Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Однородный гликоконъюгированный, производимый комбинированной неестественной аминокислотной инкорпорацию и нажмите-химию для целей вакцины

Published: December 19, 2020 doi: 10.3791/60821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Université de Nantes, CNRS, Unité Fonctionnalité et Ingénierie des Protéines (UFIP), UMR 6286

Summary

Генетическое расширение кода применяется для введения неестественной аминокислоты, несущей биоргононо-функциональную группу на несущем белке в определенном месте. Биортогональная функция далее используется для селективного соединения углеводного антигена для обеспечения однородной гликоконъюгации вакцины.

Abstract

Расширение генетического кода является мощным инструментом для внедрения неестественных аминокислот (УА) в белки для изменения их характеристик, изучения или создания новых белковых функций или доступа к протеиновым конъюгратам. Остановить подавление кодона, в частности подавления янтарного кодона, стало самым популярным методом генетического внедрения БПЛА на определенных позициях. Эта методология применяется к подготовке несущего белка, содержащего UAA укрывательство биоортогональной функциональной группы. Эта реактивная ручка может быть использована для конкретного и эффективного прививки синтетического олигосахарида hapten для обеспечения однородной гликоконъюгации вакцины. Протокол ограничен синтезом гликоконъюгатов в соотношении белка 1:1 углеводов, но податлив к многочисленным парам биортогональных функциональных групп. Гликококонджгейт однородность вакцины является важным критерием для обеспечения полной физико-химической характеристики, тем самым удовлетворяя все более и более требовательные рекомендации агентства по регулированию лекарственных препаратов, критерий, который не удовлетворяется классическими стратегиями спряжения. Кроме того, этот протокол позволяет точно настроить структуру фактической конъюгации вакцины, что дает возможность использовать инструменты для решения отношений между структурой и иммуногенностью.

Introduction

Гликоконъюгированные вакцины являются важными элементами арсенала вакцин, доступного для профилактического лечения инфекционных заболеваний. Они безопасны, хорошо переносятся и эффективны в широкой возрастной группе, включая маленьких детей. Они обеспечивают оптимальную защиту от инфекций, вызванных капсулированных бактерий, таких как менингококк, пневмококк или гемофильные грипп типа b1. Гликоконъюгированные вакцины сделаны из очищенных бактериальных полисахаридов, которые образуют капсулы бактерий или синтетических олигосахаридов, которые имитируют эти поверхностно выраженныеполисахариды 2, которые ковалентно связаны с белками перевозчика. Наличие белка перевозчика имеет важное значение для содействия защитной гуморальной иммунной реакции, направленной против антигенного детерминанта, выраженного углеводныхантигенов 3. Помимо тщательного отбора и производства углеводного антигена, функции, как известно, оказывают влияние на эффективность вакцины гликоконъюгации являются: природа белка перевозчика, спряжение химии (в том числе характер и длина связующим звеном при использовании), или сахарид / соотношениебелка 3. Очевидно, что позиции, при которых сахарид спрягаются с белком, а также количество точек подключения имеют отношение к иммуногенности. На сегодняшний день эти два параметра практически не изучены, поскольку подготовка гликоконъюгатов остается в основном эмпирической. Их синтез обычно опирается на использование амина или карбоксилиновой кислоты функции, соответственно, лизина или аспарагиновой / глутамической кислоты боковой цепи остатков, присутствующих на последовательности белка перевозчика. Это приводит не к одному, а к неоднородной смеси гликоконъюгатов.

Игра на реактивности, доступности или распределении аминокислотных остатков в белке приводит к более определенным гликоконъюгатам, которые являются более надежными для документирования эффекта сахарид/белковой связи4. Шаг вперед к этой цели может быть достигнут путем применения технологии соединения белка гликан, рекомбинантный процесс, который позволяет производство контролируемых гликоконъюгированных вакцин на клеточныхфабриках 5,6. Тем не менее, гликозиляция происходит исключительно на аспарагин остаток в D / EXNYS / T sequons (в котором X любой из 20 природных аминокислот), естественно, не присутствует на несущей белков.

Сайт селективного мутагенеза и, в частности, включение цистеин для использования их высокой и селективной реактивности появляетсяв качестве альтернативы 7,8. Производство белков-носителей, включающих БПЛА в их последовательность, может предложить еще большую гибкость для однородного гликоконъюгирования вакцины. Более 100 БПЛА были разработаны и дополнительно включены в различные белки9,10. Многие из них содержат биоортогональные функции, обычно используемые для выполнения постреакционныхмодификаций 11 или для прививкибиофизических зондов 12 или препаратов 13, но которые являются идеальными ручками для дальнейшего спряжения с углеводными антигенами. Успешные примеры были заявлены Biotech14 с использованием клеточного синтезабелка 15, но подготовка гликоконъюгированных вакцин в соответствии с этой стратегией все еще ждет становится популяризировал.

