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Biochemistry

केमोप्रोब-आधारित इम्युनोसेस का उपयोग करके KDM1A लक्ष्य सगाई का प्रत्यक्ष मापन

Published: June 13, 2019 doi: 10.3791/59390
Automatic Translation
1, 1, 1
1Oryzon Genomics

Summary

यहाँ, हम एक मानव या पशु सेल, ऊतक या रक्त के नमूने KDM1A inhibitors के साथ इलाज में KDM1A लक्ष्य सगाई को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. प्रोटोकॉल मुक्त KDM1A एंजाइम और केमोप्रोब आधारित इम्यूनोसेस का उपयोग कर लक्ष्य व्यवसाय के प्रत्यक्ष परिमाणीकरण की chemoprobe टैगिंग कार्यरत हैं और पूर्व नैदानिक और नैदानिक अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

लक्ष्य सगाई का आकलन, प्रोटीन के लिए डिजाइन किया गया था के साथ एक दवा की बातचीत के रूप में परिभाषित, दवा के विकास में या बुनियादी अनुसंधान परियोजनाओं में किसी भी यौगिक की जैविक गतिविधि की व्याख्या के लिए एक बुनियादी आवश्यकता है. epigenetics में, लक्ष्य सगाई सबसे अधिक बार प्रॉक्सी मार्करों के विश्लेषण के बजाय लक्ष्य के लिए परिसर के संघ को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया है. डाउनस्ट्रीम जैविक readouts कि विश्लेषण किया गया है histone निशान मॉडुलन या जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन शामिल हैं. KDM1A एक lysine demethylase है कि मोनो से मिथाइल समूहों को हटा- और dimethylated H3K4, जीन अभिव्यक्ति के silencing के साथ जुड़े एक संशोधन है. प्रॉक्सी मार्करों के मॉडुलन सेल प्रकार और जांच की कोशिकाओं के आनुवंशिक मेकअप के समारोह पर निर्भर है, जो व्याख्या और पार मामले तुलना काफी मुश्किल बना सकते हैं. इन समस्याओं को दरकिनार करने के लिए, एक बहुमुखी प्रोटोकॉल खुराक प्रभाव और प्रत्यक्ष KDM1A लक्ष्य सगाई की गतिशीलता का आकलन करने के लिए प्रस्तुत किया है. परख वर्णित एक KDM1A chemoprobe का उपयोग करने पर कब्जा करने और uninhibited एंजाइम मात्रा बनाता है, मोटे तौर पर आनुवंशिक संशोधन के लिए आवश्यकता के बिना कोशिकाओं या ऊतक के नमूने के लिए लागू किया जा सकता है, का पता लगाने का एक उत्कृष्ट खिड़की है, और बुनियादी अनुसंधान के लिए दोनों इस्तेमाल किया जा सकता है और नैदानिक नमूनों का विश्लेषण.

Introduction

Lysine विशिष्ट demethylase 1 (KDM1A)1 एक demethylase जीन प्रतिलेखन के नियंत्रण में शामिल है. यह प्रोटीन ऑन्कोलॉजी में एक उम्मीदवार औषधीय लक्ष्य2 के रूप में उभरा है; तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया3 (एएमएल), मायलोडिप्लासिया सिंड्रोम (एमडीएस)4, मायलोफिब्रोसिस (एमएफ)5,6,छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (SCLC)7सहित; सिकल सेल रोग (एससीडी)8,9, और अल्जाइमर रोग (एडी), मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) सहित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोगों में; और आक्रामकता में10.

नैदानिक विकास में केडीएम1ए बाधा यौगिकों में से अधिकांश साइक्लोप्रोपाइलामाइन डेरिवेटिव होते हैं और इसके फ्लाविन एडेनेन डेन्यूक्लिओटाइड (एफएडी) सहकारक11के लिए सहसंयोजक बंधन द्वारा प्रोटीन को रोकते हैं। KDM1A के निषेध जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन लाती है, लेकिन इन परिवर्तनों के ऊतकों, सेल प्रकार, या रोग के मामलों में काफी भिन्नता है. KDM1A के निषेध भी histone निशान12परिवर्तन, अभी तक इन परिवर्तनों को आम तौर पर जीनोम में एक विशिष्ट साइट पर स्थानीय स्तर पर उत्पादित कर रहे हैं, और फिर से कर रहे हैं, उच्च ऊतक और सेल विशिष्ट.

प्रोटोकॉल सीधे जैविक नमूनों में KDM1A लक्ष्य सगाई को मापने के लिए विकसित किया गया था और cyclopropylamine व्युत्पन्न inhibitors के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है. परख ELISA प्रौद्योगिकी पर आधारित है और विश्लेषण करती है, समानांतर में, कुल और नि: शुल्क (यानी अवरोधकरनेक द्वारा असीम) KDM1A एक ठोस चरण परख में एक जैविक नमूने से एक देशी प्रोटीन निकालने में. एक पहला कदम के रूप में, जैविक नमूना biotinylated KDM1A चयनात्मक chemoprobe OG-88113,14, चयनात्मक KDM1A अवरोध करनेवाला ORY-1001 (iadademstat), नैदानिक में KDM1A के एक शक्तिशाली अवरोध करनेवाला की उपस्थिति में lysed है ओन्कोलॉजिकल बीमारी के उपचार के लिए विकास। कीमोप्रोब में 120 एनएम के केडीएम1ए के लिए एक आईसी 50 है और इसमें एक बायोटिनीलेड पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी)-टेल से जुड़ा एक एफएडी बाइंडिंग मोइटी शामिल है। chemoprobe विशेष रूप से मुक्त KDM1A करने के लिए बांधता है, लेकिन नमूने में अवरोध करनेवाला बाध्य KDM1A करने के लिए नहीं. chemoprobe बाइंडिंग के बाद, KDM1A नमूने में परिसरों युक्त मुक्त KDM1A निर्धारित करने के लिए streptavidin लेपित सतह के साथ microtiter प्लेटों पर कब्जा कर रहे हैं, या एक monoclonal विरोधी KDM1A कब्जा एंटीबॉडी के साथ लेपित प्लेटों पर कुल KDM1A निर्धारित करने के लिए. धोने के बाद, दोनों प्लेटों एक विरोधी KDM1A का पता लगाने एंटीबॉडी के साथ incubated रहे हैं, फिर से धोया, और एक माध्यमिक HRP-कंजुटेड गधा विरोधी Rabbit IgG एंटीबॉडी के साथ incubated एक lumincent सब्सट्रेट का उपयोग कर पता लगाने के लिए और परिमाणीकरण रिश्तेदार को मापने के द्वारा एक luminometer में प्रकाश इकाइयों (RLU) (चित्र 1).

Figure 1
चित्र 1. ELISA एंजाइम से जुड़े chemoprobe इम्यूनोशोबनेंट परख KDM1A लक्ष्य सगाई के लिए स्कीमा: ए) कुल KDM1A का निर्धारण सैंडविच एलिसा और बी का उपयोग कर मुक्त KDM1A का निर्धारण chemoprobe ELISA का उपयोग कर. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रत्येक परख की रैखिकता को सत्यापित करने के लिए एक मानक वक्र को एलिसा प्लेटदोनों में शामिल किया जाता है। प्रत्येक नमूने में KDM1A लक्ष्य सगाई का निर्धारण तो पूर्व खुराक या वाहन इलाज नमूना करने के लिए एक सापेक्ष मूल्य के रूप में गणना की है.

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Protocol

रक्त के नमूने Instituto de Investigaci-n Biom$dica संत पाउ Biobank स्पेनिश कानून के अनुसार प्राप्त किए गए (रियल Decreto de Biobancos 1716/2011) और स्थानीय नैतिकता समितियों के अनुमोदन. पशु ऊतकों के साथ अध्ययन प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया (यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देशक 86/ प्राल-पीसीबी।

1. परख के लिए जैविक नमूनों की तैयारी.

चेतावनी: इस प्रोटोकॉल में जैविक नमूनों में हेरफेर शामिल है जो व्यावसायिक सुरक्षा और स्वास्थ्य प्रशासन (ओएसए) रक्त बोर्न पैथोजेन्स मानक (29 CFR 1910.1030), यूरोपीय संसद के निर्देशक 2000/ 18 सितंबर 2000 या समकक्ष नियमों की परिषद. इसके अलावा, जैविक नमूनों में जैविक रूप से सक्रिय अन्वेषणात्मक रासायनिक यौगिकों के निशान हो सकते हैं और प्रोटोकॉल में ऐसे यौगिकों के आगे हेरफेर शामिल हो सकता है। प्रयोग की शुरुआत से पहले उपयोग किए गए यौगिकों की सुरक्षा डेटा शीट (एसडीएस) की समीक्षा करें और पर्याप्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) के उपयोग सहित अनुसंधान केंद्र में स्थापित सभी लागू सुरक्षा उपायों का कड़ाई से पालन करें। उचित सुरक्षात्मक कपड़े पहनें और प्रयोग के दौरान उचित परिरक्षण का उपयोग करें। उपयुक्त अपशिष्ट कंटेनरों (जैविक/साइटोटॉक्सिक अपशिष्ट) में अवशेषों को त्यागें।

नोट: इस प्रोटोकॉल कोशिकाओं या एक KDM1A अवरोध करनेवाला और उनके अनुपचारित या वाहन / placebo इलाज नियंत्रण3के साथ इलाज विषयों के नमूने के साथ शुरू होता है.

  1. इन विट्रो में वाहन या KDM1A अवरोध करनेवाला के साथ इलाज कोशिकाओं
    1. निलंबन में बड़े कोशिकाओं के लिए, 10 एमएल संस्कृतियों के रूप में, निलंबन को साफ 15 एमएल शंकु ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 1.1.3 पर आगे बढ़ें।
    2. अनुशीलन कोशिकाओं (75 सेमी2 फ्लास्क में विकसित) के लिए, फ्लास्क से माध्यम को हटा दें और 4 एमएल पीबीएस का उपयोग करके संक्षेप में धो लें। 2 - 5 मिनट (ट्रिप्सिनेशन शर्तों में भिन्नता हो सकती है) के दौरान 0.5% ट्रिप्सिन-EDTA के 1.5 एमएल का उपयोग करके अपने जहाजों से कोशिकाओं को अलग करें, सेल लाइन के लिए प्रदाता सिफारिशों का पालन करें), 4 एमएल पीबीएस जोड़ें और कोशिकाओं को साफ 15 एमएल शंकु ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    3. एक बेंच शीर्ष अपकेंद्रण में ट्यूब डालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 400 x g पर 5 मिनट के लिए centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा। सुपरनेंट निकालें, एक micropipette का उपयोग कर वितरित पीबीएस के 1 एमएल में गोली resuspend और एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में निलंबन हस्तांतरण.
    4. एक माइक्रोट्यूब अपकेंद्रित्र में नमूनों को सम्मिलित करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 400 x g पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रण। एक micropipette के साथ आकांक्षा द्वारा पीबीएस निकालें और या तो बर्फ पर छर्रों रखने के लिए और चरण 2 के लिए आगे बढ़ना; या सूखी बर्फ पर छर्रों फ्रीज और चरण 3 तक -80 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें स्टोर।
  2. वाहन/प्लेसबो या KDM1A अवरोध करनेवाला के साथ इलाज विषयों या जानवरों से नमूने
    1. ऊतक: एक स्केलपेल का उपयोग करके ऊतक को छोटे, $1 सेमी3 टुकड़ों में काटें। ऊतकों के टुकड़ों को देवर के पात्र में तरल छ2 में फ्रीज करें और उन्हें चरण 3 तक -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. बहुरूपी रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी): ताजा रक्त के 10 एमएल को पतला करें (रक्त वापसी के बाद अधिकतम 2 एच प्रक्रिया) के2-EDTA ट्यूबों में एकत्र किया गया जिसमें 50 एमएल शंकु ट्यूब में पीबीएस की 2 मात्रा एंबर्स हैं। निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से प्राप्त PBMC जुदाई ट्यूब का उपयोग कर रक्त से PBMCs अलग करना. बर्फ पर छर्रों रखें और चरण 3.2 के लिए आगे बढ़ना; या सूखी बर्फ पर छर्रों फ्रीज और चरण 3 तक -80 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें स्टोर।
      नोट: सेल के आकार के आधार पर 20 से 50 डिग्री सेल्सियस की गीली कोशिका गोली में 1 x 107 कोशिकाएँ होती हैं। स्वस्थ मानव रक्त के 10 एमएल से प्राप्त एक गीला पीबीएमसी गोली की मात्रा 20 डिग्री सेल्सियस होती है और इसमें 1 x 107 PBMCs होता है। ऊतक या कोशिका छर्रों को 6 महीने तक -80 oC पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. समाधान तैयारी

