not: OG-881 veya KDM1A inhibitörü stok çözümleri ile çözümlerin veya numunelerin istenmeyen kontaminasyonunu önlemek için uygun önlemleri alın. İstenen hacmi hesaplamak için 1x hücre liziz tampon ile 25 Nm OG-881, varsayalım 400 μL başına gerekli olduğunu 40 mg becerdin doku, veya 200 μL başına 107 hücrelerin ıslak Pelet.
3. yerli protein ekstraksiyon
- Dokulardan:
- Kuru buzda soğutulmuş bir harç ve pestili ile ≈ 1 cm3 küp dondurulmuş doku sindirmek ve homojenize. ≈ 40 mg doku tozu içeren tek kullanımlık şişelerde örneklerin aliquot, her zaman çözülme kaçının. 3.1.2 adıma geçin. -80 °C ' de anında işleme veya mağaza için.
- Resuspend 40 mg toz doku 400 μL 1x hücre Liziz tampon ile 25 nM OG-881, Vortex 10 s, ve örnek en az beş kez bir 18-gauge künt şırınga iğne kadar dokusunun lizit elde edilir ve turuncu süspansiyon için bulanık bir ışık sarı Elde. Kabarcık oluşumundan kaçının.
- Adım 3,3 devam
- Hücre pelletinden (PBMCs ve hücre hatları):
- ≈ 1 x 107 hücrelerinin 200 μL 'de 25 Nm OG-881 içeren 1x hücreli liziz tamponunun bir peleti resuspend. Örnekleri kısa bir süre Vortex ve 5 dakika boyunca buzda tutun.
- 45 kHz 'de her biri 20 s 'Lik 3 darbeleri kullanarak bir sonicoratörün örneklerini sonikat; Bakliyat arasında 20 s için buz üzerine yerleştirin.
Not: biyolojik numuneler 1x hücre liziz tamponunda resuspended olarak, sürecin geri kalanı boyunca buz üzerinde tutun.
- Numuneleri ek 5 dakika boyunca buzda tutun, kısa bir süre Vortex ve 4 °C ' de ön soğutmalı santrifüjte 14 000 x g 'de 10 dakika boyunca numuneleri santrifüjleyin.
- 1 mL mikropipet kullanarak, Süpernatantları taze 1,5 mL mikrosantrifüjlere aktarın ve 2 saat boyunca buzun üzerine bırakın. Adım 4 ' e devam edin.
- İsteğe bağlı olarak,% 100 hedef etkileşimi simüle etmek için pozitif bir denetim aşağıdaki gibi hazırlanabilir:
- Hücre Pelet veya toz doku bir araç ya da tedavi edilmemiş (predose) örnek 1x hücre Liziz tampon ile 25 nM ORY-1001 ve süreç olarak adım 3,1 için 3,3 özetlenen olarak gerekli hacminde resuspend.
- Taze 1,5 ml mikrosantrifüjü tüpler içine olumlu kontrol süpernatanlarında aktarmak ve 1 h. ORY-1001 için buz üzerinde bırakın isteyerek KDM1A inhibe ve chemoprobe bağlayıcı blok.
- Pozitif kontrol süpernatant (40 mg doku örneğinden üretilen pozitif kontrol için hacim) veya 2 μm OG-881 çalışma çözeltisi 2,5 μL (107hücreli örnekteki pozitif kontrol için hacim) elde etmek için 5 μL 2 μm OG-881 çalışma çözümü ekleyin diğer örneklerle aynı OG-881 konsantrasyonu ve 2 saat içinde buzda bırakın. Adım 4 ' e devam edin.
4. Bradford tahlil kullanarak yerli protein ölçümü
- H2O tip 1 çift distile su ile ticari kaynaklı Bradford protein assay reaktünü 5 kez seyreltin. Numune ve standartların toplam miktarı için gerekli reaktif hacmini hesaplayın (örnek başına 1 mL veya standart + 5 mL fazla hacim).
