Summary
A termoforese de microescala obtém constantes de ligação rapidamente a baixo custo de material. A termoforese de microescala rotulada ou sem rótulo está comercialmente disponível; no entanto, a termoforese livre de rótulos não é capaz da diversidade de medidas de interação que podem ser realizadas usando rótulos fluorescentes. Fornecemos um protocolo para medições de termoforese rotuladas.
Abstract
A capacidade de determinar a afinidade vinculante dos lipídios às proteínas é uma parte essencial da compreensão das interações proteína-lipídicas no tráfico de membranas, transdução de sinais e remodelagem citoesquelética. Ferramentas clássicas para medir tais interações incluem ressonância de plasmon superficial (SPR) e calorimetria de titulação isotermal (ITC). Embora ferramentas poderosas, essas abordagens têm contratempos. O ITC requer grandes quantidades de proteína purificada, bem como lipídios, que podem ser caros e difíceis de produzir. Além disso, o ITC e o SPR são muito demorados, o que poderia agregar significativamente ao custo de realizar esses experimentos. Uma maneira de contornar essas restrições é usar a técnica relativamente nova de termoforese de microescala (MST). O MST é rápido e econômico usando pequenas quantidades de amostra para obter uma curva de saturação para um determinado evento de vinculação. Atualmente existem dois tipos de sistemas MST disponíveis. Um tipo de MST requer rotulagem com um fluoróforo no espectro azul ou vermelho. O segundo sistema conta com a fluorescência intrínseca de aminoácidos aromáticos na faixa UV. Ambos os sistemas detectam o movimento das moléculas em resposta à indução localizada de calor de um laser infravermelho. Cada abordagem tem suas vantagens e desvantagens. O MST sem rótulos pode usar proteínas nativas não cometas; no entanto, muitos analitos, incluindo farmacêuticos, fluoresce na faixa UV, que podem interferir com a determinação de valores de KD precisos. Em comparação, o MST rotulado permite uma maior diversidade de interações paridas mensuráveis utilizando sondas fluorescentes rotuladas ligadas a ligantes com absorções mensuráveis na faixa visível em oposição à UV, limitando o potencial de interferência de sinais de analitos.
Introduction
A termoforese de microescala é uma técnica relativamente nova na determinação das constantes de desassociação (KD), bem como as constantes de inibição (IC50) entre ligantes bioquimicamente relevantes. O principal varejista comercial para MST (por exemplo, NanoTemper) oferece duas tecnologias populares de MST: 1) Rotular MST livre exigindo uma marca fluorescente, e 2) rotulada termoforese usando a fluorescência inerente de proteínas dependentes do número de resíduos aromáticos presentes em cada proteína1. Uma desvantagem da termoforese sem rótulo é que, na maioria dos casos, não permite a medição de interações proteína-proteína. No entanto, pode ser possível projetar proteínas sem aminoácidos aromáticos, como o triptofano para uso na termoforese gratuita de rótulo2.
O MST mede o movimento das partículas em resposta à indução de campos de temperatura microscópicos iniciados por um laser infravermelho em tecnologias atualmente disponíveis1. O MST pode ser usado para medir interações proteína-proteína, interações proteína-lipídicas, moléculas proteicas pequenas, experimentos de competição e até interações entre pequenas moléculas, desde que se possa produzir separação de sinal suficiente. Além disso, o MST permite a medição de interações à base de proteína de membrana embutidas em lipossomos ou nanodiscos. A termoforese rotulada aproveita o uso de etiquetas fluorescentes rotuladas permitindo a separação quimicamente controlável do sinal entre ligante e analito. Os valores de KD podem ser obtidos utilizando termoforese para interações envolvendo ligação proteica em baixas concentrações de nanomolar, que na maioria dos casos é uma concentração de proteína muito menor do que a necessária para a calimeto isotermal (ITC)3. Além disso, o MST não possui requisitos rigorosos de tampão, conforme exigido para a ressonância de plasmon superficial (SPR)4 e a termoforese rotulada pode até mesmo ser usada para medir constantes vinculantes de proteínas de interesse de soluções proteicas não totalmente purificadas5 com tags fluorescentes geneticamente inseridas6. Uma desvantagem do MST é que os parâmetros cinéticos não podem ser obtidos prontamente para o MST como no SPR2.
