Summary
Her presenterer vi en protokoll for å måle KDM1A mål engasjement i et menneske eller dyr celle, vev eller blodprøver behandlet med KDM1A-hemmere. Protokollen sysselsetter chemoprobe merking av det frie KDM1A-enzymet og direkte kvantifisering av mål okkupasjonen ved hjelp av chemoprobe-baserte immunanalyser og kan brukes i prekliniske og kliniske studier.
Abstract
Vurderingen av målet engasjement, definert som samspillet av et medikament med proteinet den ble utformet for, er et grunnleggende krav for tolkningen av biologisk aktivitet av enhver forbindelse i narkotika utvikling eller i grunnleggende forskningsprosjekter. I epigenetikk, mål engasjement er oftest vurdert av analysen av proxy markører i stedet for å måle foreningen av sammensatte til målet. Nedstrøms biologiske readouts som har blitt analysert inkluderer histone merke modulering eller genuttrykk endringer. KDM1A er en lysin-demethylase som fjerner metyl-grupper fra mono-og dimethylated H3K4, en modifikasjon knyttet til deaktivering av genuttrykk. Modulering av proxy markører er avhengig av celle type og funksjon av genetisk make-up av cellene undersøkt, som kan gjøre tolkning og kryss-saken sammenligning ganske vanskelig. For å omgå disse problemene, presenteres en allsidig protokoll for å vurdere dose effekter og dynamikk av direkte KDM1A mål engasjement. Analysen beskrevet gjør bruk av en KDM1A chemoprobe å fange og kvantifisere uhemmet enzym, kan grovt brukes på celler eller vevsprøver uten behov for genetisk modifisering, har et utmerket vindu for deteksjon, og kan brukes både for grunnleggende forskning analyse av kliniske prøver.
Introduction
Lysin spesifikke demethylase 1 (KDM1A)1 er en demethylase involvert i kontroll av genet transkripsjon. Dette proteinet har dukket opp som en kandidat farmakologisk mål2 i onkologi; inkludert akutt myelogen leukemi3 (AML), myelodysplasi syndrom (MDS)4, myelofibrose (MF)5,6, liten celle lungekreft (SCLC)7; i sigdcellesykdom (SCD)8,9, og i sentrale nervesystemet sykdommer inkludert Alzheimers sykdom (AD), multippel sklerose (MS); og i aggresjon10.
Mesteparten av KDM1A hemme forbindelser i klinisk utvikling er cyclopropylamine derivater og hemme proteinet ved kovalente binding til sin Flavin adenine dinucleotide (FAD) kofaktor11. Hemming av KDM1A induserer genuttrykk endringer, men disse endringene varierer enormt på tvers av vev, celletyper, eller sykdomstilfeller. Hemming av KDM1A også endringer histone merker12, men disse endringene er vanligvis produsert lokalt på et bestemt sted i Genova, og er igjen, svært vev og celle spesifikke.
Protokollen ble utviklet for å direkte måle KDM1A mål engasjement i biologiske prøver og har blitt optimalisert for bruk med cyclopropylamine avledet hemmere. Analysen er basert på ELISA teknologi og analyser, parallelt, total og gratis (dvs. ubundet av inhibitor) KDM1A i en innfødt protein ekstrakt fra en biologisk prøve i en solid fase analysen. Som et første skritt er den biologiske prøven lysert i nærvær av biotinylated KDM1A selektive chemoprobe og-88113,14, avledet fra den selektive KDM1A inhibitor ORY-1001 (iadademstat), en potent hemmer av KDM1A i klinisk utvikling for behandling av onkologiske sykdom. Den chemoprobe har en IC50 for KDM1A av 120 nM og inkluderer en kjepphest bindende moiety knyttet til en biotinylated polyetylen GLYKOL (PEG)-tail. Chemoprobe binder utelukkende til den frie KDM1A, men ikke til den hemmer-bundne KDM1A i prøven. Etter den chemoprobe bindingen blir KDM1A som inneholder komplekser i prøven fanget opp på mikrotiterbrønnene plater med streptavidin belagt overflate for å bestemme fri KDM1A, eller på plater belagt med et monoklonale anti-KDM1A fangst antistoff for å fastslå total KDM1A. Etter vask er begge platene inkubert med et anti-KDM1A deteksjon antistoff, vasket igjen, og inkubert med et sekundært HRP-bøyd esel anti-kanin IgG antistoff for påvisning ved hjelp av et selvlysende substrat og kvantifisering ved å måle relative lys enheter (RLU) i en luminometeret (figur 1).