- Sığır serum albumin (BSA) standart eğrisi için, 1 mL seyreltilmiş Bradford protein assay çözeltisi (boş) ve seyreltilmiş Bradford protein assay çözeltisi 995 μL ile yedi mikrosantrifüjlü boru ile bir mikrosantrifüj Tüp hazırlayın. BSA standartlarının her biri için 5 μL (125 ila 2.000 μg/mL arasında değişen konsantrasyon) 7 mikrosantrifüj tüplerin her birini ekleyin ve tüpleri birkaç kez hafifçe ters çevirerek karıştırın. RT 'de 5 dakika boyunca inküye yapın.
- Seyreltilmiş standartları küvetler 'e aktarın ve 280 nm 'de bir spektrofotometrede boş ve sığır serum albumin standart örneklerinin od değerini okuyun.
- Biyolojik numuneler için, 1 mL seyreltilmiş Bradford protein assay çözeltisi (boş) ile bir mikrosantrifüjle Tüp hazırlayın ve 999 μL 'Lik, seyreltilmiş Bradford protein assay reakajının, nicelik olması gereken numuneler olarak birçok mikrosantrifüjle tüpleri yapın. Otomatik P2 mikropipet kullanarak, 3. adımda hazırlanan 1 μL doğal protein özü ekleyin ve her mikrosantrifüjte tüpün içine hafifçe çevirerek tüpleri birkaç kez karıştırın. Numuneleri RT 'de 5 dakika içinde kulyatın.
- Birimler için küvetler aktarmak ve 280 nm bir spektrofotometrede numunelerin od okuyun.
- Tercihen, adım 5 ' e hemen geçin. Alternatif olarak, yerel protein özleri-80 °C ' ye adım 5 ' e kadar saklayın. Dondurmayı çözme döngüleri kaçının.
5. Toplam ve ücretsiz KDM1A belirlenmesi için Işıksaçan ELISAs
Not: Laboratuvar sıcaklığını 23-24 °C ' de (RT) sabit tutun.
- KDM1A antikor veya streptavidin yakalama ile mikrotiter plakaları kaplama
- Toplam KDM1A ELıSA: her plaka için, PBS 'de 2 μg/mL 'Lik son konsantrasyona 10 mL KDM1A yakalama antikor hazırlayın. 100 μL plakanın her bir kuyusu içine aktarın.
- Ücretsiz KDM1A ELISA: her plaka için, PBS 'de 10 μg/mL 'de 10 mL streptavidin hazırlayın. 100 μL plakanın her bir kuyusu içine aktarın.
- Toplam ve ücretsiz KDM1A ELıSA plakalarını yapışkan film ile üst üste mühürleyin ve tabakaları gece 4 °C ' de buzdolabında tutınız.
- Plakaları yıkama ve engelleme
- Buzdolabının tabakları alın ve onları kullanmadan önce RT 45 dk civarında için doğrultma izin.
- Hazırlamak 1.000 mL yıkama tampon (0,1% PBS içinde ara) ve 50 mL engelleme tampon (1% BSA içinde PBS) plaka başına.
- Yıkama tampon ile plakaları 3 kez yıkayın. Bu ve sonraki adımlarda, her yıkama adımının ardından kağıt havluların üzerine plakaya dokunarak kalan solüsyonu çıkarın.
- Her iki plakada her iki plaka için de blok tamponu 200 μL ekleyin, hem yapıştırıcı film ile hem de 2 saat RT 'de inküye yapın.
- Biyolojik numune hazırlama
- Adım 3 ' ün sonunda elde edilen doğal protein ekstrelerini PBS kullanarak uygun konsantrasyona seyreltin. Önerilen konsantrasyon biyolojik örnekteki KDM1A ifade seviyesinin işlevinde farklılık gösterecektir. Uygun aralıkları örnekleri (1) hücre Pellet: 0,5-10 μg başına. (2) PBMCs: 5-30 μg başına iyi. (3) pulverize doku (beyin, akciğer, cilt): 20-100 μg başına. Preparat sırasında örnekleri buzda tutun. Mümkün olduğunda, teknik triplicate örnek analizleri çalıştırın.