As medidas de termoforese dependem da diferença de temperatura local de uma solução. Este calor pode ser gerado a partir de um laser infravermelho. O dispositivo MST tem um detector de fluorescência acoplado a um feixe infravermelho (IR) e pode captar alterações na fluorescência das mudanças de concentração locais das moléculas fluorescentes no ponto em que o laser IR é alvo. O dispositivo MST utiliza um laser direcionado ao IR acoplado diretamente a um detector de fluorescência focado no mesmo ponto em que o calor é gerado na solução. Isso permite uma detecção robusta de mudanças de temperatura correspondentes ao esgotamento das moléculas no ponto de calor gerado pelo laser IR. A fluorescência medida geralmente diminui mais perto do laser ir em resposta ao aumento da temperatura. As diferenças medidas como resultado podem ser devido a vários fatores, incluindo carga, tamanho ou entropia de solvação. Essas diferenças são medidas como mudanças na fluorescência em resposta à indução do calor ou movimento de moléculas de partes quentes a mais frias do capilar.
Ao carregar um capilar com uma determinada solução, é importante deixar o ar em cada extremidade do capilar e não carregar o capilar completamente cheio. O capilar comercial contém cerca de 10 μL de solução. Pode-se obter medições precisas com 5 μL de solução desde que a solução seja manipulada para o centro do capilar, não há bolhas de ar (potencialmente degas antes do carregamento capilar), e é preciso carregar o rack para não sacudir a solução do centro do capilar, onde o laser infravermelho é alvo. Se o laser não entrar em contato totalmente com a solução, o resultado provavelmente será uma das três saídas inutilizáveis para essa concentração: 1) não ou baixa detecção de fluorescência, 2) maior detecção de fluorescência (potencialmente com pico irregular), ou 3) detecção de fluorescência dentro de outros valores a partir dada titulação, mas com um pico irregular e não encaminhado.
Para termoforese rotulada é ideal ter um sinal de fluorescência acima de 200 e abaixo de 2000 unidades de fluorescência7. O dispositivo MST usa uma gama de intensidades led de 0 a 100, que podem ser selecionadas para alcançar um sinal acima de 200 ou abaixo de 2000. Alternativamente, pode-se usar diferentes concentrações do ligante rotulado para modificar o sinal de fluorescência a um nível ideal. É importante executar uma varredura de tampa com uma determinada medição MST como referência ao analisar dados, pois uma verificação de tampa ruim pode muitas vezes resultar em um ponto que pode ser mais tarde determinado como um outlier. Cada execução deve levar aproximadamente 30 minutos se medir uma única potência MST com uma varredura de tampa. Os dispositivos comerciais permitem alterações na potência do MST. Em versões de software mais antigas isso poderia ser definido de 0 a 100; e nas versões posteriores pode-se selecionar MST baixo, médio ou alto. Para alcançar traços robustos, um pesquisador pode precisar tentar cada um desses e decidir qual configuração do MST resulta nos dados mais robustos para uma determinada interação.
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Protocol
1. Preparação de materiais
- Preparar soro fisco tampão de fosfato (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 e 2 mM KH2PO4, pH 7.41.
- Prepare o corante NTA-Atto 647 N. Diluir o estoque NTA-Atto 647 N corante para 100 nM de uma solução DMSO 100% em PBS sem Interpol.
- Express Vam7-His8 – Proteína como proteína de fusão em E. coli e purificar usando Ni-NTA e exclusão de tamanho cromatografia8.
- Titular o analito no buffer PBS. Se o analito estiver em um buffer diferente, o MST rotulado não é particularmente sensível a pequenas diferenças tampão de moléculas como o DMSO, a menos que o conteúdo do tampão de analito interaja com proteína rotulada.
2. Preparação do dispositivo MST
- Ligue o interruptor de alimentação na parte de trás do dispositivo.
- Abra o software de controle e certifique-se de que o laptop esteja ligado e conectado no computador conectado ao dispositivo.
- Insira as configurações de fluorescência e MST para este experimento. Definir MST Antes dos 3 s, MST em 30 s, e recuperação de Fluorescência (Fluo.) após 1 s. Antes de medidas de fluorescência inicial e não requer longos tempos; MST é a quantidade real de tempo para que o equilíbrio seja alcançado após a indução do calor.
- Tabela de Capilares: Para cada tubo capilar, digite o nome do alvo (ligante), o nome do ligante (analito), a concentração do alvo e a maior concentração de titulação e use a razão de titulação de preenchimento automático. Por exemplo, digite 50 nM para a concentração de alvo de Vam7-His8, Vam7-His8 para nome de destino, (1,2-dioctanoyl ácido fosfídico) Di-C8 PA para nome de ligantes, e a maior concentração do ligante selecionando 1:1 e arrastando para slots de autofill 2-16.
- Execute uma varredura de tampa para selecionar o LED apropriado (20% LED (predefinido)) com base no sinal da proteína alvo e ajuste entre unidades de fluorescência de 200 e 2000 para mst rotulado. As varreduras de tampa devem mostrar picos uniformes arredondados em forma de sino.
- Selecione uma gama de poderes MST e digite valores para cada um testar o ajuste de ligação mais robusto e aperte o Start Cap Scan + Measurement, escaneando diferentes valores para determinar as melhores condições de funcionamento para uma determinada interação que está sendo testada.
- Determine a potência MST com um melhor ajuste usando o software de análise e a predefinição para termoforese com Tjump. Analisar se encaixa de acordo com a maior separação de fluorescência entre a menor e a maior concentração em comparação com a potência MST com melhor ajuste e selecione o poder MST para ensaios de replicação.
- Determine se o fotobleaching ocorreu entre a primeira e a segunda execução, indo ao software de análise e mudando a análise para o modo expert. Em seguida, selecione fluorescência em vez de termoforese para análise. Selecione o modo de especialista e, em seguida, fotobleaching.
3. Preparação de amostras para MST rotulado
- Traga a solução Vam7-His8 para uma concentração de 200 nM na PBS sem Interpol.
- Leve o corante NTA-Atto 647 para 100 nM em PBS sem Interpol.
- Misture o corante Vam7-His8 e NTA-Atto 647 a uma proporção volumosa de 1:1 e deixe sentar-se à temperatura ambiente coberta de luz por 30 minutos. Determine a concentração adequada de proteína alvo como na seção 2.5 (ver Suplemento sobre a utilização de KD de corante Ni-NTA como demonstrado em vídeo).
- Mistura centrífuga de corante NTA-Atto 647 N e proteína por 10 minutos em uma sala escura usando uma centrífuga de mesa a aproximadamente 8.161 x g.
- Armazene a mistura a 4 °C após o experimento ou no gelo durante o experimento para reutilização dentro de algumas horas, se necessário, a fim de evitar que a proteína se desnaturasse.
- Use o localizador de concentração NT para determinar o intervalo de concentração necessário para a titulação.
- Leve o Di-C8 PA para a concentração máxima adequada na água.
- Titule o analito usando uma diluição seriada de 1:1 no buffer PBS para 16 concentrações com base na etapa anterior. Ao contrário do SPR, a termoforese não é tão sensível às diferenças de buffer.
4. MST de amostras
- Ligue o dispositivo e o laptop conectado.
- Pressione a seta para cima na frente da máquina e deslize o rack capilar para fora.
- Carregue capilares no rack com a maior concentração na posição 1.
- No software de controle, selecione o Canal Vermelho correspondente ao NTA-Atto 647 N.
- Digite informações de concentração, posição e nome para cada capilar na Tabela dos Capilares.
- Execute uma varredura capilar atingindo o Start Cap Scan em 20% LED (predefinido) e ajuste de acordo entre 200 e 2000 unidades de fluorescência usando configurações de intensidade led ou concentração de ligante (proteína rotulada).
- Selecione uma gama de energia MST.
- Iniciar a varredura da tampa + medição MST.
- Analise usando o software de análise.
5. Análise dos dados do MST
NOTA: O software de análise fornecido pela Nanotemper é proprietário e é realizado usando a Análise de Afinidade M.O. Existem diferentes maneiras de medir afinidades vinculantes baseadas em fluorescência ou termoforese. As versões mais recentes deste software são predefinidas para avaliar automaticamente os dados usando termoforese e são predefinidas para usar a Termoforese com tjump aproveitando ambas as medidas. Alternativamente, pode-se selecionar ou Tjump sozinho ou Termoforesis sozinho. Além disso, o software de análise permite medições estimadas de afinidade usando fluorescência inicial. Essas configurações podem ser acessadas apenas no modo de especialista.
- Defina a estratégia de avaliação no software de análise para especialista clicando na caixa para o relâmpago ao lado de um conjunto de dados na tela Seleção de Dados. O Software de Análise é predefinido para análise da Análise MST; no entanto, um pesquisador pode selecionar Criar Novas Análises e selecionar Análise Inicial de Fluorescência, a fim de estimar afinidades vinculantes com base na fluorescência inicial. O modo expert também está disponível para fluorescência inicial. Na análise descrita abaixo, a termoforese e tjump foi utilizada para determinar o KD do apresentado de Vam7-His8 com seu substrato natural, o ácido fosfatidídeo lipídico.
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Representative Results
Esta é uma saída amostral usando a análise de afinidade. O MST rotulado foi usado para determinar a constante de ligação do Vam7-His8 ao dioctanoyl solúvel (DiC8) PA de um de seus substratos naturais9. A Figura 1 apresenta os traços termoforéticos de um ensaio de uma titulação de 1:1 de DiC8 PA a partir de 500 μM contra 50 nM de Vam7-His8. Fluorescência inicial (tempo antes do laser infravermelho ligado), Tjump (tempo inicialmente após o laser infravermelho ligado) e termoforese (uma vez que as partículas atingem o equilíbrio com a temperatura) são mostrados. Pode-se calcular um KD de qualquer uma dessas medidas sozinho ou pode usar uma combinação de Tjump e termoforese considerando duas dessas medidas.
Na Figura 2, é mostrada uma curva de saturação para a termoforese com saída Tjump do software de análise. Como mostrado na Figura 2, a curva de saturação pode ser traçada a partir desses resultados; no entanto, pode ser difícil calcular uma curva de saturação, já que fnorm não começa a partir de zero. Para contornar esse problema, os dados podem ser normalizados manualmente, ou a saída pode ser definida como a fração vinculada determinada pelo software de análise. Geralmente, os resultados do MST são determinados usando uma escala de log, como mostrado na Figura 3. O software de análise contabiliza automaticamente a concentração de proteínas em conta, a fim de determinar a afinidade vinculante selecionando o modelo KD e inserindo a concentração de proteína. O modelo Hill no software de análise também pode ser usado, que não considera concentração de proteínas, mas pode potencialmente dar uma medida de cooperatividade para uma determinada interação. Exportando qualquer saída do software de análise e plotando em software de terceiros, pode-se obter uma medição KD como mostrado na Figura 3. Deve-se notar que a concentração crítica de micela (CMC) dos glicerofosfolipídios dioctanoyl é >3 mM, indicando que esses experimentos estão operando muito abaixo do CMC10.
Figura 1: Traços mst de Vam7-His8 para DiC8 PA. Os traços são mostrados para analito PA para NTA-Atto 647N rotulado ligante Vam7-His8 medido no canal vermelho. A fluorescência inicial foi medida à temperatura ambiente por 5 s (A) antes de ligar o laser infravermelho. O tjump (B) é medido nos segundos iniciais após a indução do calor do laser infravermelho embutido e mede as diferenças de fluorescência presentes quando o laser IR é ligado pela primeira vez antes do movimento termoforético das partículas sendo medidos. A termoforese (C) é medida após moléculas se equilibrarem do movimento induzido pelo calor do laser infravermelho devido a diferenças de movimento termoforético devido a fatores como tamanho, carga, entropia de solvação ou alteração conformacional de partícula sendo medida em relação ao analito titulado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Vinculação de saturação determinada a partir dos resultados do MST exportado utilizando software de terceiros. Resultados de fluorescência normalizados exportados do software de análise. Os dados foram exportados e plotados usando um modelo de vinculação específico de um local. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Afinidade vinculante de Vam7-His8 ao DiC8 PA usando um modelo sigmoidal. Análise dos dados exportados da Figura 1 exportados a partir do software de análise utilizando a normalização Fnorm [%]. Tomando o registro das concentrações de DiC8 PA plotados contra Fnorm usando Graphpad Prism v.7 usando Sigmoidal, 4PL, X é log(concentration) modelo permite um ajuste que resulta em um KD de 89 ± 18,0 μM para Vam7-His8 afinidade vinculante ao DiC8 PA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A determinação de Vam7-His8binding para DiC8-PA forneceu um KD robusto para a interação dada, que é um pouco menor do que o KD medido de Vam7-His8 para lipossomos pa (inédito). Essa diferença é mais provável devido à falta de uma membrana, o que geralmente resulta em menor afinidade para interações de ligação lipídica específica da membrana e, portanto, demonstra o papel do andaime de membrana liposso para esta interação11.
Para determinar melhor a força dos dados do MST, um pesquisador precisa examinar tanto a forma dos traços da Figura 1 quanto a separação dos traços do método de análise escolhido. Olhando para os traços da Figura 1, a maioria das concentrações resultou em um traço claro como determinado pelo nivelamento da porção termoforese da curva. Em alguns casos, traços correspondentes a reações contendo maiores concentrações de analito no final da medição fluorescente podem ser devido à agregação na adesão da amostra aos capilares amostrais, que podem ser remediadas por adições de plurônico ou tween ao buffer12. No entanto, detergentes como estes podem não ser adequados para interações proteína-lipídica13. Para testar a ligação não específica para este tipo de interação proteína-lipídica pode-se adicionar em BSA, aumentar a concentração de sal ou usar glicerol no buffer e testar se isso afeta o KD14,15 estimado.
A separação é determinada pela diferença de Fnorm entre a medida de concentração mais alta e menor para a interação dada. Como mostrado na Figura 2, a separação para essa interação foi de aproximadamente 75 unidades de fluorescência. De modo geral, uma separação de pelo menos 5 unidades de fluorescência deve ser alcançada para confiar com confiança em dados do MST de medições de afinidade química desconhecidas. Se um ajuste de KD robusto for alcançado em uma separação ligeiramente menor, pode-se ainda considerar tais dados se corresponder a medidas de afinidade usadas através de outra técnica, como SPR ou ITC.
Como alguns dos traços termoforéticos mostraram alguma pegajosa na amostra, a saída escolhida para a Figura 3 foi uma combinação de termoforese com Tjump. Esta configuração é a configuração pré-eleita na maioria das versões posteriores do software de análise. A Figura 3 indica um ajuste robusto para um modelo de afinidade de ligação sigmoidal, pois houve saturação clara com uma titulação de 12 pontos 1:1. O dispositivo permite que 16 pontos sejam tomados em uma determinada corrida, e muitas interações requerem todos esses pontos para obter uma forte medição de afinidade de ligação. Para obter maior confiança, este julgamento deve ser repetido com novos capilares duas ou mais vezes exigindo um total de 36 tubos capilares para este experimento. Além disso, pode-se tentar outra técnica, como a SPR, para corroborar esses dados, a fim de garantir relatórios confiáveis de constantes de afinidade como já fizemos anteriormente 8,16.
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Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses em potencial.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciência (MCB 1818310) para a RAF. Este trabalho foi apoiado em parte pela Unidade de Cristalidade de Biologia Química/Proteína do H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH/NCI: P30-CA076292).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye | GE Healthcare | PA23031 | For protein labeleing |
| Graphpad Prsim | Graphpad software | ||
| Monolith NT.115 Capillaries (1000 count) | Nanotemper | MO-K022 | Capillaries for MST |
| Monolith NT.115 machine | Nanotemper | University equipment | |
| NTA-Atto 647 N | Sigma | 2175 | label for His tags |
| Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8) | Echelon | P-3008 | Lipid for binding experiments |
References
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