Figur 1. Skjema av ELISA enzym knyttet chemoprobe immunoabsorbent analysen for KDM1A Target engasjement: A) fastsettelse av total KDM1A bruker sandwich Elisa og B) fastsettelse av gratis KDM1A bruker CHEMOPROBE Elisa. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
En standard kurve er inkludert i begge ELISA-platene for å verifisere linearitet til hver analyse. Fastsettelse av KDM1A mål engasjement i hver prøve blir deretter beregnet som en relativ verdi til pre-dose eller kjøretøy behandlet prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blodprøvene ble innhentet fra Instituto de Investigación Biomédica Sant Pau biobank i henhold til spansk lovgivning (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) og godkjennelse av lokale etikk komiteer. Studier med animalsk vev ble utført i samsvar med de institusjonelle retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr (det europeiske fellesskap rådsdirektiv 86/609/EØF) etablert av etisk komité for dyre eksperimentering ved PRAAL-PCB.
1. utarbeidelse av biologiske prøver for analysen.
FORSIKTIG: denne protokollen innebærer manipulering av biologiske prøver som kan utsettes for Occupational Safety and Health Administration (OSHA)-standarden for blodforgiftning (29 CFR 1910,1030), direktiv 2000/54/EC fra Europaparlamentet og Rådet for 18 september 2000 eller tilsvarende regelverk. I tillegg kan de biologiske prøvene inneholde spor av biologisk aktive Investigational kjemiske forbindelser og protokollen kan innebære ytterligere manipulering av slike forbindelser. Gjennomgå sikkerhetsdatabladet (SDS) av forbindelsene som ble brukt før forsøket startet, og overhold nøye alle gjeldende sikkerhetstiltak som er etablert i forskningssenteret, inkludert bruk av tilstrekkelig personlig verneutstyr (PPE). Bruk egnede verneklær og riktig skjerming i løpet av eksperimentet. Kast rester i egnede Avfallsbeholdere (biologisk/cytotoksisk avfall).
Merk: denne protokollen starter med celler eller prøver av behandlet med en KDM1A inhibitor og deres ubehandlede eller kjøretøy/placebo behandlet kontroller3.
- Celler behandlet med kjøretøy eller KDM1A inhibitor in vitro
- For cellene som dyrkes i suspensjon, som 10 mL kulturer, overføre suspensjoner til rene 15 mL koniske rør og Fortsett til 1.1.3.
- For de tilhenger cellene (dyrket i 75 cm2 flasker), fjerner du mediet fra flasken og vasker kort ved hjelp av 4 ml PBS. Løsne cellene fra fartøyene sine med 1,5 mL 0,5% Trypsin-EDTA i løpet av 2-5 min (trypsinization forhold kan variere, følg leverandør anbefalingene for cellelinjen), tilsett 4 mL PBS og Overfør cellene til rene 15 mL koniske rør.
- Sett rørene i en benk topp sentrifuge og samle cellene ved sentrifugering i 5 min ved 400 x g ved 4 ° c. Fjern supernatanten, resuspend pellet i 1 mL PBS utlevert ved hjelp av en micropipette og Overfør suspensjonen til et 1,5 mL mikrosentrifugen rør.
- Sett prøvene i en microtube sentrifuge og sentrifuger dem i 5 min ved 400 x g ved 4 ° c. Fjern PBS ved aspirasjon med en micropipette og enten holde pellets på isen og gå videre til trinn 2; eller fryse pellets på tørr is og oppbevar dem ved-80 ° c til trinn 3.
- Prøver fra forsøkspersoner eller dyr behandlet med kjøretøy/placebo eller KDM1A-hemmer
- Vev: Skjær vevet i små, ≈ 1 cm3 stk ved hjelp av en skalpell. Frys vevs bitene i flytende N2 i en Dewar beholder og oppbevar dem ved-80 ° c til trinn 3.
- Polymorfe blod mononukleære celler (Pbmc): fortynne 10 mL friskt blod (prosess maksimalt 2 timer etter blod uttak) samlet i K2-EDTA rør med 2 VOLUMER av PBS i et 50 ml konisk rør. Isoler Pbmc fra blod ved hjelp av kommersielt oppnådde PBMC separasjon rør i henhold til produsentens anvisninger. Hold pellets på isen og gå videre til trinn 3,2; eller fryse pellets på tørr is og oppbevar dem ved-80 ° c til trinn 3.
Merk: en våt celle pellet på 20 til 50 μL inneholder ≈ 1 x 107 celler, avhengig av cellestørrelsen. En våt PBMC-pellet fremstilt fra 10 mL sunt humant blod har et volum på ≈ 20 μL og inneholder ≈ 1 x 107 Pbmc. vev eller celle pellets kan oppbevares ved-80 º c i opptil 6 måneder.
2. forberedelse av løsningen
- Forbered 2 μM OG-881 arbeids løsning: ta en 10 μL en gangs alikvot av 20 mM biotinylated sonde OG-881 lagerløsning av 4 ° c kjøleskapet og la det ligge ved romtemperatur (RT) i 10 min. klargjør arbeids løsningen på 2 μM ved seriell fortynning av OG-881 lager Solut i PBS, ved hjelp av en micropipette med filter tips og endre spissen mellom de ulike fortynning trinnene.