- İnsan rKDM1A kullanarak standart eğrisi hazırlayın:
- KDM1A standart çalışma çözümünü hazırlamak için, 25 pg/μL 'nin son konsantrasyonu için rKDM1A uygun hacminin pipet, 2 μM OG-881 75 μL ekleyin ve 15 mL 'Lik Falcon tüpünde toplam 6 mL hacmine 1 x PBS ile doldurun. KDM1A standart çalışma çözümünü 1 saat boyunca buzda tutun ve 15 mL şahin tüpünü her 20 dakikada bir birkaç kez tersine çevirerek çözümü nazikçe karıştırın.
- 1,5 mL mikrosantrifüjli tüplerde KDM1A Standart seyreltme serilerini Tablo 1 ' e göre hazırlayın (Standart hazırlama), 2 96 iyi mikrotiter plakalarının triplicate analizi için yeterli hacimli.
| STANDART SERI | KDM1A standart çalışma çözümü (μL) | |
| (PG KDM1A/Well) | PBS (μL) | |
| C için 2500-* | 800 | - |
| 2500 | 800 | - |
| 1750 | 560 | 240 |
| 1250 | 400 | 400 |
| 750 | 240 | 560 |
| 250 | 80 | 720 |
| 25 | 8 | 792 |
| 0 | 0 | 800 |
| Not: | ||
| (1) her seyreltme hazırlanan hacim test triplicate 2 plaka çalıştırmak için yeterlidir. | ||
| (2) Önerilen Aralık arasında 2,5 ve 5.000 pg/iyi | ||
| * Negatif kontrol C-KDM1A algılama antikor olmadan | ||
Tablo 1: Standart hazırlık. Standart KDM1A proteini hazırlamak için, KDM1A standart çalışma çözeltisi ve PBS 'nin belirtilen hacimlerini sekiz düzgün etiketli 1,5 mL mikrosantrifüjli tüplere pipet etmek.
Tablo 2: derin kuyu plaka tasarımı. Standartlar (mavi) ve örnekleri (sarı) adım 5.4.2. mavi (Standart) ve sarı (numune) okları yönünde aşağıdaki ELISA plakaları içine yükleme kolaylaştırmak için derin kuyu plaka yansıyan pozisyonlara pipetli edildi. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 3: ELıSA plaka tasarımı. Tahlil plakası rekombinant KDM1A hedef (mavi) azalan miktarlarda standart eğri içerir; sarı biyolojik numune (ler); ve karşılık gelen negatif kontroller (örnekleri içerir, ancak birincil algılama antikor) beyaz, derin kuyu plaka ELıSA plakaları üzerinde yüklenecek. Boş (Standart eğri 0) tüm yakalama ve algılama reaktifleri içerir, ancak örnek yok. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
- ELISA
- (Adım 5.2.4 devam eder.) 2 saat inkübasyon yapıldıktan sonra, engelleme tamponunu atın ve plakaları yıkama tamponunu ile yıkayın.
- Tablo 2 ' de (derin kuyu plaka tasarımı) gösterilen plaka dağılımını takiben uygun seyreltilmiş numuneleri (adım 5,3 ' dan gelen doğal protein özler ve standart eğrisi) bir soğutucu 96 derin iyi saklama bloğuna aktarın.
- Tablo 3 ' te (ELISA Plate Design) gösterilen plaka dağılımının ardından toplam ve serbest ELISA plakalarının pipetleme 100 μL numune/kuyusu içinde buz üzerinde bu bloğu tutun.
- RT 'de 1 h için inküye, örnekleri atın ve yıkama tamponu ile 5 kez plakaları yıkayın.
- Hazırlama 20 mL tavşan Anti-KDM1A algılama antikor at 0,125 μg/mL engelleyici tampon, eklemek 100 μL her bir plaka içinde iyi test, dışında kuyu negatif kontrolleri karşılık C-. Plakayı üst-mühürleyin ve RT 'de 1 saat inküye yapın.
- Algılama antikor çözeltisi atın ve yıkama tampon ile plakaları 6 kez yıkayın.
- Hazırlamak 25 mL ikincil keçi Anti-tavşan antikor HRP bir seyreltme için 1:5000 engelleme tampon, eklemek 100 μL başına iyi mikrotiter plakaları; ve RT 'de 1 saat inkübe.
