Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att mäta KDM1A mål engagemang i en människa eller djur cell, vävnad eller blodprov som behandlats med KDM1A-hämmare. Protokollet sysselsätter chemoprobe märkning av den fria KDM1A enzym och direkt kvantifiering av mål ockupationen med chemoprobe-baserade immunanalyser och kan användas i prekliniska och kliniska studier.
Abstract
Bedömningen av målet engagemang, definierad som samspelet mellan ett läkemedel med proteinet det utformades för, är ett grundläggande krav för tolkningen av den biologiska aktiviteten hos någon förening i läkemedelsutveckling eller i grundläggande forskningsprojekt. I epigenetik bedöms mål engagemanget oftast av analysen av proxymarkörer istället för att mäta föreningen av substansen till målet. Nedströms biologiska avläsningar som har analyserats inkluderar Histon mark modulering eller genuttryck förändringar. KDM1A är en lysin-demetyleras som avlägsnar metylgrupper från mono-och dimetylerade H3K4, en modifiering som är förknippad med ljuddämpning av genuttryck. Modulering av proxy markörer är beroende av celltyp och funktion av den genetiska make-up av de undersökta cellerna, som kan göra tolkning och Cross-Case jämförelse ganska svårt. För att kringgå dessa problem, ett mångsidigt protokoll presenteras för att bedöma dos effekter och dynamik i direkt KDM1A mål engagemang. Analysen beskrivs gör användning av en KDM1A chemoprobe att fånga och kvantifiera ohämmade enzym, kan i stort sett tillämpas på celler eller vävnadsprover utan behov av genetisk modifiering, har ett utmärkt fönster för detektion, och kan användas både för grundforskning och analys av kliniska prover.
Introduction
Lysin-specifika demetyleras 1 (KDM1A)1 är en demetyleras inblandade i kontrollen av gentranskription. Detta protein har vuxit fram som en kandidat farmakologisk mål2 i onkologi; inklusive akut myeloisk leukemi3 (AML), myelodysplasia syndrom (MDS)4, myelofibros (MF)5,6, småcellig Lung cancer (SCLC)7; i sicklecellanemi (SCD)8,9, och i centralanervsystemet sjukdomar inklusive Alzheimers sjukdom (AD), multipel skleros (MS); och i aggression10.
De flesta av de KDM1A hämmande föreningar i klinisk utveckling är cyklopropylamin derivat och hämmar proteinet genom kovalenta bindning till dess Flavin adenin--dinukleotid (FAD) kofaktor11. Hämning av KDM1A inducerar förändringar av genuttryck, men dessa förändringar varierar enormt mellan vävnader, celltyper eller sjukdoms fall. Hämning av KDM1A ändrar också Histon Marks12, men dessa förändringar är i allmänhet produceras lokalt på en specifik plats i genomet, och är återigen, mycket vävnad och cell specifika.
Protokollet utvecklades för att direkt mäta KDM1A mål engagemang i biologiska prover och har optimerats för användning med cyklopropylamin härledda hämmare. Analysen är baserad på ELISA-teknik och analyserar, parallellt, totalt och gratis (dvs. obunden av inhibitor) KDM1A i ett inhemskt proteinextrakt från ett biologiskt prov i en solid fas analys. Som ett första steg, är det biologiska provet lyserat i närvaro av en KDM1A selektiva chemoprobe og-88113,14, härrör från selektiv KDM1A inhibitor ORY-1001 (iadademstat), en potent hämmare av KDM1A i kliniska utveckling för behandling av onkologisk sjukdom. Den chemoprobe har en IC50 för KDM1A av 120 Nm och innehåller en modefluga bindande del kopplad till en en polyetylenglykol (PEG)-svans. Chemosonden binder exklusivt till den fria KDM1A, men inte till inhibitoren-begränsar KDM1A i ta prov. Efter chemoprobe bindning, de KDM1A som innehåller komplex i provet fångas på mikrotiterplattor med konjugerat belagd yta för att bestämma fri KDM1A, eller på plattor belagda med en monoklonal anti-KDM1A Capture antikropp för att bestämma totala KDM1A. Efter tvättning inkuberas båda plattorna med en anti-KDM1A detektionsantikropp, tvättas igen, och inkuberas med en sekundär HRP-konjugerad åsna anti-kanin IgG antikropp för detektion med hjälp av ett självlysande substrat och kvantifiering genom att mäta relativa ljusenheter (RLU) i en luminometern (figur 1).
Figur 1. Schema för ELISA enzym länkade chemoprobe immunoabsorberande test för KDM1A Target Engagement: A) bestämning av total KDM1A med Sandwich-Elisa och B) bestämning av fri KDM1A med hjälp av chemoprobe Elisa. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
En standardkurva ingår i båda ELISA-plattorna för att kontrollera Lineariteten hos varje analys. Bestämning av KDM1A-målengagemang i varje prov beräknas sedan som ett relativt värde för det före dos-eller vehikel-behandlade provet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blodprov erhölls från Instituto de Investigación Biomédica Sant Pau Biobank enligt spansk lagstiftning (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) och godkännande av de lokala etikkommittéerna. Studier med djurvävnader utfördes i enlighet med de institutionella riktlinjer för skötsel och användning av försöksdjur (Europeiska gemenskapernas rådsdirektiv 86/609/EEG) som fastställts av etikkommittén för djurförsök vid PRAAL-PCB.
1. beredning av biologiska prover för analysen.
Varning: detta protokoll innebär manipulation av biologiska prover som kan utsättas för arbetsmiljö förvaltningens (OSHA) blodburna patogener standard (29 CFR 1910,1030), Europaparlamentets och rådets direktiv 2000/54/EG 18 september 2000 eller motsvarande förordningar. Dessutom kan de biologiska proverna innehålla spår av biologiskt aktiva prövnings kemiska föreningar och protokollet kan innebära ytterligare manipulation av sådana föreningar. Se över säkerhetsdatabladet (SDS) för de föreningar som använts innan försöket inleddes och iaktta strikt alla tillämpliga säkerhetsåtgärder som fastställts i forskningscentret, inklusive användning av lämplig personlig skyddsutrustning (PPE). Bär ordentliga skyddskläder och Använd lämplig avskärmning under experimentets gång. Kassera rester i lämpliga avfallsbehållare (biologiskt/cytotoxiskt avfall).
Anmärkning: detta protokoll inleds med celler eller prover av försökspersoner som behandlats med en KDM1A-hämmare och deras obehandlade eller vehikel/placebo-behandlade kontroller3.
- Celler behandlade med vehikel-eller KDM1A-hämmare in vitro
- För de celler som odlas i suspensionen, som 10 mL kulturer, överför suspensionerna till rena 15 mL koniska rör och fortsätt till 1.1.3.
- För de anhängare celler (odlas i 75 cm2 flaskor), ta bort mediet från kolven och tvätta kort med 4 ml PBS. Lossa cellerna från sina fartyg med 1,5 mL av 0,5% trypsin-EDTA under 2-5 min (trypsinization villkor kan variera, följa leverantörens rekommendationer för cellinjer), tillsätt 4 mL PBS och överföra cellerna i rena 15 mL koniska rör.
- För in rören i en bänkskiva centrifug och samla in cellerna genom centrifugering i 5 min vid 400 x g vid 4 ° c. Avlägsna supernatanten, Omsuspendera pelleten i 1 mL PBS med en mikropipett och överför suspensionen till ett 1,5 mL microcentrifugerör.
- För in proverna i en mikrorörs centrifug och centrifugera dem i 5 min vid 400 x g vid 4 ° c. Ta bort PBS genom aspiration med en micropipett och antingen hålla pellets på isen och gå vidare till steg 2; eller frysa pellets på torris och förvara dem vid-80 ° c till steg 3.
- Prover från försökspersoner eller djur som behandlats med vehikel/placebo eller KDM1A-hämmare
- Vävnader: skär vävnaden i små, ≈ 1 cm3 stycken med en skalpell. Frys vävnaderna i vätska N2 i en Dewar behållare och förvara dem vid-80 ° c till steg 3.
- Polymorfa blod mononukleära celler (PBMCs): Späd 10 mL färskt blod (process max 2 h efter blod uttag) samlas i K2-EDTA rör med 2 volymer PBS i ett 50 ml koniskt rör. Isolera PBMCs från blod med hjälp av kommersiellt framställda PBMC-separeringsrör enligt tillverkarens anvisningar. Håll pellets på isen och gå vidare till steg 3,2; eller frysa pellets på torris och förvara dem vid-80 ° c till steg 3.
Anmärkning: en våt cells pellet på 20 till 50 μL innehåller ≈ 1 x 107 celler, beroende på Cellstorlek. En våt PBMC-pellet som erhålls från 10 mL friskt humanblod har en volym på ≈ 20 μL och innehåller ≈ 1 x 107 pbmcs. vävnader eller cell pellets kan förvaras vid-80 º c i upp till 6 månader.
2. beredning av lösningen
- Förbered 2 μm og-881 arbetslösning: ta en 10 μl engångsanvändning alikvot av 20 mm en sond og-881 stamlösning av 4 ° c kylskåpet och lämna den i rumstemperatur (RT) för 10 min. Förbered 2 μm arbetslösning genom seriell utspädning av og-881 Stock en i PBS, med hjälp av en mikropipett med filter spetsar och ändra spetsen mellan de olika utspädnings stegen.
- Förbered 10X proteashämmare: Lös 1 tablett i 1 mL PBS i ett microcentrifugerör.
- Förbered önskad volym 1x Celllysis buffert med 25 nM OG-881 chemoprobe. För varje mL, blanda 100 μL kommersiellt erhållen 10X cell lysis buffert, 150 μL av 10X proteashämmare, 12,5 μL av 2 μM OG-881, och 737,5 μL av typ 1 dubbelt destillerat vatten.
- Du kan också förbereda önskad volym 1x Celllysis buffert men med 25 nM ORY-1001 i stället för OG-881 som i steg 2,3. Mindre potenta hämmare kan användas men kan kräva högre koncentrationer, för användning i positiv kontroll med 100% hämning (se steg 3,5).
Anmärkning: vidta lämpliga åtgärder för att undvika oavsiktlig kontaminering av lösningar eller prover med OG-881 eller KDM1A-hämmaren lagerlösningar. För att beräkna den önskade volymen av 1x Celllysis buffert med 25 nM OG-881, anta att 400 μL krävs per 40 mg pulveriserad vävnad, eller 200 μL per våt pellet av 107 celler.
3. Native protein utvinning
- Från vävnader:
- Pulverisera och homogenisera en ≈ 1 cm3 kub av fryst vävnad med en murbruk och mortelstöt kyld på torris. Aliquot proverna i engångsflaskor innehållande ≈ 40 mg vävnads pulver, Undvik upptinning vid alla tidpunkter. Fortsätt till steg 3.1.2. för omedelbar beredning eller lagring vid-80 ° c.
- Omsuspendera 40 mg pulver vävnad i 400 μL 1x Celllysis buffert med 25 nM OG-881, Vortex för 10 s, och tvinga provet minst fem gånger genom en 18-gauge trubbig spruta nål tills lys av vävnaden uppnås och en grumlig ljusgul till orange suspension är Erhållits. Undvik bubbelbildning.
- Fortsätt till steg 3,3
- Från cell pellets (PBMCs och cellinjer):
- Omsuspendera en pellet av ≈ 1 x 107 celler i 200 μl 1x celllysbuffert som innehåller 25 nm OG-881. Vortex proverna kort och hålla dem på is i 5 min.
- Sonikera proverna i en ultraljudsapparat med 3 pulser på 20 s vardera vid 45 kHz; placera dem på is för 20 s mellan pulser.
Anmärkning: så snart de biologiska proverna har återsuspenderas i 1x celllysis buffert, förvara dem på isen under resten av processen.
- Håll proverna på is i ytterligare 5 min, Vortex kort och centrifugera proverna i 10 min vid 14 000 x g i en förkyld centrifug vid 4 ° c.
- Med en 1 mL mikropipett, överför supernatanterna till färska 1,5 mL mikrocentrifugrör och lämna dem på isen under 2 h. Fortsätt till steg 4.
- Alternativt kan en positiv kontroll för att simulera 100% Target Engagement förberedas på följande sätt:
- Omsuspendera cellen pelleten eller pulveriserad vävnad från ett fordon eller obehandlad (predose) prov i erforderlig volym av 1x cell lysis buffert med 25 nM ORY-1001 och process som beskrivs i steg 3,1 till 3,3.
- Överför samman supernatanterna av den positiva kontrollen till färska 1,5 ml mikrocentrifug rör och lämna dem på is för 1 h. ORY-1001 uppsåtligt hämma KDM1A och blockera chemoprobe bindning.
- Tillsätt 5 μL av 2 μM OG-881 arbetslösning till den positiva kontroll supernatanten (volym för positiv kontroll som genereras från ett 40 mg vävnadsprov) eller 2,5 μL av 2 μM OG-881 arbetslösning (volym för positiv kontroll som genereras från ett 107-cellsprov) för att erhålla samma OG-881 koncentration som de andra proverna och lämna på is under 2 h. Fortsätt till steg 4.
4. kvantifiering av inhemskt protein med hjälp av Bradford assay
- Späd kommersiellt framställda Bradford protein assay reagens 5 gånger med H2O typ 1 dubbelt destillerat vatten. Beräkna den mängd reagens som krävs för den totala mängden prover och standarder (1 mL per prov eller standard + 5 mL överskottsvolym).
- Vid standardkurvan för bovint serumalbumin (BSA), Förbered ett mikrocentrifugrör med 1 mL utspädd Bradford-Proteinanalyslösning (blank) och sju mikrocentrifugrör med 995 μL av den utspädda Bradford-Proteinanalyslösningen. Tillsätt 5 μL av varje BSA-standard (koncentration mellan 125 och 2 000 μg/mL) till var och en av de 7 microcentrifugrör och blanda dem genom att försiktigt vända rören flera gånger. Inkubera i 5 minuter vid RT.
- Överför de utspädda standarderna till kyvetter och Läs av de tomma och bovint serumalbuminstandardproverna i en spektrofotometer vid 280 nm.