Применение стратегии in vivo для производства мутировавшего белка перевозчика нуждается в модифицированном переводном механизме, который включает в себя конкретный кодон, тРНК, распознающий кодон, и синтетазы аминоакил-тРНК (aaRS), который специально катализирует передачу UAA на тРНК (Рисунок 1)16. Пирролизин янтаря остановить подавление кодона является одним из наиболее широко используемых методов для включения UAA, в частности, пропаргил-лизин (PrK)17. Последние, в свою очередь, могут реагировать с азидо-функциональными углеводными haptens обеспечить полностью определенные, однородные гликоконъюгаты. В настоящей рукописи мы описываем, как синтезировать пропаргиль-L-лизин, UAA проведения алкин ручкой, как включить его в целевой белок во время его перевода в бактерии и, наконец, как выполнить спряжение между модифицированным белком и hapten проведения функции азида с помощью щелчка химии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Синтез УАА: пропаргыл-лизин (PrK)

  1. Синтез Nα-Boc-propargyl-lysine18
    1. Растворите 500 мг Boc-L-Lys-OH (2,03 ммоль) в смеси aqueous 1 M NaOH (5 мл) и THF (5 мл) в колбе и поместить колбу с кремниевой перегородкой.
    2. Охладить колбу в ледяной ванне, а затем добавить 158 л пропаргилового хлороформата (1,62 ммоль) dropwise (в течение 2-3 мин период) с помощью микросыринга при перемешивании.
    3. Разогреть реакционной смеси до комнатной температуры и продолжать помешивая в течение 10 ч.
    4. Охладить растворы 50 мл диэтил эфира, 50 мл аквеозной 1 М соляной кислоты и 60 мл этилового ацетата в ледяной ванне.
    5. Охладить сырую реакционной смесь в ледяной ванне и вылить смесь в разделительную воронку. Извлекайте смесь с 50 мл диетил эфира. Откажитесь от органического слоя.
    6. Осторожно добавьте аквеозную 1 М соляную кислоту в aqueous фазу в разделительной воронке. Затем извлекайте аковый слой дважды с помощью 30 мл этилового ацетата. Проверить наличие N-Boc-пропаргил-лизин в органической фазе TLC с помощью CH2Cl2-метанол (9:1) в качестве элюента.
    7. Высушите комбинированные органические слои над MgSO4,отфильтруй твердую фазу и сконцентрируй фильтрат под пониженным давлением на роторный испаритель.
    8. Растворите образец сырой жирной Nα-Boc-propargyl-lysine в детерированной хлороформе (CDCl3) и контролировать его идентичность на 1НМР.
      ВНИМАНИЕ: Извлечение может привести к наращиванию давления. Освобождение любого давления накопления часто.
  2. Синтез неестественной аминокислоты пропаргил-Л-лизин (PrK)
    1. Ввести Nα-Boc-propargyl-lysine в круглой нижней колбе, оснащенной перегородкой.
    2. Добавьте 4 мл ангидроус-дихлорметана (CH2Cl2) в колбу под аргоном, чтобырастворитьN α-Boc-propargyl-lysine.
    3. Добавьте 4 мл трифтороацептной кислоты (TFA) с помощью шприца при перемешивании.
    4. Перемешать реакционной смеси в течение 1 ч на RT. Мониторинг реакции TLC с помощью CH2Cl2-метанол (9:1) в качестве элюента.
    5. Сосредоточьте реакционной смеси под пониженным давлением.
    6. Добавить диэтил эфира в сырой остаток и инкубировать его при 4 градусов по Цельсию в течение 1 ч, чтобы осадки PrK. При работе в более высоком масштабе, если PrK не полностью осаждается, тритурат, чтобы вызвать его и продлить время инкубации, если это необходимо.
    7. Фильтровать PrK в виде белого твердого тела на fritted-стекло.
    8. Растворите алицит PrK в D2O. Затем провести анализ НМР, чтобы контролировать его идентичность и чистоту.
    9. Для дальнейшего использования растворите неестественную аминокислоту PrK в дистиллированной воде в конечной концентрации 100 мМ и храните при -20 градусах Цельсия в качестве 1 мл aliquots.

