Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

גליקוקוג'גייט הומוגני המיוצר על ידי התאגדות חומצת אמינו לא טבעית משולבת וכימיה לחץ למטרות חיסון

Published: December 19, 2020 doi: 10.3791/60821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Université de Nantes, CNRS, Unité Fonctionnalité et Ingénierie des Protéines (UFIP), UMR 6286

Summary

הרחבת קוד גנטי מוחלת על הקדמה של חומצת אמינו לא טבעית הנושאת קבוצה פונקציונלית ביורטוגונלית על חלבון נשא באתר מוגדר. הפונקציה biorthogonal משמש עוד יותר עבור צימוד סלקטיבי האתר של אנטיגן פחמימות כדי לספק חיסון גליקוקוג'וג'וגייט הומוגני.

Abstract

הרחבת קוד גנטי היא כלי רב עוצמה כדי להכניס חומצות אמינו לא טבעיות (כטב"מים) לתוך חלבונים כדי לשנות את המאפיינים שלהם, ללמוד או ליצור פונקציות חלבון חדשות או יש גישה ליחידות חלבון. להפסיק דיכוי קודון, במיוחד דיכוי codon ענבר, התגלה כשיטה הפופולרית ביותר להציג גנטית UAAs בעמדות מוגדרות. מתודולוגיה זו מיושמת בזאת על הכנת חלבון נשא המכיל UAA מחסה קבוצה פונקציונלית bioorthogonal. ידית תגובתית זו יכולה לשמש לאחר מכן כדי להשתיל באופן ספציפי ויעיל אוליגוסכריד hapten סינתטי כדי לספק חיסון גליקוקוג'וג'גייט הומוגני. הפרוטוקול מוגבל לסינתזה של גליקוקוגייטים ביחס חלבון 1:1 פחמימות/נשא, אך ניתן לחוות זוגות רבים של קבוצות תפקודיות ביו-לוגוניות. הומוגניות חיסון Glycocococonjugate הוא קריטריון חשוב כדי להבטיח אפיון פיזיקו-כימי מלא, ובכך, סיפוק יותר ויותר תובעני יותר המלצות הסוכנות הרגולטורית סמים, קריטריון אשר לא נענה על ידי אסטרטגיות התייחדות קלאסיות. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר לכוונן היטב את המבנה של החיסון ההתייחדות בפועל, מה שמוליך כלים לטיפול ביחסים בין מבנה לחיסונים.

Introduction

חיסוני גליקוקו-קו-גייט הם מרכיבים חיוניים של ארסנל החיסון הזמין לטיפול מונע במחלות זיהומיות. הם בטוחים, נסבלים היטב ויעילים בקבוצת גיל רחבה כולל תינוקות צעירים. הם מספקים את ההגנה האופטימלית מפני זיהומים הנגרמת על ידי חיידקים ממוססים כמו מנינגוקוקוס, פנאומוקקוס או שפעת המופילוס סוג b1. חיסוני גליקוקוקוג'וג'גייט עשויים מפוליסכרידים חיידקיים מטוהרים הקוביות של חיידקים או אוליגוסכרידים סינתטיים המחקים את הפוליסכרידיםהמבוטאים עלפני השטח 2 , המקושרים באופן קובלנטי לחלבון מוביל. הנוכחות של חלבון נשא חיוני כדי לקדם תגובות חיסוניות הומוריסטיות מגן מכוון נגד הקובע האנטיגני שהביע אנטיגנים פחמימות3. מלבד בחירה קפדנית וייצור של אנטיגן פחמימות, התכונות ידועות להפעיל השפעה על היעילות של חיסון גליקוקונג'וגייט הם: טבעו של חלבון המוביל, הכימיה ההתייחדות (כולל אופי ואורך המקשר אם נעשה שימוש), או יחס saccharide / חלבון3. מן הסתם, התנוחות שבהן ה-saccharide מודבק לחלבון, כמו גם מספר נקודות הקישוריות רלוונטיות לחיסונים. עד כה, שני פרמטרים אלה כמעט ולא נחקרו כי הכנת גליקוקוגייטים נשאר בעיקר אמפירי. הסינתזה שלהם מסתמכת בדרך כלל על השימוש בפונקציות חומצה קרבוקסילית או קארבוקסילית של, בהתאמה, ליזאין או אספרטית / גלוטמית חומצה בצד שרשרת שאריות הנוכחי על רצף חלבון המוביל. זה מוביל לא לתערובת הטרוגנית של גליקוקו-ג'וגייט.

משחק על תגובתיות, נגישות או התפלגות של שאריות חומצת אמינו בחלבון יוצר גליקוקוגטים מוגדרים יותר כי הם אמינים יותר לתעד את ההשפעה של קישוריות saccharide / חלבון4. צעד קדימה לקראת מטרה זו ניתן להשיג על ידי יישום טכנולוגיית צימוד גליקן חלבון, תהליך רקומביננטי המאפשר ייצור של חיסונים גליקוגט מבוקר במפעלי תאים5,6. עם זאת, גליקוסילציה מתרחשת באופן בלעדי במשקעים אספראג'ין בתוך D / EXNYS / T sequons (לפיה X הוא כל מתוך 20 חומצות אמינו טבעיות), לא קיים באופן טבעי על חלבוני המוביל.

