Summary
遗传代码扩展用于在定义位点载体蛋白上引入一种非自然氨基酸，该氨基酸具有生物角功能组。生物激素功能进一步用于碳水化合物抗原的位点选择性耦合，以提供均匀糖基结合疫苗。
Abstract
遗传密码扩展是将非自然氨基酸 （UAAs） 引入蛋白质以改变其特性、研究或创建新蛋白质功能或获得蛋白质结合物的有力工具。停止科登抑制，特别是琥珀色的科登抑制，已成为最流行的方法，基因引入UAA在定义的位置。此方法适用于含有生物角功能组的 UAA 的载体蛋白的制备。这种反应性手柄接下来可用于专门和有效地移植合成寡糖，以提供均匀糖结合疫苗。该协议仅限于在1：1碳水化合物哈普顿/载体蛋白比中合成糖基结合物，但可与多对生物激素功能组结合。糖球菌疫苗同质性是确保完整的物理化学特性的重要标准，因此，满足越来越多的要求苛刻的药物监管机构的建议，这是经典结合策略所未达到的标准。此外，该协议使对实际结合疫苗的结构进行微调成为可能，从而产生处理结构-免疫原性关系的工具。
Introduction
糖联疫苗是可用于传染病预防治疗的疫苗库的基本要素。在包括幼儿在内的广大年龄组中，它们安全、耐受和高效。它们为脑膜炎球菌、肺炎球菌或乙型流感嗜血杆菌等细胞大 增 菌引起的感染提供了最佳防御。糖糖结合疫苗由纯化细菌多糖制成，形成细菌胶囊或合成寡糖，模仿这些表面表达的多糖2，这些多糖与载体蛋白共价。载体蛋白的存在对于促进针对碳水化合物抗原3所表达的抗原决定因素的保护性体液免疫反应至关重要。除了仔细选择和生产碳水化合物抗原外，已知对糖基结合疫苗的疗效有影响的特征是：载体蛋白的性质、结合化学（包括链接剂的性质和长度（如果使用），或糖/蛋白比3。显然，糖与蛋白质结合的位置以及连接点的数量与免疫原性相关。迄今为止，这两个参数几乎没有被研究，因为糖结合的制备在很大程度上仍然是经验性的。它们的合成通常依赖于使用胺或碳氧酸的功能，分别，赖氨酸或阿斯巴西/谷氨酸侧链残留物存在于载体蛋白序列。这导致的不是单一的，而是糖酸结合的异质混合物。
在蛋白质中氨基酸残留物的活性、可访问性或分布上，产生更明确的糖基结合物，这些糖结合物更可靠，可以记录糖/蛋白质连接4的影响。通过应用蛋白甘油耦合技术，可以朝着这一目标迈出一步，这种重组过程允许在细胞工厂5、6中生产受控糖结合疫苗。然而，糖基化完全发生在D/EXNYS/T sequons内的芦笋残渣（即X是20种天然氨基酸中的任何一种），不是天然存在于载体蛋白上。
站点选择性突变，特别是纳入半胱氨酸，以利用其高度和选择性的活性出现作为替代7，8。生产在序列中加入 UA 的载体蛋白可以为同质糖基结合疫苗制备提供更大的灵活性。超过100个UA已经开发，并进一步纳入各种蛋白质9，10。其中许多含有生物原虫功能，通常用于进行转化后修饰11或移植生物物理探针12或药物13，但非常适合与碳水化合物抗原进一步结合。Biotech14使用无细胞蛋白质合成15，成功的例子已经声称，但根据这一策略制备糖基结合疫苗仍等待推广。
在体内策略用于生产突变载体蛋白需要一种经过改良的转化机制，包括特定的codon、识别codon的tRNA和一种氨基酸-tRNA合成酶（aaRS），它们特别催化了在tRNA上转移的UAA（图1）16。热氨酸琥珀停止抑制是采用UAA的最广泛使用的方法之一，特别是丙丙酰-莱辛（PrK）17。后者反过来可以与azido功能化碳水化合物的哈普顿反应，以提供完全定义的，均匀的糖糖酶。本手稿中，我们描述了如何合成丙丙基-L-lysine，一种携带烷基手柄的UAA，如何在细菌中翻译过程中将其整合到目标蛋白中，最后如何通过点击化学在改性蛋白质和携带亚化物功能的哈顿之间进行结合。
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Protocol
1. UAA的合成：丙丙基-莱辛（PrK）
- N α- Boc - propargyl -lysine的合成 18
- 将 500 毫克的 Boc-L-Lys-OH（2.03 mmol）溶解在烧瓶中，将水性 1 M NaOH （5 mL） 和 THF （5 mL） 混合在烧瓶中，将烧瓶与硅隔膜混合。
- 在冰浴中冷却烧瓶，然后在搅拌时使用微锡林格滴（2-3 分钟）滴滴添加 158 μL 的丙丙基氯仿酸（1.62 mmol）。
- 将反应混合物加热至室温，继续搅拌10小时。
- 在冰浴中冷却50 mL二乙醚、50 mL水性1 M盐酸和60 mL乙酸乙酸乙酯溶液。
- 冷却冰浴中的粗反应混合物，将混合物倒入分离漏斗中。用50 mL的二乙醚提取混合物。丢弃有机层。
- 小心地在分离漏斗中的水相中加入水性1 M盐酸。然后用30 mL乙酸乙酸酯萃取水层两次。使用 CH2Cl2 - 甲醇 （9：1） 作为吸水剂，通过 TLC 验证有机相中是否存在 N-Boc-Propargyl-lysine。
- 在 MgSO 4 上干燥组合的有机层，过滤掉固相，在旋转蒸发器上降低压力下将滤液浓缩。
- 溶解脱盐氯仿（CDCl3）中原油N α-Boc-Propargyl-lysine的样品，并在1HNMR下控制其特性。
注意：提取可能导致压力积聚。经常释放任何压力积聚。
- 非自然氨基酸蛋白酶-L-莱辛（PrK）的合成
- 在装有隔膜的圆形底部烧瓶中引入 N- boc - α - propargyl -lysine。
- 将4 mL无水二氯甲烷（CH2Cl2）加入砷下的烧瓶，溶解N α-Boc-propargyl-lysine。
- 搅拌时，使用注射器滴滴加入4 mL的三氟乙酸（TFA）。
- 在RT搅拌反应混合物1小时，使用CH 2 Cl2-甲醇（9：1）作为吸水剂，通过TLC监测反应。
- 在减压下浓缩反应混合物。
- 将二乙醚加入粗残留物中，并在4°C下孵育1小时，以沉淀PrK。在较高规模下工作时，如果PrK未完全沉淀，则三角沉淀，并根据需要延长孵育时间。
- 在玻璃玻璃上以白色固体的形式过滤PrK。
- 在 D 2 O 中溶解 PrK的等分。然后进行 NMR 分析，以控制其特性和纯度。
- 为进一步使用，将非自然氨基酸PrK溶解在蒸馏水中，最终浓度为100 mM，并在-20°C下储存为1 mL等分。
2. 生产由PrK改性改性重组蛋白
- 质粒制备
- 构造一个表达质粒（pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-H），其中包含目标成熟的肺炎球菌表面阿登辛A（pPsa）基因（pET24d-mPsaA-WT），然后是烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶序列， 通过克隆pET24d质粒的BamHI 和 XhoI 限制位点之间的插入。这将介绍他的6 标签在蛋白质的C术语。使用传统的站点定向诱变技术，用琥珀色的 codon （TAG） 替换 Lysine-32 的鳕子。
- 构造第二个表达质粒（pEVOL-MmPylRS），其中包含两个副本的基因编码的火热酶-tRNA合成酶从 甲 烷诺西亚纳迷宫（MmPylRS）和基因编码的相应tRNAPyr， 如前面描述的19。使用这种专门设计的质粒载体，pEVOL，有效地结合万种病。
注：详细的质粒信息在补充文件1 中描述。
- 质粒共转化为表达应变
- 在冰上解冻100μL的化学能力 大肠杆菌 BL21（DE3）5分钟。
- 将每个质粒的1μL（每个质粒50-100纳克）加入到细胞中，在冰上孵育30分钟。
- 将 1.5 mL 微管与解冻的称职细胞一起，在 42 °C 的培养箱中移动 45 秒，然后将其移回冰中 2 分钟。
- 加入900μL的LB介质，在37°C下在摇动下孵育1小时，以允许抗生素表达。然后用25微克/mL的卡那霉素和30微克/mL的氯霉素将细菌盘到LB agar上。允许在37°C下过夜生长细菌。
- 使用PrK修饰的蛋白质的表达
- 用抗生素（25微克/mL的卡那霉素和30微克/mL的氯霉素）在5 mL的LB介质中接种单个共转化菌落。在37°C下孵育过夜，并摇动。
- 将原培养子（5 mL）稀释成含有抗生素的500 mL，0.02%的L-arabinose和不自然的氨基酸PrK的1 mM，并在37°C下孵育24小时，并摇动。通过并行执行没有 PrK 的培养，包括负对，通过执行含有 wt 蛋白的克隆的培养，包括负对。
- 500 mL 培养介质中为 5 mL 的 Aliquot 5 mL，离心机为 5，000 x g ， 离心机 10 分钟。丢弃上一液，将颗粒冷冻在-20°C。 通过离心从剩余的495 mL中收获细胞，在5，000 x g下10 分钟。丢弃上一液，将颗粒冷冻在-20°C。
- 通过SDS-PAGE和西式 Blot 分析，分析 5 mL 培养样品中的粗细胞提取物
- 将 5 mL 细胞颗粒重新放入 250 μL 的解液缓冲液（50 mM Na2HPO4/NaH2PO 4、150 mM NaCl、pH 8、5 mM imidazole、0.2 mM PMSF）中，并将其转移到 1.5 mL 微管中。
- 通过冷冻液氮中的管，在42°C的浴池中解冻细胞，以高速旋转30s。重复此步骤 3 次。
- 以 17，000 x g 的离 心 样品 10 分钟，以消除细胞碎片。
- 服用10μL的上流液，加入5μL水和5μL的负载缓冲液（布罗莫酚蓝色、SDS、β-甲醇）。。在100°C下加热样品5分钟，并进行SDS-PAGE和西线分析。
- 使用镍-NTA珠子通过重力流台亲和力色谱进行蛋白质纯化
- 将细胞颗粒（从 495 mL 培养物）重新填充到 20 mL 的解解缓冲液中（50 mM Na2HPO4/NaH2PO 4，150 mM NaCl，pH 8，5 mM imidazole，0.2 m PMSF）。
- 将5 μL的DNase I（1mg/mL）和500μL的解酶（50毫克/mL）加入到悬浮液中，并在30分钟内在37°C下将悬浮液孵育为37°C，允许乳解。
- 在5分钟内对细胞进行声波化（周期为5 s-5 s，振幅为50%）然后在 20，000 x g 下离心去除细胞 碎屑 30 分钟，然后在 0.45 μm 过滤器上过滤。
- 将 Ni-NTA 树脂加入悬浮液（500 μL，用于 500 mL 的细胞培养），并在 4°C 下轻轻混合 1 小时。
- 将悬浮液倒入聚丙烯柱中，并收集未绑定分数。
- 用含有 50 mM Na2HPO 4 /NaH 2 PO4、150 mM NaCl、 10 mM imidazole 的洗涤缓冲液清洗树脂。用 5 mL 洗涤缓冲液（50 mM Na 2 HPO4/NaH2PO4、150mM NaCl、20 mM imidazole）第二次清洗树脂。收集洗涤分数。
- 用 1 mL 洗脱缓冲液（50 mM Na2HPO 4 /NaH2PO4， 150 mM NaCl， 300 mM imidazole） 来洗出他标记的蛋白质。重复此步骤 4 次，并收集所有洗脱分数。
- 在 12% 丙烯酰胺凝胶上分析 SDS-PAGE 的粗晶酸盐和 7 个纯化分数。
- 使用透析膜（切断MW 6000-8000 Da）将含有纯 His 标记蛋白的馏分与 1 L 的 TEV 蛋白酶缓冲液（50 mM Tris-HCl，0.5 mM EDTA，pH 8）进行一夜透析。测量蛋白质浓度在280纳米，摩尔灭绝系数为37 360厘米-1 +M-1和分子量34.14 kDa为mPsa。
3. TEV蛋白酶消化去除组蛋白标签
- 将蛋白质样品收集到50 mL管中，并在浓度为2mg/mL时加入TEV缓冲液（50 mM Tris HCl，0.5 mM EDTA，pH 8），高达1 mL。
注：浓度可能因先前结果而异。我们测试的蛋白质浓度在典型的2-3毫克/mL范围内。 - 加入100μL的TEV蛋白酶（加入1μL含有10单位的TEV蛋白酶，用于20μg的蛋白质消化）。
- 加入 50 μL 的 0.1 M 二次醇 （DTT）。
- 配有 TEV 缓冲器（50 mM Tris HCl，0.5 mM EDTA，pH 8），高达 5 mL。
- 在4°C下孵育，剧烈摇晃。
注：如果消化不彻底，加入更多的TEV蛋白酶，孵育时间更长或在高达30°C的高温下孵育。 - 使用透析膜（截止 6000-8000 Da）对磷酸盐缓冲液（50 mM Na 2 HPO 4 HPO4/NaH2PO 4，150 mM NaCl，5 mM imidazole），在4°C下通宵去除 EDTA。
- 为了消除TEV蛋白酶和未消化的蛋白质，用Ni-NTA珠子孵育混合物，并在4°C下轻轻混合1小时。
- 将悬浮液倒入聚丙烯柱中。收集未绑定分数，用 5 mL 洗涤缓冲液洗柱（50 mM Na2HPO4/NaH2PO4，150 mM NaCl， 10 mM imidazole）
注：感兴趣的蛋白质应在未绑定和洗涤分数中回收。 - 通过添加5 mL洗脱缓冲液（50 mM Na 2 HPO 4 /NaH2PO4，150mM NaCl，300 mM imidazole），将TEV蛋白酶和未消化蛋白加入。检查280 nm的蛋白质含量分数，并通过SDS-PAGE分析。
- 通过将未消化的蛋白质加载到 SDS PAGE 上，以控制，检查消化效率。
- 在4°C下用透析膜（切断6000-8000 Da）将消化的蛋白质对1L的点击缓冲液（50 mM Na2HPO4/NaH2PO 4，pH8）进行通宵透析，以去除伊米达佐，并交换缓冲液， 并测量蛋白质浓度在280 nm与摩尔灭绝系数和分子量的mPsaA（37 360厘米-1+M-1和MW 34.14 kDa）。
4. 对非自然氨基酸蛋白酶的可访问性和点击化学功能的评估
注： 使用 Presolski 等人20 所述的点击化学协议，将 mpsa 与 6-六氯氟辛 - 阿齐德结合。
- 以57.8μM浓度为57.8μM的PrK突变蛋白为432.5μL，放入2 mL微管中。
注：烷基最低浓度为2μM。如果蛋白质浓度较低，则用离心浓缩物浓缩，或通过增加阿齐德/烷基摩尔比来平衡反应。 - 加入 10 μL 的 5 mM 6-六氯氟化素-阿齐德，然后在 20 mM 处加入 2.5 μL 的 CuSO4 溶液，在 50 mM（库存溶液浓度）处添加 7.5 μL 的 Tris（苯二甲酰胺）胺 （THPTA）。
- 加入25μL水性100 mM氨基瓜尼丁盐酸。
- 加入25μL的20毫克/mL，一种临时制备的抗酸钠水溶液。
- 关闭管子，通过反转混合几次，在室温下孵育2小时。
- 加入 50 μL 的 0.5 M EDTA，停止反应。
- 服用15μL的反应混合物，并把它放在一个微管，加入5μL的加载缓冲液（溴酚蓝色，SDS，β-美甲乙醇），在100°C加热混合物5分钟，然后加载到12%丙烯酰胺凝胶。迁移后，在 312 nm 的紫外光下在凝胶上可视化荧光结合。
5. 通过单击化学将mPsa与阿齐多功能化碳水化合物抗原（Pn14TS-N3）结合
- 耦合
- 将 432.5 μL 的 PrK 突变蛋白在 57.8 μM 下放入 2 mL 微管中。
- 在水中加入 10 μL 5 mM Pn14TS-N321， 然后在 20 mM 处加入 2.5 μL 的 CuSO4 溶液预混，在 50 mM 时加入 7.5 μL 的 THPTA。
注：Pn14TS-N3的合成，一种四糖， 一 种模仿肺炎链球菌血清型14大帽多糖，已描述在参考21。从理论上讲，任何含有亚兹德功能的碳水化合物抗原都可以使用。 - 加入25μL的100 mM氨基瓜尼丁盐酸。
- 加入25μL的20mg/mL，临时制备的抗酸钠水溶液。
- 关闭管子，通过反转几次混合，并在2小时内在RT中孵育。
- 加入 50 μL 的 0.5 M EDTA，停止反应。
- 采集 15 μL 样品，然后通过 SDS-PAGE 进行分析。
- 糖联聚气的凝胶过滤纯化
- 通过将其应用于一个石排的排干琼糖柱（15 x 600 床尺寸，3，000-70，000 分馏范围）来净化糖气，用 100 mM PBS 缓冲液进行平衡，pH 7.3 在 0.8 mL/min 流量下检测为 280 nm。
- 收集含有糖联酸的馏分。
注：对于长期储存，将糖分液对1L的H 2O两次2小时，然后用透析膜（切断Mw 6000-8000 Da）在4°C过夜，然后冷冻干燥，将糖结合储存在-80°C。
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Representative Results
在这个项目中，使用琥珀色停止抑制策略编写了一种均匀糖基结合疫苗，在定义的地点引入 UAA（图1）。肺炎球菌表面阿得辛 A 被选为载体蛋白莫伊蒂。这种蛋白质是高度保存和表达所有菌株肺炎链球菌22。它是高度免疫原性，以前用作载体的肺炎球菌疫苗配方21，23。作为概念的证明，对由野生类型热解-tRNA合成酶（PylRS）/tRNA对的古甲纳萨奇纳迷宫有效充电的UAA丙丙基-莱辛进行了调查。丙丙基-莱辛是市售的，但可以有利地准备从Boc-L-lysine只有两个合成步骤（图2）。在含有mPsa基因的pET24D质粒中，在所需位置生成琥珀胶质。这种质粒与一个pEVOL质粒（爱德华·莱姆克（EMBL19）的一种礼物共同转化，含有将丙丙基-莱辛结合到称职的大肠杆菌BL21（DE3）菌株中所必需的正交工具。使用25μg/mL卡那霉素和30微克/mL氯霉素选择正共转化克隆。质粒pEVOL最初不是MmPylRS基因编码的一个，而是两个副本，用于整合丙酰胺-莱辛残留物：第一个拷贝由组成促进器控制，而另一个副本的表达在阿拉伯糖的存在下是可吸收的。然而，我们注意到，如果组织启动子控制的MmPylRS基因被抑制，蛋白丙基-莱辛的合并并没有显著减少。
蛋白丙氨酸在位置32被引入，以替代Psa的N-术语附近的莱辛。鉴于进行进一步结合，几乎可以交换具有表面暴露侧链的任何残留物。变异蛋白以成熟形式（mPsaK32PrK）产生，在其C-术语中加入可切割的6组蛋白标记序列。使用抗西丁标记抗体，在存在或不存在 UAA 丙基-莱辛的情况下进行生长，并与野生型 mPsa 的生产进行比较时，SDS-PAGE 和西 Blot 分析对 mPsaK32PrK生产的效率进行了检查（图 3）。可视化显示蛋白质带的分子量（Lanes 4，图3A和3B）。全长蛋白质的存在强烈地表明PrK成功地融入了mPsa。然而，强度低于野生型mPsa（车道2，图3A和3B）观察到的强度。泄漏（即生产全长蛋白质而不加入UAA）和在翻译过程中释放因子RF1过早释放蛋白质是在这个过程中经常遇到的两个主要缺点。一方面，在没有丙丙基-莱辛表示未发生泄漏的情况下，没有在预期分子量处显示波段（Lanes 3，图3A和3B），并间接确认在4号通道上观测到的波段与mPsaK32PrK相对应。另一方面，在低分子量下，无法看到与mPsa的截断形式对应的波段（图3A上的Lane4）。然后，通过亲和色谱对mPsaK32PrK进行纯化，典型产量为8毫克/升（与野生型蛋白质相比为12-20毫克/升），最终通过质谱法确认丙丙基-林氨酸残留物的加入（图4）。使用TE夫蛋白酶在蛋白酶的蛋白酶时去除原蛋白酶标签（图4）。由此获得的mPsaK32PrK的稳定性通过循环二体论评估，这表明蛋白质的结构没有受到Lysine 32突变为蛋白酶-莱氨酸的干扰（数据未显示）。
拥有mPsAK32PrK，使用阿齐多功能化荧光素评估烷基的活性，进一步用于结合合成寡糖抗原β-2-二甲乙基d-Galp-（+ 1→4） - β-d-Glcp-（1→6）-β-d-Galp-（1→4）=-β-d-GlcpNAc （Pn14TS） （图5）。这种四糖与S.肺炎型14帽状多糖有关，以前曾与MPSA使用不同的结合化学8、21、24结合。这里的实验是与野生型mPsa相比进行的。使用 Tev 蛋白酶首先在蛋白酶裂解时去除原蛋白酶标签。消化的mPsaK32PrK和mPsa WT随后与氟化物（图6A）或Pn14TS（图6B）结合。SDS-PAGE对反应进行了评估。样本分子量在通道6和7之间小增加（图6B）表明与四糖Pn14TS成功结合。最后，糖联聚氰酸酯通过凝胶过滤进行纯化，其特性通过质谱法得到确认（图6C）。点击化学的结合是定量的，大多数mPsaK32PrK与Pn14TS-N3结合，如质谱结果所示（图6C）。
图1：在使用正交热力-tRNA合成物/tRNA对和TAG codon重新分配25时将丙丙基-莱辛（PrK）融入mpsa。在翻译过程中，内源性合成促进氨基酸与相应tRNA之间的联系。然后，核糖体机械使用加载的tRNA来生成新合成的多肽。根据琥珀色停止抑制策略，正交氨基-tRNA合成酶（aaRS）（此处为M.mazei的火热酶-tRNA合成物），在其同源tRNA上加载一个UAA（此处PrK），其设计抗糖的tRNA可以读取mRNA上的琥珀色停止codon（TAG）。这种特定的识别指导将 UAA 纳入目标蛋白的特定位点。图转载自王等人25。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：丙丙基-莱辛合成。 （A） 丙丙基-莱辛合成的步骤。插入：监测Bok-l-Lys（prop-2-ynyloxycarbonyl）-OH中间体）的脱保：0.25毫米硅胶板上的薄层色谱与荧光指示器（GF254），用硫酸/乙醇中的烷利（1.5：95 v/v）进行目比;Eluent： CH2Cl2/ MeOH （9：1）， 左车道： Boc - l - Lys （prop- 2 - ynyloxycarbonyl） - OH （Rf 0.90）， 右车道： 粗丙丙基 - 莱辛，（Rf 0.38）.400 MHz 1H （B） 和 13C NMR 光谱 （C） 的丙丙基-莱辛记录在 D2O. 请点击这里查看这个数字的更大版本.
图3：粗细胞样品分析。 （A） SDS-PAGE分析和（B）西方粗细胞样品印迹分析.巷1：未污染的蛋白质标记;巷2：野生型mPsa的粗细胞提取物;车道3：在没有PrK的情况下生长的mPsaK32TAG 的粗细胞提取物;车道4：在PrK条件下生长的mpsaK32TAG 的粗细胞提取：12%丙烯酰胺凝胶，运行在100 V，2小时SDS-PAGE由库马西蓝色染色;西布洛特透露使用抗原性标签抗体和二级抗体与AlexaFluor680。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：西提丁标签去除和质谱分析。 （A） SDS-PAGE 分析。巷1：未污染的蛋白质标记;巷2：粗细胞提取物;车道3：未绑定分数;车道4：用10 mM imidazole洗分数;车道5：用20 mM imidazole洗分数;条件：12%丙烯酰胺凝胶在100 V运行2小时，并染色的库马西蓝色;（B） 马尔迪-TOF-MS光谱（上）mPsa WT，理论MW 33 103 Da，发现33 106 Da和（底部）mPsa K32PrK，理论33 184 Da，发现33 192达。找到的群众在预期保证金误差范围内。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：点击化学的结合策略的示意图。 带有阿齐德的单四糖特别耦合到其补充生物托戈纳尔阿尔基恩组在mPsa K32PrK（基于1PSZ PDB文件的mPsa表示，分辨率为2.0+26）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：10月14日，1PSA与（A）荧光素-N3 和（B）Pn14TS的沙丁标记消化和结合。 （A） SDS-PAGE车道1-3：WT mPsa;车道 4-6： mPsaK32PrK;（B） 车道1：未污染的蛋白质标记;车道 2-4： WT mpsa;车道 5-7： mPsaK32prK.2 μg 蛋白质样本/通道，12% 丙烯酰胺，100 V，2 小时;（C） Pn14TS-mpsaK32prK 理论 Mw 34 091 Da 的 MALDI-TOF-MS 光谱，找到 34 088 Da. 请点击这里查看这个数字的较大版本。
补充文件 1.请单击此处查看此文件（右键单击以下载）。
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Discussion
现场定向诱变是一个直接的策略，将特定的氨基酸纳入一种蛋白质的固定位置，这种蛋白质仍然几乎不用，目的是准备糖基结合疫苗7，8，14。基于20种天然氨基酸方法的经典突变是高效的，因为不需要修改翻译机械。半胱氨酸突变通常针对进一步探索独特的硫醇反应，无论是直接还是分两步（例如，在它修改成去氢碱中间体后，一种称为翻译后突变的策略）27，28。遗传密码的扩展也许更有吸引力和灵活，因为它允许直接纳入广泛的UA与不同的功能9，10。虽然几个UA可以同时在蛋白质29中加入，但突变的数量通常比较有限。本文应用了相关的琥珀停止科登策略，在载体蛋白中引入单一丙丙基-莱辛。如果初始氨基酸的侧链是表面暴露的，则可以在任何位置进行合并，这一标准很容易从 X 射线晶体结构或硅形建模中确定。此外，它不限于丙丙基-莱辛，但可以扩展到任何UAA功能与生物角功能，稍后将作为锚来嫁接传入的碳水化合物抗原，并为此存在正交AARS/tRNA对。
该策略的缺点之一是可能产生截断的蛋白质，由于在读取琥珀停止 codon 时释放的肽侧链，作为副产品。即使我们没有在这里观察到任何截断的形式（可能由于细菌非常小而退化），在蛋白质的C-Terminus中添加了一个组蛋白标签，以方便从杂质和明显从截断的蛋白质（从本质上不表达组蛋白标签序列）中纯化预期的全长突变蛋白。如果 UAA 在蛋白质 C-术语附近进行整合，这一点可能变得至关重要，因为不能尝试使用替代色谱技术（如凝胶过滤）进行纯化。
对于大多数应用程序，删除组丁标签不是强制性的。然而，它可能有用的糖结合疫苗的设计，因为免疫系统的一部分可能会被转移到标签序列。为了这个概念验证，我们插入了一个氨基酸长度序列，专门由TEV蛋白酶切割，在消化后在载体蛋白上留下五个额外的氨基酸。
根据普雷索尔斯基等人报告的点击化学协议，在丙丙基-莱辛的烷基与与肺炎球菌胶囊相关的具有代表性的合成寡糖Pn14TS和带有互补的阿齐德之间的结合步骤进行了。20 如有必要，可以通过增加反应时间或修改烷基、阿齐德和铜反应物与试剂之间的比，轻松完成反应。铜盐通过过量的 EDTA 处理而消除，然后通过铁质排除色谱进行短净化。
与本工作中描述的技术获得的糖结合，然后可用于免疫小鼠。拥有这种完全定义和易于调节的糖结合在手提供了宝贵的工具，以评估的哈普滕/蛋白质载体连接对免疫反应8的影响。由于使用短哈普滕30时，增加同方/蛋白比通常与增强的抗同性体体反应相关，因此人们可能有兴趣测试具有多个哈普的偶数。然而，多个 UAA 的合并需要对协议进行一些调整，因为将 UAA 纳入蛋白质往往会降低由于 RF1 活性而产生蛋白质的产量。
最终，这种方法是获得同质糖结合疫苗的有力工具，有助于其物理化学特性和进一步的碳水化合物抗原/载体连接-免疫原性关系研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
E.C感谢卢瓦尔支付协会（Pari科学项目"BioSynProt"）的财政支持，特别是向T.V.提供博士学位。我们还感谢Robert B. Quast博士（INRA UMR0792，CNRS UMR5504，LISBP，法国图卢兹）的宝贵技术建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AIM (autoinductif medium) | Formedium | AIMLB0210 | Solid powder |
| Boc-Lys-OH | Alfa-Aesar | H63859 | Solid powder |
| BL21(DE3) | Merck Novagen | 69450 | E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS) |
| Dialysis membrane | |||
| DNAseI | |||
| Filter 0.45 µm | |||
| L-arabinose | |||
| lysozyme | |||
| Ni-NTA resin | Machery Nagel | Protino | Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol |
| Pall centrifugal device | |||
| pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH | this study | same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene | |
| pET24d-mPsaA-WT | this study | pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene | |
| pEVOL plasmid | gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) | plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene | |
| Propargyl chloroformate | Sigma-Aldrich | 460923 | Liquid |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB120-220 |
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