-
Kemiluminesans algılama
- Adım 5.4.7 sonundan önce 30 dk. ve yumuşak ışık koşullarında, luminol-Enhancer ve peroksit solüsyonun eşit parçalarını (10,5 mL: 10,5 mL, 2 plaka için) sarı bir şişede karıştırın ve RT 'de bırakın.
Not: luminol çalışma çözümünü kehribar şişesinde tutun ve herhangi bir yoğun ışığa uzun süreli maruz kalmamak. Tipik laboratuar aydınlatmaya kısa süreli maruz kalma, çalışma çözümüne zarar vermez. - Luminesans ölçümden en az 20 dakika önce, 25 °C ' de Mikroplaka okuyucusunu açın ve 1.000 MS entegrasyon süresi ve 150 MS kapatma süresi için okuma ayarlayın. Parametre ayarları, cihazın fonksiyonunda optimizasyon gerektirebilir.
- Adım 5.4.7 in inkübasyon 1 h sonra, ikincil antikor çözeltisi atın ve yıkama tampon ile 6 kez plakaları yıkayın.
- Adım 5.5.1 ' de hazırlanan luminol çalışma çözeltisi (kemiluminesans substrat) başına pipet 100 μL. Çok yavaş pipet ve kabarcık oluşumundan kaçının. Çözelti ilavesi ve plakaların Luminesans ölçümü ilavesi arasındaki süreyi kontrol etmek için bir zamanlayıcı kullanın ve iyi bir inter assay yeniden üretilebilirliği elde etmek için bu zaman sabit tutun.
- Üst-mühür plakaları ve 500 x g için RT 45 s için bir plaka santrifüjte kalan kabarcıklar ortadan kaldırmak için santrifüj. 100 RPM 'de bir plaka çalkalayıcı üzerinde 1 dakika için plakaları inküye.
- Plakayı okuyucunun içine yerleştirin ve 25 °C ' de (yapışkan film olmadan) sıcaklığı stabilize etmek için 3 dakika bırakın. Her zaman ücretsiz ELISA plakası ile başlayın.
- Her ELISA plaka tahlil (ücretsiz ve toplam KDM1A) göreli lüminesans üniteleri (RLU) okuyun.
- Kaydet ve RAW verileri Excel dosyaları daha ayrıntılı analiz için RAW RLU değerleri kopyalayın.
- Adım 5.4.7 sonundan önce 30 dk. ve yumuşak ışık koşullarında, luminol-Enhancer ve peroksit solüsyonun eşit parçalarını (10,5 mL: 10,5 mL, 2 plaka için) sarı bir şişede karıştırın ve RT 'de bırakın.
6. hedef etkileşimi hesaplanması
- Bir elektronik tablo yazılımında, SX ve referans NUMUNELERININ RLU ücretsiz ve RLU toplam değerlerini hesaplayın (tedavi edilmemiş, araç veya ön doz örneği) aşağıda ayrıntılı olarak teknik çoğaltır RAW verilerinden:
- Bireysel RAW Rluı Total ve RAW Rluı ücretsiz verileri boşluklar, standart eğri, negatif kontroller C-ve biyolojik örnekler (SX ve ref) analiz veri sayfasına (örn., Excel) girin. Ayrıca, veri sayfasındaki standart eğri 'den KDM1A miktarlarını (PG cinsinden) girin.
- Ham ortalama RLU, standart sapma σRLUve her teknik çoğaltma DataPoint Için bireysel RAW Total ve RAW ücretsiz Rluı verilerinden varyasyon CVRLU katsayısı hesaplayın.
- Outlier eliminasyonu uygulayın (triplicates için örnek): her biri için RAW RLU toplam ve RAW RLU ücretsiz veri noktası Rluı teknik bir triplicate DataPoint, uygulamak Grubbs ölçütleri ne zaman için CV triplicate > 0,15 ve tek şüpheli RAW RLU değeri Reddet Tesis
,
Bu nedenle Z = 1,148 n = 3 ve 90% güven aralığı (CI) için. - Outlier eleme uygulanmışsa, yeniden hesaplamak RAW ortalama RLU, standart sapma σ RLU ve CVRLU olmayan reddedilen (NR) RAW rlui Total ve RAW rluı ücretsiz değerleri her DataPoint için.