- För de biologiska proverna, Förbered en microcentrifug tub med 1 mL utspädd Bradford protein assay lösning (blank) och så många mikrocentrifugrör med 999 μL av den utspädda Bradford protein assay reagens som prover som behöver kvantifieras. Använd en automatisk P2-mikropipett och tillsätt 1 μL inbyggt proteinextrakt som bereds i steg 3 till varje mikrocentrifugrör och blanda genom att försiktigt vända rören flera gånger. Inkubera proverna 5 min vid RT.
- Överför volymerna till kyvetter och Läs OD av proverna i en spektrofotometer vid 280 nm.
- Företrädesvis, Fortsätt omedelbart till steg 5. Alternativt kan du förvara de inhemska protein extrakten vid-80 ° c till steg 5. Undvik frys tining cykler.
5. Luminescent ELISAs för total och fri KDM1A bestämning
Obs: Behåll laboratorie temperaturkonstanten vid 23-24 ° c (RT).
- Beläggning av mikrotiterplattor med Capture KDM1A antikropp eller Streptavidin
- Totalt KDM1A ELISA: Förbered 10 mL KDM1A Capture-antikropp för varje platta till en slutlig koncentration på 2 μg/mL i PBS. Överför 100 μL till varje brunn på plattan.
- Gratis KDM1A Elisa: Förbered 10 ml konjugerat på 10 μg/ml i PBS för varje tallrik. Överför 100 μL till varje brunn på plattan.
- Top-Seal den totala och fria KDM1A ELISA plattor med självhäftande film och inkubera plattorna över natten vid 4 ° c i kylskåpet.
- Tvättning och blockering av plattorna
- Ta plattorna ur kylskåpet och låt dem jämvikt för ca 45 min vid RT före användning.
- Förbered 1 000 mL tvättbuffert (0,1% Tween i PBS) och 50 mL blockeringsbuffert (1% BSA i PBS) per tallrik.
- Tvätta plattorna 3 gånger med tvättbuffert. I detta och efterföljande steg, knacka på plattan på pappershanddukar efter varje tvättsteg för att ta bort kvarvarande lösning.
- Tillsätt 200 μL blockeringsbuffert per brunn till båda plattorna, Top-Seal båda plattorna med en självhäftande film och inkubera 2 h vid RT.
- Biologiskt provberedning
- Späd ut de inhemska proteinextrakt som erhållits i slutet av steg 3 till lämplig koncentration med hjälp av PBS. Den rekommenderade koncentrationen kommer att variera i funktion av nivån av KDM1A uttryck i det biologiska provet. Exempel på lämpliga områden är (1) cell pellets: 0,5-10 μg per brunn. (2) PBMCs: 5-30 μg per brunn. (3) pulveriserad vävnad (hjärna, lungor, hud): 20-100 μg per brunn. Förvara proverna på isen under beredningen. När det är möjligt, kör tekniska tre exemplar provanalyser.
- Förbered en standard kurva med Human rKDM1A:
- För att förbereda KDM1A standard arbetslösning, Pipettera lämplig volym av rKDM1A för en slutlig koncentration av 25 PG/μL, tillsätt 75 μL av 2 μM OG-881, och komplett med 1 x PBS till en total volym av 6 mL i en 15 mL Falcon Tube. Håll KDM1A standard fungerande lösning på is under 1 h och blanda lösningen försiktigt genom att invertera 15 mL Falcon röret flera gånger varje 20 min.
- Förbered KDM1A standard spädningsserien i 1,5 ml mikrocentrifugrör enligt tabell 1 (standardpreparat), i volym nog för tre exemplar analys av 2 96 väl i mikrotiterbrunnarna plattor.
| STANDARD SERIE | KDM1A standard arbetslösning (μL) | |
| (PG KDM1A/well) | PBS (μL) | |
| 2500 för C-* | 800 | - |
| 2500 | 800 | - |
| 1750 | 560 | 240 |
| 1250 | 400 | 400 |
| 750 | 240 | 560 |
| 250 | 80 | 720 |
| 25 | 8 | 792 |
| 0 | 0 | 800 |
| Observera: | ||
| (1) den volym som framställs av varje spädning är tillräcklig för att köras i tre exemplar 2 plattor av analys. | ||
| (2) det rekommenderade intervallet är mellan 2,5 och 5 000 PG/well | ||
| * För negativ kontroll C-, utan KDM1A Detection antikropp | ||
Tabell 1: Standard beredning. För att förbereda standardserien av KDM1A protein, Pipettera de angivna volymerna av KDM1A standardarbetslösning och PBS i åtta korrekt märkta 1,5 mL microcentrifug rör.
Tabell 2: design av djupa och platta plattor. Standarder (blå) och prover (gula) från steg 5.4.2. pipetterades in i de reflekterade positionerna för den djupa brunnen plattan för att underlätta lastning i ELISA-plattorna efter riktningen av den blå (standard) och gula (prov) pilar. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Tabell 3: utformning av ELISA-plattan. Analys plattan innehåller standardkurvan med minskande mängder rekombinant KDM1A Target (i blått). de biologiska proverna (-erna) i gult. och motsvarande negativa kontroller (innehåller proverna men inte den primära detektions antikroppen) i vitt, som ska lastas på ELISA-plattorna från den djupa brunnen plattan. Det tomma (0 i standardkurvan) innehåller alla reagenser för avskiljning och detektering, men inget prov. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
- Elisa
- (Fortsättning från steg 5.2.4.) Efter 2 h inkubering, kassera blockeringsbufferten och tvätta plattorna med tvättbuffert.
- Överför de lämpligt utspädda proverna (inhemska proteinextrakt och standardkurvan från steg 5,3.) till en kyld 96 djup förvarings block efter plattfördelningen som visas i tabell 2 (djup brunn plåt design).
- Förvara detta block på is tills Pipettera 100 μL prov/brunn i de totala och fria ELISA-plattorna efter plattfördelningen som visas i tabell 3 (Elisa-plattdesign).
- Inkubera i 1 h vid RT, kassera proverna och tvätta plattorna 5 gånger med tvättbuffert.
- Förbered 20 mL kanin anti-KDM1A Detection antikropp på 0,125 μg/mL i blockerande buffert, tillsätt 100 μL per brunn i varje platta av analysen, utom i brunnar som motsvarar de negativa kontrollerna C-. Top-Seal plattan och inkubera 1 h vid RT.
- Kassera detekterings antikroppslösningen och tvätta plattorna 6 gånger med tvättbuffert.
- Förbered 25 mL sekundär get anti-kanin antikropp HRP till en spädning 1:5000 i blockerande buffert, tillsätt 100 μL per brunn till mikrotiterplattorna; och inkubera 1 h vid RT.
-
Kemisk Luminescent detektion
- 30 min före slutet av steg 5.4.7. och under mjuka ljusförhållanden, blanda lika delar av luminol-Enhancer och peroxid lösning (10,5 mL: 10,5 mL, för 2 plattor) i en bärnsten flaska och lämna den på RT.
Obs: Håll luminol Working Solution i en bärnstensfärgad flaska och undvik långvarig exponering för intensivt ljus. Kortvarig exponering för typisk laboratoriebelysning kommer inte att skada arbetslösningen. - Minst 20 min innan du mäter Luminescens, slå på mikroplattläsaren vid 25 ° c och Ställ in avläsning till 1 000 MS integrations tid och 150 ms kvitta tid. Parameter inställningar kan kräva optimering i funktion av instrumentet.
- Efter 1 h inkubation i steg 5.4.7, kassera den sekundära antikroppslösningen och tvätta plattorna 6 gånger med tvättbuffert.
- Pipettera 100 μL per brunn av Luminolarbetslösning (Chemiluminescent substrat) som bereds i steg 5.5.1. Pipettera mycket långsamt och Undvik bubbelbildning. Använd en timer för att kontrollera tiden mellan tillsats av lösningen och Luminescens mätning av plattorna och hålla denna tid konstant för att uppnå en god Inter assay reproducerbarhet.
- Top-Seal plattorna och centrifugera till 500 x g vid RT för 45 s i en plattcentrifug för att eliminera eventuella kvarvarande bubblor. Inkubera plattorna i 1 min på en tallrik shaker vid 100 rpm.
- Sätt in plattan inuti läsaren och låt den verka i 3 minuter för att stabilisera temperaturen vid 25 ° c (utan självhäftande film). Börja alltid med den kostnadsfria ELISA-plattan.
- Läs de relativa luminescensenheterna (RLU) för varje ELISA-plattanalys (fritt och totalt KDM1A).
- Spara och kopiera RAW RLU värden från rå data Excel-filer för ytterligare analys av resultaten.
- 30 min före slutet av steg 5.4.7. och under mjuka ljusförhållanden, blanda lika delar av luminol-Enhancer och peroxid lösning (10,5 mL: 10,5 mL, för 2 plattor) i en bärnsten flaska och lämna den på RT.
6. beräkning av mål engagemanget
- Beräkna de RLU-värden som är fria och RLU totala värdena för proverna SX och referensproverna Ref (obehandlad, vehikel eller före dosering) från deras tekniska replikat rådata enligt nedan:
- Ange de enskilda rå RLUi totalt och rå RLUi fri data från tomma, standardkurva, negativa kontroller C-och biologiska prover (SX och ref) i analysdata bladet (t. ex., Excel). Ange också beloppen (i PG) för KDM1A från standard kurvan i databladet.
- Beräkna rå medelvärdet RLU, standardavvikelser σRLUoch koefficienten för variation CVRLU från de enskilda rå totala och rå fri rlui data för varje teknisk replikera Datapoint.
- Tillämpa avvikare eliminering (exempel för tre exemplar): för varje enskild rå RLU totalt och rå RLU fri datapunkt RLUi från en teknisk treplicera Datapoint, tillämpa Grubbs kriterier när CV för tre exemplar > 0,15, och avvisa enda misstänkt rå RLU värde När
,
varvid Z = 1,148 för n = 3 och 90% konfidensintervall (CI). - Om avvikare eliminering tillämpades, re-beräkna den råa medelvärdet RLU, standardavvikelsen σRLU och CVRLU från den icke-avvisade (nr) rå Rlui totalt och rå rlui fria värden för varje Datapoint.
- Använd bakgrundskorrigering: beräkna medelvärdet för RLU-fri och RLU-totalvärden för varje standard prov och varje prov SX och REFERENSPROV ref som:
- Återge data grafiskt enligt följande:
- Rita RLUgratis och RLUtotala värden (Y-axeln) i förhållande till deras exempel-ID (X-axeln) i ett stapeldiagram.
- Också Rita RLU värden (Y-axeln) av standarderna i ett spridningsdiagram i förhållande till deras mängd PG av rKDM1A protein (X-axeln) för fria och totala mätningar, samt motsvarande Lineal trendlinjer och beräkna r2 (kvadraten på den linjära korrelationskoefficienten).
- Beräkna mål engagemanget (TE); det vill säga den procentuella andel av KDM1A som binds av KDM1A-hämmaren i varje prov SX i förhållande till ett referensprov Ref (obehandlat, vehikel eller fördosprov) enligt följande:
- Beräkna förhållandet R för medelvärdet av RLU fritt till totalvärdena för SX-och REF-proven som:
- Beräkna sedan mål engagemanget (TE) för provet SX som:
Valfritt: (1) om N biologiska replikat experiment utfördes, var och en med n tekniska replikat; beräkna först TESX för de tekniska replikat uppsättningarna. Därefter beräknar du medelvärdet för TE, SD och CV-värden för den biologiska replikat uppsättningen.
- Beräkna förhållandet R för medelvärdet av RLU fritt till totalvärdena för SX-och REF-proven som:
- Se över om kriterierna för acceptans av analysen uppfylls: Kontrollera att (1) analysens bakgrund är godtagbar och medelvärdet tom < 0,05 x 107 RLU; (2) provet autoluminescens är frånvarande och RLUs av de negativa kontrollerna C-ligger under den undre kvantifieringsgränsen (LLOQ = medelvärde blank + 10X SD); (3) rKDM1A standardkurva är linjär och R2 ≥ 0,98; (4) de biologiska proverna har RLU-värden som faller inom analysens dynamiska och linjära omfång, d.v.s. mellan LLOQ och 2 500 pg/well.
Anmärkning: steg 6,1. till 6,4. kan lätt automatiseras i en kalkylbladsdata blad. - Exportera TE-data till en öppen källkod eller kommersiellt framställda statistik programvara av val för den grafiska representationen av TE-värden och ytterligare statistiska utvärderingar.
,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lineariteten av total och fri KDM1A beslutsamhet.
En standard serie utarbetades enligt beskrivningen i steg 5.3.2., med hjälp av 0 till 2500 PG av fullängds humant rekombinant KDM1A enzym. RLU-värdena för total och Free rKDM1A bedömdes för att kontrollera Lineariteten (figur 2A och 2b). Data representeras som medelvärde från 3 experiment med 3 tekniska replikat (n) ± SD. RLU-värdena för totalt och fritt KDM1A som upptäckts i humana PBMCs från blodet hos 3 oberoende frivilliga är ovanpå standard kurvan i figur 2C och 2D. Blodprov erhölls från Instituto de Investigación Biomédica Sant Pau Biobank enligt spansk lagstiftning (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) och godkännande av de lokala etikkommittéerna.
Figur 2. Bestämning av total och fri rKDM1A i PBMCs hos friska frivilliga. RLU-värden för total rKDM1A bedömt av Elisa (a) och av Free rKDM1A bedömt av chemoprobe Capture Elisa (B). Data erhölls från 3 replikat experiment, var och en analyserade i tre exemplar (N = 3; n = 3). RLU värden för total KDM1A bedömt av ELISA (C) och av Free KDM1A (D) för PBMCs av 3 oberoende obehandlade frivilliga (röda, blå och gröna kvadrater) ovanpå standard kurvan. Data erhölls från ett experiment som analyserades i tre exemplar (N = 1; N = 3). Värden som representeras är medel ± SD. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Analys av KDM1A mål interaktion i celler
AML-celler var odlade efter leverantörens rekommendationer. Celler behandlades med vehikel eller ORY-1001 vid olika koncentrationer (0,25; 0,5; 1; 5 och 25 nM) (figur 3). De infödda proteinextrakt erhölls i närvaro av 25 nM OG-881 chemoprobe. 0,5 μg totalt protein användes för att utföra den mål engagemangs analys som beskrivits ovan. Totala och fria KDM1A fastställdes, och andelen mål engagemang av ORY-1001 till KDM1A beräknades i förhållande till fordonet som beskrivs.
Figur 3. Dos-respons av KDM1A mål engagemang i en human AML-celllinje. Celler behandlades med vehikel eller ORY-1001 vid olika koncentrationer (0,25; 0,5; 1; 5 och 25 nm) och användes för bestämning av mål engagemanget enligt beskrivningen. Data erhölls från 3 replikat experiment, som var och en analyserades i tre exemplar (N = 3, n = 3). Värden som representeras är medel ± SD. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Analys av in vivo KDM1A Target Engagement
Syftet med detta experiment var att karakterisera målet engagemang av ORY-1001 i olika råtta vävnader, i funktion av dosnivå. För att uppnå detta mål, 15 Sprague-Dawley rats (200-250 g) var inrymt i ett cytostatiskt säkerhets rum för att undvika potentiell förorening av den testade föreningen. Högst 3 råttor/bur randomiserades till 5 studiegrupper. De fem olika studiegrupperna fick respektive fordon. 1 3 10 eller 30 μg/kg ORY-1001 genom oral administrering under 4 dagar i följd. Sammansatta lagerlösningar bereddes dagligen. Djuren vägdes före varje administrering för att justera önskad volym. Alla djur var inhysta vid konstant rumstemperatur (20-24 º C) och relativ luftfuktighet (45-65%) under en 12 h ljus-mörk cykel (lyser på klockan 6:00). Mat och vatten fanns tillgängliga AD libitum. Blodprov samlades 2 timmar efter sista administreringen i K2EDTA-rör och pbmcs isolerades enligt det förfarande som beskrevs tidigare i steg 1.2.2. och bevaras vid-80 ° c tills infödda protein utvinning. Lung prov samlades också in 2 timmar efter den sista läkemedels administrationen, frystes omedelbart i flytande kväve och lagrades vid-80 ° c. Studier har utförts i enlighet med de institutionella riktlinjer för skötsel och användning av försöksdjur (Europeiska gemenskapernas rådsdirektiv 86/609/EEG) som upprättats av etikkommittén för djurförsök vid PRAAL-PCB.
Efter pulverisering erhölls de infödda protein extrakten från lungan enligt beskrivningen och kvantifierades. 5 μg totalt protein från poolade PBMCs eller 7,5 μg totalt protein från lunga från 3 djur användes per dos grupp för att köra KDM1A Target Engagement-analysen.
Dos-responsen av KDM1A Target Engagement i PBMCs och i lung behandling av råttor med ORY-1001 genom oral songen, beräknad i förhållande till fordons gruppen visas i figur 4a och 4b. Som framgår av figur 4cger den ex vivo-inkubation med 25 nm ORY-1001 av lung proteinextrakt från vehikel-behandlade djur full te ännu men ökar inte te i prover från råttor som behandlats i 4 dagar med 30 μg/kg ory-1001 , bekräftar KDM1A redan helt hämmade in vivo.
Figur 4. In vivo och ex vivo Native KDM1A mål engagemang. Dos-respons av KDM1A Target Engagement i PBMCs (A) och lung prov (B) från råttor behandlade med ORY-1001 under 4 dagar i följd (p. o). Data erhölls från poolade PBMCs-extrakt från 3 djur per kohort, analyserade i två exemplar (N = 1, n = 2) eller från lungorna från 3 enskilda djur per kohort, analyserade i tre exemplar (N = 3, n = 3). C. jämförelse av TE i poolade lung proteinextrakt från råttor som behandlats med vehikel (vänster) eller 30 μg/kg ORY-1001; efter 1 h ex vivo inkubation av extrakten utan (gråa staplar) eller med 25 nM ORY-1001 (blå staplar) (N = 3, n = 3). Alla data representeras som medel ± SD. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som presenteras här utvecklades för att direkt mäta KDM1A mål engagemang med hjälp av en roman KDM1A chemoprobe Capture baserade ELISA. Metoden har validerats på odlade humana cellinjer och ex vivo prover från människa, råtta och mus och babian (inklusive pbmcs, lung, hjärna, hud, tumörer), men kan lätt appliceras på andra arter där KDM1A antikropp mål epitoper och katalytisk Center bevaras. Som OG-881 är en verksamhet baserad chemoprobe, provet kvalitet är viktigt och korrekt manipulation och bevarande av prover bör eftersträvas särskilt under de första stegen i protokollet, för att säkerställa KDM1A verksamhet bevaras.
Den nuvarande experimentella protokollet var optimerad för att analysera KDM1A mål engagemang av kovalenta FAD-hämmare. Det kan också användas med reversibla hämmare som blockerar tillgången till FAD kofaktor av KDM1A. Potenta reversibla hämmare med långa uppehållstider kan använda det oförändrade protokollet.
Den OG-881 chemoprobe kanske inte lämpar sig för låg potens reversibla hämmare med hög off-priser. Den särskilda chemoprobe som används i detta manuskript är inte cellpenetrant och därför utförs analyser ex vivo på lyserade prover.
Metoden kan drivas på instrument som är allmänt tillgängliga i forsknings-och analyslaboratorier. Det kräver inte att genetiska modifikationer införs i celler, och det kan enkelt appliceras på olika provtyper. En annan fördel är att den kan användas på prover som härrör från olika arter som ofta används i prekliniska bevis på begrepps studier och i toxikologiska modeller och att den framgångsrikt har översatts för att analysera kliniska prover.
Andra metoder har använts för analys av KDM1A Target Engagement. Många av dessa metoder använder proxy markörer som förändringar av H3K4me2 Histon mark, med alphalisa15; eller induktion av uttrycks markörer med qRT-PCR eller FACS-analys16. I celler eller vävnader styrs dock histonmarkeringarna av flera faktorer, och analyser som mäter förändringar i histonmärket ger inte alltid ett bra dynamiskt omfång för analys. KDM1A hämning kan inducera potenta förändringar i gen och proteinuttryck, men svaret tenderar att mycket heterogena och mycket cell sammanhang beroende, vilket kan försvåra analyser av dos svar3,7.
Den direkta bedömningen av ockupationen av målet är därför det bästa alternativet för att mäta mål engagemanget. En analys som har föreslagits för detta är den cellulära termisk Skift analys (CETSA), baserat på ökningen av termisk stabilitet av målproteiner vid bindning av hämmare. Denna metod kan i princip tillämpas på icke modifierade celler och olika vävnadstyper och har nyligen använts för att bedöma den cellulära aktiviteten hos KDM1A-hämmare i odlade celler17. Emellertid, denna teknik har sällan använts för in vivo farmakodynamik studier18 och till det bästa av vår kunskap, dess användning har inte rapporterats i kliniska prövningar.
Det protokoll som anges här beskriver en fullt validerad chemoprobe baserad metod som har använts för att bestämma KDM1A mål engagemang i celler och vävnadsprover. Metoden har framgångsrikt översatts för att analysera prover av försökspersoner som behandlats med en KDM1A-hämmare19 och kommer att vara till stor nytta för att modellera PK/PD-svar i kliniska prövningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren Tamara Maes är en verkställande direktör och aktieägare, och författarna Cristina Mascaró och Raquel Ruiz Rodriguez är anställda av Oryzon Genomics S.A. Oryzon Genomics S.A. utvecklar KDM1A-hämmare och innehar patent som omfattar föreningar och metoder som används i den här artikeln.
Acknowledgments
Denna studie finansierades av Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche, och delvis med stöd av CIIP-20152001 och RETOS Collaboration program RTC-2015-3332-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X Protease Inhibitor Tablets | Roche | #11836153001 | |
| 96 deep well storage block | VWR | #734-1679 | |
| 96 well ELISA plates | Nunc | #436110 | |
| Adhesive black Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Adhesive transparent Film | VWR | #60941-062 | |
| Biotinylated KDM1A probe OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | # 3117057001 | |
| Bovine Serum Albumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| Cell lysis buffer 10X | Cell Signaling | #9803 | |
| Centrifuge for 96- well plates | Hettich | Rotina 420R | |
| Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
| Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Microplate reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
| Needle G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| PBMC separation tubes 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| PBMC separation tubes 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Plate shaker | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
| Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
| Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| Spectrophotometer cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Spectrophotometer for cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| Syringe | BD | #303172 | |
| Type 1 ultrapure water | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | USC200T |
References
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T. ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia. Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).
- Sugino, N. A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers. Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).
- Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms. Blood. 126, 601 (2015).
- Jutzi, J. S., et al. LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone. HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).
- Mohammad, H. P. DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC. Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).
- Rivers, A., et al. RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases γ-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model. Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).
- Rivers, A. Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons. Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).
- Buesa, C., et al. The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation. Alzheimer’s & Dementia. 11 (7), P905 (2015).
- Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1. Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).
- Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. Human histone demethylase LSD1 reads the histone code. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).
- Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor. Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. , WO2017158136 (2016).
- Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors. Journal of Biological Chemistry. , In Press (2019).
- Rodriguez-Suarez, R. Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).
- Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1. Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).
- Schulz-Fincke, J. Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation. European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).
- Ishii, T., et al. CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens. Scientific Report. 7, 13000 (2017).
- Maes, T. ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders. Alzheimer’s & Dementia. 12 (7), P1192 (2017).