אתר מוטגנזה סלקטיבית ובמיוחד התאגדות של ציסטאין כדי לנצל את תגובתיותם מאוד סלקטיבית מופיעהכאלטרנטיבה 7,8. ייצור חלבוני נשא המשלבים כטב"מים ברצף שלהם יכול להציע גמישות רבה עוד יותר להכנת חיסון גליקו-conjugate הומוגני. יותר מ 100 כטב"מים פותחו ושילבו עוד יותר חלבוניםשונים 9,10. רבים מהם מכילים פונקציות bioorthogonal משמש בדרך כלל לבצע שינוייםתרגום פוסט 11 או להשתיל בדיקותביופיזיות 12 או תרופות 13 אבל שהם ידיות אידיאליות להתייחדות נוספת עם אנטיגנים פחמימות. דוגמאות מוצלחות כבר טענו על ידי ביוטכנולוגיה14 באמצעות סינתזת חלבון ללאתאים 15 אבל הכנת חיסונים גליקוגייט על פי אסטרטגיה זו עדיין מחכה להיות פופולרי.

יישום של אסטרטגיית vivo לייצור של חלבון נשא מוטציה צריך מכונות תרגום שונה הכולל codon ספציפי, tRNA זיהוי קודון סינתזה אמינואציל-tRNA (aaRS) אשר במיוחד מקטע את העברת UAA על tRNA (איור 1)16. דיכוי הענבר pyrrolysine להפסיק קודון היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לשלב UAA, במיוחד propargyl-ליסין (PrK)17. האחרון יכול בתורו להגיב עם הפטנים פחמימות פונקציונליאזידו לספק מוגדר באופן מלא, גליקוגטים הומוגניים. בכתב היד הנוכחי אנו מתארים כיצד לסנתז את propargyl-L-ליסין, UAA נושא ידית alkyne, איך לשלב אותו לתוך חלבון היעד במהלך התרגום שלה בחיידק ולבסוף איך לבצע התייחדות בין החלבון שונה hapten נושא פונקציה אזיד באמצעות כימיה לחץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. סינתזה של UAA: פרופארג'י-לייסין (PrK)

  1. סינתזה של Nα-Boc-propargyl-ליסין18
    1. להמיס 500 מ"ג של Boc-L-Lys-OH (2.03 mmol) בתערובת של מים 1 M NaOH (5 מ"ל) ו THF (5 מ"ל) במבחנות ולה להתאים את הבקבוקון עם מחיצה סיליקון.
    2. מצננים את הבקבוקון באמבט קרח ולאחר מכן מוסיפים 158 μL של פרופארג'י כלורופורם (1.62 מ"מ) תוך כדי ערבוב.
    3. מחממים את תערובת התגובה לטמפרטורת החדר וממשיכים לערבב במשך 10 שעות.
    4. לקרר פתרונות של 50 מ"ל של אתר diethyl, 50 מ"ל של חומצה הידרוכלורית 1 M מים ו 60 מ"ל של אצטט אתיל באמבט קרח.
    5. מצננים את תערובת התגובה הגולמית באמבט קרח ויוצקים את התערובת למשפך הפרדה. לחלץ את התערובת עם 50 מ"ל של אתר diethyl. השליכו את השכבה האורגנית.
    6. בזהירות להוסיף חומצה הידרוכלורית 1 M מים לשלב המים במשפך ההפרדה. לאחר מכן לחלץ את השכבה המכך פעמיים באמצעות 30 מ"ל של אצטט אתיל. ודא את הנוכחות של N-Boc-propargyl-ליסין בשלב האורגני על ידי TLC באמצעות CH2Cl2-מתנול (9:1) כמו eluent.
    7. יבשו את השכבות האורגניות המשולבות מעל MgSO 4 ,מסנניםאת השלב המוצק ומרכזים את הסינון תחת לחץ מופחת על אידוי סיבובי.
    8. להמיס מדגם של הנפט הגולמי Nα-Boc-propargyl-ליסין בכלורופורם deuterated (CDCl3) ולשלוטבזהותו על ידי 1H NMR.
      התראה: החילוץ עלול לגרום להצטברות של לחץ. לשחרר כל הצטברות לחץ לעתים קרובות.
  2. סינתזה של חומצת אמינו לא טבעית propargyl-L-לייסין (PrK)
    1. הציגו α-Boc-propargyl-ליציןבמבחנות תחתית עגולה המצוידת במחיצת החלקה.
    2. להוסיף 4 מ"ל של דיכלורומטאן anhydrous (CH2Cl2)לבקבוקון תחת ארגון כדי להמיסאת N α-Boc-propargyl-ליצין.
    3. להוסיף 4 מ"ל של חומצה trifluoroacetic (TFA) dropwise באמצעות מזרק תוך כדי ערבוב.
    4. מערבבים את תערובת התגובה במשך שעה אחת ב RT. לפקח על התגובה על ידי TLC באמצעות CH2Cl2-מתנול (9:1) כמו eluent.
    5. לרכז את תערובת התגובה תחת לחץ מופחת.
    6. הוסף אתר diethyl למשקע הגולמי ותדגרה אותו ב 4 ° C עבור 1 שעות כדי לזרז את PrK. בעת עבודה בקנה מידה גבוה יותר, אם PrK אינו מזרז לחלוטין, triturate כדי לזרז אותו ולהאריך את זמן הדגירה במידת הצורך.
    7. מסננים את ה-PRK בצורה של מוצק לבן על מנוצת.
    8. לפזר את האליקוט של PRK ב D2O. לאחר מכן לבצע ניתוחי NMR כדי לשלוט בזהותו ובטוהרה.
    9. לשימוש נוסף, להמיס את חומצת אמינו לא טבעי PrK במים מזוקקים בריכוז סופי של 100 mM ולאחסן ב -20 ° C כמו 1 מ"ל aliquots.