2. Производство рекомбинантного белка, модифицированного PrK

  1. Плазмидная подготовка
    1. Построить выражение плазмид (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYF-HHHHHHHH), который содержит целевой зрелый пневмококковый поверхностный адхесин A (mPsaA) ген (mPsaA) pET24d-mPsa-WT), за которым следует последовательность протеазы вируса табака Etch (TEV), клонирование вставки между местами ограничения BamHI и XhoI плазмид pET24d. Это введет его6 тегов на C-терминуса белка. Замените кодон лизина-32 на янтарный кодон (TAG), используя обычную технику мутагенеза, направленную на сайт.
    2. Создайте вторую плазмиду экспрессии (pEVOL-MmPylRS), содержащую две копии генного кодирования для пирролизил-тРНК-синтетазы от Methanosarcina mazei (MmPylRS) и кодирования генов для соответствующего tRNAPyr, какописано ранее 19. Используйте этот специально разработанный плазмидный вектор, pEVOL, для эффективного включения БПЛА.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о плазмидах описана в дополнительном файле 1.
  2. Совместное преобразование плазмидов в экспрессионный штамм
    1. Оттепель 100 йл aliquot химически компетентных Escherichia coli BL21 (DE3) на льду в течение 5 мин.
    2. Добавьте 1 йл каждой плазмиды (50-100 нг каждая) в клетки и инкубировать в течение 30 минут на льду.
    3. Перенесите микротрубки 1,5 мл с размороженными компетентными клетками в инкубатор при 42 градусов по Цельсию на 45 градусов, а затем перемести его обратно на лед в течение 2 минут.
    4. Добавьте 900 л среды LB и инкубировать под встряхивания в течение 1 ч при 37 градусов по Цельсию, чтобы выражение антибиотиков. Затем пластины бактерий на LB агар с 25 мкг / мл канамицина и 30 мкг / мл хлорамфеникол. Разрешить рост бактерий в одночасье при 37 градусов по Цельсию.
  3. Выражение белков, модифицированных с помощью PrK
    1. Прививка одной совместно преобразованной колонии в 5 мл ЛБ среды с антибиотиками (25 мкг/мл канамицина и 30 мкг/мл хлорамфеникол). Инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию со тряской.
    2. Разбавить первичную культуру (5 мл) в 500 мл автоматической индукционной среды, содержащей антибиотики, 0,02% L-арабинозы и 1 мМ неестественной аминокислоты PrK и инкубировать его при 37 градусов по Цельсию в течение 24 ч при встряхивании. Включите отрицательный контроль, выполняя культуру без PrK параллельно и положительный контроль, выполняя культуру клона, содержащего белок wt.
    3. Aliquot 5 мл из 500 мл среды культуры и центрифуги в течение 10 мин при 5000 х г. Откажитесь от супернатанта и заморозьте гранулы при -20 градусов по Цельсию. Урожай клеток из оставшихся 495 мл центрифугации в течение 10 мин при 5000 х г. Откажитесь от супернатанта и заморозьте гранулы при -20 градусов по Цельсию.
  4. Анализ экстрактов сырых клеток из образцов культуры 5 мл SDS-PAGE и западного анализа Blot
    1. Resuspend 5 мл клеточных гранул в 250 мкл буфера лиза (50 мМ На2HPO4/2PO4, 150 мМм NaCl, рН 8, 5 мм имидазол, 0,2 мММ PMSF) и передать его в 1,5 мл микротрубки.
    2. Лизе-клетки, замораживая трубки в жидком азоте, оттаивание его в ванне 42 градусов по Цельсию и вихри на высокой скорости в течение 30 с. Повторите этот шаг 3 раза.
    3. Образцы центрифуги на 17000 х г в течение 10 мин для устранения клеточного мусора.
    4. Возьмите 10 МКЛ супернатанта и добавьте 5 МКЛ воды и 5 МКЛ погрузочного буфера (бромофено-голубой, SDS, β-меркаптоэтанол). Нагрейте образцы в течение 5 минут при температуре 100 градусов по Цельсию и провести SDS-PAGE и западный анализ Blot.
  5. Очистка белка гравитационным потоком-скамейка сродство хроматографии с использованием никель-NTA бисера
    1. Перезапись клеточных гранул (из культуры 495 мл) в 20 мл лиза буфера (50 мМ На2HPO4/NaH2PO4, 150 мМн NaCl, рН 8, 5 мм имидазол, 0,2 мММ PMSF).
    2. Добавьте в суспензию 5 л DNase I (1 мг/мл) и 500 мкл лизозима (50 мг/мл) и дайте лизу прорезать суспензию при 37 градусах Цельсия в течение 30 мин.
    3. Sonicate клетки в течение 5 мин (циклы 5 с-5 с, амплитуда 50%) а затем удалить клеточный мусор путем центрифугации на 20000 х г в течение 30 мин с последующим фильтрацией на 0,45 мкм фильтра.
    4. Добавьте смолу Ni-NTA в суспензию (500 мкл за 500 мл клеточной культуры) и аккуратно перемешайте при 4 градусах Цельсия в течение 1 ч.
    5. Налейте суспензию в полипропиленовую колонку и соберите несысяную фракцию.
    6. Вымойте смолу 10 мл стирального буфера, содержащего 50 мМ На2HPO4/NaH2PO4,150 мМ NaCl, 10 мм имидазола. Вымойте смолу во второй раз с 5 мл стирального буфера (50 мМ На2HPO4/NaH2PO4, 150 мМ NaCl, 20 мм имидазол). Соберите фракции для мытья.
    7. Elute его помеченный белок с 1 мл элюционного буфера (50 мМ На2HPO4/NaH2PO4, 150 мМ NaCl, 300 мм имидазол). Повторите этот шаг 4 раза и соберите все фракции elution.
    8. Проанализируйте сырой лисат, а также 7 фракций очистки SDS-PAGE на 12% акриламидный гель.
    9. Объедините фракции, содержащие чистый белок с тегами Его, и облизтете его против 1 Л буфера протеазы TEV (50 мМ Трис-HCl, 0,5 мМ EDTA, рН 8) на ночь с помощью диализной мембраны (отрезанный МВт 6000-8000 Да). Измерьте концентрацию белка на уровне 280 нм с коэффициентом вымирания моляров 37 360см -1М -1 и молекулярным весом 34,14 кДа для MPsaA.

