Summary
ここでは、KDM1A阻害剤で処理したヒトまたは動物細胞、組織または血液試料におけるKDM1A標的関与を測定するプロトコルを提示する。このプロトコルは、自由なKDM1A酵素の化学療法タグ付けと、化学プローブベースの免疫アッセイを用いた標的職業の直接定量を採用し、前臨床および臨床研究で使用することができます。
Abstract
標的エンゲージメントの評価は、それが設計されたタンパク質との薬物の相互作用として定義され、医薬品開発または基礎研究プロジェクトにおける任意の化合物の生物学的活性の解釈のための基本的な要件である。エピジェネティクスでは、ターゲットエンゲージメントは、化合物の標的との結合を測定するのではなく、プロキシマーカーの分析によって最も頻繁に評価されます。分析された下流の生物学的読み出しには、ヒストンマーク変調または遺伝子発現の変化が含まれる。KDM1Aは、モノラルおよびジメチル化H3K4からメチル基を除去するリジンデメチラーゼであり、遺伝子発現のサイレンシングに関連する修飾である。プロキシマーカーの変調は、調査された細胞の遺伝的構成の細胞の種類と機能に依存し、解釈と大文字と小文字の比較を非常に困難にすることができます。これらの問題を回避するために、直接KDM1Aターゲットエンゲージメントの線量効果およびダイナミクスを評価する汎用性の高いプロトコルが提示される。記載されたアッセイは、KDM1Aケモプローブを使用して、非抑制酵素を捕捉し、定量化し、遺伝子改変を必要とせずに細胞や組織サンプルに広く適用することができ、検出の優れた窓を有し、基礎研究の両方に使用することができます臨床サンプルの分析。
Introduction
リジン特異的デメチラーゼ1(KDM1A)1は、遺伝子転写の制御に関与するデメチラーゼである。このタンパク質は、腫瘍学における候補薬理学的標的2として出現した。急性骨髄性白血病3(AML)、骨髄異形成症候群(MDS)4、骨髄線維症(MF)5、6、小細胞肺癌(SCLC)7を含む; 鎌状赤血球病(SCD)8、9、およびアルツハイマー病(AD)、多発性硬化症(MS)を含む中枢神経系疾患において。そして侵略10で.
臨床開発におけるKDM1A阻害化合物のほとんどは、シクロプロピラミン誘導体であり、そのフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)共因子11に共価結合することによってタンパク質を阻害する。KDM1Aの阻害は遺伝子発現変化を誘発するが、これらの変化は組織、細胞型、または疾患の場合によって大きく異なる。KDM1Aの阻害はまたヒストンマーク12を変化させ、しかもこれらの変化は一般にゲノム内の特定の部位で局所的に産生され、再び、高度な組織および細胞特異的である。
このプロトコルは、生体試料におけるKDM1A標的関与を直接測定するために開発され、シクロプロピラミン由来阻害剤との使用に最適化されています。アッセイはELISA技術に基づいており、相物由来アッセイ中の生体タンパク質抽出物中のKDM1Aを並行して、トータルおよびフリー(阻害剤によって結合しない)を分析する。第一段階として、生体試料は、ビオチン化KDM1A選択的化学プローブOG-88113,14の存在下で、臨床におけるKDM1Aの強力な阻害剤である選択的KDM1A阻害剤ORY-1001(iadademstat)に由来する。オンコジカル疾患の治療のための開発。化学プローブは120 nMのKDM1AのためのIC50を有し、生物化ポリエチレングリコール(PEG)-尾にリンクされたFAD結合部分を含んでいる。化学プローブは、自由なKDM1Aに排他的に結合しますが、サンプル中の阻害剤結合KDM1Aには結合しません。化学プローブ結合後、試料中の複合体を含むKDM1Aは、ストレプトアビジンコーティング面を有するマイクロチタプレート上で捕捉され、遊値KDM1Aを決定するか、またはモノクローナル抗KDM1A捕捉抗体で被覆されたプレート上で、全KDM1Aを決定する。洗浄後、両方のプレートを抗KDM1A検出抗体でインキュベートし、再度洗浄し、二次HRP結合ロバ抗ウサギIgG抗体でインキュベートし、相対測定による発光基板と定量を用いて検出した。照明計の光単位(RLU)(図1)。
図 1.ELISA酵素のスキーマは、KDM1A標的関与に対する化学プローブ免疫吸収性アッセイを連結した:A)サンドイッチELISAおよびBを用いて全KDM1Aの決定)ケモプローブELISAを用いて自由KDM1Aの決定を行った。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
標準曲線は、各アッセイの直線性を検証するために、両方のELISAプレートに含まれています。各サンプルにおけるKDM1Aターゲットエンゲージメントの決定は、次いで、前用量または車両処理サンプルに対する相対値として計算される。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
血液サンプルは、スペインの法律(レアル・デクレト・デ・バイオバンコス1716/2011)と地元の倫理委員会の承認に従って、インスティトゥート・デ・インスティトゥート・デ・ディオメディカ・サン・パウ・バイオバンクから入手されました。動物組織を用いた研究は、動物実験倫理委員会が設置した実験動物のケアと使用に関する制度ガイドライン(欧州共同体協議会指令86/609/EEC)に従って行われた。プラアルPCB。
1. アッセイ用の生物学的サンプルの調製。