2. ייצור החלבון רקומביננטי שונה על ידי PrK

  1. הכנת פלסמיד
    1. לבנות ביטוי פלסמיד (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH) המכיל את היעד בוגר פנאומוקוקוק משטח דבק A (mPsaA) גן (mPsaA) (pET24d-mPsaA-WT) ואחריו רצף protease וירוס Etch טבק (TEV) על ידי שיבוט ההוספה בין BamHI ואתרי הגבלת XhoI של pET24d plasmid. זה יציג את תג6 שלו ב C-terminus של החלבון. החלף את קודון ליסין-32 בענבר קודון (TAG), תוך שימוש בטכניקה קונבנציונלית של מוטגנזה בבימוי האתר.
    2. לבנות ביטוי שני plasmid (pEVOL-MmPylRS) המכיל שני עותקים של קידוד הגן עבור סינתזה pyrrolysyl-tRNA מ Methanosarcina mazei (MmPylRS) ואת קידוד הגן עבור tRNAPyr המתאים כפי שתוארקודם לכן 19. השתמש בווקטור פלסמיד שתוכנן במיוחד, pEVOL, לשילוב יעיל של כטב"מים.
      הערה: מידע plasmids מפורט מתואר בקובץ משלים 1.
  2. טרנספורמציה של פלסמידים לזן הביטוי
    1. להפשיר 100 μL aliquot של Escherichia כשיר כימית קולי BL21 (DE3) על קרח במשך 5 דקות.
    2. מוסיפים 1 μL של כל פלסמיד (50-100 ng של כל אחד) לתוך התאים דגירה במשך 30 דקות על קרח.
    3. להעביר את microtube 1.5 מ"ל עם תאים מוסמכים הפשיר באינקובטור ב 42 ° C עבור 45 s ולאחר מכן להעביר אותו בחזרה לקרח במשך 2 דקות.
    4. להוסיף 900 μL של LB בינוני דגירה תחת רועד במשך 1 שעה ב 37 ° C כדי לאפשר ביטוי אנטיביוטי. ואז לצלחת החיידקים על LB אגר עם 25 μg / מ"ל של kanamycin ו 30 μg / מ"ל של כלוראמפניקול. לאפשר צמיחת חיידקים בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
  3. ביטוי של חלבונים ששונו עם PrK
    1. לחסן מושבה אחת ב-5 מ"ל של LB בינוני עם אנטיביוטיקה (25 μg/mL של kanamycin ו 30 μg/ mL של כלוראמפניקול). דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות.
    2. לדלל את התרבות העיקרית (5 מ"ל) לתוך 500 מ"ל של מדיום אינדוקציה אוטומטית המכיל אנטיביוטיקה, 0.02% של L-arabinose ו 1 mM של חומצת אמינו לא טבעי PrK דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות עם טלטול. כלול שליטה שלילית על ידי ביצוע התרבות ללא PrK במקביל ושליטה חיובית על ידי ביצוע התרבות של שיבוט המכיל את החלבון wt.
    3. Aliquot 5 מ"ל מתוך 500 mL תרבות בינונית צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 5,000 x g. השליכו את הסופרנטנט והקפיאו את הכדור ב-20 מעלות צלזיוס. תאי קציר מ 495 מ"ל הנותרים על ידי צנטריפוגציה במשך 10 דקות ב 5,000 x g. השליכו את הסופרנטנט והקפיאו את הכדור ב-20 מעלות צלזיוס.
  4. נתח תמציות תאים גולמיים מדגימות תרבות 5 מ"ל על-ידי SDS-PAGE וניתוח כתם מערבי
    1. Resuspend 5 מ"ל כדורי תא לתוך 250 μL של מאגר lysis (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0.2 mM PMSF) ולהעביר אותו לתוך microtube 1.5 מ"ל.
    2. תאי Lyse על ידי הקפאת הצינורות בחנקן נוזלי, הפשרתם באמבט 42 מעלות צלזיוס ומערבולת במהירות גבוהה במשך 30 שניות. חזור על שלב זה 3 פעמים.
    3. דגימות צנטריפוגה ב 17,000 x g עבור 10 דקות כדי לחסל פסולת תא.
    4. קח 10 μL של supernatant ולהוסיף 5 μL של מים ו 5 μL של מאגר טעינה (ברומונול כחול, SDS, β-mercaptoethanol). מחממים את הדגימות למשך 5 דקות ב-100 מעלות צלזיוס ומבצעים ניתוחי SDS-PAGE ו-Western Blot.
  5. טיהור חלבונים על ידי כרומטוגרפיה של זיקה בספסל זרימת הכבידה באמצעות חרוזי ניקל-NTA
    1. תולה מחדש את כדורי התא (מתרבות 495 מ"ל) ל-20 מ"ל של מאגר ליסיס (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0.2 mM PMSF).
    2. להוסיף 5 μL של DNase I (1 מ"ג / מ"ל) ו 500 μL של ליזוזים (50 מ"ג / מ"ל) לתוך המתלים ולאפשר lysis על ידי דגירה ב 37 ° C במהלך 30 דקות.
    3. Sonicate התאים במהלך 5 דקות (מחזורים של 5 s-5 s, משרעת 50%) ולאחר מכן להסיר את פסולת התא על ידי צנטריפוגציה ב 20,000 x g עבור 30 דקות ואחריו סינון על 0.45 μm מסנן.
    4. הוסף שרף Ni-NTA להשעיה (500 μL עבור 500 מ"ל של תרבות התא) ולערבב בעדינות ב 4 ° C עבור 1 שעה.
    5. יוצקים את המתלים לעמודת פוליפרופילן ואספו את השבר הלא מאוגד.
    6. לשטוף את השף עם 10 מ"ל של מאגר כביסה המכיל 50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4,150 mM NaCl, 10 mm imidazole. לשטוף את השף בפעם השנייה עם 5 מ"ל של מאגר כביסה (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4,150 mM NaCl, 20 mM imidazole). לאסוף את שברים לשטוף.
    7. להגביר את החלבון מתויג שלו עם 1 מ"ל של מאגר חוגר אלגנטיות (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4,150 mM NaCl, 300 mM imidazole). חזור על שלב זה 4 פעמים ולאסוף את כל השברים ההתכלה.
    8. נתחו את הליוס הגולמי, כמו גם את 7 שברי הטיהור על ידי SDS-PAGE על ג'ל אקרילאמיד של 12%.
    9. שלב את השברים המכילים חלבון מתויג טהור שלו דיאליזה אותו מול 1 L של מאגר protease TEV (50 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8) לילה באמצעות קרום דיאליזה (חיתוך MW 6000-8000 Da). למדוד את ריכוז החלבון ב 280 nm עם מקדם הכחדה טוחנת של 37 360 ס"מ-1∙M -1 ומשקל מולקולרי של 34.14 kDa עבור mPsaA.

