Summary
Genetische code uitbreiding wordt toegepast voor de introductie van een onnatuurlijk aminozuur met een biorthogonale functionele groep op een drager eiwit op een gedefinieerde site. De biorthogonale functie wordt verder gebruikt voor de plaatsselectieve koppeling van een koolhydraatantgeen om een homogeen glycoconjugaatvaccin te bieden.
Abstract
Genetische code uitbreiding is een krachtig instrument om onnatuurlijke aminozuren (IA's) in eiwitten te introduceren om hun kenmerken te wijzigen, om nieuwe eiwitfuncties te bestuderen of te creëren of om toegang te hebben tot eiwitconjugaten. Stop codon onderdrukking, in het bijzonder amber codon onderdrukking, is naar voren gekomen als de meest populaire methode om genetisch te introduceren UAAs op gedefinieerde posities. Deze methode wordt hierin toegepast op de bereiding van een dragereiwit dat een UAA bevat die een bioorthogonale functionele groep herbergt. Deze reactieve handgreep kan vervolgens worden gebruikt om specifiek en efficiënt een synthetische oligosaccharide hapten te transplanteren om een homogeen glycoconjugaatvaccin te leveren. Het protocol is beperkt tot de synthese van glycoconjugates in een 1:1 koolhydraat hapten /drager eiwit verhouding, maar vatbaar voor tal van paren van biorthogonal functionele groepen. Glycococonjugate vaccin homogeniteit is een belangrijk criterium om volledige fysisch-chemische karakterisering te waarborgen, waardoor, voldoen aan meer en meer veeleisende drug regelgevende instantie aanbevelingen, een criterium dat wordt onvervuld door klassieke vervoeging strategieën. Bovendien maakt dit protocol het mogelijk om de structuur van het eigenlijke conjugaatvaccin nauwkeurig af te stemmen, wat aanleiding geeft tot instrumenten om structuur-immunogeniciteitsrelaties aan te pakken.
Introduction
Glycoconjugate vaccins zijn essentiële elementen van het vaccin arsenaal beschikbaar voor de profylactische behandeling van infectieziekten. Ze zijn veilig, goed verdragen en efficiënt in een brede leeftijdsgroep met inbegrip van jonge zuigelingen. Ze bieden de optimale afweer tegen infecties veroorzaakt door gekapseizeerde bacteriën zoals meningokokken, pneumokokken of Haemophilus influenzae type b1. Glycococonjugate vaccins zijn gemaakt van gezuiverde bacteriële polysaccharides die de capsules van bacteriën of synthetische oligosadariden die deze oppervlakte-uitgedrukte polysaccharidesnabootsen 2, die covalent zijn gekoppeld aan een drager eiwit. De aanwezigheid van een dragereiwit is essentieel om beschermende humorale immuunreacties te bevorderen gericht tegen de antigene determinant uitgedrukt door de koolhydraatantigenen3. Afgezien van een zorgvuldige selectie en productie van het koolhydraatantgeen, zijn de kenmerken waarvan bekend is dat ze een invloed uitoefenen op de werkzaamheid van een glycoconjugaatvaccin: de aard van het dragereiwit, de vervoegingschemie (inclusief de aard en de lengte van de linker indien gebruikt), of de saccharide/eiwitverhouding3. Uiteraard zijn de posities waarin de saccharide is vervoegd aan het eiwit en het aantal verbindingspunten relevant voor immunogeniciteit. Tot op heden zijn deze twee parameters nauwelijks bestudeerd omdat de voorbereiding van de glycoconjugates grotendeels empirisch blijft. Hun synthese is meestal gebaseerd op het gebruik van amine- of carboxylzuurfuncties van respectievelijk lysine of aspartic/glutaminezuurzijketenresten die op de dragereiwitsequentie aanwezig zijn. Dit leidt niet tot een enkele, maar tot een heterogeen mengsel van glycoconjugates.
Spelen op de reactiviteit, toegankelijkheid of distributie van de aminozuurresten in het eiwit geeft aanleiding tot meer gedefinieerde glycoconjucten die betrouwbaarder zijn om het effect van saccharide/eiwitconnectiviteit te documenteren4. Een stap voorwaarts in de richting van dit doel kan worden bereikt door het toepassen van eiwitglycan koppelingstechnologie, een recombinant proces dat de productie van gecontroleerde glycoconjugaatvaccins in celfabrieken5,6mogelijk maakt . De glycosylation vindt echter uitsluitend plaats bij een aspergesidu in D/EXNYS/T-sequons (waarbij X een van de 20 natuurlijke aminozuren is), die niet van nature aanwezig zijn op de dragereiwitten.
Plaats selectieve mutagenese en in het bijzonder de integratie van cysteines om hun zeer en selectieve reactiviteit te benutten lijkt een alternatief7,8. Productie van drager-eiwitten waarin UAA's in hun volgorde zijn verwerkt, kunnen nog meer flexibiliteit bieden voor homogene glycoconjugaatvaccinpreparaatatie. Meer dan 100 NAA's zijn ontwikkeld en verder opgenomen in verschillende eiwitten9,10. Velen van hen bevatten bioorthogonale functies meestal gebruikt voor het uitvoeren van post translationele wijzigingen11 of om biofysische sondes12 of drugs13 enten, maar die ideale handvatten voor verdere vervoeging met koolhydraat antigenen. Succesvolle voorbeelden zijn geclaimd door Biotech14 met behulp van cel-vrije eiwitsynthese15, maar de voorbereiding van glycoconjugaat vaccins volgens deze strategie wacht nog steeds op steeds gepopulariseerd.
De toepassing van de in vivo strategie voor de productie van gemuteerde dragereiwit vergt een gewijzigde translationele machinerie die een specifieke codon, een tRNA dat de codon erkent en een aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) die specifiek de overdracht van de UAA op tRNA(Figuur 1)16) katalyseert . De pyrrolysine amber stop codon onderdrukking is een van de meest gebruikte methoden om UAA op te nemen, met name de propargyl-lysine (PrK)17. Deze laatste kan op zijn beurt reageren met azido-gefunctionaliseerde koolhydraathaten om volledig gedefinieerde, homogene glycoconjugates te bieden. In het onderhavige manuscript beschrijven we hoe we het propargyl-L-lysine, een UAA met een alkynegreep, kunnen synthetiseren, hoe het tijdens de vertaling in een bacterie in een doeleiwit worden opgenomen en hoe je vervoeging uitvoeren tussen het gemodificeerde eiwit en een hapten die een azide-functie dragen met behulp van klikchemie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synthese van de VAA: propargyl-lysine (PrK)
- Synthese van Nα-Boc-propargyl-lysine18
- Los 500 mg Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) op in een mengsel van waterige 1 M NaOH (5 mL) en THF (5 mL) in een kolf en pas de kolf in met een siliciumepma.
- Koel de kolf in een ijsbad en voeg vervolgens 158 μL propargylchloroforme (1,62 mmol) dropwise (over een periode van 2-3 minuten) toe met behulp van een microsyring tijdens het roeren.
- Verwarm het reactiemengsel op kamertemperatuur en blijf 10 uur roeren.
- Koel oplossingen af van 50 mL diethylether, 50 mL waterig 1 M zoutzuur en 60 mL ethylacetaat in een ijsbad.
- Koel het ruwe reactiemengsel in een ijsbad en giet het mengsel in een scheidingstrechter. Haal het mengsel uit met 50 mL diethylether. Gooi de organische laag weg.
- Voorzichtig waterig 1 M zoutzuur toevoegen aan de waterige fase in de scheidingstrechter. Haal vervolgens de waterige laag twee keer uit met 30 mL ethylacetaat. Controleer de aanwezigheid van N-Boc-propargyl-lysine in de organische fase door TLC met CH2Cl2-methanol (9:1) als eluent.
- Droog de gecombineerde organische lagen over MgSO4,filter de vaste fase af en concentreer het filtraat onder verminderde druk op een roterende verdamper.
- Los een monster van de ruwe olieachtige Nα-Boc-propargyl-lysine op in deuterated chloroform (CDCl3)en controleer de identiteit met 1H NMR.
LET OP: Extractie kan leiden tot een ophoping van druk. Laat elke drukopbouw vaak los.
- Synthese van het onnatuurlijke aminozuur propargyl-L-lysine (PrK)
- Introduceer Nα-Boc-propargyl-lysine in een ronde bodemkolf uitgerust met een septum.
- Voeg 4 mL waterhydroous dichloormethaan (CH2Cl2) toe aan de kolf onder argon om de Nα-Boc-propargyl-lysine op te lossen.
- Voeg 4 mL trifluoroacetisch zuur (TFA) dropwise toe met behulp van een spuit tijdens het roeren.
- Roer het reactiemengsel 1 uur bij RT. Monitor de reactie van TLC met CH2Cl2-methanol (9:1) als eluent.
- Concentreer het reactiemengsel onder verminderde druk.
- Voeg diethylether toe aan het ruwe residu en incubieer het bij 4 °C gedurende 1 uur om de PrK neer te halen. Bij het werken op hogere schaal, als de PrK niet volledig neergeslagen is, trituraat te precipitaten en de incubatietijd indien nodig uit te breiden.
- Filter de PrK in de vorm van een witte vaste stof op een gefriteerd glas.
- Los een aliquot van de PrK op in D2O. Voer vervolgens NMR-analyses uit om de identiteit en zuiverheid ervan te controleren.
- Los voor verder gebruik het onnatuurlijke aminozuur PrK op in gedestilleerd water bij een uiteindelijke concentratie van 100 mM en bewaar bij -20 °C als 1 mL aliquots.
2. Productie van het door PrK gemodificeerde recombinant eiwit
- Plasmid voorbereiding
- Bouw een expressie plasmid (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH) die het doelrijpe Pneumokokkenoppervlak adhesine A (mPsaA) gen (mPsaA) bevat pET24d-mPsaA-WT) gevolgd door een Tabaks Etch Virus (TEV) protease sequentie door het klonen van de insert tussen de BamHI en XhoI beperking sites van de pET24d plasmid. Dit zal een His6 tag introduceren op het C-eindpunt van het eiwit. Vervang de codon van lysine-32 door de amber codon (TAG), met behulp van conventionele site-directed mutagenesis techniek.
- Bouw een tweede expressie plasmide (pEVOL-MmPylRS) met twee kopieën van de gencoding voor de pyrrolysyl-tRNA synthetase van Methanosarcina mazei (MmPylRS) en de gencoding voor de overeenkomstige tRNAPyr zoals eerder beschreven19. Gebruik deze speciaal ontworpen plasmidevector pEVOL voor een efficiënte integratie van UTI's.
OPMERKING: De gedetailleerde plasmidsinformatie wordt beschreven in supplementisch dossier 1.
- Co-transformatie van plasmiden in de expressiestam
- Ontdooi een 100 μL aliquot van chemisch bevoegde Escherichia coli BL21 (DE3) op ijs gedurende 5 min.
- Voeg 1 μL van elke plasmid (50-100 ng van elk) in de cellen en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
- Breng de 1,5 mL microbuis met de ontdooide bevoegde cellen in een couveuse op 42 °C voor 45 s en verplaats het vervolgens 2 min terug naar ijs.
- Voeg 900 μL LB-medium en incubaat onder schudden toe gedurende 1 uur bij 37 °C om de expressie van antibiotica mogelijk te maken. Zet de bacteriën vervolgens op LB agar met 25 μg/mL kanamycine en 30 μg/mL chlooramfenicol. Laat bacteriëngroei 's nachts bij 37 °C.
- Expressie van eiwitten gewijzigd met PrK
- Inenting van een enkele co-getransformeerde kolonie in 5 mL LB-medium met antibiotica (25 μg/mL kanamycine en 30 μg/mL chlooramfenicol). Incubeer 's nachts bij 37 °C met schudden.
- Verdun de primaire cultuur (5 mL) tot 500 mL auto-inductiemedium met antibiotica, 0,02% L-arabinose en 1 mM van het onnatuurlijke aminozuur PrK en broed het bij 37 °C gedurende 24 uur met schudden. Neem een negatieve controle door het uitvoeren van de cultuur zonder PrK in parallel en een positieve controle door het uitvoeren van de cultuur van een kloon met het wt-eiwit.
- Aliquot 5 mL uit de 500 mL cultuur medium en centrifuge voor 10 min op 5.000 x g. Gooi de supernatant weg en vries de pellet in bij -20 °C. Oogst cellen van de resterende 495 mL door centrifugatie gedurende 10 min bij 5.000 x g. Gooi de supernatant weg en vries de pellet in bij -20 °C.
- Analyseer ruwe celextracten uit de 5 mL-cultuurmonsters door SDS-PAGE en western Blot-analyse
- Resuspend 5 mL celpellets in 250 μL lyse buffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0.2 mM PMSF) en breng het over in een 1,5 mL microtube.
- Lyse cellen door het bevriezen van de buizen in vloeibare stikstof, ontdooien in een 42 °C bad en vortexing op hoge snelheid voor 30 s. Herhaal deze stap 3 keer.
- Centrifugemonsters van 17.000 x g gedurende 10 minuten om celpuin te elimineren.
- Neem 10 μL van de supernatant en voeg 5 μL water en 5 μL laadbuffer toe (bromofenolblauw, SDS, β-mercaptoethanol). Verwarm de monsters gedurende 5 minuten bij 100 °C en voer SDS-PAGE- en western Blot-analyses uit.
- Eiwitzuivering door zwaartekracht flow-bench affiniteit chromatografie met behulp van Nickel-NTA kralen
- Resuspend de celpellets (van de 495 mL cultuur) in 20 mL lyse buffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0,2 mM PMSF).
- Voeg 5 μL DNase I (1 mg/mL) en 500 μL lysozyme (50 mg/mL) toe aan de ophanging en laat lyse toe door de suspensie gedurende 30 minuten bij 37 °C uit te broeden.
- Sonicate de cellen gedurende 5 min (cycli van 5 s-5 s, amplitude 50%) en verwijder vervolgens het celpuin door centrifugatie op 20.000 x g gedurende 30 minuten, gevolgd door filtratie op 0,45 μm filter.
- Voeg Ni-NTA hars toe aan de suspensie (500 μL voor 500 mL celkweek) en meng voorzichtig bij 4 °C gedurende 1 uur.
- Giet de suspensie in een polypropyleenkolom en verzamel de niet-gebonden fractie.
- Was de hars met 10 mL wasbuffer met 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 10 mM imidazole. Was de hars een tweede keer met 5 mL wasbuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 20 mM imidazole). Verzamel de wasfracties.
- Elute het zijn-gelabelde eiwit met 1 mL elution buffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazole). Herhaal deze stap 4 keer en verzamel alle elution fracties.
- Analyseer de ruwe lysate evenals de 7 zuiveringsfracties door SDS-PAGINA op een 12% acrylamide gel.
- Combineer de fracties met zuiver Zijn-gelabelde eiwit en dialyseren tegen 1 L van TEV protease buffer (50 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) 's nachts met behulp van een dialyse (membraan cut-off MW 6000-8000 Da). Meet de concentratie van het eiwit op 280 nm met een molaire extinctiecoëfficiënt van 37 360 cm-1∙M-1 en een moleculair gewicht van 34,14 kDa voor mPsaA.
3. Verwijdering van de histidinetag door TEV protease spijsvertering
- Verzamel het eiwitmonster in een buis van 50 mL en voeg tev-buffer (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) tot 1 mL toe bij een concentratie van 2 mg/mL.
LET OP: De concentratie kan variëren afhankelijk van eerdere resultaten. Eiwitconcentraties die we hebben getest bevinden zich in een typisch 2-3 mg/mL-bereik. - Voeg 100 μL TEV protease toe (voeg 1 μL met 10 eenheden TEV protease toe voor 20 μg eiwit om te verteren).
- Voeg 50 μL van 0,1 M dithiothreitol (DTT) toe.
- Compleet met TEV buffer (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) tot 5 mL.
- Incubeer 's nachts bij 4 °C met langzaam schudden.
OPMERKING: Als de spijsvertering niet voltooid is, voeg dan meer TEV protease toe, broed voor langere tijd of bij een hogere temperatuur tot 30 °C. - Dialyze het verteerde eiwit om EDTA 's nachts bij 4 °C te verwijderen met behulp van een dialysemembraan (cut-off 6000-8000 Da) tegen fosfaatbuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 5 mM imidazole).
- Om de TEV protease en het onverteerde eiwit te elimineren, ontcunooit u de mix met Ni-NTA kralen en meng voorzichtig gedurende 1 uur bij 4 °C.
- Giet de suspensie in een polypropyleenkolom. Verzamel de niet-gebonden fractie en was de kolom met 5 mL wasbuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole)
OPMERKING: Het eiwit van belang moet worden teruggewonnen in de niet-gebonden en wassen fracties. - Elute de TEV protease en het onverteerde eiwit door toevoeging van 5 mL elutiebuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazole) op de kolom. Controleer de breuken op eiwitgehalte op 280 nm en door SDS-PAGE analyse.
- Controleer de efficiëntie van de spijsvertering door verteerde monsters op een SDS-pagina te laden met het onverteerd eiwit als controle.
- Dialyseer het verteerde eiwit tegen 1 L klikbuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH8) bij 4 °C 's nachts met een dialysemembraan (cut-off 6000-8000 Da) om imidazole te verwijderen en om de buffer te wisselen, en meet de concentratie van het eiwit op 280 nm met molaire extinctiecoëfficiënt en moleculair gewicht van mPsaA (37 360 cm-1∙M-1 en MW 34,14 kDa).
4. Beoordeling van de onnatuurlijke aminozuur propargyl-lysine toegankelijkheid en functionaliteit voor klik chemie
OPMERKING: Vervoeg de mPsaA met 6-hexachloorein-fluorescein-azide met behulp van het protocol beschreven door Presolski et al.20 voor klikchemie.
- Neem 432,5 μL prk-gemuteerd eiwit met een concentratie van 57,8 μM in een 2 mL microbuis.
OPMERKING: Een minimumconcentratie van 2 μM alkyne is aanvaardbaar. Als de eiwitconcentratie lager is, concentreer het met een centrifugale concentrator of bevoordeel het saldo van de reactie door de verhouding tussen azide/alkyne te verhogen. - Voeg 10 μL cuso4-oplossing toe bij 20 mM en 7,5 μL Tris(benzylzostrlylmethyl)amine (THPTA) op 50 mM (voorraadoplossingenconcentraties).
- Voeg 25 μL waterige 100 mM aminoguanidine hydrochloride toe.
- Voeg 25 μL van 20 mg/mL een extemporaneously bereide waterige oplossing van natrium ascorbaat toe.
- Sluit de buis, meng door meerdere keren om te keren en incubeer op kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Stop de reactie door 50 μL 0,5 M EDTA toe te voegen.
- Neem 15 μL van het reactiemengsel en zet het een microbuis, voeg 5 μL laadbuffer toe (bromophenolblauw, SDS, β-mercaptoethanol), verwarm het mengsel op 100 °C gedurende 5 minuten en laad het vervolgens in een 12% acrylamidegel. Visualiseer na de migratie de fluorescerende conjugaat op de gel onder UV-licht op 312 nm.
5. Vervoeging van mPsaA met een azido-gefunctionaliseerd koolhydraatantigeen (Pn14TS-N3) door klikchemie
- Koppeling
- Neem 432,5 μL prk-gemuteerd eiwit bij 57,8 μM in een 2 mL microbuis.
- Voeg 10 μL van 5 mM Pn14TS-N321 toe in water en voeg vervolgens een premix van 2,5 μL CuSO4-oplossing toe op 20 mM en 7,5 μL THPTA bij 50 mM.
OPMERKING: Synthese van Pn14TS-N3, een tetrasaccharide die de Streptococcus pneumoniae serotype 14 capsular polysaccharide nabootst, is beschreven in referentie 21. Theoretisch kan elk koolhydraatantgeen dat een azidefunctie bevat, worden gebruikt. - Voeg 25 μL van 100 mM aminoguanidine hydrochloride toe.
- Voeg 25 μL van 20 mg/mL extemporaneously bereide waterige oplossing van natrium ascorbaat toe.
- Sluit de buis, meng door meerdere keren om te keren en in te broeden op RT gedurende 2 uur.
- Stop de reactie door 50 μL 0,5 M EDTA toe te voegen.
- Neem 15 μL monsters en analyseer door SDS-PAGE.
- Gelfiltratie zuivering van het glycoconjugaat
- Zuiver het glycoconjugaat door het toe te passen op een steric exclusion agarose kolom (15 x 600 bedafmetingen, 3.000-70.000 fractioneringsbereik), geëquilibrated met 100 mM PBS buffer, pH 7.3 bij een 0.8 mL/min stroom met detectie op 280 nm.
- Verzamel de fracties met de glycoconjugaat.
OPMERKING: Voor langdurige opslag dialyseert u de glycoconjugaat tweemaal tegen 1 L van H2O gedurende 2 uur en 's nachts bij 4 °C met behulp van dialysemembraan (cut-off Mw 6000-8000 Da), vries vervolgens droog en bewaar het glycoconjugaat bij -80 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit project werd een homogeen glycoconjugaatvaccin voorbereid met behulp van de amberstopcodononderdrukkingsstrategie om een UAA in te voeren op een gedefinieerde locatie(figuur 1). Pneumokokken oppervlak adhesine A werd geselecteerd als de drager eiwit moiety. Dit eiwit wordt zeer geconserveerd en uitgedrukt door alle stammen van Streptococcus pneumoniae22. Het is zeer immunogeen en eerder gebruikt als drager in pneumokokkenvaccinformuleringen21,23. Als proof-of-concept werd het UAA propargyl-lysine efficiënt opgeladen door het wilde type pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS)/tRNA-paar van het archaea Methanosarcina mazei. De propargyl-lysine is commercieel verkrijgbaar, maar kan voordelig worden bereid van Boc-L-lysine in slechts twee synthetische stappen(figuur 2). Een ambercodon werd gegenereerd op een gewenste positie in een pET24d plasmide met het mPsaA-gen. Dit plasmide werd mede getransformeerd met een pEVOL plasmide (een soort geschenk van Edward Lemke (EMBL19) met orthogonale hulpmiddelen die nodig zijn om de propargyl-lysine op te nemen in de bevoegde E. coli BL21(DE3) stam. Positieve mede-getransformeerde klonen werden geselecteerd met behulp van 25 μg/mL kanamycine en 30 μg/mL chlooramfenicol. De plasmid pEVOL bevat oorspronkelijk niet één maar twee kopieën van de gencoding voor MmPylRS om het propargyl-lysineresidu op te nemen: het eerste exemplaar staat onder controle van een constitutieve promotor, terwijl de expressie van de andere in aanwezigheid van arabinose ontleidbaar is. We hebben echter geen dramatische afname van propargyl-lysine-integratie opgemerkt als het MmPylRS-gen onder controle van constitutieve promotor wordt onderdrukt.
Het propargyl-lysine werd geïntroduceerd op positie 32 ter vervanging van een lysine in de buurt van het N-eindpunt van de PsaA. Elk residu met een aan de oppervlakte blootgestelde zijketen kan vrijwel worden uitgewisseld met het oog op verdere vervoeging. Het gemuteerde eiwit werd geproduceerd in zijn volwassen vorm (mPsaAK32PrK)met opname van een cleavable 6-histidine tag sequentie op zijn C-terminus. De efficiëntie van de mPsaAK32PrK productie werd gecontroleerd door SDS-PAGE en Western Blot analyse met behulp van een anti-Histidine tag antilichaam, toen de groei werd uitgevoerd in de aanwezigheid of de afwezigheid van de UAA propargyl-lysine en in vergelijking met de productie van het wilde type mPsaA (Figuur 3). Visualisatie toonde een eiwitband op een verwacht moleculair gewicht (Lanes 4, Figuur 3A & 3B). De aanwezigheid van een full-length eiwit duidt sterk op de succesvolle integratie van de PrK in mPsaA. De intensiteit is echter lager dan die voor wild type mPsaA (Lanes 2, figuur 3A & 3B). Lekkage (d.w.z. de productie van het volledige eiwit zonder integratie van de UAA) en vroegtijdige afgifte van het eiwit door de Release Factor RF1 tijdens de vertaling zijn twee belangrijke nadelen die vaak tijdens dit proces worden ondervonden. Aan de ene kant wordt geen enkele band op het verwachte molecuulgewicht gevisualiseerd bij afwezigheid van propargyl-lysine, wat betekent dat er geen lekkage is opgetreden (Lanes 3, Figuur 3A & 3B) en indirect bevestigd dat de band waargenomen op Lanes 4 overeenkomt met mPsaK32PrK. Aan de andere kant is er geen band te zien bij een laag moleculair gewicht dat kan overeenkomen met de afgekapte vorm van mPsaA (Baan 4 op figuur 3A). De mPsaAK32PrK werd vervolgens gezuiverd door affiniteitschromatografie, met een typische opbrengst van 8 mg/L (in vergelijking met 12-20 mg/L voor het wilde eiwit) en de integratie van het propargyl-lysineresidu werd uiteindelijk bevestigd door massaspectrometrie (figuur 4). De histidine tag werd verwijderd op proteolytische decolleté met behulp van TEV protease (Figuur 4). De stabiliteit van de aldus verkregen mPsaAK32PrK werd beoordeeld door circulair dichroisme, waaruit bleek dat de structuur van het eiwit niet werd verstoord door de mutatie van de Lysine 32 in een propargyl-lysine (niet getoonde gegevens).
Na de mPsaAK32PrKwerd de reactiviteit van de alkyne voor klikchemie beoordeeld met behulp van een azido-gefunctionaliseerde fluoresceïne en verder gebruikt om een synthetisch oligosaccharide-antigeen β-2-azidoethyl d-Galp-(2) te vervoegen→4)-β-d-Glcp-(1→6)-[β-d-Galp-(1→4)]-β-d-GlcpNAc (Pn14TS) (figuur 5). Deze tetrasaccharide is gerelateerd aan de S. pneumoniae type 14 capsaire polysaccharide en is eerder vervoegd aan mPsaA met behulp van verschillende vervoeging chemie8,21,24. Experimenten hier werden gedaan in vergelijking met wilde type mPsaA als een controle. De histidine tag werd voor het eerst verwijderd op proteolytische decolleté met behulp van de TEV protease. De verteerde mPsaAK32PrK en mPsaA WT werden vervolgens geconjugeerd naar de fluoroprobe (figuur 6A) of Pn14TS ( figuur6B). De reactie werd beoordeeld door SDS-PAGE. De kleine toename van het molecuulgewicht van het monster tussen baan 6 en 7 (figuur 6B) duidt op een succesvolle vervoeging met de tetrasaccharide Pn14TS. Ten slotte werd de glycoconjugaat gezuiverd door gelfiltratie en de identiteit ervan bevestigd door massaspectrometrie (figuur 6C). De vervoeging door klikchemie is kwantitatief de meerderheid van de mPsaAK32PrK werd vervoegd met de Pn14TS-N3 zoals blijkt uit de massaspectrometrie resultaten (Figuur 6C).
Figuur 1: Integratie van propargyl-lysine (PrK) in mPsaA tijdens de vertaling met behulp van een orthogonale pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA paar en TAG codon hertoewijzing25. Tijdens de vertaling katalyseren endogene synthetases het verband tussen aminozuren en bijbehorende tRNAs. Vervolgens worden geladen tRNAs gebruikt door de ribosomale machines om de neo-gesynthetiseerde polypeptide te genereren. Volgens de amber stop codon onderdrukking strategie, een orthogonale aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) (hierin een pyrrolysyl-tRNA synthetase van M. mazei), laadt een UAA (herein PrK) op haar cognate tRNA die ontworpen anticodon kan lezen de amber stop codon (TAG) op het mRNA. Deze specifieke herkenning leidt de integratie van de VAA in de specifieke site op het doeleiwit. Figuur gereproduceerd uit Wang et al.25. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Propargyl-lysine synthese. (A) Stappen van propargyl-lysinesynthese. Insert: Monitoring van de deprotectie van Boc-l-Lys(prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH intermediate: dunne laag chromatografie op 0,25 mm silica gelplaten met fluorescerende indicator (GF254) en gevisualiseerd door verkooling met vanillin in zwavelzuur/ethanol (1.5:95 v); eluent: CH2Cl2/MeOH (9:1), linkerrijstrook: Boc-l-Lys(prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH (Rf 0.90), rechterrijstrook: ruwe propargyl-lysine, (Rf 0.38). 400 MHz 1H (B) en 13C NMR spectra (C) van propargyl-lysine opgenomen in D2O. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Analyse van ruwe celmonsters. (A) SDS-PAGE analyse en (B) Westerse vlekanalyse op ruwe celmonsters. Baan 1: niet-gekleurde eiwitmarker; Rijstrook 2: ruw celextract van wild type mPsaA; Baan 3: ruwe cel extract van mPsaAK32TAG geteeld in de afwezigheid van PrK; Baan 4: ruwe celextractie van mPsaAK32TAG geteeld in aanwezigheid van PrK. Voorwaarden: 12% acrylamide gel, draaiend op 100 V, 2 h. SDS-PAGE gekleurd door Coomassie blauw; Western Blot bleek met behulp van anti-histidine tag antilichaam en secundaire antilichaam in combinatie met AlexaFluor680. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Histidine tag verwijdering en massaspectrometrie analyse. (A) SDS-PAGE analyse. Baan 1: niet-gekleurde eiwitmarker; Rijstrook 2: ruwe celextract; Rijstrook 3: niet-gebonden fractie; Baan 4: wasfractie met 10 mM imidazool; Baan 5: wasfractie met 20 mM imidazool; Voorwaarden: 12% acrylamide gel draait op 100 V voor 2 uur, en gekleurd door Coomassie blauw; (B) MALDI-TOF-MS spectra van (top) mPsaA WT, theoretische MW 33 103 Da, gevonden 33 106 Da en (bodem) mPsaA K32PrK, theoretisch 33 184 Da, gevonden 33 192 Da. De gevonden massa's bevinden zich binnen de verwachte margefout. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Schematische weergave van de vervoegingsstrategie door klikchemie. Een enkele tetrasaccharide met een azide is specifiek gekoppeld aan zijn complementaire biorthogonale alkyne groep op mPsaA K32PrK (mPsaA vertegenwoordiging op basis van de 1PSZ PDB bestand, met een resolutie van 2.0 Å26). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Histidine-tag spijsvertering en vervoeging van mPsaA met (A) fluorescein-N3 en met (B) Pn14TS. a) SDS-PAGE Lanes 1-3: WT mPsaA; Baan 4-6: mPsaAK32PrK; (B) Baan 1: niet-gekleurde eiwitmarker; Baan 2-4: WT mPsaA; Baan 5-7: mPsaAK32PrK. 2 μg eiwitmonster/rijstrook, 12% acrylamide, 100 V, 2 uur; (C) MALDI-TOF-MS spectra van de Pn14TS-mPsaAK32PrK theoretische MW 34 091 Da, gevonden 34 088 Da. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend bestand 1. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Site-directed mutagenesis is een eenvoudige strategie om specifieke aminozuren op te nemen in een gedefinieerde positie van een eiwit dat nauwelijks wordt gebruikt met het doel om glycoconjugate vaccins7,8,14voor te bereiden . Klassieke mutagenesis op basis van de 20 natuurlijke aminozuren aanpak is zeer efficiënt, omdat er geen wijziging van de vertaalmachines nodig is. Cysteïne mutaties zijn meestal gericht op verdere verkenning van de unieke thiol reactiviteit, hetzij direct of in twee stappen(bijvoorbeeld, na de wijziging ervan in een dehydroalanine intermediair, een strategie genaamd post-translationele mutagenesis)27,28. Genetische code uitbreiding is misschien nog aantrekkelijker en flexibeler, omdat het mogelijk maakt de directe integratie van een breed scala van IA's met diverse functionaliteiten9,10. Hoewel verschillende IA's gelijktijdig kunnen worden opgenomen in een eiwit29,is het aantal mutaties meestal beperkter. We hebben hierin de gerelateerde amber stop codon strategie toegepast om een enkel propargyl-lysine in een drager eiwit te introduceren. De integratie kan plaatsvinden op elke positie op voorwaarde dat de sidechain van het oorspronkelijke aminozuur aan het oppervlak werd blootgesteld, een criterium dat gemakkelijk kan worden bepaald aan de hand van röntgenkristallografische structuren of in silicomodellering. Bovendien is het niet beperkt tot propargyl-lysine, maar kan worden uitgebreid tot elke UAA gefunctionaliseerd met een biorthogonale functie die later zal dienen als een anker om het inkomende koolhydraat antigeen te transplanteren en waarvoor een orthogonale / tRNA paar bestaat.
Een van de nadelen van de strategie is de mogelijke productie van afgekapt eiwit, als gevolg van het vrijkomen van de peptidyl sidechain bij het lezen van de amber stop codon, als een bijproduct. Zelfs als we hier geen afgekapte vorm hebben waargenomen (waarschijnlijk afgebroken door de bacteriën vanwege het zeer kleine formaat), is er een histidine-tag toegevoegd op C-eindpunt van het eiwit om de zuivering van het verwachte volledige gemuteerde eiwit uit onzuiverheden en merkbaar uit het afgeknotte eiwit te vergemakkelijken (dat in wezen de histidine-tagsequentie niet uitdrukt). Dit kan essentieel worden als de UAA-integratie wordt uitgevoerd in de buurt van het eiwit C-terminus, omdat zuivering niet kan worden geprobeerd met behulp van alternatieve chromatografie technieken zoals gel filtratie.
Voor de meeste toepassingen is het verwijderen van de histidine-tag niet verplicht. Het kan echter nuttig zijn met betrekking tot het ontwerp van glycoconjugate vaccin als onderdeel van het immuunsysteem kan worden afgeleid tegen de tag sequentie. Voor dit proof-of-concept hebben we een aminozuurlengtesequentie ingebracht die specifiek door de TEV-protease is gespleten, waardoor er na de spijsvertering vijf extra aminozuren op het dragereiwit achterblijft.
De vervoegingsstap tussen de alkyne van de propargyl-lysine en een representatieve synthetische oligosaccharide Pn14TS met betrekking tot een pneumokokkencapsule en het dragen van een aanvullend azide werd uitgevoerd volgens een door Presolski et al. gemeld klikchemieprotocol.20 Indien nodig kan de voltooiing van de reactie gemakkelijk worden bereikt door de reactietijd te verhogen of door de verhouding tussen de alkyne, azide en koper reactanten en reagentia te wijzigen. Koperzouten worden geëlimineerd door behandeling met overtollige EDTA, gevolgd door een korte zuivering door sterische uitsluitingchromatografie.
De glycoconjugaat verkregen met de techniek beschreven in het huidige werk kan vervolgens worden gebruikt om muizen te immuniseren. Het hebben van dergelijke volledig gedefinieerde en gemakkelijk gemoduleerde glycoconjugaat in handen biedt onschatbare hulpmiddelen om de impact van de hapten/eiwitdragerconnectiviteit op de immuunrespons te evalueren8. Aangezien het verhogen van de hapten/eiwitverhouding vaak gecorreleerd is met verbeterde anti-hapten humorale respons bij het gebruik van korte haptens30,zou men geïnteresseerd kunnen zijn in het testen van conjugaten met meerdere haptens. De integratie van meerdere NAA's heeft echter enkele aanpassingen van het protocol nodig, omdat de integratie van een UAA in het eiwit de neiging heeft om de opbrengst van de eiwitproductie als gevolg van de RF1-activiteit te verminderen.
In het definitieve, deze methode is een krachtig instrument om toegang te krijgen tot homogene glycoconjugaat vaccins vergemakkelijken hun fysisch-chemische karakterisering en verdere koolhydraat antigeen / drager connectiviteit-immunogeniciteit relatie studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
E.C. erkent dankbaar de financiële steun van La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Program "BioSynProt"), in het bijzonder een doctoraatsbeurs voor T.V. We erkennen ook Dr. Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Frankrijk) voor zijn kostbare technische adviezen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AIM (autoinductif medium) | Formedium | AIMLB0210 | Solid powder |
| Boc-Lys-OH | Alfa-Aesar | H63859 | Solid powder |
| BL21(DE3) | Merck Novagen | 69450 | E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS) |
| Dialysis membrane | |||
| DNAseI | |||
| Filter 0.45 µm | |||
| L-arabinose | |||
| lysozyme | |||
| Ni-NTA resin | Machery Nagel | Protino | Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol |
| Pall centrifugal device | |||
| pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH | this study | same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene | |
| pET24d-mPsaA-WT | this study | pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene | |
| pEVOL plasmid | gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) | plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene | |
| Propargyl chloroformate | Sigma-Aldrich | 460923 | Liquid |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB120-220 |
References
- Rappuoli, R. Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms. Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).
- Verez-Bencomo, V., et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).
- Berti, F., Adamo, R. Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).
- Stefanetti, G., et al. Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).
- Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines. NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).
- Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine. Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).
- Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).
- Pillot, A., et al. Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation. Frontiers in Chemistry. , (2019).
- Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function. Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).
- Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).
- Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies. Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids. Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).
- Kularatne, S. A., et al. A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).
- WIPO. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids. , https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS)&maxRec=11858 (2018).
- Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis. FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).
- Wang, L. Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts. Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).
- Brabham, R., Fascione, M. A. Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).
- Oller-Salvia, B. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
- Prasanna, M., et al. Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).
- Morrison, K. E., et al. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).
- Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae. Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).
- Safari, D., et al. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).
- Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).
- Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein. Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).
- Wright, T. H., Davis, B. G. Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins. Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).
- Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine. Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).
- Worst, E. G., et al. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
- Carboni, F., et al. GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation. The Journal of Infectious Diseases. , (2019).