- Arka plan düzeltmeyi uygulayın: ortalama RLU ücretsiz ve RLU toplam değerleri her standart örnek için hesaplayın ve her örnek SX ve başvuru örnek ref olarak:
- Verileri aşağıdaki gibi grafiksel olarak temsil eder:
- RLUserbest ve RLUToplam değerleri (Y ekseni) bir çubuk grafikte örnek kimlik (X ekseni) göreli olarak çizin.
- Ayrıca, ücretsiz ve toplam ölçümler için rKDM1A protein (X-eksen) pg kendi miktarına göre bir dağılım çizim standartlarının RLU değerleri (Y-eksen) çizmek yanı sıra karşılık gelen Lineal eğilim çizgileri ve hesaplamak r2 (kare doğrusal bağıntı katsayısı) değerleri.
- Hedef etkileşimi hesaplayın (TE); Örneğin, her örnekteki KDM1A inhibitörü tarafından KDM1A bağlı olan bir referans örnek REF (tedavi edilmeyen, araç veya ön doz örneği) göreli olarak aşağıdaki gibidir:
- SX ve REF örnekleri için Ortalama RLU ücretsiz değerleri R oranını hesaplayın:
- Ardından, örnek SX 'in hedef ETKILEŞIMI (te) hesaplayın:
İsteğe bağlı: (1) N biyolojik çoğaltma denemeleri gerçekleştirilmiştir, her biri n teknik çoğaltır; önce teknik çoğaltma setleri için TESX hesaplayın. Daha sonra, biyolojik çoğaltma seti için Ortalama TE, SD ve CV değerlerini hesaplayın.
- SX ve REF örnekleri için Ortalama RLU ücretsiz değerleri R oranını hesaplayın:
- Tahlil kabul kriterlerinin karşılanması olup olmadığını gözden geçirin: (1) tahlil arka plan kabul edilebilir ve ortalama boş < 0,05 x 107 RLU olduğunu doğrulayın; (2) örnek Auto-Luminescence yok ve negatif kontroller C RLUs-quantification alt sınırı (LLOQ = Mean Blank + 10X SD) altındadır; (3) rKDM1A standart eğrisi doğrusal ve R2 ≥ 0,98; (4) biyolojik numuneler, LLOQ ve 2.500 pg/iyi arasında test yani dinamik ve doğrusal aralıkta düşen RLU değerlerine sahiptir.
Not: 6,1 adımları. 6,4 için. bir matematik veri sayfasında kolaylıkla otomatik olabilir. - Te değerlerini ve ek istatistiksel değerlendirmeleri grafik gösterimi için tercih edilen bir açık kaynak veya ticari olarak elde edilen istatistik yazılımına TE verilerini dışa aktarın.
,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Toplam ve serbest KDM1A belirlenmesinde doğrusallık.
A standart serisi adım 5.3.2 açıklandığı gibi hazırlanmıştır., kullanarak 0 için 2500 pg tam uzunlukta insan rekombinant KDM1A enzim. Toplam ve ücretsiz rKDM1A RLU değerleri doğrusallık doğrulamak için değerlendirildi (Şekil 2a ve 2B). Veriler 3 Teknik çoğaltır (n) ± SD ile 3 deneyden ortalama olarak temsil edilir. 3 bağımsız gönüllülerin kanından insan PBMCs 'de algılanan Total ve Free KDM1A RLU değerleri Şekil 2C ve 2D'de standart eğrinin üzerinde yer aldı. Kan numuneleri, Ispanyolca mevzuatına (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) ve yerel etik komitelerinin onayı uyarınca Instituto de Investis Biomédica Sant Pau biobank 'tan alınmıştır.
Şekil 2. Sağlıklı gönüllülerin PBMCs toplam ve ücretsiz rKDM1A belirlenmesi. ELISA (A) ve ücretsiz rKDM1A tarafından değerlendirilen toplam rKDM1A RLU değerleri chemoprobe yakalama ELıSA (B) tarafından değerlendirildi. Veriler 3 çoğaltma deneyinden elde edilmiştir ve her biri üç kopya olarak incelenir (N = 3; n = 3). Toplam KDM1A RLU değerleri, standart eğri üzerinde Süperpoze 3 bağımsız tedavi edilmemiş gönüllülerin (kırmızı, mavi ve yeşil kareler) pbmcs için ELISA (C) ve ücretsiz KDM1A (D) tarafından değerlendirildi. Veriler, triplicate içinde analiz edilen bir deneyden (N = 1; n = 3) elde edildi. Temsil edilen değerler ± SD demektir. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Hücrelerde KDM1A hedef etkileşimi Analizi
AI hücreleri sağlayıcı önerileri aşağıdaki kültürlü. Hücreler farklı konsantrasyonlarda araç veya ORY-1001 ile tedavi edildi (0,25; 0,5; 1; 5 ve 25 nM) (Şekil 3). Yerli protein özler 25 nM OG-881 chemoprobe varlığında elde edildi. 0,5, daha önce açıklandığı gibi hedef nişan analizini gerçekleştirmek için toplam protein μg kullanılmıştır. Toplam ve ücretsiz KDM1A belirlendi ve ORY-1001 için hedef nişan yüzdesi KDM1A ' e göre araç olarak belirtildiği şekilde hesaplanır.
Şekil 3. Doz-yanıt-in KDM1A hedef nişan içinde a insan AYL hücre hat. Hücreler farklı konsantrasyonlarda araç veya ORY-1001 ile tedavi edildi (0,25; 0,5; 1; 5 ve 25 Nm) ve açıklandığı gibi hedef etkileşimi belirlenmesi için kullanılır. Veriler 3 çoğaltma deneyinden elde edildi, her biri üç plağını analiz etti (N = 3, n = 3). Temsil edilen değerler ± SD demektir. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
In vivo KDM1A hedef etkileşimi Analizi
Bu denemenin amacı, doz seviyesinin işlevinde, farklı sıçan dokularında ORY-1001 hedef etkileşimi karakterize etmektir. Bu hedefe ulaşmak için, 15 Sprague-Dawley fareler (200-250 g) test edilmiş bileşik tarafından potansiyel kontaminasyonu önlemek için bir sitostatik güvenlik odasında barındırıldı. 5 çalışma grubuna maksimum 3 sıçan/kafes rasgele atanmıştır. Alınan 5 farklı çalışma grubu sırasıyla araç; 1 3 10 veya 30 μg/kg ORY-1001 oral yönetim tarafından ardışık 4 gün boyunca. Bileşik stok çözümleri her gün hazırlanmıştır. Hayvanlar gerekli hacmi ayarlamak için her yönetim önce tartıldı. Tüm hayvanlar sabit oda sıcaklığında (20-24 º C) ve bağıl nemi (45-% 65) barındırıldı 12 h açık karanlık döngüsü altında (ışıklar açık 6:00 AM). Gıda ve su kullanılabilir reklam Isteğe bağlı. Kan örnekleri toplanan 2 h son uygulamadan sonra K2EDTA tüpler ve PBMCs daha önce adım 1.2.2 açıklanan prosedüre göre izole edildi. ve-80 °C ' de yerli protein ekstraksiyonu kadar korunur. Akciğer numuneleri de son ilaç yönetiminden 2 saat sonra toplanır, hemen sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve-80 °C ' de saklanır. Araştırmalar, PRAAL-PCB ' l e hayvan deneyi Etik Komitesi tarafından kurulan Laboratuvar hayvanlarının (Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi 86/609/EEC) bakımı ve kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak yapılmıştır.
Pulverizasyon sonra, akciğer doğal protein ekstraları açıklandığı ve nicelleşmiş olarak elde edildi. KDM1A hedef nişan tahlili için doz grubu başına 5 μg toplam protein havuzlanmış PBMCs veya 7,5 μg toplam protein akciğer 3 hayvandan kullanıldı.
PBMCs 'de KDM1A hedef etkileşimini ve ORY-1001 ' i n oral gavaj ile sıçanların akciğer tedavisinde doz-tepkisi, araç grubuna göre hesaplanan Şekil 4A ve 4B'de gösterilir. Figure 4c'de gördüğünüz gibi, 25 Nm ORY-1001 ile ex vivo inkübasyon, araç tarafından tedavi edilen hayvanlardan gelen akciğer proteini EKSTRALARı tam te henüz ama daha fazla ten örneklerinde te artış yapmaz 4 gün boyunca tedavi et 30 μg/kg ORY-1001 , KDM1A teyit zaten tamamen içinde vivo engellenir.
Şekil 4. In vivo ve ex vivo Native KDM1A hedef etkileşimi. PBMCs (A) ve akciğer örneklerinde (B) KDM1A hedef etkileşimi, ORY-1001 ile tedavi edilen farelerden (s. o) 4 ardışık gün için doz-yanıtı. Veriler, kohort başına 3 hayvandan havuza alınan PBMCs ekstrelerinden, yinelenen (N = 1, n = 2) ya da kohort başına 3 bireysel hayvandan gelen akciğerlerden (N = 3, n = 3) incelenmiştir. C. araç (sol) veya 30 μg/kg ORY-1001 ile tedavi edilen fareler havuzlu akciğer proteini özler TE karşılaştırılması; (gri çubuklar) veya 25 nM ORY-1001 (mavi çubuklar) (N = 3, n = 3) olmadan özler 1 h ex vivo inkübasyon sonra. Tüm veriler ± SD anlamına gelir. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokol doğrudan KDM1A hedef nişan bir roman KDM1A chemoprobe yakalama tabanlı ELISA kullanarak ölçmek için geliştirilmiştir. Yöntem, insan, sıçan ve fare ve babun (pbmcs, akciğer, beyin, cilt, tümörler dahil), ama kolayca diğer türler için uygulanabilir hangi KDM1A antikor hedef epitopları ve katalitik olarak kültürlü insan hücresi hatları ve ex vivo örnekleri üzerinde doğrulandı Merkezi temin edilmektedir. OG-881 bir aktivite bazlı chemoprobe olduğu için, örnek kalite önemli ve uygun manipülasyon ve numunelerin korunması özellikle protokolün ilk adımlar sırasında, KDM1A aktivite korunması sağlamak için takip edilmelidir.
Geçerli Deneysel protokol, KDM1A hedef etkileşimi, kovalent FAD hedefleme inhibitörleri tarafından analiz etmek için optimize edilmiştir. Ayrıca KDM1A FAD kofaktör erişimi engelleyen geri dönüşümlü inhibitörleri ile kullanılabilir. Uzun ikamet süreleri ile güçlü geri dönüşümlü inhibitörler değiştirilmemiş protokol istihdam edebilir.
OG-881 chemoprobe, yüksek off-RATES ile düşük potens geri dönüşümlü inhibitörleri için uygun olmayabilir. Bu yazıda kullanılan özel kemoprob hücre Penetrant değildir ve bu nedenle analizler ex vivo lysed örneklerinde gerçekleştirilir.
Yöntem, araştırma ve analitik laboratuvarlarda geniş bir şekilde kullanılabilen araçlarla çalıştırılabilir; Bu hücreler içine tanıtılacak genetik değişiklikler gerektirmez ve kolayca farklı örnek türlerine uygulanabilir. Başka bir avantaj da, kavram çalışmalarının preklinik kanıtında ve toksikoloji modellerinde sık kullanılan farklı türlerden türeyen örneklerde ve klinik numunelerin analiz edilmesi için başarıyla çevrildiği örneklerde kullanılabilmesi.