3. הסרת תג היסטידין על ידי TEV עיכול פרוטאז

  1. לאסוף את דגימת החלבון לתוך צינור 50 מ"ל ולהוסיף מאגר TEV (50 mM Tris HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8) עד 1 מ"ל בריכוז של 2 מ"ג / מ"ל.
    הערה: הריכוז עשוי להשתנות בהתאם לתוצאות קודמות. ריכוזי חלבון שבדקנו נמצאים בטווח טיפוסי של 2-3 מ"ג/מ"ל.
  2. להוסיף 100 μL של Protease TEV (להוסיף 1 μL המכיל 10 יחידות של Protease TEV עבור 20 μg של חלבון לעיכול).
  3. הוסף 50 μL של 0.1 M dithiothreitol (DTT).
  4. מושלם עם מאגר TEV (50 מ', טריס HCl, 0.5 מ"מ EDTA, pH 8) עד 5 מ"ל.
  5. דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס עם רעידות איטיות.
    הערה: אם העיכול לא הושלם, הוסף פרוטאז TEV נוסף, דגירה לזמן ארוך יותר או בטמפרטורה גבוהה יותר עד 30 °C.
  6. דיאליזה החלבון המעוכל כדי להסיר EDTA ב 4 ° C לילה באמצעות קרום דיאליזה (לחתוך 6000-8000 Da) נגד מאגר פוספט (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4, 150 mM NaCl, 5 mM imidazole).
  7. כדי לחסל את פרוטאז TEV ואת החלבון הלא מעוכל, דגירה את התערובת עם חרוזי Ni-NTA ולערבב בעדינות במשך 1 שעה ב 4 ° C.
  8. יוצקים את המתלים לעמודת פוליפרופילן. לאסוף את השבר הלא מאוגד ולשטוף את העמודה עם 5 מ"ל של מאגר כביסה (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 10 mM imidazole)
    הערה: יש לשחזר את החלבון של עניין בשברים הלא מאוגדים ושברים כביסה.
  9. התיז את פרוטאז TEV ואת החלבון הלא מזוקק על ידי הוספת 5 מ"ל של מאגר חוגר חומוס (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazole) בעמודה. בדוק את השברים עבור תכולת חלבון ב 280 נארם ועל ידי ניתוח SDS-PAGE.
  10. בדוק את יעילות העיכול על-ידי טעינת דגימות מעוכלות בדף SDS עם החלבון הלא מעוכל כשליטה.
  11. דיאליזה החלבון המעוכל נגד 1 L של מאגר לחץ (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4, pH8) ב 4 ° C לילה עם קרום דיאליזה (לחתוך 6000-8000 Da) כדי להסיר imidazole, כמו גם להחליף את המאגר, למדוד את ריכוז החלבון ב 280 נה"מ עם מקדם הכחדה טוחנת ומשקל מולקולרי של MPsaA (37 360 ס"מ-1∙M -1 ו MW 34.14 kDa).

4. הערכה של הנגישות והפונקציונליות של חומצת אמינו לא טבעית propargyl-ליסין עבור כימיה לחץ

הערה: להזדהות עם 6-hexachloro-fluorescein-azide באמצעות הפרוטוקול המתואר על ידי פרסולסקי ואח'. 20 עבור כימיה לחץ.

  1. קח 432.5 μL של חלבון מוטציה PrK בריכוז של 57.8 μM לתוך microtube 2 מ"ל.
    הערה: ריכוז מינימלי של 2 μM של alkyne מקובל. אם ריכוז החלבון נמוך יותר, לרכז אותו עם ריכוז צנטריפוגלי או להעדיף את האיזון של התגובה על ידי הגדלת יחס אזיד / אלקין טוחנת.
  2. להוסיף 10 μL של 5 mM 6-hexachloro-פלואורסין-אזיד ולאחר מכן להוסיף premix של 2.5 μL של תמיסת CuSO4 ב 20 mM ו 7.5 μL של Tris (benzyltriazolylmethyl)אמין (THPTA) ב 50 mM (ריכוזי פתרונות מניות).
    1. להוסיף 25 μL של 100 m aminoguanidine הידרוכלוריד.
    2. להוסיף 25 μL של 20 מ"ג / מ"ל תמיסה מים מוכנה extemporaneously של נתרן ascorbate.
    3. סוגרים את הצינור, מערבבים על ידי היפוך מספר פעמים ותו לא בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות.
    4. לעצור את התגובה על ידי הוספת 50 μL של 0.5 M EDTA.
    5. קח 15 μL של תערובת התגובה ולשים אותו microtube, להוסיף 5 μL של מאגר טעינה (כחול ברומופנול, SDS, β-mercaptoethanol), לחמם את התערובת ב 100 ° C במשך 5 דקות, ולאחר מכן לטעון אותו לתוך 12% ג'ל אקרילאמיד. לאחר הנדידה, לדמיין את הפלואורסצנט להצטייד על הג'ל תחת אור UV ב 312 מילינר.