注意:このプロトコルは、労働安全衛生局(OSHA)血液媒介病原体規格(29 CFR 1910.1030)、欧州議会および欧州議会の指令2000/54/ECに従う可能性のある生物学的サンプルの操作を含みます。2000年9月18日または同等の規制の評議会。加えて、生物学的試料は、生物学的に活性な化学化合物の痕跡を含んでいてもよいし、プロトコルはそのような化合物のさらなる操作を含み得る。実験開始前に使用した化合物の安全データシート(SDS)を確認し、適切な個人用保護具(PPE)の使用を含め、研究センターに設置されているすべての適用可能な安全対策を厳密に遵守してください。適切な防護服を着用し、実験中に適切なシールドを使用してください。適切な廃棄物容器(生物学的/細胞傷害性廃棄物)に残渣を廃棄する。
注:このプロトコルは、KDM1A阻害剤で処理された被験者の細胞またはサンプルから始まり、その未処理または車両/プラセボ処理コントロール3で始まります。
- ビトロで車両またはKDM1A阻害剤で処理した細胞
- 懸濁液中で増殖した細胞については、10 mL培養物として、懸濁液をクリーンな15 mL円錐管に移し、1.1.3に進みます。
- 付着細胞(75cm2フラスコで増殖)の場合は、フラスコから培地を取り出し、4 mL PBSを使用して短時間洗浄します。2~5分間に0.5%トリプシン-EDTAの1.5mLを使用して血管から細胞を剥離し(トリプシン化条件は異なる場合があり、細胞株のプロバイダーの推奨に従い、4 mL PBSを追加し、細胞をきれいな15 mL円錐管に移す)。
- ベンチトップ遠心分離機にチューブを挿入し、4°Cで400 x gで5分間遠心分離によって細胞を収集します。上清を取り出し、マイクロピペットを使用して分配されたPBSの1mLでペレットを再懸濁し、懸濁液を1.5mLマイクロ遠心管に移す。
- マイクロチューブ遠心分離機にサンプルを挿入し、4°Cで400 x gで5分間遠心分離します。マイクロピペットで吸引によってPBSを取り外し、ペレットを氷の上に保ち、ステップ2に進みます。またはドライアイスでペレットを凍結し、ステップ3まで-80 °Cに保存します。
- 車両/プラセボまたはKDM1A阻害剤で処理された被験者または動物からのサンプル
- ティッシュ:メスを使って組織を小さく、1cm3個切ります。デュワー容器に液体N2で組織片を凍結し、ステップ3まで-80°Cで保存します。
- 多形血液単核細胞(PBMC):50mL円錐管に2体のPBSを含むK2-EDTAチューブに採取した新鮮な血液の希釈10mL(血液離脱後のプロセス最大2時間)。製造元の指示に従って市販のPBMC分離管を用いて血液からPBMCを分離する。ペレットを氷の上に置き、ステップ3.2に進みます。またはドライアイスでペレットを凍結し、ステップ3まで-80 °Cに保存します。
注:20~50 μLの湿細胞ペレットには、細胞サイズに応じて、1 x 107細胞が含まれています。健康なヒト血液の10 mLから得られた湿ったPBMCペレットは、体積が≥20 μLで、1 x 107 PBMCを含有し、組織または細胞ペレットを最大6ヶ月間-80 ºCで保存することができます。
2. ソリューションの準備
- 2 μM OG-881作動液を準備する:20mMバイオミニル化プローブOG-881ストック溶液の10 μLシングルユースアリコートを4°C冷蔵庫から取り出し、室温(RT)で10分間放置し、OG-881ストックソラットのシリアル希釈により2μM作業溶液を準備PBSのイオンは、フィルターチップ付きのマイクロピペットを使用し、異なる希釈ステップ間の先端を変更します。
- 10xプロテアーゼ阻害剤を調圧する:マイクロ遠心管に1mL PBSで1錠を溶解する。
- 25 nM OG-881ケモプローブを使用して、1x細胞リシスバッファーの所望の体積を調製します。各mLについて、市販の10x細胞リシスバッファー、10xプロテアーゼ阻害剤の150 μL、2 μM OG-881の12.5 μL、およびタイプ1の2倍蒸留水の737.5 μLを混合します。
- 必要に応じて、ステップ 2.3 のように OG-881 の代わりに 25 nM ORY-1001 を使用して、1x Cell lysis バッファーの所望の体積を準備します。より強力な阻害剤を使用することはできますが、100%阻害を有する陽性対照で使用するために、より高い濃度を必要とする場合があります(ステップ3.5参照)。
注:OG-881またはKDM1A阻害剤ストックソリューションを使用した溶液またはサンプルの意図しない汚染を避けるために、適切な措置を講じてください。25 nM OG-881を用いた1x細胞リシスバッファーの所望の体積を計算するには、粉砕組織の40mgあたり400 μL、または107細胞の湿ったペレット当たり200μLが必要であると仮定します。
3. 天然タンパク質抽出
- 組織から:
- 乾燥した氷の上で冷やされたモルタルと害虫で凍結した組織の≥1 cm3立方体を粉砕し、均質化します。組織粉末の≥40 mgを含む単一使用バイアルのサンプルをアリコートし、常に解凍を避ける。手順 3.1.2 に進みます。-80 °C.で即時処理または保存用。
- 25 nM OG-881を用いた1x細胞Lysisバッファーの400 μLで粉末組織の40mgを再懸濁し、10sの渦を10sにし、組織のlysisが達成され、オレンジ色の懸濁液が達成されるまで、18ゲージの鈍い注射器針を通してサンプルを少なくとも5回強制する。取得。バブル形成を避けてください。
- 手順 3.3 に進む
- 細胞ペレット(PBMCおよび細胞株)から:
- 25 nM OG-881を含む1x細胞リシスバッファーの200 μLで≥1 x 107細胞のペレットを再ステースする。サンプルを短時間渦にし、氷の上に5分間保管します。
- 45 kHzでそれぞれ20sの3パルスを使用して、超音波でサンプルを超音波処理します。パルスの間に20sの氷の上に置きます。
注:生体サンプルが1x細胞リシスバッファーで再懸濁されるとすぐに、プロセスの残りの部分の間に氷の上に保管してください。
- さらに5分間氷の上にサンプルを保管し、渦を短時間保管し、4°Cで予冷した遠心分離機で14 000 x gで10分間サンプルを遠心分離します。
- 1 mLマイクロピペットを使用して、上清を新鮮な1.5mLマイクロ遠心管に移し、2時間の間に氷の上に放置します。
- 必要に応じて、100% ターゲットエンゲージメントをシミュレートするための正のコントロールを次のように用意できます。
- 25 nM ORY-1001を有する1x細胞Lysisバッファーの必要な体積で、車両または未処理(前投与)サンプルから細胞ペレットまたは粉末組織を再中断し、ステップ3.1から3.3に概説したプロセスを行います。
- 陽性コントロールの上清を新鮮な1.5mLマイクロ遠心分離管に移し、1時間氷の上に放置し、KDM1Aを意図的に阻害し、ケモプローブ結合をブロックします。
- 陽性制御上清(40mg組織サンプルから生成された陽性制御用体積)または2μM OG-881作動溶液(10 7-cellサンプルから生成された正の制御のための体積)に2 μLの2μLの作業溶液を5μLを追加して取得します。他のサンプルと同じOG-881濃度を2時間の間に氷の上に残し、ステップ4に進みます。
4. ブラッドフォードアッセイを用いた天然タンパク質の定量
- 市販のブラッドフォードタンパク質アッセイ試薬をH2 Oタイプ1ダブル蒸留水で5回希釈します。サンプルおよび標準の総量に必要な試薬の体積を計算します(サンプルあたり1mLまたは標準+ 5 mLの過剰容積)。
- ウシ血清アルブミン(BSA)標準曲線の場合は、希釈されたブラッドフォードタンパク質アッセイ溶液(ブランク)を1mL希釈したマイクロ遠心管1本と、希釈されたブラッドフォードタンパク質アッセイ溶液の995μLを用いて7つのマイクロ遠心管を調調します。BSA規格の各5 μL(125~2,000 μg/mLの濃度)を7マイクロ遠心管のそれぞれに加え、チューブを数回ゆっくりと反転して混ぜます。RTで5分間インキュベートします。
- 希釈された標準をキュベットに移し、280 nmの分光光度計でブランクおよびウシ血清アルブミン標準サンプルのODを読み取ります。
- 生物学的試料の場合は、1mL希釈されたブラッドフォードタンパク質アッセイ溶液(ブランク)と、希釈されたブラッドフォードタンパク質アッセイ試薬の999μLを用いて多くのマイクロ遠心管を定量する必要があるサンプルとして1つのマイクロ遠心分離管を調用する。自動P2マイクロピペットを使用して、ステップ3で調製した天然タンパク質抽出物を各マイクロ遠心管に1μLを加え、チューブを数回静かに反転して混合する。RTでサンプルを5分インキュベートします。
- キュヴェットにボリュームを転送し、280 nmの分光光度計でサンプルのODを読み取ります。
- 優先的に、すぐに手順 5 に進みます。あるいは、工程5まで-80°Cで天然タンパク質抽出物を保存する。凍結解凍サイクルを避けてください。
5. トータルおよび無料KDM1A決定のための発光ELISA
注:ラボの温度を23~24 °C(RT)に保ちます。
- 捕捉KDM1A抗体またはストレプトアビジンを用いたマイクロティタープレートのコーティング
- 合計KDM1A ELISA:各プレートについて、PBSで2 μg/mLの最終濃度に対してKDM1A捕捉抗体の10 mLを調出します。プレートの各ウェルに100 μLを移します。
- フリーKDM1A ELISA:各プレートについて、PBSで10 μg/mLのストレプトアビジンを10mL調出します。プレートの各ウェルに100 μLを移します。
- 接着剤フィルムで合計およびフリーKDM1A ELISAプレートをトップシールし、冷蔵庫で4°Cで一晩プレートをインキュベートします。
- プレートの洗浄とブロック
- 冷蔵庫からプレートを取り出し、使用前にRTで約45分間平衡させます。
- プレートあたり1,000 mL洗浄バッファー(PBSでは0.1%のツイエン)と50 mLブロッキングバッファ(PBSでは1%BSA)を準備します。
- プレートを洗浄バッファーで3回洗います。この手順およびその後の手順では、残液を除去するために、すべての洗浄ステップの後にペーパータオルのプレートをタップします。
- 両方のプレートにウェルあたり200 μLのブロッキングバッファを追加し、両方のプレートを粘着フィルムでトップシールし、RTで2hをインキュベートします。
- 生物学的サンプル調製
- ステップ3の終わりに得られた天然タンパク質抽出物をPBSを用いて適切な濃度に希釈する。推奨濃度は、生体試料中のKDM1A発現のレベルの機能が変化する。適切な範囲の例は、(1)細胞ペレット:ウェル当たり0.5〜10 μgである。(2) PBMC: 5 - 30 μg/ウェル。(3)粉砕組織(脳、肺、皮膚):ウェル当たり20~100μg。準備中は氷の上にサンプルを保管してください。可能な場合は、テクニカルトリプリケートサンプル分析を実行します。
- 人間の rKDM1A を使用して標準カーブを準備します。
- KDM1A標準作業液を準備するには、25 pg/μLの最終濃度に対して適切なrKDM1Aの体積をピプレットし、2 μM OG-881の75 μLを追加し、1x PBSで1x PBSを15 mLファルコンチューブで6 mLの総容積に充てります。KDM1A標準作業液を1時間の間に氷の上に保ち、15 mLファルコンチューブを20分ごとに数回反転して穏やかに溶液を混合します。
- 表1(標準調製)に従って1.5 mLマイクロ遠心分離管でKDM1A標準希釈シリーズを準備し、2つの96ウェルマイクロチタープレートの三重分析に十分な体積で準備します。
| スタンダードシリーズ | KDM1A 標準作動ソリューション(μL) | |
| (pg KDM1A/ウェル) | PBS (μL) | |
| 2500 C-* | 800の | - |
| 2500年 | 800の | - |
| 1750年 | 560の | 240の |
| 1250年 | 400人 | 400人 |
| 750名 | 240の | 560の |
| 250名 | 80歳 | 720の |
| 25名 | 8 | 792の |
| 0 | 0 | 800の |
| メモ： | ||
| (1)各希釈の調製量は、アッセイの2枚のプレートを三切りにして走るのに十分である。 | ||
| (2) 推奨範囲は2.5~5,000pg/ウェル | ||
| *陰性対照C-、KDM1A検出抗体なし | ||
表 1: 標準準備.KDM1Aタンパク質の標準シリーズを準備するには、KDM1A標準作業溶液およびPBSの示された体積を8つの適切に標識された1.5 mLマイクロ遠心分離管にピペットする。
表 2: ディープウェルプレート設計ステップ5.4.2からの標準(青)およびサンプル(黄色)。青(標準)と黄色(サンプル)矢印の方向に従ってELISAプレートへのロードを容易にするために、ディープウェルプレートの反射位置にピペットされました。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:ELISAプレート設計アッセイプレートには、組換えKDM1Aターゲットの量が減少する標準曲線(青色)が含まれています。黄色の生物学的サンプル(S);対応する負のコントロール(サンプルを含むが、一次検出抗体を含まない)を白色で、ディープウェルプレートからELISAプレートにロードする。ブランク(標準曲線の0)には、すべての捕捉および検出試薬が含まれていますが、サンプルはありません。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
- Elisa
- (ステップ 5.2.4 から続く)インキュベーションの2時間後、ブロッキングバッファを廃棄し、洗浄バッファでプレートを洗浄します。
- 適切に希釈されたサンプル(工程5.3.から天然タンパク質抽出物および標準曲線)を、表2(ディープウェルプレート設計)に示すプレート分布に従って冷蔵された96深井戸貯蔵ブロックに移します。
- 表3(ELISAプレート設計)に示すプレート分布に続く合計およびフリーELISAプレートで100μLサンプル/ウェルをピペッティングするまで、このブロックを氷の上に保管してください。
- RTで1時間インキュベートし、サンプルを廃棄し、洗浄バッファーでプレートを5回洗浄します。
- ブロッキングバッファー内の0.125 μg/mLでウサギの抗KDM1A検出抗体の20 mLを調製し、負の対照C-に対応するウェルを除き、アッセイの各プレートにウェル当たり100μLを添加する。プレートをトップシールし、RTで1時間インキュベートします。
- 検出抗体溶液を廃棄し、洗浄バッファーでプレートを6回洗浄します。
- ブロッキングバッファーで希釈1:5,000に二次ヤギ抗ウサギ抗体HRPの25 mLを調製し、マイクロチタプレートにウェル当たり100μLを添加する。RT で 1 時間インキュベートします。
-
化学発光検出
- ステップ 5.4.7 の終了前に 30 分。柔らかい光条件下で、ルミノールエンハンサーと過酸化物溶液(10.5 mL:10.5 mL、2プレート用)をオレンジボトルに混ぜ、RTに残します。
注:オレンジ色のボトルにルミノール作業溶液を保持し、任意の強烈な光への長時間の暴露を避けます。典型的な実験室の照明への短期的な露出は働く解決に害を与えない。 - 発光を測定する前に少なくとも20分、25°Cでマイクロプレートリーダーのスイッチを入れ、1,000ミリ秒の積分時間と150ミリ秒の決済時間に読み出しを設定します。パラメータ設定では、計測器の機能の最適化が必要な場合があります。
- ステップ5.4.7.でインキュベーションの1時間後、二次抗体溶液を廃棄し、洗浄バッファーでプレートを6回洗浄します。
- ステップ5.5.1で調製したルミノール加工液(化学発光基板)のウェルあたりのピペット100μL。非常にゆっくりとピペットとバブル形成を避ける。タイマーを使用して、溶液の添加とプレートの発光測定の間の時間を制御し、良好なインターアッセイ再現性を達成するために、この時間を一定に保ちます。
- プレートと遠心分離機をプレート遠心分離機で45秒のRTで500 x gにトップシールし、残りの気泡を除去します。プレートシェーカーを100rpmで1分間インキュベートします。
- プレートをリーダーの中に差し込み、3分間放置して25°C(粘着フィルムなし)で温度を安定させます。常に無料のELISAプレートから始めます。
- 各ELISAプレートアッセイの相対発光単位(RLU)を読み取ります(自由および合計KDM1A)。
- Raw RLU 値を保存して、結果をさらに分析するために、Raw Data excel ファイルからコピーします。
- ステップ 5.4.7 の終了前に 30 分。柔らかい光条件下で、ルミノールエンハンサーと過酸化物溶液(10.5 mL:10.5 mL、2プレート用)をオレンジボトルに混ぜ、RTに残します。
6. ターゲットエンゲージメントの計算
- スプレッドシート ソフトウェアで、以下に詳しく説明するように、テクニカル レプリケート Raw データからサンプル SXおよび参照サンプル REF (未処理、車両または事前線量サンプル) の RLU Free および RLU 合計値を計算します。
- ブランク、標準曲線、負のコントロール C サンプルと生物学的サンプル(SXおよび REF)から、個々の Raw RLUi 合計および未加工 RLUi フリー データを分析データシート (Excel など) に入力します。また、データシートに標準曲線から KDM1A の金額 (pg) を入力します。
- 各テクニカルレプリケートデータポイントの個々の生合計および未自由RLUiデータから、生平均RLU、標準偏差σRLU、および変動CVRLU係数を計算します。
- 外れ値の除去(例えば三量体の場合):技術的な三量体データポイントから個々のRaw RLU合計およびRaw RLUフリーデータポイントRLUiに適用し、トリプル> 0.15のCVの場合にGrubbs基準を適用し、単一の疑わしいRaw RLU値を拒否します。いつ
,
ここで、N = 3 および 90% 信頼区間 (CI) の場合、Z = 1.148 です。 - 外れ値除去が適用された場合は、各データポイントの非不転(nr)Raw RLUi合計および未 RLUi フリー値から、Raw 平均 RLU、標準偏差 σRLUおよび CVRLUを再計算します。
- 背景補正を適用する:各標準サンプルの平均RLU Free値とRLU合計値を計算し、各サンプルSXと参照サンプルREFを次のように計算します。
- データを次のようにグラフィカルに表します。
- RLUフリー値と RLU合計値(Y 軸)を棒グラフのサンプル識別(X 軸)に対して相対的にプロットします。
- また、自由および合計測定のためのrKDM1Aタンパク質(X軸)のpg量に対する散布図内の規格のRLU値(Y軸)をプロットし、対応する線形の近似曲線を計算し、r2(線形の二乗)相関係数)値。
- ターゲット エンゲージメント (TE) を計算します。すなわち、参照サンプルREF(未処理、車両または用量前試料)に対する各サンプルSXにおけるKDM1A阻害剤によって結合されたKDM1Aの割合は、以下の通りです。
- SX サンプルと REF サンプルの平均 RLU 自由値と合計値の比率 R を次のように計算します。
- 次に、サンプル SXのターゲット エンゲージメント (TE) を次のように計算します。
オプション: (1) N生物学的反復実験が行われた場合、それぞれn技術反復を行う。まず、テクニカル レプリケート セットの TESXを計算します。続いて、生物学的反復セットの平均TE、SDおよびCV値を計算する。
- SX サンプルと REF サンプルの平均 RLU 自由値と合計値の比率 R を次のように計算します。
- アッセイ受け入れ基準が満たされているかどうかを修正する: (1) アッセイの背景が許容可能であり、平均ブランク < 0.05 x 107 RLU を確認します。(2)サンプルの自動発光が存在せず、負のコントロールCのLLUが定量の下限を下回っている(LLOQ = 平均ブランク+ 10x SD)。(3) rKDM1A 標準曲線は線形で r2 ≥ 0.98;(4)生体試料は、LLOQと2,500 pg/wellの間のアッセイの動的および線形範囲に該当するRLU値を持っています。
注: 手順 6.1.6.4に。微積分データシートで容易に自動化できます。 - TE データをオープン ソースまたは市販の統計ソフトウェアにエクスポートして、TE 値のグラフィカルな表現と追加の統計評価を行います。
,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
合計および自由KDM1A決定の直線性。
標準シリーズは、ステップ5.3.2.で説明したように、全長ヒト組換えKDM1A酵素の0〜2500 pgを用いて調製された。合計および自由rKDM1AのRLU値を評価し、直線性を検証した(図2Aおよび2B)。 データは、3つの技術的反復(n)±SDを用いる3つの実験からの平均として表される。3人の独立したボランティアの血液からヒトPBMCで検出された合計および自由KDM1AのRLU値は、図2Cおよび2Dの標準曲線上に重ね合わされる。血液サンプルは、スペインの法律(レアル・デクレト・デ・バイオバンコス1716/2011)と地元の倫理委員会の承認に従って、インスティトゥート・デ・インスティトゥート・デ・ディオメディカ・サン・パウ・バイオバンクから入手されました。
図 2.健康なボランティアのPBMCにおける合計および無料rKDM1Aの決定ELISA(A)によって評価された総rKDM1AのRLU値および化学プローブ捕捉ELISA(B)によって評価された自由rKDM1Aの。データは3回の反復実験から得られ、それぞれが三元体で分析された(N=3;n=3)。ELISA(C)によって評価された合計KDM1AのRLU値と、標準曲線上に重ね合わされた3つの独立した未処理ボランティア(赤、青、緑の正方形)のPBMCに対する無料KDM1A(D)の値。データは、三元体で分析された1つの実験から得られた(N=1;n=3)。表される値は±SDの平均値です。
細胞におけるKDM1A標的関与の解析
AML細胞は、プロバイダの推奨事項に従って培養した。細胞を異なる濃度で車両またはORY-1001で処理した(0.25; 0.5; 1; 5および25nM)(図3)。天然タンパク質抽出物は、25nM OG-881ケモプローブの存在下で得られた。0.5 μgの全タンパク質を用い、前述したように標的関与解析を行った。合計及び自由KDM1Aを決定し、記載されているように車両に対するORY-1001対KDM1Aの目標エンゲージメントの割合を算出した。
図 3.ヒトAML細胞株におけるKDM1A標的関与の用量応答細胞を異なる濃度(0.25;0.5;1;5および25nM)で車両またはORY-1001で処理し、記載されたターゲットエンゲージメントの決定に使用した。データは3回の反復実験から得られ、それぞれが三元体で分析された(N=3、n=3)。表される値は±SDの平均値です。
インビボKDM1Aターゲットエンゲージメントの分析
この実験の目的は、異なるラット組織におけるORY-1001の標的関与を、用量レベルの機能で特徴付けることを目的とした。この目標を達成するために、15匹のスプラーグ・ドーリーラット(200-250g)を細胞増止セキュリティルームに収容し、試験化合物による潜在的な汚染を避けた。最大3匹のラット/ケージを5つの研究グループにランダムに割り当てた。5つの異なる研究グループは、それぞれ、車両を受け取りました。1;3;ORY-1001の10または30 μg/kgを4日間連続して経口投与した。複合ストックソリューションを毎日調製した。動物は、必要な体積を調整するために、各投与前に計量した。すべての動物は、一定の室温(20 - 24 ºC)と相対湿度(45 - 65%)で収容されました12時間の明暗サイクルの下で(6:00 AMに点灯)。食べ物と水は、アドリビタムを利用できました.血液サンプルは、K2 EDTAチューブおよびPBMCにおける最後の投与後2時間、ステップ1.2.2で前述の手順に従って単離した。ネイティブタンパク質抽出まで-80°Cで保存します。肺試料も最後の薬物投与後2時間に採取し、液体窒素中で直ちに凍結し、-80°Cで保存した。研究は、PRAAL-PCBの動物実験倫理委員会によって設立された実験動物のケアと使用に関する制度ガイドライン(欧州共同体評議会指令86/609/EEC)に従って行われました。
粉砕後、肺からの天然タンパク質抽出物を記載し、定量した。プールされたPBMCからの総タンパク質の5 μgまたは3匹の動物からの肺からの総タンパク質の7.5 μgを用量群当たりに使用し、KDM1A標的性アッセイを実行した。
PBMCおよびORY-1001を用いるラットの経口ガベージにおけるKDM1A標的関与の用量応答を、車両群に対して計算した図4Aおよび4Bに示す。図4Cに見ることができるように、車両処理動物からの肺タンパク質抽出物の25 nM ORY-1001を用いたex vivoインキュベーションは、まだ完全なTEを生み出しますが、30 μg/kg ORY-1001で4日間処理されたラットからのサンプルのTEをさらに増加させません。、KDM1Aが生体内で既に完全に阻害されたことを確認した。
図 4.インビボと ex vivo ネイティブ KDM1A ターゲット エンゲージメント。ORY-1001で4日連続して処理したラットからのPBMC(A)および肺試料(B)におけるKDM1A標的関与の用量応答(p.o)。データは、コホート当たり3匹の動物からプールされたPBMC抽出物から得られ、複製(N=1、n=2)またはコホート当たり3個の個々の動物からの肺から分析され、三元体で分析された(N=3、n=3)。C. 車両で処理したラットのプールされた肺タンパク質抽出物(左)または30 μg/kg ORY-1001のTEの比較;1時間後に抽出物のインキュベーション(灰色のバー)または25nM ORY-1001(青いバー)を使用した後(N=3、n=3)。すべてのデータは、平均±SDとして表されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで提示されたプロトコルは、新しいKDM1Aケモプローブ捕捉ベースのELISAを用いてKDM1Aターゲットエンゲージメントを直接測定するために開発された。この方法は、ヒト、ラット、マウスおよびヒヒ(PBMC、肺、脳、皮膚、腫瘍を含む)からの培養ヒト細胞株およびex vivoサンプルで検証されたが、KDM1A抗体標的エピトープおよび触媒を有する他の種に容易に適用することができる。中央は保存されます。OG-881は活性ベースの化学プローブであり、サンプルの品質は重要であり、特にプロトコルの初期段階でサンプルの適切な操作と保存を追求し、KDM1A活性が確実に保存されるようにする必要があります。
現在の実験プロトコルは、共生FADターゲティング阻害剤によるKDM1A標的関与を分析するために最適化された。また、KDM1AのFAD共因子へのアクセスをブロックする可逆阻害剤と共に使用することもできます。長い滞留時間を持つ強力な可逆的阻害剤は、未改変プロトコルを採用してもよい。
OG-881ケモプローブは、高いオフレートの低効力リバーシブル阻害剤には適さない場合があります。この原稿で使用される特定の化学プローブは細胞浸透剤ではないため、分析は、lysedサンプル上でex vivoを行う。
この方法は、研究および分析ラボで広く利用可能な機器で実行できます。遺伝子改変を細胞に導入する必要がならず、異なるサンプルタイプに簡単に適用できます。もう一つの利点は、概念実証研究および毒物学モデルで頻繁に使用される異なる種由来のサンプルに使用でき、臨床サンプルを分析するために正常に翻訳されたことです。
KDM1A ターゲットエンゲージメントの分析には、他の方法が使用されています。これらのメソッドの多くは、AlphaLisa 15 を使用して H3K4me2 ヒストンマークの変更のようなプロキシ マーカーを使用します。またはqRT-PCRまたはFACS分析16を用いて発現マーカーの誘導。しかし、細胞や組織では、ヒストンマークは複数の因子によって制御され、ヒストンマークの変化を測定するアッセイは、常に分析のための良好な動的範囲を提供するとは限りません。KDM1A阻害は、遺伝子およびタンパク質発現の強力な変化を誘発し得るが、応答は非常に不均一で細胞的なコンテキスト依存する傾向があり、これは用量応答3、7の分析を複雑にし得る。
したがって、ターゲットの職業を直接評価することは、ターゲットエンゲージメントを測定するための最良の選択肢です。このために提案されているアッセイの1つは、阻害剤の結合時の標的タンパク質の熱安定性の増加に基づく細胞熱シフトアッセイ(CETSA)である。この方法は、原理的には、未修飾細胞および異なる組織型に適用され、最近培養細胞17におけるKDM1A阻害剤の細胞活性を評価するために用いられている。しかし、この技術は、生体内薬力学研究18でほとんど使用されておらず、我々の知る限界に、その使用は臨床試験で報告されていません。
ここで提供されるプロトコルは、細胞および組織サンプルにおけるKDM1A標的関与を決定するために使用された完全に検証された化学プローブベースの方法を説明する。この方法は、KDM1A阻害剤19で治療されたヒト被験者のサンプルを分析することに成功しており、臨床試験におけるPK/PD応答のモデル化に大いに利用される。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者タマラ・メイスはエグゼクティブ・ディレクターであり株主であり、著者のクリスティーナ・マスカロとラクエル・ルイス・ロドリゲスは、オリゾン・ゲノミクスS.A.オリゾン・ゲノミクスS.A.の従業員であり、KDM1A阻害剤を開発し、使用される化合物および方法をカバーする特許を保有しています。この記事で。
Acknowledgments
本研究はオリゾンゲノミクスが出資した。S.A.、ホフマン・ラ・ロシュ、CIIP-20152001およびRETOSコラボレーションプログラムRTC-2015-3332-1によって部分的にサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X Protease Inhibitor Tablets | Roche | #11836153001 | |
| 96 deep well storage block | VWR | #734-1679 | |
| 96 well ELISA plates | Nunc | #436110 | |
| Adhesive black Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Adhesive transparent Film | VWR | #60941-062 | |
| Biotinylated KDM1A probe OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | # 3117057001 | |
| Bovine Serum Albumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| Cell lysis buffer 10X | Cell Signaling | #9803 | |
| Centrifuge for 96- well plates | Hettich | Rotina 420R | |
| Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
| Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Microplate reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
| Needle G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| PBMC separation tubes 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| PBMC separation tubes 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Plate shaker | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
| Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
| Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| Spectrophotometer cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Spectrophotometer for cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| Syringe | BD | #303172 | |
| Type 1 ultrapure water | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | USC200T |
References
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T. ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia. Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).
- Sugino, N. A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers. Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).
- Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms. Blood. 126, 601 (2015).
- Jutzi, J. S., et al. LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone. HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).
- Mohammad, H. P. DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC. Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).
- Rivers, A., et al. RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases γ-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model. Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).
- Rivers, A. Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons. Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).
- Buesa, C., et al. The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation. Alzheimer’s & Dementia. 11 (7), P905 (2015).
- Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1. Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).
- Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. Human histone demethylase LSD1 reads the histone code. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).
- Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor. Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. , WO2017158136 (2016).
- Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors. Journal of Biological Chemistry. , In Press (2019).
- Rodriguez-Suarez, R. Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).
- Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1. Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).
- Schulz-Fincke, J. Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation. European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).
- Ishii, T., et al. CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens. Scientific Report. 7, 13000 (2017).
- Maes, T. ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders. Alzheimer’s & Dementia. 12 (7), P1192 (2017).