KDM1A hedef etkileşimi analizi için diğer yöntemler kullanılmıştır. Bu yöntemlerin çoğu H3K4me2 histon işareti değişiklikleri gibi proxy işaretçileri kullanmak, alphalisa15kullanarak; veya qRT-PCR veya FACS Analizi16kullanarak ifade işaretçileri indüksiyon. Ancak, hücreler veya dokularda, histon işaretleri birden fazla faktör tarafından kontrol edilir ve histon işaretindeki değişikliklerin ölçülmesi her zaman analiz için iyi bir Dinamik Aralık sağlamasırlar. KDM1A inhibisyonu gen ve protein ifadesinde güçlü değişiklikler yapabilir, ancak yanıt doz tepkisi analizlerini zorlaştırabilir çok heterojen ve yüksek hücre bağlamı bağımlı eğilimindedir3,7.
Hedef işgalinin doğrudan değerlendirilmesi, bu nedenle, hedef etkileşimi ölçmek için en iyi seçenektir. Bu için önerilen bir tahlil hücresel termal vardiya tahlil (CETSA), inhibitörleri bağlama üzerine hedef proteinlerin termal stabilitesi artışa dayanmaktadır. Bu yöntem, prensip olarak, değiştirilmemiş hücrelere ve farklı doku türlerine uygulanabilir ve yakın zamanda KDM1A inhibitörlerinin hücresel aktivitesini değerlendirmek için kullanılan hücrelerde17. Ancak, bu teknoloji nadiren in vivo Farmakodinamik çalışmalar için kullanılan18 ve bilgi en iyi, onun kullanımı klinik çalışmalarda rapor edilmedi.
Burada sağlanan protokol, hücreler ve doku örneklerinde KDM1A hedef etkileşimi belirlemek için kullanılan tam olarak doğrulanmış bir chemoprobe tabanlı yöntem açıklanmaktadır. Yöntem başarıyla KDM1A inhibitörü19 ile tedavi insan konuları örnekleri analiz etmek için çevrilmiş ve KLINIK çalışmalarda PK/PD tepkiler modeli için büyük kullanım olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar Tamara Maes bir İcra Direktörü ve hissedar, ve yazarlar Cristina Mascaró ve Raquel Ruiz Rodriguez Oryzon Genomics S.A. Oryzon Genomics S.A. çalışanları KDM1A inhibitörleri geliştirir ve patentleri kapsayan bileşikler ve yöntemleri kullanılan tutar Bu makalede.
Acknowledgments
Bu çalışmada Oryzon Genomics tarafından finanse edilmiştir. S.A., Hoffman-La Roche ve CIıP-20152001 ve RETOS işbirliği programı RTC-2015-3332-1 tarafından kısmen desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X Protease Inhibitor Tablets | Roche | #11836153001 | |
| 96 deep well storage block | VWR | #734-1679 | |
| 96 well ELISA plates | Nunc | #436110 | |
| Adhesive black Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Adhesive transparent Film | VWR | #60941-062 | |
| Biotinylated KDM1A probe OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | # 3117057001 | |
| Bovine Serum Albumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| Cell lysis buffer 10X | Cell Signaling | #9803 | |
| Centrifuge for 96- well plates | Hettich | Rotina 420R | |
| Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
| Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Microplate reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
| Needle G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| PBMC separation tubes 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| PBMC separation tubes 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Plate shaker | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
| Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
| Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| Spectrophotometer cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Spectrophotometer for cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| Syringe | BD | #303172 | |
| Type 1 ultrapure water | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | USC200T |
References
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T. ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia. Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).
- Sugino, N. A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers. Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).
- Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms. Blood. 126, 601 (2015).
- Jutzi, J. S., et al. LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone. HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).
- Mohammad, H. P. DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC. Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).
- Rivers, A., et al. RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases γ-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model. Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).
- Rivers, A. Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons. Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).
- Buesa, C., et al. The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation. Alzheimer’s & Dementia. 11 (7), P905 (2015).
- Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1. Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).
- Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. Human histone demethylase LSD1 reads the histone code. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).
- Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor. Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. , WO2017158136 (2016).
- Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors. Journal of Biological Chemistry. , In Press (2019).
- Rodriguez-Suarez, R. Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).
- Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1. Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).
- Schulz-Fincke, J. Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation. European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).
- Ishii, T., et al. CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens. Scientific Report. 7, 13000 (2017).
- Maes, T. ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders. Alzheimer’s & Dementia. 12 (7), P1192 (2017).