5. התייחדות של mPsaA עם אנטיגן פחמימות פונקציונלי אזידו (Pn14TS-N3)על ידי כימיה לחץ

  1. צימוד
    1. קח 432.5 μL של חלבון מוטציה PrK ב 57.8 μM לתוך 2 מ"ל microtube.
    2. להוסיף 10 μL של 5 mM Pn14TS-N321 במים ולאחר מכן להוסיף premix של 2.5 μL של פתרון CuSO4 ב 20 mM ו 7.5 μL של THPTA ב 50 mM.
      הערה: סינתזה של Pn14TS-N3, טטראסכריד המחקה את דלקת הריאות סטרפטוקוקוס 14 פוליסכריד capsular, תוארה בהתייחסות 21. תיאורטית, ניתן להשתמש בכל אנטיגן פחמימות המכיל פונקציית אזיד.
    3. להוסיף 25 μL של 100 mM אמינוגואנידין הידרוכלוריד.
    4. להוסיף 25 μL של 20 מ"ג / מ"ל מוכן extemporaneously תמיסה מים של נתרן ascorbate.
    5. סגור את הצינור, לערבב על ידי היפוך מספר פעמים דגירה ב RT במהלך 2 שעות.
    6. לעצור את התגובה על ידי הוספת 50 μL של 0.5 M EDTA.
    7. קח 15 μL של דגימות ולנתח על ידי SDS-PAGE.
  2. סינון ג'ל של גליקוקוג'וג'גייט
    1. לטהר את גליקוקו-ג'וגייט על-ידי החלתו על עמודת agarose של הדרה סטרית (15 x 600 ממדי מיטה, טווח שברים של 3,000-70,000), עם חיץ PBS של 100 מ"ר, pH 7.3 בזרימה של 0.8 מ"ל/דקה עם זיהוי במהירות של 280 00 00 00 00 00 00 00:00.
    2. אסוף את השברים המכילים את הגיקו-קו-ג'וגייט.
      הערה: עבור אחסון ממושך, דיאליזה גליקוקוג'גייט נגד 1 L של H2O פעמיים עבור 2 שעות ולאחר מכן לילה ב 4 ° C באמצעות קרום דיאליזה (לחתוך Mw 6000-8000 Da), לאחר מכן להקפיא יבש ולאחסן את גליקוקוג'וגייט ב -80 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בפרויקט זה, הוכנה חיסון הומוגני גליקוקונג'וג'גייט באמצעות אסטרטגיית דיכוי הענבר להפסיק codon כדי להציג UAA באתר מוגדר (איור 1). דבק פני השטח Pneumoccocal A נבחר כחלבון המוביל moiety. חלבון זה הוא מאוד שמר ומובע על ידי כל הזנים של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס22. הוא חיסוני מאוד בשימוש בעבר כנשא ניסוחים חיסון פנאומוק21,23. כהוכחה לרעיון, UAA propargyl-ליסין טעון ביעילות על ידי סוג פראי pyrrolysyl-tRNA סינתטאז (PylRS)/ tRNA זוג של ארכיאה מתנוסרצ'ינה mazei נחקר. propargyl-ליצין זמין מסחרית, אבל יכול להיות מוכן יתרון מ Boc-L-ליצין רק בשני צעדים סינתטיים(איור 2). קודון ענבר נוצר במיקום הרצוי בפלסמיד pET24d המכיל את הגן mPsaA. פלסמיד זה השתנה בשותף עם pEVOL plasmid (מתנה סוג מאדוארד Lemke (EMBL19)המכיל כלים אורתוגונליים הדרושים כדי לשלב את propargyl-ליסין, לתוך זן E. coli BL21 (DE3) מוסמך. שיבוטים חיוביים שהשתנו ב-25 μg/mL kanamycin ו-30 μg/mL כלוראמפניקול. pEVOL plasmid מכיל במקור לא אחד אלא שני עותקים של קידוד הגן עבור MmPylRS לשלב את שאריות propargyl-lysine: העותק הראשון נמצא תחת שליטה של מקדם constitutive בעוד הביטוי של השני הוא בלתי ניתן להובלה בנוכחות arabinose. עם זאת, לא שמנו לב לירידה דרמטית של התאגדות propargyl-lysine אם הגן MmPylRS תחת שליטה של מקדם constitutive מודחק.

הפרופארג'י-ליסין הוצגה בעמדה 32 כתחליף לליזאין ליד ה-N-terminus של PSAA. ניתן להחליף כל שאריות עם שרשרת צדדית חשופה לפני השטח, למעשה, כדי לבצע התייחדות נוספת. החלבון שעבר מוטציה יוצר בצורתו הבוגרת (mPsaAK32PrK)עם הכללה של רצף תג 6-היסטידין הניתן לניתן לניתוק במסוף C שלו. היעילות של ייצורK32PrK MPsaA נבדקה על ידי SDS-PAGE וניתוח כתם מערבי באמצעות נוגדן תג אנטי היסטידין, כאשר הצמיחה בוצעה בנוכחות או בהיעדר propargyl-לייסין UAA ובהשוואה לייצור של MPsa סוג פראי(איור 3). הדמיה חשפה רצועה חלבון במשקל מולקולרי צפוי (נתיבים 4, איור 3A & 3B). הנוכחות של חלבון באורך מלא מצביעה על ההתאגדות המוצלחת של PRK לתוך MPsaA. עם זאת, העוצמה נמוכה מזה שנצפה עבור חברי פרלמנט מסוג פראי (נתיבים 2, איור 3A & 3B). דליפה (כלומר, ייצור של חלבון באורך מלא ללא התאגדות של UAA) ושחרור מוקדם של החלבון על ידי RF1 גורם שחרור במהלך התרגום הם שני חסרונות עיקריים נתקלים לעתים קרובות במהלך תהליך זה. מצד אחד, אף להקה במשקל המולקולרי הצפוי לא מדמיינת בהיעדר פרו-פרגיל-לינזין כלומר לא התרחשה דליפה (נתיבים 3, איור 3A & 3B) ואישרהבעקיפין כי הלהקה שנצפתה בנתיבים 4 מתאימה ל-MPsaAK32PrK. מצד שני, אף להקה לא ניתן לראות במשקל מולקולרי נמוך שיכול להתאים לצורה קתועה של mPsaA (ליין 4 על איור 3A). MPsaAK32PrK טוהר אז על ידי כרומטוגרפיה זיקה, עם תשואה אופיינית של 8 מ"ג / L (בהשוואה 12-20 מ"ג / L עבור חלבון מסוג בר) ואת ההתאגדות של שאריות propargyl-לינזין אושרה לבסוף על ידי ספקטרומטריהמסה (איור 4). תג ההיסטידין הוסר על מחשוף פרוטאוליטי באמצעות פרוטאז TEV (איור 4). היציבות של MPsaAK32PrK שהושג ולכן הוערך על ידי dichroism מעגלי, אשר הראה כי המבנה של החלבון לא היה מופרע על ידי המוטציה של ליציה 32 לתוך propargyl-לי סין (נתונים לא מוצגים).

לאחר mPsaAK32PrK, את ההגביה של alkyne עבור כימיה קליק הוערך באמצעות פלואורסצן אזידו פונקציונלית ובנוסף שימש כדי להזדהות אנטיגן אוליגוסכריד סינתטי β-2-אזידואתיל d-Galp-(2-galp 1→4)-β-d-Glcp-(1→6)-[β-d-Galp-(1→4)]-β-d-GlcpNAc (Pn14TS) (איור 5). טטרה-כריד זה קשור לפוליסוקריד מסוג S. דלקת ריאות 14, ובעבר הווסכם ל-mPsaA באמצעות כימיה אחרת של התייחדות8,21,24. הניסויים כאן נעשו בהשוואה ל-MPsaA מסוג פראי כשליטה. תג ההיסטידין הוסר לראשונה על מחשוף פרוטאוליטי באמצעות protease TEV. לאחר מכן, חברי הפרלמנטהמעוכלים K32PrK ו-MPsaA WT הוסתרו לתהליך הפלואורו(איור 6א') או Pn14TS(איור 6ב'). התגובה הוערכה על ידי SDS-PAGE. העלייה הקטנה במשקל המולקולרי של המדגם בין נתיב 6 ו- 7(איור 6ב') מצביעה על התייחדות מוצלחת עם הטטרסקריד Pn14TS. לבסוף, גליקוקוג'וג'גייט טוהר על ידי סינון ג'ל וזהותו אושרה על ידי ספקטרומטריההמונית (איור 6ג'). ההתייחדות על ידי כימיה קליק להיות כמותית רוב MPsaAK32PrK היה באוב עם Pn14TS-N3 כפי שמוצג על ידי תוצאות ספקטרומטריה מסה ( איור6C).

Figure 1
איור 1: התאגדות של פרופארג'י-ליסין (PrK) לתוך mPsaA במהלך התרגום באמצעות פירוטו-tRNA synthetase/tRNA זוג תג קודון הקצאה מחדש25. במהלך התרגום, סינתזות אנדוגניים מקטן את הקשר בין חומצות אמינו tRNAs המתאים. לאחר מכן, tRNAs נטען משמשים את המכונות ריבוזומל כדי ליצור פוליפפטיד ניאו מסונתז. על פי אסטרטגיית דיכוי codon עצירת ענבר, סינתזה orthogonal אמינואציל-tRNA (aaRS) (כאן סינתזה pyrrolysyl-tRNA מ M. mazei),טוען UAA (כאן PrK) על tRNA הקוגנטה שלה אשר תוכנן אנטיקודון יכול לקרוא את הענבר להפסיק קודון (TAG) על mRNA. זיהוי ספציפי זה מכוון את ההתאגדות של UAA לתוך האתר הספציפי על חלבון היעד. איור שהועתק מוואנג ואח'25. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: סינתזת פרופארג'י-לייסין. (א)שלבים של סינתזת פרופארג'י-לייסין. הוספה: ניטור של deprotection של Boc-l-Lys (אביזר-2-ynyloxycarbonyl)-OH ביניים: כרומטוגרפיה שכבה דקה על 0.25 מ"מ ג'ל סיליקה לוחות עם מחוון פלורסנט (GF254) ודמיינו על ידי חרוך עם ונילין בחומצה גופרתית / אתנול (1.5:95 v/v); eluent: CH2Cl2/MeOH (9:1), נתיב שמאל: Boc-l-Lys (אביזר-2-ynyloxycarbonyl)-OH(Rf 0.90), נתיב ימני: פרופארג'י-לייסין גולמי,(Rf 0.38). 400 MHz 1H (B) ו 13ספקטרה NMR C (C) של propargyl-ליצין נרשם D 2 O. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 3
איור 3: ניתוח דגימות תאים גולמיים. (A) ניתוח SDS-PAGE ו- (B) ניתוח כתם מערבי על דגימות תאים גולמיים. נתיב 1: סמן חלבון לא מוכתם; נתיב 2: תמצית תאים גולמיים של חברי פרלמנט מסוג פראי; נתיב 3: תמצית תאים גולמיים של MPsaAK32TAG גדל בהיעדר PrK; ליין 4: חילוץ תאים גולמיים של MPsaAK32TAG גדל בנוכחות PrK. תנאים: 12% ג'ל אקרילאמיד, פועל ב 100 V, 2 h. SDS-PAGE מוכתם על ידי כחול Coomassie; כתם מערבי חשף באמצעות נוגדן תג אנטי היסטידין ונוגדן משני יחד עם AlexaFluor680. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: הסרת תג היסטדין וניתוח ספקטרומטריה מסה. (A)ניתוח דף SDS. נתיב 1: סמן חלבון לא מוכתם; נתיב 2: תמצית תאים גולמיים; נתיב 3: שבר לא מאוגד; נתיב 4: שטף שבר עם 10 mM imidazole; נתיב 5: שטף שבר עם 20 mM imidazole; תנאים: 12% ג'ל אקרילאמיד פועל ב 100 V עבור 2 שעות, ומוכתם על ידי כחול Coomassie; (ב)MALDI-TOF-MS ספקטרה של (למעלה) mPsaA WT, MW תיאורטי 33 103 Da, מצא 33 106 Da ו (למטה) mPsaA K32Prk, תיאורטי 33 184 Da, מצא 33 192 Da. ההמונים שנמצאו נמצאים בתוך שגיאת השוליים הצפויה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: ייצוג סכמטי של אסטרטגיית ההתייחדות על ידי כימיה של קליק. tetrasaccharide יחיד הנושא אזיד הוא במיוחד יחד עם קבוצת alkyne biorthogonal המשלים שלה על mPsaA K32PrK (ייצוג mPsaA מבוסס על קובץ PDB 1PSZ, עם רזולוציה של 2.0 Å26). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: עיכול היסטידין-תג והתייחדות של mPsaA עם (א)פלואורסצ'ין-N 3 ועם (ב) Pn14TS. (A) SDS-PAGE נתיבים 1-3: WT mPsaA; נתיב 4-6: ח"כK32PrK; (ב)ליין 1: סמן חלבון לא מוכתם; נתיב 2-4: ח"כים WT; נתיב 5-7: ח"כK32PrK. 2 μg חלבון מדגם / נתיב, 12% acrylamide, 100 V, 2 שעות; (ג)MALDI-TOF-MS ספקטרה של Pn14TS-mPsaAK32PrK תיאורטי MW 34 091 Da, מצא 34 088 Da. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

קובץ משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mutagenesis באתר היא אסטרטגיה פשוטה לשלב חומצות אמינו ספציפיות בעמדה מוגדרת של חלבון אשר נשאר בקושי בשימוש במטרה להכין חיסונים גליקונג'וגייט7,8,14. מוטגנזה קלאסית המבוססת על 20 גישת חומצות אמינו טבעיות יעילה מאוד מאחר שלא נדרש שינוי במכונות התרגום. מוטציות ציסטאין בדרך כלל ממוקדות כדי להמשיך לחקור את תגובתיות thiol ייחודי או ישירות או בשני שלבים (למשל,לאחר השינוי שלה לתוך ביניים דהידרואלאנין, אסטרטגיה הנקראת mutagenesis שלאחרתרגום) 27,28. הרחבת קוד גנטי היא אולי אפילו יותר אטרקטיבית וגמישה שכן היא מאפשרת התאגדות ישירה של מגוון רחב של כטב"מים עם פונקציותמגוונות 9,10. בעוד כמה כטב"מים ניתן לשלב בו זמניתבתוך חלבון 29, מספר המוטציות הוא בדרך כלל מוגבל יותר. אנו מיישם כאן את אסטרטגיית הענבר להפסיק codon הקשורים כדי להציג פרופארג'י-ליסין יחיד בחלבון נשא. ההתאגדות יכולה להתקיימה בכל עמדה בתנאי שהצד של חומצת אמינו הראשונית היה חשוף לפני השטח, קריטריון שנקבע בקלות ממבנים קריסטלוגרפיים רנטגן או במודלים silico. יתר על כן, זה לא מוגבל propargyl-ליסין, אבל ניתן להרחיב לכל UAA פונקציונלי עם פונקציה biorthogonal אשר מאוחר יותר ישמש עוגן להשתיל אנטיגן פחמימות נכנסות שעבורו קיים זוג aaRS/tRNA אורתוגונלי.

אחד החסרונות של האסטרטגיה הוא ייצור אפשרי של חלבון קצוע, הנובע משחרור של sidechain peptidyl בעת קריאת הענבר להפסיק קודון, כמוצר צד. גם אם לא צפנו כאן לצורה מקוטצת כלשהי (כנראה מפורקת על ידי החיידקים בגלל גודלו הקטן מאוד), נוספה תג היסטידין ב-C-terminus של החלבון כדי להקל על טיהור החלבון המוטציה הצפוי באורך מלא מטימה ובאופן ניכר מהחלבון הקצוע (אשר בעצם אינו מבטא את רצף התגים ההיסטידין). זה יכול להיות חיוני אם ההתאגדות UAA מתבצעת ליד החלבון C-terminus מאז טיהור לא ניתן לנסות באמצעות טכניקות כרומטוגרפיה חלופית כמו סינון ג'ל.

עבור רוב היישומים הסרת תג histidine אינו חובה. עם זאת, זה עשוי להיות שימושי לגבי העיצוב של חיסון גליקוקונג'וגייט כחלק ממערכת החיסון עשוי להיות מופנה נגד רצף התגים. עבור הוכחת הרעיון הזה, הכנסנו רצף אורך חומצת אמינו במיוחד התכווצות על ידי protease TEV אשר משאיר חמש חומצות אמינו נוספות על חלבון המוביל לאחר העיכול.

צעד ההתייחדות בין alkyne של propargyl-ליסין ונציג oligosaccharide סינתטי Pn14TS הקשורים קפסולה pneumococcal ונושאים אזיד משלים בוצע על פי פרוטוקול קליקים כימיה שדווח על ידי פרסולסקי ואח '.20 במידת הצורך, השלמת התגובה ניתן להגיע בקלות על ידי הגדלת זמן התגובה או על ידי שינוי היחס בין אלקין, אזיד ונחושת מגיבים ריאגנטים. מלחי נחושת מסולקים על ידי טיפול עם EDTA עודף ואחריו טיהור קצר על ידי כרומטוגרפיה הדרה סטרית.

גליקוקו-קווג'גייט שהושגה עם הטכניקה המתוארת בעבודה הנוכחית יכולה לשמש לחסן עכברים. לאחר כזה מוגדר באופן מלא וlyly מאופנן גליקוקוג'וגייט בידיים מספק כלים יקרי ערך כדי להעריך את ההשפעה של קישוריות נשא hapten / חלבון על התגובה החיסונית8. מאז הגדלת יחס hapten / חלבון הוא לעתים קרובות בקורלציה עם תגובה הומוריסטית אנטי-hapten משופרת בעת שימוש haptens קצר30, אחד עשוי להיות מעוניין בבדיקת התייחדות עם haptens מרובים. ההתאגדות של כטב"מים מרובים עם זאת צריך כמה התאמות של הפרוטוקול כמו ההתאגדות של UAA בחלבון נוטה להקטין את התשואה של ייצור חלבון בשל פעילות RF1.

בהחלט, שיטה זו היא כלי רב עוצמה כדי לקבל גישה חיסוני גליקוקוג'וג'וגייט הומוגניים להקלה על האפיון הפיזיקו-כימי שלהם ועוד פחמימות אנטיגן / מוביל קישוריות-immunogenicity מחקרים מערכת יחסים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

E.C. מודה בהכרת תודה על התמיכה הכספית של La Région Pays de la Loire (תוכנית פארי Scientifique "BioSynProt"), במיוחד מלגת דוקטורט ל-T.V. אנו גם מכירים ד"ר רוברט B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, טולוז, צרפת) עבור ייעוץ טכני יקר שלו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AIM (autoinductif medium) Formedium AIMLB0210 Solid powder
Boc-Lys-OH Alfa-Aesar H63859 Solid powder
BL21(DE3) Merck Novagen 69450 E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resin Machery Nagel Protino Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH this study same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WT this study pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmid gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformate Sigma-Aldrich 460923 Liquid
Sonicator Thermo Fisher FB120-220

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rappuoli, R. Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms. Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).
  2. Verez-Bencomo, V., et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).
  3. Berti, F., Adamo, R. Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).
  4. Stefanetti, G., et al. Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).
  5. Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines. NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).
  6. Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine. Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).
  7. Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).
  8. Pillot, A., et al. Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation. Frontiers in Chemistry. , (2019).
  9. Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function. Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).
  10. Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).
  11. Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies. Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).
  12. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids. Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).
  13. Kularatne, S. A., et al. A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).
  14. WIPO. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids. , https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS)&maxRec=11858 (2018).
  15. Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis. FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).
  16. Wang, L. Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts. Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).
  17. Brabham, R., Fascione, M. A. Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).
  18. Oller-Salvia, B. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019).
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  21. Prasanna, M., et al. Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).
  22. Morrison, K. E., et al. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).
  23. Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae. Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).
  24. Safari, D., et al. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).
  25. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).
  26. Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein. Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).
  27. Wright, T. H., Davis, B. G. Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins. Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).
  28. Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine. Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).
  29. Worst, E. G., et al. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
  30. Carboni, F., et al. GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation. The Journal of Infectious Diseases. , (2019).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 166 ביולוגיה סינתטית גליקוקוג'וג'גייט הומוגני ביו-התייחדות סלקטיבית באתר חומצת אמינו לא טבעית הרחבת קוד גנטי כימיה של קליקים פרו-פרגיל-ל-לייסין פחמימות
גליקוקוג'גייט הומוגני המיוצר על ידי התאגדות חומצת אמינו לא טבעית משולבת וכימיה לחץ למטרות חיסון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Violo, T., Dussouy, C., Tellier, C., … More

Violo, T., Dussouy, C., Tellier, C., Grandjean, C., Camberlein, E. Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes. J. Vis. Exp. (166), e60821, doi:10.3791/60821 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter