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Bioengineering

Glycoconjugate homogéneo producido por la incorporación combinada de aminoácidos antinaturales y la química de clics para fines de vacunas

Published: December 19, 2020 doi: 10.3791/60821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Université de Nantes, CNRS, Unité Fonctionnalité et Ingénierie des Protéines (UFIP), UMR 6286

Summary

La expansión del código genético se aplica para la introducción de un aminoácido antinatural que lleva un grupo funcional biorthogonal en una proteína portadora en un sitio definido. La función biorthogonal se utiliza además para el acoplamiento selectivo del sitio de un antígeno de carbohidratos para proporcionar una vacuna de glucoconjugado homogénea.

Abstract

La expansión del código genético es una poderosa herramienta para introducir aminoácidos antinaturales (UAAs) en proteínas para modificar sus características, estudiar o crear nuevas funciones proteicas o tener acceso a conjugados proteicos. Detener la supresión del codón, en particular la supresión del codón de ámbar, ha surgido como el método más popular para introducir genéticamente uaas en posiciones definidas. Esta metodología se aplica en este documento a la preparación de una proteína portadora que contiene una UAA que alberga un grupo funcional bioortohogonal. Este mango reactivo se puede utilizar a continuación para injertar de forma específica y eficiente un hapten sintético de oligosacárido para proporcionar una vacuna de glicoconjugado homogénea. El protocolo se limita a la síntesis de glucoconjugados en una proporción de proteína de hapten/portador de carbohidratos 1:1, pero susceptible a numerosos pares de grupos funcionales biorthogonales. La homogeneidad de la vacuna glucococonjugada es un criterio importante para garantizar una caracterización fisicoquímica completa, satisfaciendo así las recomendaciones cada vez más exigentes de los organismos reguladores de medicamentos, un criterio que no se cumple con las estrategias clásicas de conjugación. Además, este protocolo permite ajustar con precisión la estructura de la vacuna conjugada real, dando lugar a herramientas para abordar las relaciones estructura-inmunogenicidad.

Introduction

Las vacunas contra el glicoconjugado son elementos esenciales del arsenal de vacunas disponible para el tratamiento profiláctico de enfermedades infecciosas. Son seguros, bien tolerados y eficientes en un amplio grupo de edad, incluidos los bebés pequeños. Proporcionan la defensa óptima contra las infecciones causadas por bacterias capsuladas como meningococo, neumococo o Haemophilus influenzae tipo b1. Las vacunas glucococonjugate están hechas de polisacáridos bacterianos purificados que forman las cápsulas de bacterias o oligosacáridos sintéticos que imitan estos polisacáridos expresados en superficie2,que están covalentemente vinculados a una proteína portadora. La presencia de una proteína portadora es esencial para promover respuestas inmunitarias humorales protectoras dirigidas contra el determinante antigénico expresado por los antígenos de carbohidratos3. Aparte de una cuidadosa selección y producción del antígeno de carbohidratos, las características que se sabe que ejercen una influencia en la eficacia de una vacuna glucoconjugada son: la naturaleza de la proteína portadora, la química de conjugación (incluyendo la naturaleza y la longitud del vinculador si se utiliza), o la relación sacárido/proteína3. Obviamente, las posiciones en las que el sacárido se conjuga con la proteína, así como el número de puntos de conectividad son relevantes para la inmunogenicidad. Hasta la fecha, estos dos parámetros apenas se han estudiado porque la preparación de los glicoconjugados sigue siendo en gran medida empírica. Su síntesis generalmente se basa en el uso de funciones de amina o ácido carboxílico de, respectivamente, residuos de cadena lateral de lisina o ácido aspártico/glutámico presentes en la secuencia de proteína portadora. Esto no conduce a una sola sino a una mezcla heterogénea de glicoconjugados.

Jugar con la reactividad, accesibilidad o distribución de los residuos de aminoácidos en la proteína da lugar a glucoconjugados más definidos que son más fiables para documentar el efecto de la conectividad de sacárido/proteína4. Un paso adelante hacia este objetivo se puede lograr mediante la aplicación de la tecnología de acoplamiento de glicano proteico, un proceso recombinante que permite la producción de vacunas de glucoconjugado controlado en fábricas celulares5,6. Sin embargo, la glicosilación tiene lugar exclusivamente en un residuo de asparagina dentro de las secuoyas D/EXNYS/T (en la que X es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales), no presente naturalmente en las proteínas portadoras.

La mutagénesis selectiva del sitio y, enparticular,la incorporación de cisteínas para explotar su alta y selectiva reactividad aparece como alternativa7,8. La producción de proteínas portadoras que incorporan UAAs en su secuencia puede ofrecer aún más flexibilidad para la preparación homogénea de vacunas con glucoconjugado. Más de 100 UAAs han sido desarrolladas e incorporadas en diversas proteínas9,10. Muchos de ellos contienen funciones bioortohogonales generalmente utilizadas para llevar a cabo modificaciones posteriores a la traducción11 o para injertar sondas biofísicas12 o fármacos13 pero que son mangos ideales para una conjugación adicional con antígenos de carbohidratos. Biotech14 ha reclamado ejemplos exitosos utilizando la síntesis de proteínas libres de células15, pero la preparación de vacunas de glucoconjugado de acuerdo con esta estrategia todavía espera a popularizarse.

La aplicación de la estrategia in vivo para la producción de proteína portadora mutada necesita una maquinaria traslacional modificada que incluya un codón específico, un ARN que reconozca el codón y un aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) que cataliza específicamente la transferencia de la UAA en el ARN (Figura 1)16. La supresión del codón de detención de ámbar pirro lisina es uno de los métodos más utilizados para incorporar UAA, en particular la propargyl-lisina (PrK)17. Este último a su vez puede reaccionar con haptens de carbohidratos azido-funcionalizados para proporcionar glucococonjugados homogéneos y totalmente definidos. En el presente manuscrito describimos cómo sintetizar el propargyl-L-lisina, un UAA que lleva un mango de alquina, cómo incorporarlo a una proteína diana durante su traducción en una bacteria y finalmente cómo realizar la conjugación entre la proteína modificada y un hapten que lleva una función de azide utilizando la química de clics.

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Protocol

1. Síntesis de la UAA: propargil-lisina (PrK)

  1. Síntesis de N α-Boc-propargyl-lisina18
    1. Disolver 500 mg de Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) en una mezcla de 1 M NaOH (5 ml) y THF (5 ml) en un matraz y colocar el matraz con un tabique de silicio.
    2. Enfríe el matraz en un baño de hielo y luego agregue 158 l de cloroformato propargilo (1,62 mmol) por gota (durante un período de 2-3 minutos) utilizando una microsyringe durante la agitación.
    3. Calentar la mezcla de reacción a temperatura ambiente y continuar revolviendo durante 10 h.
    4. Enfríe las soluciones de 50 ml de éter dietílico, 50 ml de ácido clorhídrico acuoso de 1 M y 60 ml de acetato de etilo en un baño de hielo.
    5. Enfríe la mezcla de reacción bruta en un baño de hielo y vierta la mezcla en un embudo de separación. Extraiga la mezcla con 50 ml de éter dietílico. Deseche la capa orgánica.
    6. Añadir con precaución el ácido clorhídrico acuoso de 1 M a la fase acuosa en el embudo de separación. Luego extraiga la capa acuosa dos veces usando 30 ml de acetato de etilo. Verificar la presencia de N-Boc-propargyl-lisina en la fase orgánica por TLC usando CH2Cl2-metanol (9:1) como eluyente.
    7. Secar las capas orgánicas combinadas sobre MgSO4,filtrar la fase sólida y concentrar el filtrado bajo presión reducida en un evaporador rotatorio.
    8. Disolver una muestra del N α-Boc-propargyl-lisine en cloroformo deuterado (CDCl3)y controlar su identidad por 1H NMR.
      ADVERTENCIA: La extracción puede resultar en una acumulación de presión. Libere cualquier acumulación de presión con frecuencia.
  2. Síntesis del aminoácido antinatural propargyl-L-lisina (PrK)
    1. Introducir Nα-Boc-propargyl-lisina en un matraz de fondo redondo equipado con un tabique.
    2. Añadir 4 ml de diclorometano anhidro (CH2Cl2) al matraz bajo el argón para disolver el Nα-Boc-propargyl-lisine.
    3. Añadir 4 ml de ácido trifluoroacético (TFA) por gotas utilizando una jeringa durante la agitación.
    4. Revuelva la mezcla de reacción durante 1 h en RT. Monitoree la reacción por TLC usando CH2Cl2-metanol (9:1) como eluyente.
    5. Concentrar la mezcla de reacción bajo presión reducida.
    6. Añadir éter de dietil al residuo crudo e incubarlo a 4oC durante 1 h para precipitar el PrK. Cuando se trabaja a mayor escala, si el PrK no está completamente precipitado, triturar para precipitarlo y extender el tiempo de incubación si es necesario.
    7. Filtrar el PrK en forma de un sólido blanco en un vidrio frito.
    8. Disolver una alícuota del PrK en D2O. A continuación, realice análisis de RMN para controlar su identidad y pureza.
    9. Para su uso posterior, disolver el aminoácido antinatural PrK en agua destilada a una concentración final de 100 mM y almacenar a -20 oC como 1 ml de alícuotas.

2. Producción de la proteína recombinante modificada por PrK

  1. Preparación de Plásmido
    1. Construir un plásmido de expresión (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH) que contenga el gen de adhesina de superficie neumocócica madura objetivo A (mPsaA) (mPsaA) pET24d-mPsaA-WT) seguido de una secuencia de proteasa del virus de la fuerza del tabaco (TEV) clonando la plaquita entre los sitios de restricción BamHI y XhoI del plásmido pET24d. Esto introducirá una etiqueta De6 en el C-terminus de la proteína. Sustituya el codón de lisina-32 por el codón ámbar (TAG), utilizando la técnica convencional de mutagénesis dirigida por el sitio.
    2. Construir un plásmido de segunda expresión (pEVOL-MmPylRS) que contenga dos copias del gen codificación para la sintetasa pirrolysyl-tRNA de Methanosarcina mazei (MmPylRS) y la codificación genética para el tRNAPyr correspondiente como se describió anteriormente19. Utilice este vector plásmido especialmente diseñado, pEVOL, para la incorporación eficiente de UAAs.
      NOTA: La información detallada de plásmidos se describe en el archivo suplementario 1.
  2. Co-transformación de plásmidos en la cepa de expresión
    1. Descongelar una alícuota de 100 l de Escherichia coli BL21(DE3) químicamente competente sobre hielo durante 5 min.
    2. Añadir 1 l de cada plásmido (50-100 ng de cada una) en las células e incubar durante 30 minutos sobre hielo.
    3. Transfiera el microtubo de 1,5 ml con las células competentes descongeladas en una incubadora a 42oC durante 45 s y luego muévalo de nuevo al hielo durante 2 min.
    4. Añadir 900 l de medio LB e incubar bajo agitación durante 1 h a 37oC para permitir la expresión de antibióticos. A continuación, encama las bacterias en el agar LB con 25 g/ml de kanamicina y 30 g/ml de cloramphenicol. Permita el crecimiento de bacterias durante la noche a 37 oC.
  3. Expresión de proteínas modificadas con PrK
    1. Inocular una sola colonia co-transformada en 5 ml de medio LB con antibióticos (25 g/ml de kanamicina y 30 g/ml de cloramphenicol). Incubar durante la noche a 37oC con temblor.
    2. Diluir el cultivo primario (5 ml) en 500 ml de medio de autoinducción que contiene antibióticos, 0,02% de L-arabinosa y 1 mM del aminoácido antinatural PrK e incubarlo a 37 oC durante 24 h con temblor. Incluya un control negativo realizando la cultura sin PrK en paralelo y un control positivo realizando la cultura de un clon que contiene la proteína wt.
    3. Alícuota 5 ml del medio de cultivo de 500 ml y centrífuga durante 10 min a 5.000 x g. Deseche el sobrenadante y congele el pellet a -20 oC. Cosechar células de los 495 ml restantes por centrifugación durante 10 min a 5.000 x g. Deseche el sobrenadante y congele el pellet a -20 oC.
  4. Analizar extractos de células brutas de las muestras de cultivo de 5 ml mediante SDS-PAGE y el análisis western Blot
    1. Resuspender pellets de células de 5 ml en 250 ml de tampón de lisia (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazol, 0,2 mM PMSF) y transferirlo a un microtube de 1,5 mL.
    2. Lyse cells mediante la congelación de los tubos en nitrógeno líquido, descongelar en un baño de 42 oC y vórtices a alta velocidad durante 30 s. Repita este paso 3 veces.
    3. Centrifugar muestras a 17.000 x g durante 10 min para eliminar los desechos celulares.
    4. Tome 10 l del sobrenadante y añada 5 ml de agua y 5 ml de tampón de carga (azul bromofenol, SDS, β-mercaptoetanol). Calentar las muestras durante 5 min a 100 oC y realizar análisis SDS-PAGE y western Blot.
  5. Purificación de proteínas por cromatografía de afinidad de banco de flujo de gravedad utilizando cuentas de níquel-NTA
    1. Resuspender los gránulos celulares (del cultivo de 495 ml) en 20 ml de tampón de lisia (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazol, 0,2 mM PMSF).
    2. Añadir 5 l de DNase I (1 mg/ml) y 500 l de lesozima (50 mg/ml) en la suspensión y permitir la lelisis incubando la suspensión a 37oC durante 30 min.
    3. Sonicar las células durante 5 min (ciclos de 5 s-5 s, amplitud 50%) y luego retirar los desechos celulares por centrifugación a 20.000 x g durante 30 min seguido de filtración en el filtro de 0,45 m.
    4. Añadir resina Ni-NTA a la suspensión (500 ml para 500 ml de cultivo celular) y mezclar suavemente a 4 oC durante 1 h.
    5. Vierta la suspensión en una columna de polipropileno y recoja la fracción sin enlazar.
    6. Lavar la resina con 10 ml de tampón de lavado que contiene 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol. Lavar la resina por segunda vez con 5 ml de tampón de lavado (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 20 mM imidazol). Recoger las fracciones de lavado.
    7. Eluir la proteína etiquetada con 1 ml de tampón de elución (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazol). Repita este paso 4 veces y recopile todas las fracciones de elución.
    8. Analizar el analizado crudo, así como las 7 fracciones de purificación de SDS-PAGE en un gel de acrilamida del 12%.
    9. Combine las fracciones que contienen proteína pura su-etiquetada y dialícela contra 1 L de Tampón de proteasa TEV (50 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8) durante la noche mediante el uso de una membrana de diálisis (corte MW 6000-8000 Da). Mida la concentración de la proteína a 280 nm con un coeficiente de extinción molar de 37 360 cm-1m-1 y un peso molecular de 34,14 kDa para mPsaA.

3. Eliminación de la etiqueta de histidina por digestión proteasa TEV

  1. Recoger la muestra de proteína en un tubo de 50 ml y añadir tampón TEV (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) hasta 1 ml a una concentración de 2 mg/ml.
    NOTA: La concentración puede variar según los resultados anteriores. Las concentraciones de proteínas que hemos probado se encuentran en un rango típico de 2-3 mg/ml.
  2. Añadir 100 l de proteasa de TEV (añadir 1 l que contenga 10 unidades de TEV proteasa para 20 g de proteína a digerir).
  3. Añadir 50 l de 0,1 M ditiothreitol (TDT).
  4. Completo con buffer TEV (50 mM Tris HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8) hasta 5 mL.
  5. Incubar durante la noche a 4oC con agitación lenta.
    NOTA: Si la digestión no está completa, añadir más PROteasa TEV, incubar durante más tiempo o a una temperatura más alta hasta 30 oC.
  6. Dialíza la proteína digerida para eliminar el EDTA a 4oC durante la noche mediante el uso de una membrana de diálisis (corte 6000-8000 Da) contra tampón de fosfato (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 5 mM illomidale).
  7. Para eliminar la proteasa TEV y la proteína no digerido, incubar la mezcla con perlas de Ni-NTA y mezclar suavemente durante 1 h a 4oC.
  8. Vierta la suspensión en una columna de polipropileno. Recoger la fracción sin enlazar y lavar la columna con 5 ml de tampón de lavado (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol)
    NOTA: La proteína de interés debe recuperarse en las fracciones sin ataduras y de lavado.
  9. Eluir la proteasa TEV y la proteína no digerido añadiendo 5 ml de tampón de elución (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazol) en la columna. Compruebe las fracciones en busca de contenido proteico a 280 nm y mediante el análisis SDS-PAGE.
  10. Compruebe la eficiencia de la digestión cargando muestras digeridas en una SDS PAGE con la proteína no digerida como control.
  11. Dialíza la proteína digerida contra 1 L de tampón de clic (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH8) a 4oC durante la noche con una membrana de diálisis (corte 6000-8000 Da) para eliminar el imidazol, así como para cambiar el tampón, y medir la concentración de la proteína a 280 nm con coeficiente de extinción molar y peso molecular de mPsaA (37 360 cm-1m-1 y MW 34,14 kDa).

4. Evaluación de la accesibilidad y funcionalidad de propargyl-lisina de aminoácidos antinaturales para la química de clics

NOTA: Conjugar el mPsaA con 6-hexacloro-fluoresceína-azida utilizando el protocolo descrito por Presolski et al.20 para la química de clics.

  1. Tomar 432,5 ml de proteína mutada por PrK a una concentración de 57,8 m en un microtubo de 2 ml.
    NOTA: Se puede observar una concentración mínima de 2 m de alquina. Si la concentración de proteína es menor, consúltela con un concentrador centrífugo o favorezca el equilibrio de la reacción aumentando la proporción de molares de azida/alquina.
  2. Añadir 10 l de 5 mM 6-hexacloro-fluoresceína-azida y luego añadir una premezcla de 2,5 l de solución de CuSO4 a 20 mM y 7,5 l de Tris (benzyltriazolylmethyl)amina (THPTA) a 50 mM (concentraciones de soluciones de stock).
    1. Añadir 25 l de clorhidrato de aminoguanidina acuoso de 100 mM.
    2. Añadir 25 l de 20 mg/ml una solución acuosa preparada extemporáneamente de ascorbato sódico.
    3. Cierre el tubo, mezcle invirtiendo varias veces e incubar a temperatura ambiente durante 2 h.
    4. Detenga la reacción añadiendo 50 l de 0,5 M EDTA.
    5. Tomar 15 l de la mezcla de reacción y ponerlo un microtubo, añadir 5 l de tampón de carga (azul de bromofenol, SDS, β-mercaptoetanol), calentar la mezcla a 100 oC durante 5 min, y luego cargarlo en un gel de acrilamida al 12%. Después de la migración, visualice el conjugado fluorescente en el gel bajo luz UV a 312 nm.

5. Conjugación de mPsaA con un antígeno de carbohidratos azido-funcionalizado (Pn14TS-N3) por clic en química

  1. Acoplamiento
    1. Tomar 432,5 ml de proteína mutada por PrK a 57,8 oM en un microtubo de 2 ml.
    2. Añadir 10 l de 5 mM Pn14TS-N321 en agua y luego añadir una premezcla de 2,5 l de solución de CuSO4 a 20 mM y 7,5 l de THPTA a 50 mM.
      NOTA: En la referencia 21 se ha descrito la síntesis de Pn14TS-N3, un tetrasacárido que imita el polisacárido capsular Streptococcus pneumoniae. Teóricamente, se puede utilizar cualquier antígeno de carbohidratos que contenga una función de azida.
    3. Añadir 25 l de clorhidrato de aminoguanidina de 100 mM.
    4. Añadir 25 l de 20 mg/ml de solución acuosa preparada extemporáneamente de ascorbato sódico.
    5. Cierre el tubo, mezcle invirtiendo varias veces e incubar a RT durante 2 h.
    6. Detenga la reacción añadiendo 50 l de 0,5 M EDTA.
    7. Tomar 15 l de muestras y analizar por SDS-PAGE.
  2. Purificación de filtración de gel del glicoconjugado
    1. Purificar el glucoconjugado aplicándolo a una columna de agarosa de exclusión esterica (15 x 600 dimensiones de lecho, 3.000-70.000 rango de fraccionamiento), equilibrado con 100 mM de tampón PBS, pH 7.3 a un flujo de 0,8 ml/min con detección a 280 nm.
    2. Recoger las fracciones que contienen el glucoconjugado.
      NOTA: Para un almacenamiento prolongado, marque el glucoconjugado contra 1 L de H2O dos veces durante 2 h y luego durante la noche a 4 oC utilizando membrana de diálisis (corte Mw 6000-8000 Da), luego seque y almacene el glicoconjugado a -80 oC.

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Representative Results

En este proyecto, se preparó una vacuna homogénea de glucoconjugado utilizando la estrategia de supresión de codón de parada de ámbar para introducir una UAA en un sitio definido (Figura 1). La adhesina de superficie neumocoica A fue seleccionada como la mitad de la proteína portadora. Esta proteína es altamente conservada y expresada por todas las cepas de Streptococcus pneumoniae22. Es altamente inmunogénico y anteriormente utilizado como portador en formulaciones de vacunas neumocócicas21,23. Como prueba de concepto, se investigó el par de propargyl-lisina de uaA eficientemente cargado por el tipo salvaje pirrolysyl-tRNA sintetasea (PylRS)/tRNA par de la arquea Methanosarcina mazei fue investigado. El propargyl-lisina está disponible comercialmente, pero se puede preparar ventajosamente a partir de Boc-L-lisina en sólo dos pasos sintéticos (Figura 2). Se generó un codón de ámbar en la posición deseada en un plásmido pET24d que contiene el gen mPsaA. Este plásmido fue co-transformado con un plásmido pEVOL (un regalo amable de Edward Lemke (EMBL19)que contiene las herramientas ortogonales necesarias para incorporar la propargyl-lisina, en la cepa competente de E. coli BL21(DE3). Los clones copo transformados positivos se seleccionaron utilizando kanamicina de 25 g/ml y cloramphenicol de 30 g/ml. El plásmido pEVOL contiene originalmente no una sino dos copias de la codificación génica para MmPylRS para incorporar el residuo propargyl-lisina: la primera copia está bajo el control de un promotor constitutivo, mientras que la expresión del otro es inducible en presencia de arabinosa. Sin embargo, no hemos notado ninguna disminución dramática de la incorporación de propargyl-lisina si se suprime el gen MmPylRS bajo el control del promotor constitutivo.

El propargyl-lisina fue introducido en la posición 32 en reemplazo de una lisina cerca de la N-terminus de la PsaA. Cualquier residuo con una cadena lateral expuesta a la superficie se puede intercambiar virtualmente con vistas a la realización de una conjugación adicional. La proteína mutada se produjo en su forma madura (mPsaAK32PrK) con la inclusión de una secuencia de etiquetas cleavable de 6-histidina en su C-terminus. La eficiencia de la producción de mPsaAK32PrK se comprobó mediante el análisis SDS-PAGE y Western Blot utilizando un anticuerpo de etiqueta antihistidina, cuando el crecimiento se realizó en presencia o la ausencia de la propargil-lisina de la UAA y en comparación con la producción del tipo silvestre mPsaA (Figura 3). La visualización reveló una banda de proteínas con un peso molecular esperado (Carriles 4, Figura 3A y 3B). La presencia de una proteína de longitud completa indica fuertemente la incorporación exitosa del PrK en mPsaA. La intensidad es, sin embargo, menor que la observada para el tipo salvaje mPsaA (Carriles 2, Figura 3A y 3B). La fuga (es decir, la producción de la proteína de longitud completa sin la incorporación de la UAA) y la liberación prematura de la proteína por el factor de liberación RF1 durante la traducción son dos inconvenientes principales que se encuentran con frecuencia durante este proceso. Por un lado, no se visualiza ninguna banda en el peso molecular esperado en ausencia de propargyl-lisine, lo que significa que no se produjo ninguna fuga (Carriles 3, Figura 3A y 3B)e indirectamente confirmada que la banda observada en los carriles 4 corresponde a mPsaAK32PrK. Por otro lado, no se puede ver ninguna banda en un peso molecular bajo que pueda corresponder a la forma truncada de mPsaA (carril 4 en la figura 3A). El mPsaAK32PrK fue purificado por cromatografía de afinidad, con un rendimiento típico de 8 mg/L (en comparación con 12-20 mg/L para la proteína de tipo silvestre) y la incorporación del residuo propargyl-lisina fue finalmente confirmada por espectrometría de masas (Figura 4). La etiqueta de histidina se eliminó tras el escote proteolítico utilizando TEV proteasa (Figura 4). La estabilidad del mPsaAK32PrK así obtenido fue evaluada por dicroísmo circular, que mostró que la estructura de la proteína no fue perturbada por la mutación de la lisina 32 en un propargyl-lisine (datos no mostrados).

Teniendo el mPsaAK32PrK, la reactividad de la alquina para la química de clics se evaluó utilizando una fluoresceína adosalizada y se utilizó además para conjugar un antígeno sintético de oligosacárido β-2-azidolelo d-Galp-(1 →4)-β-d-Glcp-(1→6)-[β-d-Galp-(1→4)]-β-d-GlcpNAc (Pn14TS) (Figura 5). Este tetrasacárido está relacionado con el polisacárido capsular S. pneumoniae tipo 14 y previamente se ha conjugado con mPsaA utilizando diferentes químicas de conjugación8,21,24. Los experimentos aquí se hicieron en comparación con el tipo salvaje mPsaA como un control. La etiqueta de histidina se eliminó por primera vez al escote proteolítico usando la proteasa TEV. Los mPsaA digeridosK32PrK y mPsaA WT se conjugaron entonces con el fluoroprobe (Figura 6A) o Pn14TS ( Figura6B). La reacción fue evaluada por SDS-PAGE. El pequeño aumento en el peso molecular de la muestra entre los carriles 6 y 7 (Figura 6B) indica una conjugación exitosa con el tetrasacárido Pn14TS. Finalmente, el glucoconjugate fue purificado por filtración de gel y su identidad confirmada por espectrometría de masas (Figura 6C). La conjugación por clic química siendo cuantitativa la mayoría de la mPsaAK32PrK se conjuga con el Pn14TS-N3 como se ilustra en los resultados de espectrometría de masas (Figura 6C).

Figure 1
Figura 1: Incorporación de propargyl-lisina (PrK) en mPsaA durante la traducción utilizando un par ortogonal pirrolysyl-tRNA synthetase/tRNA y la reasignación de codón TAG25. Durante la traducción, las sintetasas endógenas catalizan el vínculo entre los aminoácidos y los tRNAs correspondientes. A continuación, la maquinaria ribosomal utiliza los tRNAomal cargados para generar el polipéptido neo-sintetizado. Según la estrategia de supresión de codón de parada ámbar, una synthetasa de aminoactil-tRNA ortogonal (aaRS) (aquí una synthetasa pirrolysyl-tRNA de M. mazei), carga un UAA (aquí PrK) en su tRNA cognate que diseñó anticodon puede leer el codón de parada ámbar (TAG) en el ARNm. Este reconocimiento específico dirige la incorporación de la UAA en el sitio específico en la proteína objetivo. Figura reproducida de Wang et al.25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Síntesis de propargyl-lisina. (A) Pasos de síntesis propargil-lisina. Insertar: Monitoreo de la desprotección de Boc-l-Lys(prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH intermedio: cromatografía de capa delgada en placas de gel de sílice de 0,25 mm con indicador fluorescente (GF254) y visualizado por carbonización con vanillina en ácido sulfúrico/etanol (1,5:95 v/v); eluente: CH2Cl2/MeOH (9:1), carril izquierdo: Boc-l-Lys(prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH(Rf 0.90), carril derecho: crudo propargyl-lisine, (Rf 0.38). 400 MHz 1H (B) y 13C MMR (C) de propargyl-lisine registrado en D2O. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis de muestras de células brutas. (A) Análisis SDS-PAGE y (B) Análisis de manchas occidentales en muestras de células brutas. Carril 1: marcador de proteínas no manchada; Carril 2: Extracto de célula bruta de tipo salvaje mPsaA; Carril 3: Extracto de células brutas de mPsaAK32TAG cultivado en ausencia de PrK; Carril 4: extracción de células brutas de mPsaAK32TAG cultivada en presencia de PrK. Condiciones: 12% gel de acrilamida, que funciona a 100 V, 2 h. SDS-PAGE teñido por Coomassie blue; Western Blot reveló el uso de anticuerpos antihitedina y anticuerpo secundario junto con AlexaFluor680. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Eliminación de etiquetas de histidina y análisis de espectrometría de masas. (A) Análisis SDS-PAGE. Carril 1: marcador de proteínas no manchada; Carril 2: extracto de célula bruta; Carril 3: fracción sin ataduras; Carril 4: fracción de lavado con imidazol de 10 mM; Carril 5: fracción de lavado con imidazol de 20 mM; Condiciones: 12% gel de acrilamida que funciona a 100 V durante 2 h, y manchado por Coomassie azul; (B) MALDI-TOF-MS spectra de (arriba) mPsaA WT, MW teórico 33 103 Da, encontrado 33 106 Da y (abajo) mPsaA K32PrK, teórico 33 184 Da, encontrado 33 192 Da. Las masas encontradas están dentro del error de margen esperado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Representación esquemática de la estrategia de conjugación mediante la química de clics. Un solo tetrasacárido con un azide se acopla específicamente a su grupo complementario de alquina biorthogonal en mPsaA K32PrK (representación mPsaA basada en el archivo 1PSZ PDB, con una resolución de 2,0 a26). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Digestión y conjugación de la etiqueta histidina de mPsaA con (A) fluorescein-N3 y con (B) Pn14TS. (A) Carriles SDS-PAGE 1-3: WT mPsaA; Carril 4-6: mPsaAK32PrK; (B) Carril 1: marcador de proteínas no manchado; Carril 2-4: WT mPsaA; Carril 5-7: mPsaAK32PrK. 2 g de muestra de proteína/carril, 12% acrilamida, 100 V, 2 h; (C) Los espectros MALDI-TOF-MS del Pn14TS-mPsaAK32PrK teórico MW 34 091 Da, encontraron 34 088 Da. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La mutagénesis dirigida por el sitio es una estrategia sencilla para incorporar aminoácidos específicos en una posición definida de una proteína que apenas se utiliza con el objetivo de preparar vacunas de glicoconjugado7,8,14. La mutagénesis clásica basada en el enfoque de 20 aminoácidos naturales es altamente eficiente ya que no se requiere ninguna modificación de la maquinaria de traducción. Las mutaciones de la cisteína generalmente están dirigidas a explorar más a fondo la reactividad única del tiol, ya sea directamente o en dos pasos(por ejemplo,después de su modificación en un intermedio deshidroalanina, una estrategia llamada mutagénesis post-traduccional)27,28. La expansión del código genético es quizás aún más atractiva y flexible ya que permite la incorporación directa de una amplia gama de UAAs con diversas funcionalidades9,10. Mientras que varias UAAs se pueden incorporar simultáneamente dentro de una proteína29, el número de mutaciones es generalmente más limitado. Aquí aplicamos la estrategia de codón de parada de ámbar relacionada para introducir una sola propargil-lisina en una proteína portadora. La incorporación puede tener lugar en cualquier posición siempre que la cadena lateral del aminoácido inicial estuviera expuesta a la superficie, un criterio fácilmente determinado a partir de estructuras cristalográficas de rayos X o en el modelado de silico. Por otra parte, no se limita a propargyl-lisina, pero se puede extender a cualquier UAA funcionalizado con una función biorthogonal que más tarde servirá como un ancla para injertar el antígeno de carbohidratos entrantes y para el que existe un par ortogonal aaRS/tRNA.

Uno de los inconvenientes de la estrategia es la posible producción de proteína truncada, resultante de la liberación de la cadena lateral de peptidil al leer el codón de parada de ámbar, como un producto secundario. Incluso si no observamos ninguna forma truncada aquí (probablemente degradada por las bacterias debido a su tamaño muy pequeño), se ha añadido una etiqueta de histidina en C-terminus de la proteína para facilitar la purificación de la proteína mutada de longitud completa esperada de las impurezas y notablemente de la proteína truncada (que por esencia no expresa la secuencia de etiquetas de histidina). Esto puede llegar a ser esencial si la incorporación de UAA se lleva a cabo cerca de la proteína C-terminus ya que la purificación no se puede intentar utilizando técnicas de cromatografía alternativa como la filtración de gel.

Para la mayoría de las aplicaciones la eliminación de la etiqueta de histidina no es obligatoria. Sin embargo, puede ser útil con respecto al diseño de la vacuna glucoconjugate como parte del sistema inmunitario puede ser desviado contra la secuencia de etiquetas. Para esta prueba de concepto, insertamos una secuencia de longitud de aminoácidos específicamente cortada por la proteasa TEV que deja cinco aminoácidos adicionales en la proteína portadora después de la digestión.

El paso de conjugación entre la alquina del propargyl-lisina y un oligosacárido sintético representativo Pn14TS relacionado con una cápsula neumocócica y que llevaba un azide complementario se llevó a cabo de acuerdo con un protocolo de química de clics reportado por Presolski et al.20 Si es necesario, la finalización de la reacción puede alcanzarse fácilmente aumentando el tiempo de reacción o modificando la relación entre los reactivos y reactivos de alquina, azida y cobre. Las sales de cobre se eliminan mediante el tratamiento con exceso de EDTA seguido de una breve purificación por cromatografía de exclusión esterica.

El glucoconjugado obtenido con la técnica descrita en el presente trabajo se puede utilizar para inmunizar a los ratones. Tener tal glucósicoconjugado totalmente definido y fácilmente modulado en las manos proporciona herramientas invaluables para evaluar el impacto de la conectividad portadora de hapten/proteína en la respuesta inmune8. Dado que el aumento de la relación hapten/proteína a menudo se correlaciona con una respuesta humoral anti-hapten mejorada cuando se utilizan haptens cortos30,uno podría estar interesado en probar conjugados con múltiples haptens. Sin embargo, la incorporación de múltiples UAAs necesita algunos ajustes del protocolo, ya que la incorporación de una UAA en la proteína tiende a disminuir el rendimiento de la producción de proteínas debido a la actividad RF1.

En definitiva, este método es una poderosa herramienta para acceder a vacunas homogéneas de glucoconjugado facilitando su caracterización fisicoquímica y más estudios de relación antigen/conectividad portadora de carbohidratos/conectividad portadora.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

E.C. agradece el apoyo financiero de La Région Pays de la Loire (Programa Pari Scientifique "BioSynProt"), en particular una beca doctoral para T.V. También reconocemos al Dr. Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Francia) por sus valiosos consejos técnicos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AIM (autoinductif medium) Formedium AIMLB0210 Solid powder
Boc-Lys-OH Alfa-Aesar H63859 Solid powder
BL21(DE3) Merck Novagen 69450 E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resin Machery Nagel Protino Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH this study same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WT this study pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmid gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformate Sigma-Aldrich 460923 Liquid
Sonicator Thermo Fisher FB120-220

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioingeniería Número 166 biología sintética glucoconjugado homogéneo bioconjugación selectiva en el sitio aminoácido antinatural expansión del código genético química de clics propargyl-l-lisina carbohidratos
Glycoconjugate homogéneo producido por la incorporación combinada de aminoácidos antinaturales y la química de clics para fines de vacunas
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Violo, T., Dussouy, C., Tellier, C., … More

Violo, T., Dussouy, C., Tellier, C., Grandjean, C., Camberlein, E. Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes. J. Vis. Exp. (166), e60821, doi:10.3791/60821 (2020).

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