3. Удаление гистидина теги TEV протеазы пищеварения

  1. Соберите образец белка в трубку 50 мл и добавьте буфер TEV (50 мМ Tris HCl, 0,5 мМ EDTA, рН 8) до 1 мл при концентрации 2 мг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация может варьироваться в зависимости от предыдущих результатов. Концентрации белка, которые мы проверили, находятся в типичном диапазоне 2-3 мг/мл.
  2. Добавьте 100 МКЛ протеазы TEV (добавьте 1 йл, содержащий 10 единиц протеазы TEV для 20 мкг белка, чтобы переварить).
  3. Добавьте 50 МКЛ из 0,1 М дитиотрейтол (DTT).
  4. В комплекте с буфером TEV (50 мМ Трис HCl, 0,5 мМ EDTA, рН 8) до 5 мл.
  5. Инкубировать на ночь при 4 градусов по Цельсию с медленной тряской.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если пищеварение не завершено, добавьте больше протеазы TEV, инкубировать в течение более длительного времени или при более высокой температуре до 30 градусов по Цельсию.
  6. Диализ переваренного белка для удаления ЭДТА при 4 градусах Цельсия на ночь с помощью диализной мембраны (отрезание 6000-8000 Да) против фосфатного буфера (50 мМ На2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 5 мМ имидазол).
  7. Чтобы исключить протеазу TEV и непереваренный белок, инкубировать смесь с бисером Ni-NTA и аккуратно перемешать в течение 1 ч при 4 градусах Цельсия.
  8. Налейте подвеску в полипропиленовую колонку. Соберите несырья фракции и мыть колонку с 5 мл стирального буфера (50мМНа 2 HPO4/2PO4, 150 мМ НаКл, 10 мм имидазол)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Белок интереса должен быть восстановлен в неограниченных и стиральных фракций.
  9. Elute TEV protease и непереваренный белок, добавив 5 мл буфера элюции (50 мМ На2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 мм имидазола) на колонне. Проверьте фракции на содержание белка на 280 нм и SDS-PAGE анализа.
  10. Проверьте эффективность пищеварения, загрузив переваренные образцы на SDS PAGE с непереваренным белком в качестве контроля.
  11. Диализ переваренного белка против 1 л клика буфера (50 мМ На2HPO4/NaH2PO4, pH8) при 4 градусов по Цельсию ночь с диализной мембраны (отрезание 6000-8000 Da), чтобы удалить имидазол, а также для обмена буфера, и измерить концентрацию белка на уровне 280 нм с коэффициентом вымирания моляров и молекулярным весом MPsaA (37 360 см-1м -1 и МВт 34,14 кДа).

4. Оценка неестественной аминокислоты пропаргил-лизин доступности и функциональности для нажмите химии

ПРИМЕЧАНИЕ: Спрягать MPsaA с 6-hexachloro-fluorescein-азид с помощью протокола, описанного Presolski и др.20 для нажмите химии.

  1. Возьмите 432,5 МКЛ мутировавшего белка prK в концентрации 57,8 МКМ в микротрубку 2 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальная концентрация 2 МК алкин является приемлемым. Если концентрация белка ниже, сосредоточьте его с центробежным концентратором или в пользу баланса реакции, увеличив соотношение азид/алкин моляр.
  2. Добавьте 10 л 5 мМ 6-хексахлоро-флуоресцеин-азид, а затем добавьте премикс 2,5 л раствора CuSO4 на 20 мм и 7,5 л триса (бензилтриазоллметил) амина (THPTA) при концентрации 50 мМ (концентрации фондовых растворов).
    1. Добавьте 25 мкл аквея 100 мМ аминогуанидина гидрохлорид.
    2. Добавьте 25 л 20 мг/мл в экземпоранно подготовленный аквейный раствор аскорбата натрия.
    3. Закройте трубку, перемешайте несколько раз и инкубировать при комнатной температуре в течение 2 ч.
    4. Остановите реакцию, добавив 50 МКЛ 0,5 М EDTA.
    5. Возьмите 15 МКЛ реакционной смеси и положите ее на микротрубку, добавьте 5 МКЛ погрузочного буфера (бромофенол синий, SDS, β-меркаптоэтанол), нагрейте смесь при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 5 минут, а затем загрузите ее в 12% акриламидный гель. После миграции визуализуйте флуоресцентный конъюг на гель под ультрафиолетовым светом на 312 нм.

5. Спряжение MPsaA с азидо-функционализированным углеводным антигеном (Pn14TS-N3) одним щелчком мыши химии

  1. Муфта
    1. Возьмите 432,5 МКЛ мутировавшего белка при 57,8 МКМ в микротрубку 2 мл.
    2. Добавьте 10 л 5 мМ Pn14TS-N321 в воду, затем добавьте премикс 2,5 л раствора CuSO4 на 20 мм и 7,5 л THPTA на 50 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Синтез Pn14TS-N3, тетрасахарид имитирует Streptococcus пневмонии серотип 14 капсульный полисахарид, был описан в ссылке 21. Теоретически, любой углеводный антиген, содержащий функцию азида, может быть использован.
    3. Добавьте 25 мкл из 100 мМ аминогуанидина гидрохлорид.
    4. Добавьте 25 л 20 мг/мл extemporaneously подготовленный aqueous раствор аскорбат натрия.
    5. Закройте трубку, перемешайте несколько раз и инкубировать на RT в течение 2 ч.
    6. Остановите реакцию, добавив 50 МКЛ 0,5 М EDTA.
    7. Возьмите 15 МКЛ образцов и проанализируйте SDS-PAGE.
  2. Очистка гель фильтрации гликоконъюгата
    1. Очистите гликоконъюг, применив его к столбец агарозы стерического исключения (15 х 600 размеров кровати, 3000-70000 диапазон фракции), equilibrated с 100 мМ. PBS буфер, рН 7,3 на 0,8 мл / мин потока с обнаружением на 280 нм.
    2. Соберите фракции, содержащие гликоконъюг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного хранения, диализ гликоконъюгации против 1 л H 2 Oдваждыв течение 2 ч, а затем на ночь при 4 градусов по Цельсию с помощью диализной мембраны (отрезанные Mw 6000-8000 Da), а затем заморозить сухой и хранить гликоконъюг при -80 градусов по Цельсию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом проекте, однородная вакцина гликоконъюгат был подготовлен с использованием стратегии подавления остановки янтаря кодона ввести UAA на определенном сайте (Рисунок 1). Пневмоккокал поверхности адхезин А был выбран в качестве носителя белка moiety. Этот белок высоко сохраняется и выражается всеми штаммами стрептококковой пневмонии22. Он высоко иммуногенный и ранее использовался в качестве носителя в пневмококковых препаратоввакцины 21,23. В качестве доказательства концепции, UAA пропаргил-лизин эффективно заряжается от дикого типа пирролизил-тРНА синтеза (PylRS)/tRNA пара археи метаносарсина mazei был исследован. Пропаргиль-лизин коммерчески доступен, но может быть выгодно подготовлен из Boc-L-лизина всего за два синтетических шага(рисунок 2). Янтарный кодон был создан в нужном положении в плазмиде pET24d, содержащей ген MPsaA. Эта плазмида была преобразована совместно с плазмидой pEVOL (добрый подарок от Эдварда Лемке (EMBL19), содержащий ортогональные инструменты, необходимые для включения пропаргил-лизина, в компетентный штамм E. coli BL21(DE3). Положительные совместно преобразованные клоны были выбраны с использованием 25 мкг/мл канамицина и 30 мкг/мл хлорамфеникол. Плазмидный pEVOL содержит первоначально не одну, а две копии генного кодирования для MmPylRS для включения остатков пропаргил-лизина: первая копия находится под контролем составного промоутера, в то время как выражение другого является неуязвимым в присутствии арабинозы. Тем не менее, мы не заметили резкого снижения пропаргил-лизина включения, если ген MmPylRS под контролем составного промоутера подавляется.

Пропаргил-лизин был введен на позиции 32 в замене лизина вблизи N-терминуса ПсаА. Любые остатки с поверхностной боковой цепью могут быть практически обменен в связи с проведением дальнейшего спряжения. Мутировавший белок был произведен в зрелом виде (mPsaAK32PrK) с включением расщепляемой последовательности тегов 6-гистидина в его C-терминусе. Эффективность производства MPsaAK32PrK была проверена SDS-PAGE и западным анализом Blot с использованием антител антигистидина тега, когда рост был выполнен в присутствии или отсутствии УАА пропаргила-лизина и по сравнению с производством дикого типа MPsaA(рисунок 3). Визуализация выявила белковую полосу при ожидаемом молекулярном весе (Lanes 4, рисунок 3A и 3B). Наличие полноформатного белка сильно указывает на успешное включение PrK в MPsaA. Интенсивность, однако, ниже, чем наблюдается для диких депутатов типа MPsaA (Lanes 2, рисунок 3И 3B). Утечка (т.е. производство полноформатного белка без включения UAA) и преждевременное высвобождение белка фактором выпуска RF1 во время перевода являются двумя основными недостатками, часто встречающихся в ходе этого процесса. С одной стороны, ни одна полоса ожидаемого молекулярного веса не визуализируется в отсутствие пропаргил-лизина, что означает, что утечки не произошло (Lanes 3, Рисунок 3A и 3B)и косвенно подтверждается, что группа наблюдается на переулках 4 соответствует MPsaAK32PrK. С другой стороны, ни одна полоса не может быть замечена при низкой молекулярной массе, которая могла бы соответствовать усеченной форме MPsaA (Лейн 4 на рисунке 3A). MPsaAK32PrK затем очищается сродством хроматографии, с типичной урожайностью 8 мг/л (по сравнению с 12-20 мг/л для белка дикого типа) и включение остатков пропаргил-лизина, наконец, было подтверждено масс-спектрометрией(рисунок 4). Гистидин тег был удален на протеолитическое расщепление с помощью TEV protease (Рисунок 4). Стабильность MPsaAK32PrK, таким образом, была оценена с помощью кругового дихроизма, который показал, что структура белка не была нарушена мутацией лизина 32 в пропаргил-лизин (данные не показаны).

Имея MPsaAK32PrK, реактивность alkyne для нажмите химии была оценена с помощью азидо-функционализированных флуоресцента и далее используется для спряжения синтетического антигена олигосахарида β-2-азидоэтил d-Galp-(3 1→4)-β-d-Glcp-(1→6)-β-d-Galp-(1→4)-β-d-GlcpNAc (Pn14TS)(рисунок 5). Этот тетрасахарид связан с S. пневмонии типа 14 капсулярный полисахарид и ранее был спряжен на MPsaA с использованием различных химии спряжения8,21,24. Эксперименты здесь проводились по сравнению с дикими депутатами типа MPsaA в качестве контроля. Гистидин тег был впервые удален на протеолитическое расщепление с помощью TEV protease. Переваренные MPsaAK32PrK и MPsaA WT были затем спряжены с фторпробом(рисунок 6A)или Pn14TS(рисунок 6B). Реакция была оценена SDS-PAGE. Небольшое увеличение молекулярного веса образца между полосой 6 и 7(рисунок 6B) указывает на успешное спряжение с тетрасахаридом Pn14TS. Наконец, гликоконджугат был очищен фильтрацией геля и его идентичностью, подтвержденной масс-спектрометрией(рисунок 6C). Спряжение щелчком химии количественно большинство MPsaAK32PrK был спряжен с Pn14TS-N3, как показано на результаты масс-спектрометрии (Рисунок 6C).

Figure 1
Рисунок 1: Включение пропаргил-лизина (PrK) в MPsaA во время перевода с использованием ортогонального пирролизил-тРНА синтезетазы / тРНК пара и TAG кодон переназначения25. Во время перевода эндогенные синтезы катализаеты катализирует связь между аминокислотами и соответствующими тРНК. Затем загруженные тРН используются рибосомным механизмом для генерации нео синтезированного полипептида. В соответствии со стратегией подавления остановки янтаря, ортогональный аминоакил-тРНА синтезаз (aaRS) (здесь пирролизил-тРНА синтезетазы от M. mazei), загружает UAA (здесь PrK) на его cognate tRNA, который разработал антикодон может читать янтарный стоп-кодон (TAG) на mRNA. Это специфическое распознавание направляет включение UAA в конкретный участок на целевом белке. Рисунок воспроизводится из Wang et al.25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Синтез пропаргил-лизина. (A)Шаги синтеза пропаргил-лизина. Вставка: Мониторинг депротекции Boc-l-Lys (prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH промежуточный: тонкослойная хроматография на 0,25 мм кремнезема гель пластины с флуоресцентным индикатором (GF254) и визуализированы путем обугливания ванилином в серной кислоте/этаноле (1,5:95 v/v); eluent: CH2Cl2/MeOH (9:1), левая полоса: Boc-l-Lys (prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH(Rf 0.90), правая полоса: сырой пропаргиль-лизин, (R f 0.38). 400 МГц 1H (B) и 13C NMR spectra (C) пропаргил-лизина, записанного в D2O. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Анализ образцов сырых клеток. (A) SDS-PAGE анализ и (B) Западный анализ помарки на образцах сырой клетки. Переулок 1: необлитый белковый маркер; Переулок 2: экстракт сырой клетки дикого типа MPsaA; Переулок 3: экстракт сырой клетки MPsaAK32TAG, выращенный в отсутствие PrK; Переулок 4: добыча сырой клетки MPsaAK32TAG, выращенной в присутствии PrK. Условия: 12% акриламидный гель, работает на 100 V, 2 h. SDS-PAGE окрашенных Кумасси синий; Западный пятно показали с помощью анти-гистидин теги антитела и вторичные антитела в сочетании с AlexaFluor680. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Удаление тегов гистидина и анализ масс-спектрометрии. (A)анализ SDS-PAGE. Переулок 1: необлитый белковый маркер; Переулок 2: экстракт сырой клетки; Переулок 3: несвехая фракция; Переулок 4: молевая фракция с имидазолом 10 мм; Переулок 5: молевая фракция с имидазолом 20 мМ; Условия: 12% акриламидный гель работает на 100 V для 2 ч, и окрашенные Coomassie синий; (B) MALDI-TOF-MS спектры (вверху) MPsaA WT, теоретические MW 33 103 Da, нашли 33 106 Da и (внизу) MPsaA K32PrK, теоретические 33 184 Da, найдено 33 192 Da. Найденные массы находятся в пределах ожидаемой погрешности поля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Схематическое представление стратегии спряжения одним щелчком мыши. Один тетрасакхарид, несущий азид, специально соединен с его дополнительной биорфотональной группой alkyne на MPsaA K32PrK (представительство mPsaA на основе файла PDB 1PS, с разрешением 2.0No 26). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Устидин-тег пищеварения и спряжения MPsaA с (A) флуоресцеин-N3 и с (B) Pn14TS. (A)SDS-PAGE Переулки 1-3: WT MPsaA; Переулок 4-6: MPsaAK32PrK; (B)Переулок 1: необляловый маркер белка; Переулок 2-4: WT MPsaA; Переулок 5-7: MPsaAK32PrK. 2 мкг образца белка/полосы, 12% акриламида, 100 В, 2 ч; (C) MALDI-TOF-MS спектры Pn14TS-mPsaAK32PrK теоретические MW 34 091 Da, нашли 34 088 Da. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы загрузить).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Сайт-направленный мутагенез является простой стратегией для включения конкретных аминокислот в определенном положении белка, который остается едва используется с целью подготовкигликоконъюгированных вакцин 7,8,14. Классический мутагенез, основанный на подходе 20 натуральных аминокислот, является высокоэффективным, поскольку никаких изменений в механизме перевода не требуется. Мутации цистеина, как правило, направлены на дальнейшее изучениеуникальной реактивности тиола непосредственно или в два этапа (например, после его модификации в дегидроаланин промежуточный, стратегия, называемая пост-трансляционный мутагенез)27,28. Генетическое расширение кода, пожалуй, еще более привлекательным и гибким, поскольку она позволяет прямое включение широкого спектра БПЛА сразнообразными функциональными возможностями 9,10. В то время как несколько БПЛА могут быть включены одновременно в белок29, количество мутаций, как правило, более ограничено. В этом мы применили связанную стратегию остановки янтаря, чтобы ввести один пропаргиль-лизин в несущем белке. Включение может происходить в любом положении при условии, что боковая цепь исходной аминокислоты была поверхностно подвержена воздействию, критерий легко определяется от рентгеновских кристаллографических структур или в силико моделирования. Кроме того, он не ограничивается пропаргил-лизин, но может быть распространен на любой UAA функционализируется с биортогональной функции, которая позже будет служить якорем для прививки входящих углеводов антигена и для которых ортогональной пары aaRS/tRNA существует.

Одним из недостатков стратегии является возможное производство усеченного белка, в результате чего при чтении янтарного стоп-кодона, как побочный продукт, высвобождается пептидиловая боковая цепь. Даже если мы не наблюдали какой-либо усеченной форме здесь (вероятно, деградировали бактериями из-за его очень небольшой размер), гистидин тег был добавлен в C-терминуса белка для облегчения очистки ожидаемого полнометражного мутировавшего белка из примесей и заметно из усеченного белка (который по сути не выражает последовательность тега гистидина). Это может стать необходимым, если включение UAA осуществляется вблизи белка C-терминуса, так как очистка не может быть предпринята с помощью альтернативных методов хроматографии, таких как фильтрация геля.

Для большинства приложений удаление тега гистидина не является обязательным. Тем не менее, это может быть полезно в отношении разработки гликоконъюгации вакцины как часть иммунной системы могут быть отвлечены против последовательности тегов. Для этого доказательства концепции, мы вставили аминокислоты длина последовательности специально расщепляется TEV протеазы, которая оставляет пять дополнительных аминокислот на несущей белка после пищеварения.

Шаг спряжения между алкином пропаргил-лизина и репрезентативным синтетическим олигосахаридом Pn14TS, связанным с пневмококковой капсулой и несущим дополнительный азид, был проведен в соответствии с протоколом химии кликов, о который сообщил Presolski et al.20 При необходимости завершение реакции может быть легко достигнуто путем увеличения времени реакции или путем изменения соотношения между алкином, азидом и медными реагентами и реагентами. Медные соли устраняются путем обработки с избытком ЭДТА с последующим коротким очищением стерической хроматографией исключения.

Гликоконъюгат, полученный с помощью техники, описанной в настоящей работе, может быть использован для иммунизации мышей. Имея такой полностью определенный и легко модулированный гликоконъюгации в руках предоставляет бесценные инструменты для оценки влияния hapten / белка перевозчика подключения на иммунныйответ 8. Поскольку увеличение соотношения hapten/protein часто коррелирует с расширенной анти-hapten гуморальной реакции при использовании коротких haptens30, можно было бы быть заинтересованы в тестировании конъюгирует с несколькими haptens. Включение нескольких БПЛА, однако, нуждается в некоторых корректировках протокола, так как включение UAA в белок имеет тенденцию к снижению урожайности белка из-за активности RF1.

В окончательном, этот метод является мощным инструментом, чтобы получить доступ к однородным гликоконъюгированных вакцин, облегчающих их физико-химической характеристики и дальнейшего углеводного антигена / носителя связи иммуногенности отношений исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

E.C. с благодарностью признает финансовую поддержку от Ла-Регион платит де ла Луар (Пари Scientifique программы "BioSynProt"), в частности, докторскую стипендию Т.В. Мы также признательны д-ру Роберту Б. Квасту (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Тулуза, Франция) за его ценные технические советы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AIM (autoinductif medium) Formedium AIMLB0210 Solid powder
Boc-Lys-OH Alfa-Aesar H63859 Solid powder
BL21(DE3) Merck Novagen 69450 E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resin Machery Nagel Protino Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH this study same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WT this study pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmid gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformate Sigma-Aldrich 460923 Liquid
Sonicator Thermo Fisher FB120-220

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rappuoli, R. Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms. Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).
  2. Verez-Bencomo, V., et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).
  3. Berti, F., Adamo, R. Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).
  4. Stefanetti, G., et al. Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).
  5. Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines. NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).
  6. Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine. Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).
  7. Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).
  8. Pillot, A., et al. Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation. Frontiers in Chemistry. , (2019).
  9. Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function. Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).
  10. Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).
  11. Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies. Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).
  12. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids. Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).
  13. Kularatne, S. A., et al. A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).
  14. WIPO. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids. , https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS)&maxRec=11858 (2018).
  15. Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis. FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).
  16. Wang, L. Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts. Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).
  17. Brabham, R., Fascione, M. A. Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).
  18. Oller-Salvia, B. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019).
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  21. Prasanna, M., et al. Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).
  22. Morrison, K. E., et al. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).
  23. Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae. Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).
  24. Safari, D., et al. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).
  25. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).
  26. Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein. Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).
  27. Wright, T. H., Davis, B. G. Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins. Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).
  28. Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine. Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).
  29. Worst, E. G., et al. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
  30. Carboni, F., et al. GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation. The Journal of Infectious Diseases. , (2019).

Tags

Биоинженерия выпуск 166 синтетическая биология однородный гликоконъюгат выборочная биосоотвод неестественная аминокислота расширение генетического кода клик-химия пропаргиль-л-лизин углеводы
Однородный гликоконъюгированный, производимый комбинированной неестественной аминокислотной инкорпорацию и нажмите-химию для целей вакцины
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Violo, T., Dussouy, C., Tellier, C., … More

Violo, T., Dussouy, C., Tellier, C., Grandjean, C., Camberlein, E. Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes. J. Vis. Exp. (166), e60821, doi:10.3791/60821 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter