Summary
Her præsenterer vi en protokol til måling KDM1A Target engagement i en menneske-eller dyrecelle, væv eller blodprøver behandlet med KDM1A-hæmmere. Protokollen anvender chemoprobe-mærkning af det frie KDM1A enzym og direkte kvantificering af målbesættelsen ved hjælp af chemoprobe-baserede immunassays og kan anvendes i prækliniske og kliniske studier.
Abstract
Vurderingen af Target engagement, defineret som samspillet mellem et lægemiddel med det protein, det var designet til, er et grundlæggende krav for fortolkningen af den biologiske aktivitet af enhver forbindelse i narkotika udvikling eller i grundlæggende forskningsprojekter. I Epigenetik, Target engagement er oftest vurderes af analysen af proxy markører i stedet for at måle Unionen af forbindelsen til målet. Downstream biologiske udlæsninger, der er blevet analyseret omfatter Histon Mark modulation eller genekspression ændringer. KDM1A er en lysin demethylase, der fjerner methylgrupper fra mono-og dimethylerede H3K4, en ændring forbundet med hæmning af genekspression. Graduering af proxy markører er afhængig af celletype og funktion af den genetiske sammenstilling af de undersøgte celler, hvilket kan gøre fortolkning og Cross-case sammenligning ganske vanskeligt. For at omgå disse problemer, en alsidig protokol præsenteres for at vurdere dosis effekter og dynamikken i den direkte KDM1A Target engagement. Den beskrevne analyse gør brug af en KDM1A chemoprobe til at indfange og kvantificere uhæmmet enzym, kan anvendes bredt på celler eller vævsprøver uden behov for genetisk modifikation, har et fremragende vindue til påvisning, og kan bruges både til grundforskning og analyse af kliniske prøver.
Introduction
Lysin specifik demethylase 1 (KDM1A)1 er en demethylase involveret i kontrollen af gen transskription. Dette protein er dukket op som en kandidat farmakologiske mål2 i onkologi; herunder akut myeloid Leukemia3 (AML), Myelodysplasi syndrom (MDS)4, myelofibrose (MF)5,6, småcellet lungekræft (SCLC)7; i seglcellesygdom (SCD)8,9, og i centrale nervesystem sygdomme, herunder Alzheimers sygdom (ad), multipel sklerose (MS); og i aggression10.
De fleste af de KDM1A hæmmende forbindelser i klinisk udvikling er cyclopropylamin derivater og hæmmer proteinet ved kovalent binding til dets Flavin adenin dinucleotid (fad) cofaktor11. Hæmning af KDM1A inducerer genekspression ændringer, men disse ændringer varierer enormt på tværs af væv, celletyper, eller sygdomstilfælde. Hæmning af KDM1A ændrer også Histon mærker12, men disse ændringer er generelt produceres lokalt på et bestemt sted i genomet, og er igen, meget væv og celle specifikke.
Protokollen blev udviklet til direkte at måle KDM1A Target engagement i biologiske prøver og er blevet optimeret til brug med cyclopropylamin afledte hæmmere. Analysen er baseret på ELISA-teknologi og analyserer parallelt, samlet og gratis (dvs. ubundet af inhibitor) KDM1A i et indfødt proteinekstrakt fra en biologisk prøve i en solid fase analyse. Som et første skridt lyses den biologiske prøve i nærværelse af den biotinylerede KDM1A selektive chemoprobe og-88113,14, afledt af den selektive KDM1A inhibitor ORY-1001 (iadademstat), en potent hæmmer af KDM1A i kliniske udvikling til behandling af onkologiske sygdomme. Chemoprobe har en IC50 for KDM1A af 120 nm og omfatter en fad bindende delen forbundet med en biotinyleret polyethylenglycol (peg)-hale. Chemoprobe binder udelukkende til den frie KDM1A, men ikke til den inhibitor bundne KDM1A i prøven. Efter chemoprobe bindingen optages de KDM1A, der indeholder komplekser i prøven, på mikrotiterplader med streptavidin belagt overflade for at bestemme fri KDM1A eller på plader belagt med et monoklonalt anti-KDM1A Capture-antistof for at bestemme total KDM1A. Efter vask inkuberet begge plader med anti-KDM1A-detektionsanti stof, vaskes igen og inkuberet med et sekundært HRP-konjugeret æsel anti-kanin IgG-antistof til påvisning ved hjælp af et luminescerende substrat og kvantificering ved måling af relative lysenheder (RLU) i et luminometer (figur 1).
Figur 1. Skema af ELISA enzym forbundet chemoprobe immunoabsorber ende assay for KDM1A Target engagement: A) bestemmelse af total KDM1A ved hjælp af sandwich Elisa og B) bestemmelse af gratis KDM1A ved hjælp af chemoprobe Elisa. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
En standardkurve er inkluderet i begge ELISA-plader for at verificere lineariteten af hver analyse. Bestemmelsen af KDM1A Target engagement i hver prøve beregnes derefter som en relativ værdi til den præ-dosis eller køretøj behandlet prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Der blev udtaget blodprøver fra Instituto de Investigación Biomédica Sant Pau biobank i henhold til spansk lovgivning (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) og godkendelse af de lokale etiske komitéer. Der er udført undersøgelser med animalsk væv i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr (de Europæiske Fællesskabers direktiv 86/609/EØF), der er oprettet af det etiske udvalg for dyreforsøg på PRAAL-PCB.
1. fremstilling af biologiske prøver til analysen.
Forsigtig: denne protokol omfatter manipulation af biologiske prøver, som kan blive underkastet den europæiske arbejdsmiljøstyrelse (OSHA) blodbårne patogener standard (29 CFR 1910,1030), Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2000/54/EF af 18. september 2000 eller tilsvarende forordninger. Desuden kan de biologiske prøver indeholde spor af biologisk aktive forsøgs kemiske forbindelser, og protokollen kan indebære yderligere manipulation af sådanne forbindelser. Gennemgå sikkerhedsdatabladet (SDS) for de forbindelser, der er anvendt før forsøget påbegyndes, og nøje overholde alle gældende sikkerhedsforanstaltninger, der er etableret i forskningscentret, herunder brug af passende personlige værnemidler (PPE). Bær passende beskyttende beklædning og brug korrekt afskærmning i løbet af eksperimentet. Rester i de relevante affaldsbeholdere (biologisk/cytotoksisk affald) kasseres.
Bemærk: denne protokol indledes med celler eller prøver af forsøgspersoner behandlet med en KDM1A-hæmmer og deres ubehandlet eller placebobehandlede kontrol3.
- Celler behandlet med køretøj eller KDM1A hæmmer in vitro
- For de celler, som dyrkes i suspension, som 10 mL kulturer, overføres suspensionerne til rene 15 mL koniske rør og fortsættes til 1.1.3.
- For de vedsiddende celler (dyrket i 75 cm2 kolber) fjernes mediet fra kolben og vaskes kort ved hjælp af 4 ml PBS. Cellerne fjernes fra deres fartøjer med 1,5 mL 0,5% trypsin-EDTA i løbet af 2-5 min (trypsinization betingelser kan variere, Følg Provider anbefalinger for celle linjen), tilsæt 4 mL PBS og Overfør cellerne til rene 15 mL koniske rør.
- Indsæt rørene i en bænk top centrifuge og saml cellerne ved centrifugering i 5 min ved 400 x g ved 4 °c. Supernatanten opslæmmes i 1 mL PBS dispenseret ved hjælp af en mikropipette, og suspensionen overføres til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
- Prøverne indsættes i en mikrorørs centrifuge og centrifugeres i 5 minutter ved 400 x g ved 4 °c. Fjern PBS ved aspiration med en mikropipette, og opbevar derefter pellets på isen og Fortsæt til trin 2; eller fryse pellets på tøris og opbevare dem ved-80 °C indtil trin 3.
- Prøver fra forsøgspersoner eller dyr behandlet med køretøj/placebo eller KDM1A-hæmmer
- Væv: skær vævet i små, ≈ 1 cm3 stykker ved hjælp af en skalpel. Fryse vævet stykker i flydende N2 i en Dewar container og gemme dem ved-80 °C indtil trin 3.
- Polymorfe blod mononukleale celler (PBMCs): fortyndet 10 mL frisk blod (proces maksimum 2 h efter blod tilbagetrækning) opsamles i K2-EDTA rør med 2 VOLUMENER af PBS i en 50 ml konisk rør. Isolerer Pbmc'erne fra blod ved hjælp af kommercielt fremstillede PBMC separations slanger i henhold til fabrikantens anvisninger. Hold pellets på isen og Fortsæt til trin 3,2; eller fryse pellets på tøris og opbevare dem ved-80 °C indtil trin 3.
Bemærk: en våd celle pellet på 20 til 50 μL indeholder ≈ 1 x 107 celler, afhængigt af cellestørrelsen. En våd PBMC pellet fremstillet af 10 mL sundt humant blod har et volumen på ≈ 20 μL og indeholder ≈ 1 x 107 pbmcs. væv eller celle piller kan opbevares ved-80 º c i op til 6 måneder.
2. klargøring af opløsningen
- Forbered 2 μM OG-881 arbejdsopløsning: Tag en 10 μL engangs-alikvot af 20 mM biotinyleret sonde OG-881 stamopløsning ud af 4 °C køleskab og lad det være ved stuetemperatur (RT) i 10 min. klargør 2 μM-arbejdsopløsningen ved hjælp af seriel fortynding af og-881 Stock solut ion i PBS ved hjælp af en mikropipette med filterspidser og ændring af spidsen mellem de forskellige fortyndings trin.
- Forbered 10x proteasehæmmer: Opløs 1 tablet i 1 mL PBS i et mikrocentrifuge glas.
- Forbered det ønskede volumen af 1x cellelyse buffer med 25 nM OG-881 chemoprobe. For hver mL blandes 100 μL kommercielt opnået 10x cellelyse buffer, 150 μL 10x proteasehæmmer, 12,5 μL af 2 μM OG-881 og 737,5 μL af type 1-dobbeltdestilleret vand.
- Eventuelt forberede det ønskede volumen af 1x cellelyse buffer, men med 25 nM ORY-1001 i stedet for OG-881 som i trin 2,3. Mindre potente hæmmere kan anvendes, men kan kræve højere koncentrationer, til brug i den positive kontrol med 100% hæmning (Se trin 3,5).
Bemærk: Tag passende forholdsregler for at undgå utilsigtet kontaminering af opløsninger eller prøver med OG-881 eller KDM1A inhibitor stamopløsninger. For at beregne den ønskede volumen 1x celle lysis buffer med 25 nM OG-881, antage, at 400 μL er påkrævet pr 40 mg pulveriseret væv, eller 200 μL pr våd pellet af 107 celler.
3. native protein udvinding
- Fra væv:
- Pulveriserer og homogenisere en ≈ 1 cm3 terning af frosset væv med en mørtel og Pestle kølet på tøris. Aliquot prøverne i engangshætteglas indeholdende ≈ 40 mg vævs pulver, undgå optøning på alle tidspunkter. Fortsæt til trin 3.1.2. til umiddelbar forarbejdning eller opbevaring ved-80 °C.
- Resuspension 40 mg pulveriseret væv i 400 μL 1x celle lysis buffer med 25 nM OG-881, vortex for 10 s, og tvinge prøven mindst fem gange gennem en 18-gauge stump sprøjte nål indtil lysis af vævet er opnået, og en uklar lys gul til orange suspension er Opnået. Undgå bobledannelse.
- Fortsæt til trin 3,3
- Fra celle pellets (PBMCs og cellelinjer):
- Resuspension en pellet af ≈ 1 x 107 celler i 200 μl 1x cellelyse buffer indeholdende 25 Nm OG-881. Vortex prøverne kortvarigt og holde dem på is i 5 min.
- Soniker prøverne i en sonicator ved hjælp af 3 impulser på 20 s hver ved 45 kHz; Placer dem på is i 20 s mellem bælgfrugter.
Bemærk: så snart de biologiske prøver er blevet resuspenderet i 1x celle lysis buffer, holde dem på isen under resten af processen.
- Prøverne opbevares på is i yderligere 5 minutter, vortex kortvarigt og centrifugeres i 10 minutter ved 14 000 x g i en forkølet centrifuge ved 4 °C.
- Ved hjælp af en 1 mL mikropipette overføres Supernatanterne til friske 1,5 mL mikrocentrifuge glas og efterlader dem på isen under 2 timer. Fortsæt til trin 4.
- Et positivt kontrolelement til simulering af 100% Target engagement kan eventuelt forberedes på følgende måde:
- Resuspendere celle pellet eller pulveriseret væv fra et køretøj eller ubehandlet (prædosis) prøve i den krævede mængde 1x Cellelyse buffer med 25 nM ORY-1001 og proces som skitseret i trin 3,1 til 3,3.
- Overføre Supernatanterne fra den positive kontrol til friske 1,5 mL mikrocentrifuge glas og lade dem ligge på is i 1 h. ORY-1001 vilfuldt hæmme KDM1A og blokere chemoprobe binding.
- Der tilsættes 5 μL 2 μM OG-881 arbejdsopløsning til den positive kontrol supernatanten (volumen for positiv kontrol genereret fra en 40 mg vævsprøve) eller 2,5 μL af 2 μM OG-881 arbejdsopløsning (volumen for positiv kontrol genereret fra en 107-celleprøve) for at opnå den samme OG-881 koncentration som de andre prøver og lad på is under 2 h. Fortsæt til trin 4.
4. kvantificering af Native protein ved hjælp af Bradford assay
- Fortyndet den kommercielt indkøbte Bradford protein assay reagens 5 gange med H2O type 1 dobbeltdestilleret vand. Det nødvendige reagens volumen beregnes for den samlede mængde prøver og standarder (1 mL pr. prøve eller standard + 5 mL overskydende volumen).
- For Standardkurven for bovin serum albumin (BSA), Forbered et mikrocentrifuge glas med 1 mL fortyndet Bradford protein assay-opløsning (blank) og syv mikrocentrifuge glas med 995 μL af den fortyndede Bradford-proteinanalyse opløsning. Tilsæt 5 μL af hver af BSA-standarderne (koncentration fra 125 til 2.000 μg/mL) til hvert af de 7 mikrocentrifuge glas, og bland dem ved forsigtigt at invertere rørene flere gange. Inkuber i 5 minutter ved RT.
- De fortyndede standarder overføres til kuvetter og læses fra de blanke og bovint serum albumin standard prøver i et spektrofotometer ved 280 Nm.
- For de biologiske prøver, Forbered et mikrocentrifuge glas med 1 mL fortyndet Bradford protein assay opløsning (blank) og så mange mikrocentrifuge glas med 999 μL af den fortyndede Bradford protein assay reagens som prøver, der skal kvantificeres. Ved hjælp af en automatisk P2-mikropipette tilsættes 1 μL original proteinekstrakt fremstillet i trin 3 til hvert mikrocentrifuge glas og blandes ved forsigtigt at invertere rørene flere gange. Prøverne 5 minutter ved RT.
- Mængderne overføres til kuvetter, og prøverne læses i et spektrofotometer ved 280 Nm.
- Fortrinsvis fortsættes med trin 5. Alternativt kan du opbevare de oprindelige proteinekstrakter ved-80 °C indtil trin 5. Undgå fryse tø cyklusser.
5. luminescerende ELISAs for total og fri KDM1A bestemmelse
Bemærk: hold laboratorie temperaturen konstant ved 23-24 °C (RT).
- Belægning af mikrotiterplader med Capture KDM1A antistof eller Streptavidin
- I alt KDM1A ELISA: for hver plade skal der forberedes 10 mL KDM1A Capture-antistof til en slutkoncentration på 2 μg/mL i PBS. Overfør 100 μL til hver brønd på pladen.
- Gratis KDM1A ELISA: for hver plade forberedes 10 mL streptavidin ved 10 μg/mL i PBS. Overfør 100 μL til hver brønd på pladen.
- Top-Seal den totale og gratis KDM1A ELISA plader med klæbende film og inkubere pladerne natten over ved 4 °C i køleskabet.
- Vask og blokering af pladerne
- Tag pladerne ud af køleskabet og lad dem ækvibrere i omkring 45 min ved RT før brug.
- Forbered 1.000 mL vaskebuffer (0,1% Tween i PBS) og 50 mL blokerende buffer (1% BSA i PBS) pr. plade.
- Vask pladerne 3 gange med vaskebuffer. I dette og efterfølgende trin skal du tappe pladen på papirhåndklæder efter hvert vaske trin for at fjerne rest opløsningen.
- Tilsæt 200 μL blokerende buffer per brønd til begge plader, top-Seal begge plader med en klæbende film og inkubere 2 h ved RT.
- Forberedelse af biologisk prøve
- De oprindelige proteinekstrakter, som er opnået i slutningen af trin 3, fortyndes til den relevante koncentration ved hjælp af PBS. Den anbefalede koncentration vil variere i funktion af niveauet af KDM1A ekspression i den biologiske prøve. Eksempler på passende intervaller er (1) celle pellets: 0,5-10 μg pr brønd. (2) PBMCs: 5-30 μg pr. brønd. (3) pulveriseret væv (hjerne, lunge, hud): 20-100 μg pr. brønd. Opbevar prøverne på isen under tilberedningen. Når det er muligt, køretekniske tre eksemplarer prøveanalyser.
- Forbered en standard kurve ved hjælp af human rKDM1A:
- For at tilberede KDM1A standard arbejdsopløsningen skal du pipetere det passende volumen rKDM1A for en endelig koncentration på 25 pg/μL, tilsæt 75 μL 2 μM og-881 og komplet med 1 x PBS til et samlet volumen på 6 mL i en 15 mL Falcon tube. Opbevar den KDM1A standard arbejds løsning på is i løbet af 1 time og bland forsigtigt opløsningen ved at invertere 15 mL Falcon tube flere gange hver 20 min.
- KDM1A standard fortyndings serien forberedes i 1,5 mL mikrocentrifuge glas i henhold til tabel 1 (Standardpræparat), i volumen nok til triplicatanalysen af 2 96 brønd mikrotiterplader.
| STANDARD SERIE | KDM1A standard arbejdsopløsning (μL) | |
| (PG KDM1A/Well) | PBS (μL) | |
| 2500 for C-* | 800 | - |
| 2500 | 800 | - |
| 1750 | 560 | 240 |
| 1250 | 400 | 400 |
| 750 | 240 | 560 |
| 250 | 80 | 720 |
| 25 | 8 | 792 |
| 0 | 0 | 800 |
| Bemærk: | ||
| (1) den mængde, der tilberedes af hver fortynding, er tilstrækkelig til at køre i tre trilicate 2-plader af assay. | ||
| (2) det anbefalede interval er mellem 2,5 og 5.000 PG/brønd | ||
| * For den negative kontrol C-, uden KDM1A afsløring antistof | ||
Tabel 1: standard præparat. For at tilberede standardserien af KDM1A protein skal du afpipettere de indikerede volumener af KDM1A standardarbejdsopløsning og PBS i otte korrekt mærkede 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
Tabel 2: dyb brønd plade design. (Blå) og prøver (gule) fra trin 5.4.2. blev pipetteret ind i de reflekterede positioner af den dybe brønd plade for at lette lastning i ELISA-pladerne efterretningen af den blå (standard) og gule (prøver) pile. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Tabel 3: Elisa-plade design. Analyse pladen omfatter standardkurven med faldende mængder af rekombinant KDM1A Target (i blåt); de (t) biologiske prøver i gult og tilsvarende negative kontroller (indeholder prøverne, men ikke det primære detektionsstof) i hvidt, der skal læsses på ELISA-pladerne fra den dybe brønd plade. Den tomme (0 i standardkurven) indeholder alle reagenser til opsamling og detektion, men ingen prøve. Venligst klik her for at downloade denne fil.
- Elisa
- (Fortsat fra trin 5.2.4.) Efter 2 timer inkubation, kassér blokerende buffer og vask pladerne med vaskebuffer.
- De passende fortyndede prøver (oprindelige proteinekstrakter og standardkurve fra trin 5,3.) overføres til en kølet 96 brønd opbevarings blok efter plade fordelingen vist i tabel 2 (Deep Well Plate design).
- Opbevar denne blok på is, indtil den pipettering 100 μL prøve/brønd i de totale og frie ELISA-plader efter den plade fordeling, der er vist i tabel 3 (ELISA-plade design).
- Inkuber i 1 time ved RT, kassér prøverne og vask pladerne 5 gange med vaskebuffer.
- Forbered 20 mL kanin anti-KDM1A Detection antistof ved 0,125 μg/mL i blokerende buffer, Tilsæt 100 μL pr brønd i hver plade af analysen, undtagen i brønde svarende til de negative kontroller C-. Top-Seal pladen og inkubere 1 h ved RT.
- Kassér detektionsantistof opløsningen og vask pladerne 6 gange med vaskebuffer.
- Der fremstilles 25 mL anti-kanin antistof HRP i sekundær ged til en fortynding 1:5000 i blokerende buffer, tilsættes 100 μL pr. brønd til mikrotiterpladerne; og inkubere 1 h ved RT.
-
Påvisning af chemiluminescent
- 30 min før udgangen af trin 5.4.7. og under bløde lysforhold blandes lige dele af Luminol-Enhancer og peroxid opløsning (10,5 mL: 10,5 mL, til 2 plader) i en ravfarvet flaske og lad den stå ved RT.
Bemærk: hold Luminol-arbejdsopløsningen i en ravfarvet flaske, og undgå langvarig udsættelse for et intenst lys. Kortvarig udsættelse for typisk laboratorie belysning vil ikke skade arbejdsopløsningen. - Mindst 20 min før måling af luminescens, skal du tænde for mikropladen læseren ved 25 °C og opsætte udlæsninger til 1.000 MS integrationstid og 150 MS Settle tid. Parameter indstillinger kan kræve optimering i funktion af instrumentet.
- Efter 1 h inkubation i trin 5.4.7., kassér den sekundære antistof opløsning og vask pladerne 6 gange med vaskebuffer.
- Pipette 100 μL pr. brønd af den Luminolarbejdsopløsning (Chemiluminescent substrat), som er fremstillet i trin 5.5.1. Pipetten meget langsomt og undgå dannelse af bobler. Brug en timer til at styre tiden mellem tilsætning af opløsningen og luminescens måling af pladerne og holde denne tid konstant for at opnå en god Inter assay reproducerbarhed.
- Top-Seal pladerne og centrifugeres til 500 x g ved RT for 45 s i en plade centrifuge for at eliminere eventuelle resterende bobler. Pladerne inkubates i 1 min på en plade shaker ved 100 rpm.
- Sæt pladen inde i læseren og lad den stå i 3 min. for at stabilisere temperaturen ved 25 °C (uden selvklæbende folie). Begynd altid med den gratis ELISA-plade.
- Læs de relative luminescens enheder (RLU) for hver ELISA-plade analyse (fri og total KDM1A).
- Gem og Kopiér de rå RLU-værdier fra RAW-data Excel-filerne for yderligere analyse af resultaterne.
- 30 min før udgangen af trin 5.4.7. og under bløde lysforhold blandes lige dele af Luminol-Enhancer og peroxid opløsning (10,5 mL: 10,5 mL, til 2 plader) i en ravfarvet flaske og lad den stå ved RT.
6. beregning af Target engagement
- I et regnearksprogram beregnes de RLU-frie og RLU-totale værdier af prøverne SX og referenceprøverne Ref (ubehandlet, vehikel eller før-dosis prøve) fra deres tekniske replikat-rådata som beskrevet nedenfor:
- Indtast de enkelte RAW RLUi total og RAW RLUi gratis data fra blanktegn, standardkurve, negative kontroller C-og biologiske prøver (SX og ref) i analysedata arket (f. eks Excel). Du skal også angive beløbene (i PG) for KDM1A fra standard kurven i dataarket.
- Beregn den rå gennemsnitlige RLU, standardafvigelser σRLU, og variationskoefficient CVRLU fra de enkelte rå total og RAW gratis rlui data for hver teknisk replikat datapoint.
- Anvend outlier elimination (eksempel for triplicates): for hver enkelt RAW RLU total og RAW RLU gratis datapunkt rlui fra en teknisk tre eksemplarer datapoint, anvende Grubbs kriterier, når CV for tre eksemplarer > 0,15, og afvise enkelt mistænkt rå RLU værdi Hvornår
,
hvor Z = 1,148 for n = 3 og 90% konfidensinterval (CI). - Hvis elimineringen af outlier blev anvendt, Genberegn den rå gennemsnitlige RLU, standardafvigelsen σRLU og CVRLU fra den ikke-afviste (nr) RAW Rlui total og RAW rlui Free-værdier for hvert datapoint.
- Anvend baggrunds rettelsen: Beregn de gennemsnitlige RLU-frie og RLU-total værdier for hver standardprøve og hvert prøveeksemplar SX og reference eksempel ref som:
- Grafisk repræsentere dataene som følger:
- Afbild de RLU-frie og RLU-samlede værdier (Y-aksen) i forhold til deres eksempel identifikation (X-akse) i et søjlediagram.
- Også afbilde RLU værdier (Y-aksen) af standarderne i en scatter plot i forhold til deres mængde PG af rKDM1A protein (X-aksen) for frie og samlede målinger, samt de tilsvarende lineal tendenslinjer og beregne r2 (kvadratet af den lineære korrelationskoefficient).
- Beregn Target engagement (TE); dvs. den procentdel af KDM1A, der bindes af KDM1A-inhibitorer i hvert prøveeksemplar SX i forhold til en referenceprøve Ref (ubehandlet, køretøj eller før-dosis prøve) som følger:
- Beregn forholdet R for den gennemsnitlige RLU fri til total værdier for SX-og REF-prøverne som:
- Beregn derefter målengagementet (TE) for eksemplet SX som:
Valgfrit: (1) Hvis der er udført biologiske replikateksperimenter, hver med n tekniske replikater; Beregn først TESX for de tekniske replikatsæt. Derefter beregnes de gennemsnitlige TE-, SD-og CV-værdier for det biologiske replikatsæt.
- Beregn forholdet R for den gennemsnitlige RLU fri til total værdier for SX-og REF-prøverne som:
- Revidere, om kriterierne for accept af analysen er opfyldt: Kontroller, at (1) analyse baggrunden er acceptabel, og at den gennemsnitlige blind < 0,05 x 107 RLU; (2) prøven Auto-luminescens er fraværende og RLUs af de negative kontroller C-er under den nedre grænse for kvantificering (LLOQ = Mean blank + 10x SD); (3) den rKDM1A standardkurve er lineær og R2 ≥ 0,98; (4) de biologiske prøver har RLU-værdier, der falder inden for analysens dynamiske og lineære rækkevidde, dvs mellem LLOQ og 2.500 PG/Well.
Bemærk: trin 6,1. til 6,4. kan let automatiseres i et calculus dataark. - Eksportere TE-data til en open source-eller kommercielt erhvervet statistik software valg til grafisk gengivelse af TE-værdier og yderligere statistiske evalueringer.
,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lineariteten af total og fri KDM1A bestemmelse.
En standard serie blev udarbejdet som beskrevet i trin 5.3.2., ved hjælp af 0 til 2500 PG af fuld længde humant rekombinant KDM1A enzym. RLU-værdierne for total og Free rKDM1A blev vurderet for at verificere lineariteten (figur 2a og 2b). Data er repræsenteret som middelværdien fra 3 eksperimenter med 3 tekniske replikater (n) ± SD. RLU værdier af total og gratis KDM1A detekteret i humane PBMCs fra blodet af 3 uafhængige frivillige er over lejet på standard kurven i figur 2c og 2D. Der blev udtaget blodprøver fra Instituto de Investigación Biomédica Sant Pau biobank i henhold til spansk lovgivning (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) og godkendelse af de lokale etiske komitéer.
Figur 2. Bestemmelse af total og fri rKDM1A i PBMCs af raske frivillige. RLU-værdier af total rKDM1A vurderet af Elisa (A) og af frie rKDM1A vurderet af chemoprobe Capture Elisa (B). Der blev indhentet data fra 3 replikate eksperimenter, hver analyseret i tre eksemplarer (N = 3; n = 3). RLU-værdier af total KDM1A vurderet af ELISA (C) og af fri KDM1A (D) for PBMCs af 3 uafhængige ubehandlede frivillige (røde, blå og grønne firkanter), som er fremstillet på standard kurven. Der blev indhentet data fra ét eksperiment analyseret i tre eksemplarer (N = 1; n = 3). De repræsenterede værdier er midlerne ± SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Analyse af KDM1A Target engagement i celler
AML-celler blev dyrket efter udbyder anbefalinger. Celler blev behandlet med køretøj eller ORY-1001 ved forskellige koncentrationer (0,25; 0,5; 1; 5 og 25 nM) (figur 3). De indfødte proteinekstrakter blev opnået ved tilstedeværelse af 25 nM OG-881 chemoprobe. 0,5 μg total protein blev anvendt til at udføre målengagements analysen som beskrevet tidligere. Total og Free KDM1A blev fastlagt, og procentdelen af Target engagement af ORY-1001 til KDM1A blev beregnet i forhold til køretøjet som beskrevet.
Figur 3. Dosis-respons af KDM1A Target engagement i en menneskelig AML cellelinje. Celler blev behandlet med køretøj eller ORY-1001 ved forskellige koncentrationer (0,25; 0,5; 1; 5 og 25 nm) og anvendt til bestemmelse af Target engagement som beskrevet. Der blev indhentet data fra 3 replikate eksperimenter, hver analyseret i tre eksemplarer (N = 3, n = 3). De repræsenterede værdier er midlerne ± SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Analyse af in vivo KDM1A Target engagement
Formålet med dette eksperiment var at karakterisere Target engagement af ORY-1001 i forskellige rotte væv, i funktion af dosisniveau. For at nå dette mål blev 15 Sprague-Dawley-rotter (200-250 g) anbragt i et cytostatisk sikkerheds lokale for at undgå potentiel kontaminering med det testede stof. Højst 3 rotter/bur blev tilfældigt tildelt 5 studiegrupper. De 5 forskellige studiegrupper modtog henholdsvis køretøjet; 1 3 10 eller 30 μg/kg ORY-1001 ved oral administration i 4 på hinanden følgende dage. Sammensatte stamopløsninger blev fremstillet dagligt. Dyrene blev vejet før hver administration for at justere den ønskede mængde. Alle dyr blev anbragt ved konstant rumtemperatur (20-24 º C) og relativ luftfugtighed (45-65%) under en 12 h lys-mørk cyklus (lyser på klokken 6:00). Mad og vand var tilgængelige ad libitum. Der blev indsamlet blodprøver 2 timer efter sidste indgivelse i K2EDTA-rør og Pbm'er blev isoleret i henhold til den procedure, der tidligere er beskrevet i trin 1.2.2. og konserveret ved-80 °C indtil naturlig proteinekstraktion. Lunge prøver blev også indsamlet 2 h efter den sidste Drug Administration, frosset straks i flydende nitrogen, og opbevares ved-80 °C. Der er gennemført undersøgelser i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr (de Europæiske Fællesskabers direktiv 86/609/EØF), som er nedsat af det etiske udvalg for dyreforsøg på PRAAL-PCB.
Efter pulverisering, de indfødte proteinekstrakter fra lunge blev opnået som beskrevet og kvantificeret. 5 μg totalt protein fra poolede Pbmc'er eller 7,5 μg totalt protein fra lunge fra 3 dyr blev anvendt pr. dosisgruppe til at køre KDM1A Target engagement assay.
Dosis-respons af KDM1A Target engagement i PBMCs og i lunge behandling af rotter med ORY-1001 ved oral sonde, beregnet i forhold til køretøjets gruppe er vist i figur 4a og 4b. Som det fremgår af figur 4c, giver ex vivo-inkubation med 25 Nm ORY-1001 af lunge proteinekstrakter fra de behandlede dyr fuld te endnu, men øger ikke yderligere te i prøver fra rotter behandlet i 4 dage med 30 μg/kg ORY-1001 , bekræftende KDM1A var allerede fuldt hæmmet in vivo.
Figur 4. In vivo og ex vivo Native KDM1A Target engagement. Dosis-respons af KDM1A Target engagement i PBMCs (A) og lunge prøver (B) fra rotter behandlet med ORY-1001 i 4 på hinanden følgende dage (p. o). Der blev indhentet data fra poolede PBMCs-ekstrakter fra 3 dyr pr. kohorte, analyseret i to eksemplarer (N = 1, n = 2) eller fra lungerne fra 3 individuelle dyr pr. kohorte, analyseret i tre eksemplarer (N = 3, n = 3). C. sammenligning af TE i poolede lunge proteinekstrakter af rotter behandlet med køretøj (venstre) eller 30 μg/kg ORY-1001; efter 1 h ex vivo inkubation af ekstrakterne uden (grå stænger) eller med 25 nM ORY-1001 (blå stænger) (N = 3, n = 3). Alle data er repræsenteret som betyder ± SD. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen præsenteres her blev udviklet til direkte at måle KDM1A Target engagement ved hjælp af en roman KDM1A chemoprobe Capture baseret ELISA. Metoden er blevet valideret på dyrkede humane cellelinjer og ex vivo-prøver fra menneske, rotte og mus og bavian (herunder Pbm'er, lunge, hjerne, hud, tumorer), men kan let anvendes på andre arter, hvor KDM1A antistof Target epitoper og katalytisk Center er bevaret. Da OG-881 er en aktivitet baseret chemoprobe, er prøve kvaliteten vigtig og korrekt manipulation og bevaring af prøver bør forfølges især under de indledende trin i protokollen, for at sikre, at KDM1A aktivitet bevares.
Den nuværende eksperimentelle protokol blev optimeret til at analysere KDM1A Target engagement af kovalent fad målretning hæmmere. Det kan også bruges med reversible hæmmere, der blokerer adgangen til fad cofaktor af KDM1A. Potente reversible hæmmere med lange opholdstider kan ansætte den umodificerede protokol.
OG-881 chemoprobe er muligvis ikke egnet til reversible hæmmere med lav potens med høj off-rate. Den særlige chemoprobe, der anvendes i dette manuskript, er ikke celle Penetrant, og analyserne udføres derfor ex vivo på lyserede prøver.
Metoden kan køres på instrumenter, der er bredt tilgængelige i forsknings-og analyselaboratorier; Det kræver ikke, at genetiske modifikationer indføres i celler, og det kan nemt anvendes til forskellige prøvetyper. En anden fordel er, at den kan anvendes på prøver, der er afledt af forskellige arter, som ofte anvendes i prækliniske beviser for konceptstudier og i toksikologi modeller, og at det med succes er blevet oversat til at analysere kliniske prøver.
Andre metoder er blevet anvendt til analyse af KDM1A Target engagement. Mange af disse metoder bruger proxy markører som ændringer af H3K4me2 Histon Mark, ved hjælp af alphalisa15; eller induktion af udtryks markører ved hjælp af qRT-PCR eller FACS Analysis16. I celler eller væv styres Histon-mærkerne imidlertid af flere faktorer, og undersøgelser af, at måling af ændringer i Histon-mærket ikke altid giver et godt dynamikområde til analyse. KDM1A hæmning kan fremkalde potente ændringer i genet og protein ekspression, men reaktionen har tendens til meget heterogene og meget cellekontekst afhængig, hvilket kan komplicere analyser af dosisrespons3,7.
Direkte vurdering af besættelsen af målet er derfor den bedste mulighed for at måle Target engagement. En analyse, der er blevet foreslået for dette er den cellulære termiske Shift assay (CETSA), baseret på stigningen i termisk stabilitet af målproteiner ved binding af hæmmere. Denne metode kan i princippet anvendes på umodificerede celler og forskellige vævstyper og er for nylig blevet anvendt til at vurdere cellulær aktivitet af KDM1A-hæmmere i dyrkede celler17. Denne teknologi er dog sjældent blevet anvendt til in vivo farmakodynamiske undersøgelser18 , og efter vores bedste overbevisning er dets anvendelse ikke blevet rapporteret i kliniske forsøg.
Den protokol, der gives her, beskriver en fuldt valideret chemoprobe baseret metode, som er blevet brugt til at bestemme KDM1A Target engagement i celler og vævsprøver. Metoden er blevet oversat med succes for at analysere prøver af forsøgspersoner behandlet med en KDM1A inhibitor19 og vil være til stor nytte for model PK/PD svar i kliniske forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren Tamara Maes er administrerende direktør og aktionær, og forfatterne Cristina Mascaró og Raquel Ruiz Rodriguez er medarbejdere i Oryzon Genomics S.A. Oryzon Genomics S.A. udvikler KDM1A-hæmmere og besidder patenter, der dækker forbindelser og metoder, som anvendes i denne artikel.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev finansieret af Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche, og delvist understøttet af CIIP-20152001 og RETOS Collaboration program RTC-2015-3332-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X Protease Inhibitor Tablets | Roche | #11836153001 | |
| 96 deep well storage block | VWR | #734-1679 | |
| 96 well ELISA plates | Nunc | #436110 | |
| Adhesive black Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Adhesive transparent Film | VWR | #60941-062 | |
| Biotinylated KDM1A probe OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | # 3117057001 | |
| Bovine Serum Albumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| Cell lysis buffer 10X | Cell Signaling | #9803 | |
| Centrifuge for 96- well plates | Hettich | Rotina 420R | |
| Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
| Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Microplate reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
| Needle G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| PBMC separation tubes 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| PBMC separation tubes 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Plate shaker | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
| Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
| Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| Spectrophotometer cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Spectrophotometer for cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| Syringe | BD | #303172 | |
| Type 1 ultrapure water | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | USC200T |
References
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T. ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia. Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).
- Sugino, N. A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers. Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).
- Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms. Blood. 126, 601 (2015).
- Jutzi, J. S., et al. LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone. HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).
- Mohammad, H. P. DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC. Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).
- Rivers, A., et al. RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases γ-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model. Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).
- Rivers, A. Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons. Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).
- Buesa, C., et al. The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation. Alzheimer’s & Dementia. 11 (7), P905 (2015).
- Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1. Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).
- Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. Human histone demethylase LSD1 reads the histone code. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).
- Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor. Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. , WO2017158136 (2016).
- Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors. Journal of Biological Chemistry. , In Press (2019).
- Rodriguez-Suarez, R. Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).
- Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1. Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).
- Schulz-Fincke, J. Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation. European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).
- Ishii, T., et al. CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens. Scientific Report. 7, 13000 (2017).
- Maes, T. ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders. Alzheimer’s & Dementia. 12 (7), P1192 (2017).