  1. 2 डिग्री एम ओजी-881 कार्य समाधान तैयार करें: ओजी-881 स्टॉक सॉल्यूट के 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज से बाहर 20 एम एम बायोटिनलेट जांच ओजी-881 स्टॉक समाधान का 10 डिग्री सेल्सियस एकल उपयोग एलिकोट लें और इसे 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर छोड़ दें। ओजी-881 स्टॉक सॉल्यूट के सीरियल कमजोर पड़ने से 2 डिग्री एम कार्य समाधान तैयार करें। पीबीएस में आयन, फिल्टर सुझावों के साथ एक micropipette का उपयोग कर और विभिन्न कमजोर पड़ने चरणों के बीच टिप बदल रहा है.
  2. 10x प्रोटीज अवरोधक तैयार करें: माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1 एमएल पीबीएस में 1 टैबलेट को भंग करें।
  3. 25 एनएम ओग-881 कीमोप्रोब के साथ 1x सेल lysis बफर की वांछित मात्रा तैयार करें। प्रत्येक एमएल के लिए, मिश्रण 100 $L वाणिज्यिक रूप से प्राप्त 10x सेल lysis बफर, 10x Protease inhibitor के 150 $L, 2 $M OG-881 के 12.5 $L, और प्रकार के 737.5 $L 1 डबल आसुत पानी.
  4. वैकल्पिक रूप से 1x सेल lysis बफर की वांछित मात्रा तैयार लेकिन के साथ 25 nM ORY-1001 के बजाय OG-881 के रूप में चरण 2.3 में. कम शक्तिशाली inhibitors इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन उच्च सांद्रता की आवश्यकता हो सकती है, के साथ सकारात्मक नियंत्रण में उपयोग के लिए 100% निषेध (चरण देखें 3.5).
    नोट: OG-881 या KDM1A अवरोध करनेवाला स्टॉक समाधान के साथ समाधान या नमूने के किसी भी अवांछित संदूषण से बचने के लिए उचित उपाय करें। 25 एन एम ओग-881 के साथ 1x सेल lysis बफर की वांछित मात्रा की गणना करने के लिए, मान लें कि 400 डिग्री सेल्सियस pulverized ऊतक की 40 मिलीग्राम, या 107 कोशिकाओं की गीला गोली प्रति 200 डिग्री सेल्सियस की आवश्यकता है।

3. मूल प्रोटीन निष्कर्षण

  1. ऊतकों से:
    1. एक मोर्टार और मूसल सूखी बर्फ पर ठंडा के साथ जमे हुए ऊतक के एक $ 1 सेमी3 घन pulverize और homogenize. अलीकोट एकल उपयोग शीशियों में नमूनों जिसमें $ 40 मिलीग्राम ऊतक पाउडर होता है, हर समय थिंग से बचें। चरण 3.1.2 पर आगे बढ़ें. तत्काल प्रसंस्करण या -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान के लिए।
    2. 40 मिलीग्राम में पाउडर ऊतक के 400 डिग्री एल 1x सेल Lysis बफर के साथ 25 एनएम OG-881, 10 s के लिए भंवर, और एक 18 गेज कुंद सिरिंज के माध्यम से कम से कम पांच बार बल ऊतक के lysis हासिल की है और नारंगी निलंबन के लिए एक turbid प्रकाश पीला है प्राप्त. बुलबुला गठन से बचें।
    3. चरण 3.3 पर जारी रखें
  2. सेल छर्रों से (PBMCs और सेल लाइनों):
    1. 1x सेल lysis बफर के 200 डिग्री एल में 1 x 107 कोशिकाओं की एक गोली को पुन: निलंबित 25 एन एम ओजी-881 युक्त. नमूने संक्षेप में भंवर और उन्हें 5 मिनट के लिए बर्फ पर रहते हैं.
    2. Sonicate एक sonicator में नमूने का उपयोग कर 20 एस प्रत्येक 45 kHz पर प्रत्येक के 3 दालों; उन्हें दालों के बीच 20 s के लिए बर्फ पर जगह है.
      नोट: जैसे ही जैविक नमूने 1x सेल lysis बफर में resuspended किया गया है, उन्हें प्रक्रिया के बाकी के दौरान बर्फ पर रखें.
  3. एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने रखें, भंवर संक्षेप में और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक पूर्व ठंडा अपकेंद्रित्र में 14 000 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए नमूने centrifuge.
  4. 1 एमएल माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, सुपरनेट्स को ताजा 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और उन्हें 2 ज के दौरान बर्फ पर छोड़ दें। चरण 4 के लिए जारी रखें।
  5. वैकल्पिक रूप से, 100% लक्ष्य सहभागिता का अनुकरण करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण निम्नानुसार तैयार किया जा सकता है:
    1. एक वाहन या अनुपचारित (प्रीडोज) नमूना से सेल गोली या पाउडर ऊतक को 25 एनएम ORY-1001 के साथ 1x सेल Lysis बफर की आवश्यक मात्रा में नमूना और चरण 3.1 से 3.3 में उल्लिखित के रूप में प्रक्रिया को पुन: असाइन करें।
    2. सकारात्मक नियंत्रण के supernatants ताजा 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों में स्थानांतरण और उन्हें बर्फ पर छोड़ 1 h. ORY-1001 जानबूझकर KDM1A और ब्लॉक chemoprobe बाध्यकारी बाधा.
    3. सकारात्मक नियंत्रण supernatant के लिए 2 डिग्री एम ओजी-881 काम समाधान के 5 डिग्री एल जोड़ें (एक 40 मिलीग्राम ऊतक नमूने से उत्पन्न सकारात्मक नियंत्रण के लिए मात्रा) या 2.5 $L के 2 $M OG-881 काम कर रहे समाधान (एक 107-सेल नमूना से उत्पन्न सकारात्मक नियंत्रण के लिए मात्रा) प्राप्त करने के लिए अन्य नमूनों के रूप में एक ही OG-881 एकाग्रता और 2 ज के दौरान बर्फ पर छोड़ दें. चरण 4 के लिए जारी रखें।

4. ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग कर देशी प्रोटीन की मात्रा

  1. व्यावसायिक रूप से sourced ब्रैडफोर्ड प्रोटीन असेस अभिकर्मक एच2हे प्रकार 1 डबल आसुत पानी के साथ 5 बार Dilute. नमूनों और मानकों की कुल राशि के लिए आवश्यक अभिकर्मक की मात्रा की गणना (1 एमएल प्रति नमूना या मानक + 5 एमएल अतिरिक्त मात्रा).।
  2. बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) मानक वक्र के लिए, 1 एमएल पतला ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख समाधान (रिक्त) और पतला ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख समाधान के 995 $L के साथ सात माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के साथ एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें। बीएसए मानकों में से प्रत्येक के 5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें (से लेकर एकाग्रता 125 से 2,000 डिग्री सेल्सियस / आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  3. पतला मानकों cuvettes के लिए स्थानांतरण और 280 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में खाली और बोवाइन सीरम Albumin मानक नमूने के ओडी पढ़ें.
  4. जैविक नमूनों के लिए, 1 एमएल पतला ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख समाधान (रिक्त) के साथ एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें और पतला ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख अभिकर्मक के 999 $L के साथ कई माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के रूप में नमूने जो मात्रा निर्धारित करने की आवश्यकता है। एक स्वत: P2 micropipette का उपयोग करना, प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब के लिए चरण 3 में तैयार देशी प्रोटीन निकालने के 1 $L जोड़ें और धीरे ट्यूब कई बार उलटा द्वारा मिश्रण. आरटी में नमूने 5 मिनट इनक्यूबेट करें।
  5. मात्रा cuvettes करने के लिए स्थानांतरण और 280 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में नमूनों की ओडी पढ़ें।
  6. प्राथमिकता से, चरण 5 के लिए तुरंत आगे बढ़ें। वैकल्पिक रूप से, चरण 5 तक -80 डिग्री सेल्सियस पर देशी प्रोटीन के अर्क की दुकान. फ्रीज thaw चक्र से बचें.

5. कुल और नि: शुल्क KDM1A दृढ़ संकल्प के लिए चमकदार ELISAs

नोट: प्रयोगशाला के तापमान को 23-24 डिग्री सेल्सियस (आरटी) पर स्थिर रखें।

  1. कब्जा KDM1A एंटीबॉडी या Streptavidin के साथ microtiter प्लेटों की कोटिंग
    1. कुल KDM1A ELISA: प्रत्येक प्लेट के लिए, KDM1A के 10 एमएल PBS में 2 g/mL की एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रतिशरीर पर कब्जा तैयार. प्लेट के प्रत्येक कुएं में 100 डिग्री सेल्सियस का अंतरण करें।
    2. नि: शुल्क KDM1A एलिसा: प्रत्येक प्लेट के लिए, PBS में 10 g/mL पर streptavidin के 10 एमएल तैयार करते हैं। प्लेट के प्रत्येक कुएं में 100 डिग्री सेल्सियस का अंतरण करें।
    3. चिपकने वाला फिल्म के साथ कुल और नि: शुल्क KDM1A एलिसा प्लेटों को टॉप-सील करें और फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  2. प्लेटों को धोना और अवरोधित करना
    1. प्लेटों को फ्रिज से बाहर निकाल लें और उपयोग करने से पहले आरटी पर लगभग 45 मिनट के लिए उन्हें बराबर होने दें।
    2. प्रति प्लेट 1,000 एमएल वॉश बफर (0.1% ट्वीन इन पीबीएस) और 50 एमएल ब्लॉकिंग बफर (1% बीएसए पीबीएस में) तैयार करें।
    3. प्लेटों को 3 बार वॉश बफर के साथ धो लें। इस और बाद के चरणों में, अवशिष्ट समाधान को हटाने के लिए हर धोने के कदम के बाद कागज तौलिए पर प्लेट टैप करें।
    4. दोनों प्लेटों के लिए अच्छी तरह से बफर अवरुद्ध के 200 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, एक चिपकने वाला फिल्म के साथ दोनों प्लेटों को शीर्ष सील और आरटी में 2 एच इनक्यूबेट।
  3. जैविक नमूना तैयारी
    1. पीबीएस का उपयोग कर उचित एकाग्रता के लिए चरण 3 के अंत में प्राप्त देशी प्रोटीन अर्क को पतला करें। सिफारिश की एकाग्रता जैविक नमूने में KDM1A अभिव्यक्ति के स्तर के समारोह में अलग अलग होंगे. उपयुक्त पर्वतमाला के उदाहरण हैं (1) सेल छर्रों: 0.5 - 10 $g प्रति अच्छी तरह से. (2) PBMCs: 5 - 30 $g प्रति अच्छी तरह से. (3) pulverized ऊतक (मस्तिष्क, फेफड़े, त्वचा): 20 - 100 g प्रति अच्छी तरह से. तैयारी के दौरान बर्फ पर नमूने रखें. जब संभव हो, तकनीकी triplicate नमूना विश्लेषण चलाते हैं.
    2. मानव rKDM1A का उपयोग कर एक मानक वक्र तैयार करें:
      1. KDM1A मानक कार्य समाधान तैयार करने के लिए, 25 pg/$L की एक अंतिम एकाग्रता के लिए rKDM1A की उचित मात्रा pipet, जोड़ें 75 $L के 2 $M OG-881, और एक 15 एमएल बाज़ ट्यूब में 6 एमएल की कुल मात्रा के साथ पूरा करें. 1 ज के दौरान बर्फ पर KDM1A मानक काम समाधान रखें और 15 एमएल बाज़ ट्यूब कई बार हर 20 मिनट उलट द्वारा धीरे समाधान मिश्रण.
      2. KDM1A मानक Dilution श्रृंखला में तैयार 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों के अनुसार तालिका 1 (मानक तैयारी), मात्रा में पर्याप्त मात्रा में दो 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेटों के triplicate विश्लेषण के लिए.
मानक श्रृंखला KDM1A मानक कार्य समाधान ($L)
(पीजी KDM1A/ पीबीएस (जेडएल)
सी के लिए 2500-* 800 -
2500 800 -
1750 560 240
1250 400 400
750 240 560
250 80 720
25 8 792
0 0 800
नोट:
(1) प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए तैयार मात्रा परख के 2 प्लेटों में tripping में चलाने के लिए पर्याप्त है.
(2) की सिफारिश की सीमा के बीच है 2.5 और 5,000 pg /
* नकारात्मक नियंत्रण सी के लिए-, KDM1A का पता लगाने एंटीबॉडी के बिना

तालिका 1: मानक तैयारी| KDM1A प्रोटीन के मानक श्रृंखला तैयार करने के लिए, pipette KDM1A मानक काम कर समाधान और PBS के संकेत मात्रा में आठ ठीक से लेबल 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों.

Table 2
तालिका 2: डीप वेल प्लेट डिजाइन. मानक (नीला) और नमूने (पीला) चरण 5.4.2 से. नीले (मानक) और पीले (नमूने) तीर की दिशा के बाद एलिसा प्लेटों में लोड करने की सुविधा के लिए डीप वेल प्लेट की परिलक्षित स्थितियों में पाइप किए गए थे। इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Table 3
तालिका 3: एलिसा प्लेट डिजाइन. परख प्लेट पुनः संयोजक KDM1A लक्ष्य की मात्रा कम के साथ मानक वक्र भी शामिल है (नीले रंग में); पीले रंग में जैविक नमूने (एस); और इसी नकारात्मक नियंत्रण (नमूने लेकिन नहीं प्राथमिक पता लगाने एंटीबॉडी शामिल) सफेद में, गहरी अच्छी तरह से प्लेट से ELISA प्लेटों पर लोड किया जा करने के लिए. रिक्त (0 मानक वक्र में) सभी कैप्चर और डिटेक्शन अभिकर्मकों लेकिन कोई नमूना शामिल हैं। इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

  1. एलिसा
    1. (चरण 5.2.4 से जारी रखा.) 2 ज ऊष्मायन के बाद, अवरुद्ध बफर को त्यागें और प्लेटों को वॉश बफर के साथ धो लें।
    2. उचित रूप से पतला नमूनों (देशी प्रोटीन के अर्क और मानक वक्र चरण 5.3. से) को तालिका 2 (डीप वेल प्लेट डिजाइन) में दिखाए गए प्लेट वितरण के बाद एक रेफ्रिजरेटेड 96 गहरे अच्छी तरह से भंडारण ब्लॉक में स्थानांतरित करें।
    3. इस ब्लॉक को तब तक बर्फ पर रखें जब तक कि सारणी 3 (एलिसा प्लेट डिजाइन) में दर्शाए गए प्लेट वितरण के बाद कुल और नि:शुल्क एलिसा प्लेटों में 100 डिग्री सेल्सियस का नमूना न लें।
    4. आरटी में 1 एच के लिए इनक्यूबेट, नमूनों को त्यागें और प्लेटों को धोने बफर के साथ 5 बार धोएं।
    5. बफर को अवरुद्ध करने में 0.125 ग्राम/एमएल पर खरगोश विरोधी KDM1A का पता लगाने एंटीबॉडी के 20 एमएल तैयार, परख की प्रत्येक प्लेट में अच्छी तरह से 100 $L जोड़ें, नकारात्मक नियंत्रण सी करने के लिए इसी कुओं को छोड़कर. प्लेट को टॉप-सील करें और आरटी में 1 एच इनक्यूबेट करें।
    6. पता लगाने एंटीबॉडी समाधान छोड़ें और प्लेटों धोने बफर के साथ 6 बार धो लें।
    7. बफर अवरुद्ध करने में एक कमजोर पड़ने 1:5,000 करने के लिए माध्यमिक बकरी विरोधी rabbit एंटीबॉडी एचआरपी के 25 एमएल तैयार, microtiter प्लेटों के लिए अच्छी तरह से प्रति 100 $L जोड़ें; और आरटी में 1 एच इनक्यूबेट करें।
  2. केमिल्लुमिनसेंट डिटेक्शन
    1. चरण 5.4.7 के अंत से पहले 30 मिनट. और नरम प्रकाश शर्तों के तहत, एक एम्बर बोतल में Luminol-Enhancer और पेरोक्साइड समाधान (10.5 एमएल: 10.5 एमएल, 2 प्लेटों के लिए) के बराबर भागों मिश्रण और यह आरटी पर छोड़ दें।
      नोट: एक एम्बर बोतल में Luminol कार्य समाधान रखें और किसी भी तीव्र प्रकाश के लिए लंबे समय तक जोखिम से बचें. ठेठ प्रयोगशाला प्रकाश व्यवस्था के लिए अल्पकालिक जोखिम काम कर समाधान नुकसान नहीं होगा.
    2. संदीप्ति को मापने से पहले कम से कम 20 मिनट, 25 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोप्लेट रीडर पर स्विच करें और 1,000 एमएस एकीकरण समय और 150 एमएस बसने के समय के लिए readouts की स्थापना की। पैरामीटर सेटिंग्स साधन के समारोह में अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है.
    3. चरण 5.4.7. में 1 ज ऊष्मायन के बाद, द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को त्याग दें और प्लेटों को 6 बार वॉश बफर से धो लें।
    4. पिपेट 100 $L प्रति अच्छी तरह से Luminol कार्य समाधान (Chemiluminescent Substrate) चरण 5.5.1 में तैयार की. पिपेट बहुत धीरे धीरे और बुलबुला गठन से बचें। समाधान के अलावा और प्लेटों के संदीप्ति माप के अलावा के बीच समय को नियंत्रित करने के लिए एक टाइमर का उपयोग करें और इस समय एक अच्छा अंतर परख reproducibility प्राप्त करने के लिए स्थिर रखने के लिए।
    5. किसी भी शेष बुलबुले को खत्म करने के लिए एक प्लेट अपकेंद्रित्र में 45 एस के लिए आरटी पर प्लेटों और सेंट्रीफ्यूज को 500 x ग्राम के लिए टॉप-सेल करें। प्लेटको 100 आरपीएम पर प्लेट शेकर पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. पाठक के अंदर थाली डालें और यह 3 मिनट के लिए छोड़ 25 डिग्री सेल्सियस पर तापमान को स्थिर करने के लिए (संचन फिल्म के बिना). हमेशा नि: शुल्क एलिसा प्लेट के साथ शुरू करते हैं।
    7. प्रत्येक एलिसा प्लेट परख (मुक्त और कुल KDM1A) के सापेक्ष संदीप्ति इकाइयों (RLU) पढ़ें.
    8. सहेजें और कच्चे डेटा से कच्चे RLU मूल्यों की प्रतिलिपि बनाएँ परिणामों के आगे विश्लेषण के लिए फ़ाइलें उत्कृष्टता.

6. लक्ष्य सगाई की गणना

  1. एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में, नमूने एसएक्स और संदर्भ नमूने REF (अशोधित, वाहन या पूर्व खुराक नमूना) के RLU नि: शुल्क और RLU कुल मूल्यों की गणना उनके तकनीकी प्रतिकृति कच्चे डेटा से नीचे के रूप में:
    1. विश्लेषण डेटा पत्रक (जैसे, एक्सेल) में रिक्त स्थान, मानक वक्र, नकारात्मक नियंत्रण सी- और जैविक नमूने (एसएक्स और आरईएफ) से व्यक्तिगत कच्चे RLUi कुल और कच्चे RLUi नि: शुल्क डेटा दर्ज करें। साथ ही, डेटा पत्रक में मानक वक्र से KDM1A की मात्रा (पीजी में) दर्ज करें।
    2. प्रत्येक तकनीकी प्रतिकृति डेटा बिंदु के लिए अलग-अलग Raw Total और Raw Free RLUi डेटा से Raw माध्य RLU, मानक विचलन, RLU,और भिन्नता CVRLU के गुणांक की गणना करें।
    3. बाहरी उन्मूलन लागू करें (उदाहरण triplicates के लिए): प्रत्येक व्यक्ति के लिए कच्चे RLU कुल और कच्चे RLU नि: शुल्क डेटा बिंदु RLUi एक तकनीकी triplicate datapoint से, Grubs मापदंड लागू जब trilicate के लिए CV और 0.15, और एक संदिग्ध कच्चे RLU मूल्य अस्वीकार कब
      Equation 1,
      जिससे द के लिए $ 1ण्148 और 90 प्रतिशत विश्वास अंतराल (सीआई) है।
    4. बाहरी उन्मूलन लागू किया गया था, तो कच्चे मतलब RLU, मानक विचलन -RLU और CVRLU गैर-निरस्त (एनआर) कच्चे RLUi कुल और कच्चे RLUi मुक्त मान प्रत्येक डेटा बिंदु के लिए से पुन: गणना।
    5. पृष्ठभूमि सुधार लागू करें: प्रत्येक मानक नमूने के लिए औसत RLU नि: शुल्क और RLU कुल मान की गणना, और प्रत्येक नमूना एसएक्स और संदर्भ नमूना REF के रूप में:
      Equation 2
      Equation 3
  2. रेखांकन के रूप में डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं:
    1. RLUनि: शुल्क और RLUकुल मान (Y-अक्ष) उनके नमूना पहचान (X-अक्ष) के सापेक्ष एक बार ग्राफ में प्लॉट.
    2. इसके अलावा RKDM1A प्रोटीन (X-अक्ष) के pg की उनकी मात्रा के सापेक्ष एक तितर बितर साजिश में मानकों के RLU मूल्यों (Y-अक्ष) मुक्त और कुल माप के लिए, साथ ही इसी रैखिक trendlines साजिश और r2 की गणना (रेखीय के वर्ग सहसंबंध गुणांक) मान.
  3. लक्ष्य सगाई की गणना (टीई); यानी एक संदर्भ नमूना REF (अशोधित, वाहन या पूर्व खुराक नमूना) के सापेक्ष प्रत्येक नमूना एसएक्स में KDM1A अवरोध करनेवाला द्वारा बाध्य KDM1A का प्रतिशत निम्नानुसार:
    1. SX और REF नमूनों के लिए कुल मानों के लिए RLU नि: शुल्क के अनुपात R की गणना करें:
      Equation 4
      Equation 5
    2. फिर के रूप में नमूना एसएक्स के लक्ष्य सगाई (टीई) की गणना:
      Equation 6
      वैकल्पिक: (1) यदि N जैविक प्रतिकृति प्रयोगों का आयोजन किया गया, n तकनीकी प्रतिकृति के साथ प्रत्येक; पहले तकनीकी प्रतिकृति सेट के लिए TESX की गणना. बाद में, जैविक प्रतिकृति सेट के लिए मतलब TE, एसडी और सीवी मूल्यों की गणना.
  4. संशोधन कि परख स्वीकृति मापदंड मिले हैं: सत्यापित करें कि (1) परख पृष्ठभूमि स्वीकार्य है और मतलब रिक्त और 0.05 x 107 RLU; (2) नमूना ऑटो-ल्यूमिनसेंस अनुपस्थित है और नकारात्मक नियंत्रण सी के आरएलयू क्वांटिफिकेशन की निचली सीमा से नीचे हैं (LLOQ ] मतलब खाली + 10x एसडी); (3) rKDM1A मानक वक्र रैखिक और r2 है $ 0.98; (4) जैविक नमूनों में आरएलयू मान होते हैं जो परख की गतिशील और रैखिक श्रेणी में आते हैं अर्थात LLOQ और 2,500 pg/well के बीच।
    नोट: चरण 6.1. 6.4 करने के लिए. एक पथरी डेटा शीट में आसानी से स्वचालित किया जा सकता है.
  5. एक खुला स्रोत के लिए TE डेटा निर्यात या व्यावसायिक रूप से प्राप्त TE मूल्यों और अतिरिक्त सांख्यिकीय मूल्यांकन के चित्रमय प्रतिनिधित्व के लिए पसंद के आँकड़े सॉफ्टवेयर.

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Representative Results

कुल और नि: शुल्क KDM1A दृढ़ संकल्प की रैखिकता.

एक मानक श्रृंखला के रूप में चरण 5.3.2 में वर्णित तैयार किया गया था, का उपयोग कर 0 करने के लिए 2500 पूर्ण लंबाई मानव पुनः संयोजक KDM1A एंजाइम के पीजी. कुल और नि: शुल्क rKDM1A के RLU मूल्यों रैखिकता सत्यापित करने के लिए मूल्यांकन किया गया (चित्र 2A और 2B) . डेटा 3 तकनीकी प्रतिकृतियां (एन) - एसडी के साथ 3 प्रयोगों से मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. 3 स्वतंत्र स्वयंसेवकों के रक्त से मानव पीबीएम में पाए गए कुल और नि: शुल्क केडीएम1ए के आरएलयू मूल्यों को चित्र 2 सी और 2 डीमें मानक वक्र पर रखा जाता है . रक्त के नमूने Instituto de Investigaci-n Biom$dica संत पाउ Biobank स्पेनिश कानून के अनुसार प्राप्त किए गए (रियल Decreto de Biobancos 1716/2011) और स्थानीय नैतिकता समितियों के अनुमोदन.

Figure 2
चित्र 2. स्वस्थ स्वयंसेवकों के PBMCs में कुल और नि: शुल्क rKDM1A का निर्धारण. ELISA (A) द्वारा मूल्यांकन कुल rKDM1A के RLU मान और नि: शुल्क rKDM1A की chemoprobe कब्जा ELISA (बी) द्वारा मूल्यांकन किया. डेटा 3 प्रतिकृति प्रयोगों से प्राप्त किए गए थे, प्रत्येक trilicate में विश्लेषण किया (एन $ 3; द ] 3). कुल KDM1A के RLU मूल्यों ELISA (सी) और नि: शुल्क KDM1A (डी) के 3 स्वतंत्र अनुपचारित स्वयंसेवकों (लाल, नीले और हरे वर्गों) मानक वक्र पर अध्यित के PBMCs के लिए मूल्यांकन किया. आंकड़े त्रिफला में विश्लेषण किए गए एक प्रयोग से प्राप्त किए गए थे (छ र् 1; द ] 3)। प्रतिनिधित्व किए गए मान इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें - SD. कृपया यहाँ क्लिक करें।

कोशिकाओं में KDM1A लक्ष्य सगाई का विश्लेषण

एएमएल कोशिकाओं प्रदाता सिफारिशों के बाद सुसंस्कृत थे. कोशिकाओं को वाहन या ORY-1001 के साथ विभिन्न सांद्रता (0ण्25; 0ण्5; 1; 5 और 25 दम) (चित्र3) में उपचारकिया गया था। देशी प्रोटीन के अर्क 25 एनएम ओजी-881 कीमोप्रोब की उपस्थिति में प्राप्त किए गए थे। कुल प्रोटीन के 0.5 डिग्री ग्राम पहले वर्णित के रूप में लक्ष्य सगाई विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. कुल और मुक्त KDM1A निर्धारित किया गया था, और KDM1A करने के लिए ORY-1001 के लक्ष्य सगाई के प्रतिशत के रूप में वर्णित वाहन के सापेक्ष गणना की गई थी.

Figure 3
चित्र 3. एक मानव एएमएल सेल लाइन में KDM1A लक्ष्य सगाई की खुराक प्रतिक्रिया. कोशिकाओं को वाहन या ORY-1001 के साथ विभिन्न सांद्रता (0.25; 0.5; 1; 5 और 25 एनएम) पर इलाज किया गया और वर्णित के रूप में लक्ष्य सगाई के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया. डेटा 3 प्रतिकृति प्रयोगों से प्राप्त किए गए थे, प्रत्येक trilicate में विश्लेषण किया (एन $ 3, द ] 3). प्रतिनिधित्व किए गए मान इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें - SD. कृपया यहाँ क्लिक करें।

vivo KDM1A लक्ष्य सगाई में का विश्लेषण

इस प्रयोग का उद्देश्य खुराक स्तर के समारोह में, विभिन्न चूहे ऊतकों में ORY-1001 के लक्ष्य सगाई की विशेषता थी. इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, 15 Sprague-Dawley चूहों (200-250 ग्राम) परीक्षण परिसर द्वारा संभावित संदूषण से बचने के लिए एक cytostatic सुरक्षा कमरे में रखे गए थे. अधिकतम 3 चूहों/पिंजरों को बेतरतीब ढंग से 5 अध्ययन समूहों को सौंपा गया था। 5 विभिन्न अध्ययन समूहों प्राप्त, क्रमशः, वाहन; 1; 3; लगातार 4 दिनों के लिए मौखिक प्रशासन द्वारा ORY-1001 के 10 या 30 g / किलो. यौगिक स्टॉक समाधान दैनिक तैयार किए गए थे। जानवरों के लिए आवश्यक मात्रा को समायोजित करने के लिए प्रत्येक प्रशासन से पहले तौला गया. सभी जानवरों को लगातार कमरे के तापमान (20 - 24 oC) और सापेक्ष आर्द्रता (45 - 65 %) पर रखे गए थे एक 12 एच प्रकाश अंधेरे चक्र के तहत (6:00 AM पर रोशनी). भोजन और पानी उपलब्धथे . रक्त के नमूने एकत्र किए गए थे 2 एच के बाद पिछले प्रशासन के बाद2EDTA ट्यूबों और PBMCs चरण 1.2.2 में पहले वर्णित प्रक्रिया के अनुसार अलग थे. और देशी प्रोटीन निष्कर्षण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित. फेफड़ों के नमूने भी पिछले दवा प्रशासन के बाद 2 एच एकत्र किए गए थे, तरल नाइट्रोजन में तुरंत जमे हुए, और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत. PRAAL-PCB में पशु प्रयोग के लिए नैतिक समिति द्वारा स्थापित प्रयोगशाला पशुओं (यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देशक 86/609/EEC) की देखभाल और उपयोग के लिए संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार अध्ययन किए गए।

pulverization के बाद, फेफड़ों से देशी प्रोटीन के अर्क के रूप में वर्णित और मात्रा निर्धारित प्राप्त किए गए थे. जमा PBMCs से कुल प्रोटीन के 5 डिग्री या 3 जानवरों से फेफड़ों से कुल प्रोटीन के 7.5 डिग्री ग्राम प्रति खुराक समूह का इस्तेमाल किया गया KDM1A लक्ष्य सगाई परख चलाने के लिए.

पीबीएमसी में केडीएम1ए लक्ष्य सगाई की खुराक-प्रतिक्रिया और मौखिक गाव द्वारा ORY-1001 के साथ चूहों के फेफड़ों के उपचार में, वाहन समूह के सापेक्ष गणना चित्र 4A और 4Bमें दिखाया गया है। जैसा कि चित्र 4 Cमें देखा जा सकता है , वाहन से उपचारित पशुओं से फेफड़ों के प्रोटीन के अर्क के 25 एन एम ORY-1001 के साथ पूर्व विवो ऊष्मायन अभी तक पूर्ण TE पैदावार, लेकिन आगे नहीं बढ़ा ताक में चूहों से नमूनों में 30 डिग्री/ , KDM1A की पुष्टि पहले से ही पूरी तरह से विवो में बाधित किया गया था.

Figure 4
चित्र 4. विवो और पूर्व vivo देशी KDM1A लक्ष्य सगाई में. PBMCs में KDM1A लक्ष्य सगाई की खुराक प्रतिक्रिया (ए) और फेफड़ों के नमूने (बी) लगातार 4 दिनों के लिए ORY-1001 के साथ इलाज चूहों से (पी.ओ.) डेटा पूल्ड PBMCs से प्राप्त किए गए थे प्रति सहगण 3 जानवरों से अर्क, डुप्लिकेट में विश्लेषण (एन $ 1, n ] 2) या फेफड़ों से 3 अलग-अलग जानवरों से प्रति सहगण, trilicate में विश्लेषण किया (एन $ 3, n ] 3). C. वाहन के साथ इलाज चूहों के पूल्ड फेफड़ों प्रोटीन अर्क में टीई की तुलना (बाएं) या 30 ग्राम/ के बाद 1 एच पूर्व vivo बिना अर्क के ऊष्मायन (ग्रे सलाखों) या के साथ 25 nM ORY-1001 (नीले सलाखों) (एन $ 3, n ] 3). सभी डेटा साधन के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं - एसडी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल सीधे एक उपन्यास KDM1A chemoprobe कब्जा आधारित एलिसा का उपयोग कर KDM1A लक्ष्य सगाई को मापने के लिए विकसित किया गया था. विधि सुसंस्कृत मानव सेल लाइनों और मानव, चूहे और माउस और baboon (PBMCs, फेफड़े, मस्तिष्क, त्वचा, ट्यूमर सहित) से पूर्व vivo नमूने पर मान्य किया गया है, लेकिन आसानी से अन्य प्रजातियों में जो KDM1A एंटीबॉडी लक्ष्य प्रतीक और उत्प्रेरक के लिए लागू किया जा सकता है केंद्र संरक्षित हैं। के रूप में OG-881 एक गतिविधि आधारित chemoprobe है, नमूना गुणवत्ता महत्वपूर्ण है और उचित हेरफेर और नमूनों के संरक्षण विशेष रूप से प्रोटोकॉल के प्रारंभिक चरणों के दौरान पीछा किया जाना चाहिए, यह सुनिश्चित करने के लिए KDM1A गतिविधि संरक्षित है.

वर्तमान प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल covalent FAD लक्ष्यीकरण inhibitors द्वारा KDM1A लक्ष्य सगाई का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया गया था. यह भी प्रतिवर्ती inhibitors कि KDM1A के FAD cofactor के लिए उपयोग ब्लॉक के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. लंबे निवास समय के साथ शक्तिशाली प्रतिवर्ती अवरोधक असंशोधित प्रोटोकॉल को रोजगार कर सकते हैं।

OG-881 chemoprobe उच्च ऑफ-रेट के साथ कम शक्ति प्रतिवर्ती अवरोधकों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। विशेष chemoprobe इस पांडुलिपि में इस्तेमाल किया सेल penetrant नहीं है और इसलिए विश्लेषण lysed नमूनों पर पूर्व vivo प्रदर्शन कर रहे हैं.

विधि उपकरणों है कि अनुसंधान और विश्लेषणात्मक प्रयोगशालाओं में मोटे तौर पर उपलब्ध हैं पर चलाया जा सकता है; यह आनुवंशिक संशोधनों की आवश्यकता नहीं है कोशिकाओं में पेश किया जा करने के लिए, और यह आसानी से विभिन्न प्रकार के नमूने के लिए लागू किया जा सकता है. एक और लाभ यह है कि यह अक्सर अवधारणा अध्ययन के पूर्व नैदानिक सबूत में और toxicology मॉडल में उपयोग किया जाता है कि विभिन्न प्रजातियों से व्युत्पन्न नमूनों पर इस्तेमाल किया जा सकता है और यह सफलतापूर्वक नैदानिक नमूनों का विश्लेषण करने के लिए अनुवाद किया गया है कि.

अन्य तरीकों KDM1A लक्ष्य सगाई के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन तरीकों में से कई H3K4me2 हिस्टोन निशान के परिवर्तन की तरह प्रॉक्सी मार्करों का उपयोग करें, AlphaLisa15का उपयोग; या क्यूआरटी-पीसीआर या FACS विश्लेषण16का उपयोग कर अभिव्यक्ति मार्करों के प्रेरण। हालांकि, कोशिकाओं या ऊतकों में, हिस्टोन के निशान कई कारकों द्वारा नियंत्रित होते हैं, और परख जो हिस्टोन मार्क में परिवर्तन को मापते हैं हमेशा विश्लेषण के लिए एक अच्छा गतिशील रेंज प्रदान नहीं करते हैं। KDM1A निषेध जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति में शक्तिशाली परिवर्तन पैदा कर सकते हैं, लेकिन प्रतिक्रिया बहुत विषम और उच्च सेल संदर्भ निर्भर करने के लिए जाता है, जो खुराक प्रतिक्रिया के विश्लेषण जटिल हो सकता है3,7.

इसलिए, लक्ष्य सगाई को मापने के लिए सबसे अच्छा विकल्प लक्ष्य के कब्जे का प्रत्यक्ष मूल्यांकन है। एक परख है कि इस के लिए प्रस्तावित किया गया है सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख (CETSA), inhibitors के बंधन पर लक्ष्य प्रोटीन की थर्मल स्थिरता की वृद्धि पर आधारित है. इस विधि, सिद्धांत रूप में, असंशोधित कोशिकाओं और विभिन्न ऊतक प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है और हाल ही में खेती की कोशिकाओं में KDM1A inhibitors की सेलुलर गतिविधि का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है17. हालांकि, इस तकनीक का इस्तेमाल विवो फार्माकोडायनामिक्स अध्ययन18 में किया गया है और हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, इसके उपयोग की नैदानिक परीक्षणों में रिपोर्ट नहीं की गई है।

यहाँ प्रदान की प्रोटोकॉल एक पूरी तरह से मान्य chemoprobe आधारित विधि है जो कोशिकाओं और ऊतक के नमूने में KDM1A लक्ष्य सगाई निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है का वर्णन करता है. विधि सफलतापूर्वक एक KDM1A अवरोध करनेवाला के साथ इलाज मानव विषयों के नमूनों का विश्लेषण करने के लिए अनुवाद किया गया है19 और नैदानिक परीक्षणों में मॉडल पीके/पीडी प्रतिक्रियाओं के लिए महान उपयोग का हो जाएगा.

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Disclosures

लेखक Tamara Maes एक कार्यकारी निदेशक और शेयरधारक है, और लेखक क्रिस्टिना कास्का और राकेल Ruiz Rodriguez Oryzon जीनोमिक्स S.A. Oryzon जीनोमिक्स एस.ए. के कर्मचारी हैं KDM1A inhibitors विकसित करता है और पेटेंट कवर यौगिकों और तरीकों का इस्तेमाल किया रखती है इस अनुच्छेद में.

Acknowledgments

इस अध्ययन Oryzon जीनोमिक्स द्वारा वित्त पोषण किया गया था. एस.ए., हॉफमैन-ला Roche, और आंशिक रूप से CIIP-20152001 और RETOS सहयोग कार्यक्रम RTC-2015-3332-1 द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0,05% Trypsin-EDTA (1X) Thermo Scientific #25300-062
10 X Protease Inhibitor Tablets Roche #11836153001
96 deep well storage block VWR #734-1679
96 well ELISA plates Nunc #436110
Adhesive black Film Perkin Elmer #6050173
Adhesive transparent Film VWR #60941-062
Biotinylated KDM1A probe OG-881 Oryzon Genomics S.A. NA
Bovine Serum Albumin Sigma # 3117057001
Bovine Serum Albumin Standard Thermo Scientific #23208)
Bradford Protein Assay BioRad #500-0001
Cell lysis buffer 10X Cell Signaling #9803
Centrifuge for 96- well plates Hettich Rotina 420R
Flask Thermo Scientific #156499
Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A Active Motif #31426
Graphpad Prism 5 Project GraphPad Software NA
Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) Thermo Scientific #37074
Micro Centrifuge Eppendorf 5415 R
Microplate reader Infinite 200-Tecan Tecan Infinite 200
Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) Abcam #ab53269
Needle G18 gauge blunt BD #303129
ORY-1001 (iadademstat) Oryzon Genomics S.A. NA
PBMC separation tubes 10 ml Greiner bio-one #163288
PBMC separation tubes 50 ml Greiner bio-one #227288
PBS 1x Sigma #D8537
Plate shaker Heidolph Instruments Rotamax 120
Polysorbate 20 Sigma #P7949
Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) Cell Signaling #672184BF-100
Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG Thermo Scientific #31458
Spectrophotometer cuvette 1.5 Deltalab #302100
Spectrophotometer for cuvette GE Healthcare GeneQuant 1300
Streptavidin Promega #Z704A
Syringe BD #303172
Type 1 ultrapure water Millipore Milli-Q Advantage A10
Ultrasonic cleaner VWR USC200T

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References

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Mascaró, C., Ruiz Rodriguez, R., Maes, T. Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays. J. Vis. Exp. (148), e59390, doi:10.3791/59390 (2019).

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