- Klargjør 10x protease-inhibitor: løs opp 1 tablett i 1 mL PBS i et mikrosentrifugen rør.
- Klargjør ønsket volum av 1x cellelyse Rings buffer med 25 nM OG-881 chemoprobe. For hver mL, bland 100 μL kommersielt innhentet 10x cellelyse Rings buffer, 150 μL av 10x protease inhibitor, 12,5 μL av 2 μM OG-881, og 737,5 μL av type 1 dobbelt destillert vann.
- Du kan også tilberede ønsket volum av 1x Cell lyseringsbuffer, men med 25 nM ORY-1001 i stedet for OG-881 som i trinn 2,3. Mindre potente hemmere kan brukes, men kan kreve høyere konsentrasjoner, for bruk i positiv kontroll med 100% hemming (se trinn 3,5).
Merk: ta nødvendige forholdsregler for å unngå utilsiktet kontaminering av løsninger eller prøver med løsningene OG-881 eller KDM1A-hemmere. For å beregne ønsket volum av 1x cellelyse Rings buffer med 25 nM OG-881, anta at 400 μL kreves per 40 mg pulverisert vev, eller 200 μL per våt pellet på 107 celler.
3. native protein utvinning
- Fra vev:
- Homogenisere en ≈ 1 cm3 kube av frosset vev med en mørtel og morter kjølt på tørr is. Alikvot prøvene i en gangs hetteglass som inneholder ≈ 40 mg vev pulver, unngå å tine hele tiden. Fortsett til trinn 3.1.2. for umiddelbar behandling eller lagre ved-80 ° c.
- Resuspend 40 mg pulverisert vev i 400 μL av 1x Cell lyseringsbuffer med 25 nM OG-881, Vortex for 10 s, og tvinge prøven minst fem ganger gjennom en 18-gauge stump sprøyte nål før lyse av vevet er oppnådd og en grumsete lys gul til oransje suspensjon er Innhentet. Unngå boble dannelse.
- Fortsett til trinn 3,3
- Fra celle pellets (Pbmc og cellelinjer):
- Resuspend en pellet av ≈ 1 x 107 celler i 200 μL av 1x cellelyse Rings buffer som inneholder 25 nM OG-881. Vortex prøvene kort og holde dem på isen i 5 min.
- Sonikere prøvene i en sonicator med 3 pulser på 20 s hver på 45 kHz; plassere dem på isen for 20 s mellom pulser.
Merk: så snart de biologiske prøvene er resuspendert i 1x cellelyse Rings buffer, hold dem på isen under resten av prosessen.
- Hold prøvene på isen i ytterligere 5 min, Vortex kort og sentrifuger prøvene i 10 min ved 14 000 x g i en pre-avkjølt sentrifuge ved 4 ° c.
- Bruk en 1 mL micropipette, Overfør supernatanter til fersk 1,5 mL mikrosentrifugen rør og la dem på isen under 2 timer. Fortsett til trinn 4.
- Hvis du vil, kan en positiv kontroll for å simulere 100% mål engasjement være forberedt som følger:
- Resuspend celle pellet eller pulverisert vev fra et kjøretøy eller ubehandlet (inkludert) prøve i det nødvendige volumet av 1x Cell lyse buffer med 25 nM ORY-1001 og prosess som beskrevet i trinn 3,1 til 3,3.
- Overfør supernatanter til den positive kontrollen til fersk 1,5 mL mikrosentrifugen rør og la dem på isen for 1 h. ORY-1001 forsettlig hemme KDM1A og blokkere chemoprobe binding.
- Tilsett 5 μL av 2 μM OG-881 arbeids løsning på den positive kontroll supernatanten (volum for positiv kontroll generert fra en 40 mg Vevsprøve) eller 2,5 μL av 2 μM OG-881 arbeids løsning (volum for positiv kontroll generert fra et 107-cellers utvalg) for å få samme og-881 konsentrasjon som de andre prøvene og la på isen i løpet av 2 h. Fortsett til trinn 4.
4. kvantifisering av innfødte protein bruker Bradford analysen
- Fortynne den kommersielt produserte Bradford protein analysen reagens 5 ganger med H2O type 1 dobbelt destillert vann. Beregn volumet av reagens som kreves for den totale mengden av prøver og standarder (1 mL per prøve eller standard + 5 mL overflødig volum).
- For storfe serum albumin (BSA) standard kurve, utarbeide en mikrosentrifugen rør med 1 mL fortynnet Bradford protein analysen løsning (blank) og syv mikrosentrifugen rør med 995 μL av fortynnet Bradford protein analysen løsning. Tilsett 5 μL av hver av BSA-standardene (konsentrasjon fra 125 til 2 000 μg/mL) til hver av de 7 mikrosentrifugen rørene og bland dem ved å forsiktig invertere rørene flere ganger. Ruge i 5 minutter ved RT.
- Overfør den Fortynnede standarder for å kyvetter og lese OD av blank og storfe serum albumin standard prøvene i en spektrofotometer på 280 NM.
- For biologiske prøver, utarbeide en mikrosentrifugen rør med 1 mL fortynnet Bradford Proteinanalyse løsning (blank) og så mange mikrosentrifugen rør med 999 μL av fortynnet Bradford protein analyse reagens som prøver som må kvantifisert. Ved hjelp av en automatisk P2-micropipette, tilsett 1 μL av Native protein ekstrakt fremstilt i trinn 3 til hvert mikrosentrifugen rør og bland ved å forsiktig invertere rørene flere ganger. Ruge prøvene 5 min ved RT.
- Overfør volumene til kyvetter og Les OD av prøvene i en spektrofotometer ved 280 NM.
- Fortrinnsvis, gå umiddelbart til trinn 5. Alternativt kan du oppbevare de innfødte protein utdragene ved-80 ° c til trinn 5. Unngå fryse tine sykluser.
5. Selvlysende ELISAs for total og gratis KDM1A bestemmelse
Merk: Hold laboratorie temperaturen konstant ved 23-24 ° c (RT).
- Coating av mikrotiterbrønnene plater med fangst KDM1A antistoff eller Streptavidin
- Total KDM1A ELISA: for hver tallerken, klargjør 10 mL KDM1A fangst antistoff til en endelig konsentrasjon på 2 μg/mL i PBS. Overfør 100 til hver brønn på platen.
- Gratis KDM1A ELISA: for hver tallerken, klargjør 10 mL streptavidin ved 10 μg/mL i PBS. Overfør 100 til hver brønn på platen.
- Topp-forsegle totalt og gratis KDM1A ELISA plater med selvklebende film og ruge platene over natten ved 4 ° c i kjøleskapet.
- Vask og blokkering av platene
- Ta platene ut av kjøleskapet og la dem likevekt for rundt 45 min ved RT før bruk.
- Klargjør 1 000 mL vaskebuffer (0,1% mellom i PBS) og 50 mL blokkerings buffer (1% BSA i PBS) per plate.
- Vask platene 3 ganger med vaskebuffer. I denne og etterfølgende trinn trykker du på platen på papirhåndklær etter hvert vasketrinn for å fjerne rester av oppløsningen.
- Tilsett 200 μL blokkerings buffer per brønn til begge platene, topp-forsegle begge platene med en selvklebende film og ruge 2 h på RT.
- Biologisk prøveklargjøring
- Fortynne de innfødte protein ekstrakter innhentet på slutten av trinn 3 til riktig konsentrasjon ved hjelp av PBS. Den anbefalte konsentrasjonen vil variere i funksjon av nivået på KDM1A uttrykk i den biologiske prøven. Eksempler på passende områder er (1) celle pellets: 0,5-10 μg per brønn. (2) Pbmc: 5-30 μg per brønn. (3) pulverisert vev (hjerne, lunge, hud): 20-100 μg per brønn. Oppbevar prøvene på isen under forberedelsen. Kjør tekniske tre eksemplarer prøve analyser når det er mulig.
- Klargjør en standard kurve ved hjelp av humant rKDM1A:
- For å klargjøre KDM1A standard arbeids løsning, Pipet det aktuelle volumet av rKDM1A for en endelig konsentrasjon på 25 PG/μL, tilsett 75 μL av 2 μM OG-881, og komplett med 1 x PBS til et total volum på 6 mL i en 15 mL Falk tube. Oppbevar KDM1A standard arbeids løsning på is under 1 time og bland løsningen forsiktig ved å invertere 15 mL Falk røret flere ganger hver 20 min.
- Klargjør KDM1A standard Fortynnings serie i 1,5 mL mikrosentrifugen rør i henhold til tabell 1 (standard forberedelse), i volum nok til tre eksemplarer analyse av 2 96 brønn mikrotiterbrønnene plater.
| STANDARD-SERIEN | KDM1A standard arbeids løsning (μL) | |
| (PG KDM1A/brønn) | PBS (μL) | |
| 2500 for C-* | 800 | - |
| 2500 | 800 | - |
| 1750 | 560 | 240 |
| 1250 | 400 | 400 |
| 750 | 240 | 560 |
| 250 | 80 | 720 |
| 25 | 8 | 792 |
| 0 | 0 | 800 |
| Merk: | ||
| (1) volumet utarbeidet av hver fortynning er nok til å kjøre i tre eksemplarer 2 plater av analysen. | ||
| (2) det anbefalte området er mellom 2,5 og 5 000 PG/brønn | ||
| * For negativ kontroll C-, uten KDM1A deteksjon antistoff | ||
Tabell 1: standard forberedelse. For å forberede standard Series of KDM1A protein, pipette de indikerte volumene av KDM1A standard arbeids løsning og PBS i åtte riktig merket 1,5 mL mikrosentrifugen rør.
Tabell 2: dyp brønn plate design. Standarder (blå) og prøver (gul) fra trinn 5.4.2. ble Pipet tert inn i reflekterte posisjoner av Deep Well plate for å lette lasting i ELISA platene etter retning av den blå (standard) og gule (prøver) piler. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tabell 3: Elisa plate design. Analysen plate inkluderer standard kurve med synkende mengder av rekombinant KDM1A mål (i blått); biologiske prøvene (S) i gult; og tilsvarende negative kontroller (inneholder prøvene, men ikke det primære deteksjons antistoff) i hvitt, som skal legges på ELISA-platene fra Deep Well-platen. Den tomme (0 i standard kurve) inneholder alle reagenser for fangst og oppdaging, men ingen prøve. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
- Elisa
- (Fortsatt fra trinn 5.2.4.) Etter 2 h av inkubasjons, kast blokkerings bufferen og vask platene med vaskebuffer.
- Overfør de passende fortynnede prøvene (innfødte protein ekstrakter og standard kurve fra trinn 5,3.) til en nedkjølt 96 dyp brønn lagrings blokk etter plate distribusjonen som er vist i tabell 2 (dyp brønn plate design).
- Oppbevar denne blokken på isen til pipettering 100 μL prøve/brønn i total og Free ELISA platene etter plate distribusjon vist i tabell 3 (Elisa plate design).
- Ruge for 1 h ved RT, kast prøvene og vask platene 5 ganger med vaskebuffer.
- Forbered 20 mL kanin anti-KDM1A deteksjon antistoff ved 0,125 μg/mL i blokkerings buffer, tilsett 100 μL per brønn i hver plate av analysen, unntatt i brønner som tilsvarer de negative kontrollene C-. Topp-forsegle platen og ruge 1 time ved RT.
- Kast gjenkjennings antistoff oppløsningen og vask platene 6 ganger med vaskebuffer.
- Forbered 25 mL sekundær geit anti-kanin antistoff HRP til en fortynning 1:5000 i blokkerende buffer, tilsett 100 μL per brønn til mikrotiterbrønnene platene; og ruge 1 h ved RT.
-
Chemiluminiscerende deteksjon
- 30 minutter før slutten av trinn 5.4.7. og under myke lysforhold, bland like deler av Luminol-Enhancer og peroxide Solution (10,5 mL: 10,5 mL, for 2 plater) i en gul flaske og la den på RT.
Merk: Hold Luminol arbeids løsning i en gul flaske og unngå langvarig eksponering for intense lys. Kortsiktig eksponering for typisk laboratorie belysning vil ikke skade arbeids løsningen. - Minst 20 min før måle luminescence, slå på mikroplate leseren ved 25 ° c og sett opp readouts til 1 000 MS integrasjons tid og 150 MS bosette tid. Parameter innstillinger kan kreve optimalisering i funksjon av instrumentet.
- Etter 1 time av inkubasjons i trinn 5.4.7., kast den sekundære antistoff oppløsningen og vask platene 6 ganger med vaskebuffer.
- Pipetter 100 μL per brønn av Luminol arbeids løsning (Chemiluminiscerende substrat) utarbeidet i trinn 5.5.1. Pipetter svært langsomt og unngå boble dannelse. Bruk en tidtaker til å kontrollere tiden mellom tilsetning av tilsetning av løsningen og luminescence måling av platene og holde denne tiden konstant for å oppnå en god Inter analysen reproduserbarhet.
- Topp-forsegle platene og sentrifuger til 500 x g ved RT for 45 s i en plate sentrifuge for å eliminere eventuelle gjenværende bobler. Ruge platene for 1 min på en tallerken shaker ved 100 RPM.
- Sett inn platen inne i leseren og la den stå i 3 min for å stabilisere temperaturen ved 25 ° c (uten Lim film). Begynn alltid med Free ELISA-platen.
- Les de relative luminescence enhetene (RLU) for hver ELISA plate analyse (gratis og totalt KDM1A).
- Lagre og kopier RAW RLU verdiene fra RAW data Excel-filer for videre analyse av resultatene.
- 30 minutter før slutten av trinn 5.4.7. og under myke lysforhold, bland like deler av Luminol-Enhancer og peroxide Solution (10,5 mL: 10,5 mL, for 2 plater) i en gul flaske og la den på RT.
6. beregning av mål engasjement
- I et regnearkprogram, beregne RLU gratis og RLU total verdier av prøvene SX og referanse eksempler ref (ubehandlet, kjøretøy eller pre-dose prøve) fra sine tekniske gjenskape RAW-data som beskrevet nedenfor:
- Angi individuelle RAW RLUi total og RAW RLUi gratis data fra blanks, standard kurve, negative kontroller C-og biologiske prøver (SX og REF) inn i analysedata arket (for eksempel Excel). Skriv også inn beløpene (i PG) til KDM1A fra standard kurven i dataarket.
- Beregn rå middelverdien RLU, standardavvik σRLU, og koeffisient av variasjon CVRLU fra de enkelte rå total og rå gratis RLUi data for hver tekniske replikere datapoint.
- Bruk avvikende eliminering (eksempel for triplicates): for hver enkelt RAW RLU total og RAW RLU gratis datapunkt RLUi fra en teknisk tre eksemplarer datapoint, gjelder Grubbs kriterier når CV for tre eksemplarer > 0,15, og avvise enkelt mistenker rå RLU verdi når
,
der Z = 1,148 for n = 3 og 90% sikkerhetsintervall (CI). - Hvis avvikende eliminering ble brukt, beregne rå bety RLU, standardavvik σRLU og CVRLU fra ikke-forkastet (nr) rå RLUi total og rå RLUi gratis verdier for hver datapoint.
- Bruk bakgrunnen korreksjon: Beregn gjennomsnittet RLU gratis og RLU total verdier for hvert standard utvalg, og hver prøve SX og referanse sample ref som:
- Representerer dataene grafisk på følgende måte:
- Plot RLUgratis og RLUTotal Values (Y-aksen) i forhold til deres sample identifikasjon (X-aksen) i et stolpediagram.
- Også plotte RLU verdier (Y-aksen) av standardene i en scatter plot i forhold til deres mengde PG av rKDM1A protein (X-aksen) for gratis og totalt målinger, samt tilsvarende lineal trendlinjer og beregne r2 (kvadratet av den lineære korrelasjonskoeffisient) verdier.
- Beregn mål engasjementet (TE); prosentandel av KDM1A bundet av KDM1A-hemmere i hver prøve SX i forhold til et referanse eksempel ref (ubehandlet, kjøretøy eller pre-dose prøve) som følger:
- Beregn forholdet R av gjennomsnittet RLU gratis til total verdier for SX og REF prøvene som:
- Deretter beregner du mål engasjementet (TE) for prøven SX som:
Valgfritt: (1) hvis N biologisk replikere eksperimenter ble gjennomført, hver med n tekniske replikerer; først beregne TESX for tekniske replikere sett. Deretter beregner du gjennomsnittlig TE, SD og CV-verdiene for det biologiske replikere settet.
- Beregn forholdet R av gjennomsnittet RLU gratis til total verdier for SX og REF prøvene som:
- Revidere hvorvidt analysen aksept kriteriene er oppfylt: Kontroller at (1) analysen bakgrunnen er akseptabelt og gjennomsnittlig blank < 0,05 x 107 RLU; (2) prøven Auto-luminescence er fraværende og RLU av de negative kontrollene C-er under nedre grense for kvantifisering (LLOQ = Mean blank + 10x SD); (3) rKDM1A standard kurve er lineær og R2 ≥ 0,98; (4) den biologiske prøvene har RLU verdier som faller i det dynamiske og lineære området av analysen det vil si mellom LLOQ og 2 500 PG/brønn.
Merk: trinn 6,1. til 6,4. kan lett automatisert i en kalkulus dataark. - Eksportere TE data til en åpen kildekode eller kommersielt innhentet statistikk programvare av valget for grafisk representasjon av TE verdier og ytterligere statistiske evalueringer.
,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den linearitet av total og gratis KDM1A besluttsomhet.
En standard serie ble utarbeidet som beskrevet i trinn 5.3.2., bruker 0 til 2500 PG av full-lengde humant rekombinant KDM1A enzym. RLU-verdiene til total og Free rKDM1A ble vurdert for å verifisere linearitet (figur 2a og 2b). Data representeres som gjennomsnittet fra 3 eksperimenter med 3 tekniske replikerer (n) ± SD. Den RLU verdier av total og gratis KDM1A oppdaget i menneskelig Pbmc fra blodet av 3 uavhengige frivillige er superposed på standard kurve i figur 2C og 2D. Blodprøvene ble innhentet fra Instituto de Investigación Biomédica Sant Pau biobank i henhold til spansk lovgivning (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) og godkjennelse av lokale etikk komiteer.
Figur 2. Fastsettelse av total og gratis rKDM1A i Pbmc av friske frivillige. RLU verdier av total rKDM1A vurdert av Elisa (A) og Free rKDM1A vurdert av chemoprobe Capture Elisa (B). Data ble innhentet fra 3 replikere eksperimenter, hver analysert i tre eksemplarer (N = 3; N = 3). RLU verdier av total KDM1A vurdert av ELISA (C) og Free KDM1A (D) for Pbmc av 3 uavhengige ubehandlede frivillige (røde, blå og grønne firkanter) superposed på standard Curve. Data ble innhentet fra ett eksperiment analysert i tre eksemplarer (N = 1; N = 3). Verdier representert er midlene ± SD. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Analyse av KDM1A mål engasjement i celler
AML-celler ble kultivert etter leverandør anbefalinger. Celler ble behandlet med kjøretøy eller ORY-1001 ved forskjellige konsentrasjoner (0,25; 0,5; 1; 5 og 25 nM) (Figur 3). De innfødte protein ekstrakter ble oppnådd i nærvær av 25 nM OG-881 chemoprobe. 0,5 μg av totalt protein ble brukt til å utføre mål engasjements analysen som beskrevet tidligere. Totalt og gratis KDM1A ble bestemt, og prosentandelen av mål engasjement i ORY-1001 til KDM1A ble beregnet i forhold til kjøretøyet som beskrevet.
Figur 3. Dose-respons av KDM1A Target Engagement i en menneskelig AML cellelinje. Celler ble behandlet med kjøretøy eller ORY-1001 ved ulike konsentrasjoner (0,25; 0,5; 1; 5 og 25 nM) og brukes til fastsettelse av mål engasjement som beskrevet. Data ble innhentet fra 3 replikere eksperimenter, hver analysert i tre eksemplarer (N = 3, n = 3). Verdier representert er midlene ± SD. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Analyse av in vivo KDM1A mål engasjement
Målet med dette eksperimentet var å karakterisere målet engasjement av ORY-1001 i ulike rotte vev, i funksjon av dose nivå. For å oppnå dette målet, 15 Sprague-Dawley rotter (200-250 g) ble plassert i en cytostatiske sikkerhet rom for å unngå potensiell forurensning av testet sammensatte. Maksimalt 3 rotter/bur ble tilfeldig tildelt 5 studiegrupper. De 5 forskjellige studiegrupper mottatt, henholdsvis, kjøretøy; 1 3 10 eller 30 μg/kg av ORY-1001 ved oral administrering i 4 sammenhengende dager. Sammensatte lager løsninger ble tilberedt daglig. Dyr ble veid før hver administrasjon for å justere ønsket volum. Alle dyrene var huset for bestandig romtemperatur (20-24 º C) og relativ fuktighet (45-65%) under en 12 h lys-mørk syklus (lyser på 6:00 AM). Mat og vann var tilgjengelig Ad lib. Blodprøvene ble samlet inn 2 timer etter siste administrering i K2EDTA-rør og pbmc ble isolert i henhold til prosedyren beskrevet tidligere i trinn 1.2.2. og bevart ved-80 ° c til native protein utvinning. Lunge prøver ble også samlet inn 2 timer etter den siste medikament administrasjonen, frosset umiddelbart i flytende nitrogen, og lagret ved-80 ° c. Studier ble utført i samsvar med de institusjonelle retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr (European fellesskap Council direktiv 86/609/EØF) etablert av etisk komité for dyr eksperimentering på PRAAL-PCB.
Etter pulverisering ble de innfødte protein ekstrakter fra lunge innhentet som beskrevet og kvantifisert. 5 μg av totalt protein fra grupperte Pbmc eller 7,5 μg av totalt protein fra lunge fra 3 dyr ble brukt per dose gruppe for å kjøre KDM1A mål engasjement analysen.
Dose responsen til KDM1A mål engasjement i Pbmc og lunge behandling av rotter med ORY-1001 ved oral gavage, beregnet i forhold til kjøretøy gruppen, vises i figur 4a og 4b. Som kan se i figur 4c, har ex vivo-inkubasjons med 25 nM ory-1001 av lunge protein ekstrakter fra kjøretøy behandlede dyr full te ennå, men øker ikke ytterligere tes i prøver fra rotter som behandles i 4 dager med 30 μg/kg ORY-1001 , bekrefter KDM1A var allerede fullt hemmet in vivo.
Figur 4. In vivo og ex vivo native KDM1A mål engasjement. Dose-respons av KDM1A mål engasjement i pbmc (A) og lunge prøver (B) fra rotter behandlet med ORY-1001 i 4 påfølgende dager (p. o). Data ble innhentet fra sammenslåtte Pbmc-ekstrakter fra 3 dyr per kohort, analysert i duplikat (N = 1, n = 2) eller fra lungene fra 3 individuelle dyr per kohort, analysert i tre eksemplarer (N = 3, n = 3). C. sammenligning av TE i sammenslåtte lunge protein ekstrakter av rotter behandlet med kjøretøy (venstre) eller 30 μg/kg ORY-1001; etter 1 h ex vivo inkubasjons av ekstrakter uten (grå stenger) eller med 25 nM ORY-1001 (blå søyler) (N = 3, n = 3). Alle data er representert som betyr ± SD. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som presenteres her ble utviklet for å direkte måle KDM1A mål engasjement ved hjelp av en roman KDM1A chemoprobe fangst basert ELISA. Metoden har blitt validert for kulturperler menneskelige cellelinjer og ex vivo prøver fra menneske, rotte og mus og bavian (inkludert Pbmc, lunge, hjerne, hud, svulster), men kan lett brukes til andre arter der KDM1A antistoff målet epitopes og katalysator senteret er bevart. AS OG-881 er en aktivitet basert chemoprobe, er utvalget kvaliteten viktig og forsvarlig manipulasjon og bevaring av prøvene bør gjennomføres spesielt i de innledende trinnene i protokollen, for å sikre at KDM1A aktivitet er bevart.
Den nåværende eksperimentelle protokollen ble optimalisert for å analysere KDM1A mål engasjement av kovalente FAD målretting hemmere. Den kan også brukes med reversible hemmere som blokkerer tilgang til FAD kofaktor av KDM1A. Potente reversible hemmere med lange oppholdstid kan ansette den uendrede protokollen.
Den OG-881 chemoprobe kan ikke være egnet for lav potens reversible hemmere med høy off-priser. Den spesielle chemoprobe som brukes i dette manuskriptet er ikke celle penetrant og derfor analysene utføres ex vivo på lysert prøver.
Metoden kan kjøres på instrumenter som er bredt tilgjengelig i forskning og analytiske laboratorier; det krever ikke genetiske modifikasjoner for å bli introdusert i celler, og det kan lett brukes på ulike utvalg typer. En annen fordel er at den kan brukes på prøver avledet fra ulike arter som ofte brukes i prekliniske bevis på konseptstudier og i toksikologiske modeller og at den har blitt oversatt til å analysere kliniske prøver.
Andre metoder har blitt brukt til analyse av KDM1A mål engasjement. Mange av disse metodene bruker proxy markører som endringer av H3K4me2 histone merke, bruker AlphaLisa15; eller induksjon av uttrykks markører ved hjelp av qRT-PCR eller FACS-analyse16. Men i celler eller vev, de histone merkene er kontrollert av flere faktorer, og analyser som måler endringer i histone merke ikke alltid gir et godt dynamisk område for analyse. KDM1A hemming kan indusere potente endringer i genet og protein uttrykk, men responsen har en tendens til svært heterogen og svært celle kontekstavhengig, som kan komplisere analyser av dose respons3,7.
Direkte vurdering av okkupasjonen av målet er derfor det beste alternativet for å måle mål engasjement. En analyse som har blitt foreslått for dette er mobilnettet termisk forskyvning analysen (CETSA), basert på økningen av termisk stabilitet av målet proteiner ved binding av hemmere. Denne metoden kan i prinsippet brukes til uendrede celler og ulike vevstyper og har nylig blitt brukt til å vurdere cellulær aktivitet av KDM1A-hemmere i dyrket celler17. Imidlertid har denne teknologien sjelden blitt brukt til in vivo farmakodynamikk studier18 og etter beste av vår kunnskap, bruken er ikke rapportert i kliniske studier.
Protokollen her beskriver en fullt validert chemoprobe basert metode som har blitt brukt til å bestemme KDM1A mål engasjement i celler og vevsprøver. Metoden er blitt oversatt til å analysere prøver av menneskelige behandlet med en KDM1A inhibitor19 og vil være til stor bruk for å modellere PK/PD svar i kliniske studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren Tamara Maes er en administrerende direktør og aksjonær, og forfatterne Cristina Mascaró og Raquel Ruiz Rodriguez er ansatte i Oryzon Genomics S.A. Oryzon Genomics S.A. utvikler KDM1A hemmere og holder patenter som dekker forbindelser og metoder som brukes i denne artikkelen.
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert av Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche, og delvis støttes av CIIP-20152001 og RETOS samarbeid programmet RTC-2015-3332-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X Protease Inhibitor Tablets | Roche | #11836153001 | |
| 96 deep well storage block | VWR | #734-1679 | |
| 96 well ELISA plates | Nunc | #436110 | |
| Adhesive black Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Adhesive transparent Film | VWR | #60941-062 | |
| Biotinylated KDM1A probe OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | # 3117057001 | |
| Bovine Serum Albumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| Cell lysis buffer 10X | Cell Signaling | #9803 | |
| Centrifuge for 96- well plates | Hettich | Rotina 420R | |
| Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
| Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Microplate reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
| Needle G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| PBMC separation tubes 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| PBMC separation tubes 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Plate shaker | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
| Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
| Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| Spectrophotometer cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Spectrophotometer for cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| Syringe | BD | #303172 | |
| Type 1 ultrapure water | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | USC200T |
References
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T. ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia. Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).
- Sugino, N. A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers. Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).
- Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms. Blood. 126, 601 (2015).
- Jutzi, J. S., et al. LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone. HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).
- Mohammad, H. P. DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC. Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).
- Rivers, A., et al. RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases γ-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model. Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).
- Rivers, A. Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons. Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).
- Buesa, C., et al. The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation. Alzheimer’s & Dementia. 11 (7), P905 (2015).
- Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1. Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).
- Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. Human histone demethylase LSD1 reads the histone code. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).
- Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor. Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. , WO2017158136 (2016).
- Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors. Journal of Biological Chemistry. , In Press (2019).
- Rodriguez-Suarez, R. Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).
- Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1. Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).
- Schulz-Fincke, J. Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation. European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).
- Ishii, T., et al. CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens. Scientific Report. 7, 13000 (2017).
- Maes, T. ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders. Alzheimer’s & Dementia. 12 (7), P1192 (2017).
